CN110541047B

CN110541047B - 利用ssr指纹图谱鉴别正品当归的方法

Info

Publication number: CN110541047B
Application number: CN201910962330.1A
Authority: CN
Inventors: 刘新星; 欧巧明; 罗俊杰; 崔明九; 李忠旺; 石有太
Original assignee: Biotechnology Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Institute Gansu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2039-10-11
Also published as: CN110541047A

Abstract

本发明公开了利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，包括以下步骤：1)待测当归及近缘属药材样本总DNA提取；2)以待测样本的基因组DNA为模板，利用SSR引物进行PCR扩增反应；3)PCR扩增产物电泳、染色及鉴定。本发明的有益效果为：本发明提供的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，首次利用SSR分子标记技术开展当归种间(当归与近缘属药材)鉴别，构建了正品当归的SSR指纹图谱，使之能够从分子层面进行伪品剔除，解决了市场上当归药材来源混杂的问题，为当归品牌标识、育种提供可靠的材料，并对其进行遗传多样性评价。为当归产业的健康可持续发展提供技术支撑，同时可以对当归种质进行遗传多样性分析，挖掘优质基因。

Description

利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术领域，具体涉及利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法。

背景技术

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，又叫秦归、云归、西当归和岷当归，生长于海拔1800～2500m高寒阴湿地区。主要栽培于甘肃岷县及云南。性甘、辛、温。有补血活血、调经止痛、润肠通便等功能。临床上用途广泛，有“十方九归”之说。现代药理研究表明当归具有多种药理功效。当归为伞形科当归属的栽培植物，是著名常用药材之一。《中国药典》2015版收载的当归来源仅为当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其余品种与当归在功效上均有较大差异，严重影响用药安全。

药用植物覆盖了广泛的植物类群，其中包含形态学上难以鉴别的物种。调查显示，中国药用植物覆盖了383科、2309属、11146种，具有丰富的生物多样性。由于有些植物在形态上极其相似，加之长期以来对中草药的品种来源、定名、谱系、品种特性等缺乏科学管理，致使中药材名称混乱，出现一名多物、一物多名等现象，给用药安全带来了隐患。中药材传统的鉴定方法主要是性状鉴别、显微鉴别和化学特征鉴别，受原植物生长环境、生长期及炮制加工工艺的影响较大。近年来，分子鉴别方法已经广泛的在中药材上发展起来。当归药用历史悠久，品种来源甚多，由于产地、来源和加工方法不同，药材质量有很大差别，商品名称也十分混乱。目前，当归的分子鉴别在ITS、trnl-F、ISSR和RAPD上均有研究，但在SSR上还未见报道。SSR作为分子标记的一种，在植物学与农学领域广泛应用于系谱分析与进化、遗传图谱构建、基因定位克隆、品种鉴定等方面，具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点。本发明利用SSR指纹图谱鉴别当归与近缘属药材，为当归的种质资源保护和利用、市场的健康可持续发展提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，即针对目前市场上当归品种混乱、真假掺卖、优质当归供不应求的情况，提供了利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，首次利用SSR分子标记技术开展当归种间(当归与近缘属药材)鉴别，构建了正品当归的SSR指纹图谱，使之能够从分子层面进行伪品剔除，并对其进行遗传多样性评价。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，包括以下步骤：

1)待测当归及近缘属药材样本总DNA提取；

2)以待测样本的基因组DNA为模板，利用SSR引物进行PCR扩增反应；

3)PCR扩增产物电泳、染色及鉴定。

鉴定标准为扩增样本的图谱与本发明中的附图1所示的模拟图谱(其中扩增条带数量及位置)相符，则证明是正品当归。

进一步的，上述的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，所述步骤1)中，待测当归与近缘属药材样本总DNA提取，是采用天根植物基因组试剂盒进行提取。

进一步的，上述的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，所述步骤2)中，2对SSR引物序列分别为：

引物A：上游引物：5'-ACCAAACCACCTATGTCACTAC-3'；

下游引物：5'-CTCAAGGAGGCTGGAAACTG-3'；

引物B：上游引物：5'-GAGAAGAAAGCGGCTGGTGGT-3'；

下游引物：5'-AAGGCGATGAGATGACAAGGGT-3'。

进一步的，上述的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，所述步骤3)中，PCR扩增产物电泳采用6％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，染色采用银染法，鉴定采用统计电泳带型构建SSR指纹图谱进行当归鉴定。

本发明的有益效果为：本发明提供的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，首次利用SSR分子标记技术开展当归种间(当归与近缘属药材)鉴别，构建了正品当归的SSR指纹图谱，使之能够从分子层面进行伪品剔除，解决了市场上当归药材来源混杂的问题，为当归品牌标识、育种提供可靠的材料，并对其进行遗传多样性评价。为当归产业的健康可持续发展提供技术支撑，同时可以对当归种质进行遗传多样性分析，挖掘优质基因。

附图说明

图1显示为当归SSR指纹图谱模拟图；

其中，M为50bp Marker，1为当归DNA在引物A的扩增位点，2为当归DNA在引物B的扩增产物位点。

图2显示为引物A的扩增电泳图；

其中，泳道1：Marker；泳道2-28：当归；泳道29-33、36-37为当归混伪品，依次为：红柴胡、川芎、柴胡、北沙参、独活、羌活和葛缕子。

图3显示为引物B的扩增电泳图；

泳道1：Marker；泳道2-28：当归；泳道29-33、36-37为当归混伪品，依次为：红柴胡、川芎、柴胡、北沙参、独活、羌活和葛缕子。

具体实施方式

实施例1：

利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，包括以下步骤：

1)待测当归及近缘属药材样本总DNA提取；

3)PCR扩增产物电泳、染色及鉴定。

步骤1)中，待测当归与近缘属药材样本总DNA提取，是采用天根植物基因组试剂盒进行提取。

步骤2)中，2对SSR引物序列分别为：

引物A：上游引物：5'-ACCAAACCACCTATGTCACTAC-3'；

下游引物：5'-CTCAAGGAGGCTGGAAACTG-3'；

引物B：上游引物：5'-GAGAAGAAAGCGGCTGGTGGT-3'；

下游引物：5'-AAGGCGATGAGATGACAAGGGT-3'。

步骤3)中，PCR扩增产物电泳采用6％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，染色采用银染法，鉴定采用统计电泳带型构建SSR指纹图谱进行当归鉴定。

上述PCR反应体系：总体积15μl，包括2×Taq Master Mix 7.5μl，DNase-FreeWater4.5μl，Forward Primer 1μl，Reverse Primer 1μl，DNA模板1μl。

上述PCR反应程序：95℃热启动3min，95℃变性45s，48-65℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环后，72℃终延伸5min后结束。

PCR扩增产物电泳及染色：采用6％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，银染显色，相机拍照，记录电泳结果；

SSR指纹图谱结果分析及鉴定：鉴定采用统计电泳带型构建SSR指纹图谱，进行当归鉴定。上述2对引物构建的当归模拟指纹图谱见图1。如图1所示，利用本发明提供的2对SSR引物可鉴别出正品当归，当归在2对引物扩增图中对应的SSR位点如图1所示。

实施例2：

应用案例：

1.供试材料及采样方法：

以县级为单位，选取甘肃当归种植的5个主栽区卓尼县、岷县、陇西、渭源和漳县共29份当归材料，另在陇西药圃园采集当归近缘属药材川芎、独活、羌活、葛缕子、北沙参、柴胡和红柴胡7份，总共36份药材样本。摘取幼嫩的新鲜叶片置于盛有硅胶颗粒的密封袋内立即干燥带回实验室。

2.样品处理及DNA提取：

每份样品取约50mg，用液氮研磨，采用天根的植物提取基因组试剂盒进行样品DNA的提取，提取完成后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行样品质量的检测，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，将DNA稀释至20-50ng/μl，4℃保存备用。

3.SSR引物PCR扩增：

以步骤2提取的供试材料总DNA为模板，采用如下2对引物进行PCR扩增：

引物A:F:5'-ACCAAACCACCTATGTCACTAC-3'

R:5'-CTCAAGGAGGCTGGAAACTG-3'

引物B：F:5'-GAGAAGAAAGCGGCTGGTGGT-3'

R:5'-AAGGCGATGAGATGACAAGGGT-3'

4.PCR扩增产物电泳及染色：

采用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色，具体步骤如下：

(1)清洗玻璃板：用自来水和洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，晾干备用，用时喷95％酒精擦洗两遍，晾干。

(2)组装胶板：将玻璃板长板和短板叠放在一起，两侧用夹子固定，放置在一个平台上，调至水平。

(3)灌胶：取52ml双蒸水，加入12mL 40％的丙烯酰胺，16ml 5×TBE，32μl TEMED和800μl 10％的过硫酸氨(APS)，轻轻混匀，把胶沿灌胶口缓慢灌入，注意防止出现气泡，最后插入梳子，静置使其聚合60分钟。

(4)加缓冲液：取出梳子，将聚合好的胶板组装到电泳槽上，然后将电泳槽连好导线并将导线接入电泳仪中，再将干净的1.0×TBE缓冲液加入电泳槽，注意让缓冲液没过梳子孔。插上电源，在200V电压下预电泳30分钟。

(5)点样：用移液枪反复冲洗加样孔，然后将PCR产物加入点样孔，每一个加样孔点样量为3μl，Marker为2μl，电泳缓冲液为1×TBE。

(6)电泳：200V，150mA，电泳120min。

(7)扩增产物的银染显色，包括以下5个步骤：

漂洗：在塑料盘中加入400ml蒸馏水漂洗1次，倒掉蒸馏水。

染色：称取0.4g AgNO₃，溶于400ml蒸馏水，倒入塑料盘中摇床摇动10分钟。

漂洗：倒去染色液后，加入400ml蒸馏水进行二次漂洗，漂洗1分钟倒掉蒸馏水。

显影：称取6g NaOH，溶于400ml蒸馏水，再加2ml甲醛，搅拌均匀倒入盛有胶板的塑料盘中，轻摇显影至条带清晰为止，甲醛要现用现加。

洗涤：清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1-2次，彻底去掉显影液，以免保存时变色。

(9)观察照相，记录电泳结果。

5.SSR指纹图谱构建及鉴定分析

SSR标记数据采用统计电泳带型，构建当归的指纹图谱，进行正品当归种质鉴定。

注：泳道1：Marker；泳道2-28：当归；泳道29-33、36-37为当归混伪品，依次为：红柴胡、川芎、柴胡、北沙参、独活、羌活和葛缕子。

结果分析：从图2和图3看出，引物A和引物B分别在当归上扩增出的7个位点(箭头所示)，可以将当归与7份近缘属药材有效区分。在引物B的扩增电泳图中，可以看出羌活和葛缕子的扩增位点与当归只差一个位点。因此，为了保证鉴别结果的准确度，建议2对引物一起使用，如果供试材料在2对引物的扩增下均能与当归指纹图谱相一致，则可证明是正品当归。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待测当归及近缘属药材样本总DNA提取；

2)以待测样本的基因组DNA为模板，利用SSR引物进行PCR扩增反应；所述SSR引物为2对，其序列分别为：

引物A：上游引物：5'-ACCAAACCACCTATGTCACTAC-3'；

下游引物：5'-CTCAAGGAGGCTGGAAACTG-3'；

引物B：上游引物：5'-GAGAAGAAAGCGGCTGGTGGT-3'；

下游引物：5'-AAGGCGATGAGATGACAAGGGT-3'；

3)PCR扩增产物电泳、染色及鉴定。

2.根据权利要求1所述的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，其特征在于，所述步骤1)中，待测当归与近缘属药材样本总DNA提取，是采用天根植物基因组试剂盒进行提取。

3.根据权利要求1所述的利用SSR指纹图谱鉴别正品当归的方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增产物电泳采用6％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，染色采用银染法，鉴定采用统计电泳带型构建SSR指纹图谱进行当归鉴定。