CN110538175A - 穿心莲内酯在制备用于促进胆固醇逆转运的促进剂中的应用 - Google Patents
穿心莲内酯在制备用于促进胆固醇逆转运的促进剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种穿心莲内酯在制备用于促进胆固醇逆转运的促进剂中的应用，抗动脉粥样硬化的药物中的应用。试验证明，穿心莲内酯促进细胞内胆固醇逆转运、抗动脉粥样硬化运的疗效显著，见效快，且毒副作用小，尤其是穿心莲内酯对肝肾功能无影响，是一种安全、高效、稳定的治疗、调理心血管疾病的药物或保健品，适于工业化生产，易于推广。从而为穿心莲内酯的应用开拓了一个新的领域，为促进细胞内胆固醇逆转运、降低细胞内胆固醇含量，预防和治疗动脉粥样硬化、心血管疾病提供了一种新的药物来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种可调节血脂，并具有预防动脉粥样硬化性心脏病发展作用的化合物、制备方法及其应用，特别涉及一种抗动脉粥样硬化的胆固醇逆转运促进剂、制备方法及其应用。
背景技术
心血管疾病(CVD)，包括不稳定性心绞痛，中风，ST段抬高或无ST段抬高的急性心肌梗死，以及冠状动脉猝死，是全球范围内导致心血管疾病发病和死亡的主要原因。大部分的心脏病死亡病例是由于冠状动脉粥样硬化性心脏病引发。在我国北京地区，1984-1993年急性冠心病事件发病率的年平均增长率为2.3％。在全国，1984-1997年急性冠心病事件发病率的年平均增长率为1.7％。
冠心病又称冠状动脉粥样硬化性心脏病，是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化性病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。大多数急性冠状动脉综合征(ACSs)被认为是由动脉粥样硬化斑块破裂引发的。
在冠心病的发病机制中，血中增高的脂质以低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL)或其残粒的形式侵入动脉壁，堆积在平滑肌细胞、胶原和弹性纤维之间，引起平滑肌细胞增生。后者与来自血液的单核细胞一样吞噬大量脂质成为泡沫化细胞。脂蛋白降解释出胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯和其他脂质，LDL还和动脉壁的蛋白多糖结合产生不溶性沉淀，这些都能刺激纤维组织增生。上述因素共同促进纤维斑块的发展。高胆固醇水平是导致动脉粥样硬化和心血管疾病的最重要因素，由于LDL-C代谢的基因缺陷，导致患者长期处于高血浆胆固醇水平，极大提高罹患冠心病的风险。这些发现均表明，调节血脂，降低血清胆固醇、甘油三酯、LDL和oxLDL水平，促进抗氧化能力以及抑制泡沫细胞形成，是预防动脉粥样硬化病变进展的有效方法。
发明内容
本发明目的是针对现有心血管疾病高血脂、胆固醇在细胞内堆积，导致动脉粥样硬化病变的技术问题，提供一种穿心莲内酯的新用途用，即在制备用于促进胆固醇从细胞内逆转运的促进剂、抗动脉粥样硬化的胆固醇逆转运促进剂、抗动脉粥样硬化的药物、治疗高血脂症药物、治疗心血管疾病的药物中的新应用，穿心莲内酯用于抗动脉粥样硬化，降低细胞内胆固醇含量，将细胞内的胆固醇逆转运至细胞外，抑制胆固醇在平滑肌细胞胶原和弹性纤维之间堆积，避免平滑肌细胞增生，具有调节血脂，降低血清中胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白胆固醇，同时具有升高高密度脂蛋白胆固醇作用。
穿心莲内酯(3-[2-[decahydro-6-hydroxy-5-(hydroxy-methyl)-5,8a-dimethyl-2-methylenenaphthalenyl]ethylidene]dihydro-4-hydroxyfuran-2(3H)-one)，分子式为C20H30O5；分子量为M＝350.44；其结构式如下：
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种穿心莲内酯在制备促进胆固醇逆转运的促进剂中的应用。
穿心莲内酯在制备用于抗动脉粥样硬化的胆固醇逆转运促进剂中的应用。
其中，所述促进胆固醇逆转运的促进剂还包括药学上可接受的载体；所述促进胆固醇逆转运是促进泡沫细胞内的胆固醇逆转运，将泡沫细胞内的胆固醇逆转运至细胞外，降低细胞内的胆固醇含量，减少动脉粥样硬化斑块的形成；缩小动脉粥样硬化斑块面积。
穿心莲内酯在制备预防或/和治疗胆固醇在血管内皮沉淀导致的动脉粥样硬化的药物或保健品中的应用。
特别是，所述促进剂以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂形式存在。
药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical excipients，第2版，由A.Wade和P.J.Weller编辑；AmericanPharmaceutical Association出版，Washington and The Pharmaceutical Press,London,1994)等工具书中找到。
尤其是，所述的载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘结剂，如预胶化淀粉、糊精等；甜味剂；抗氧化剂；防腐剂、矫味剂、香料等；
其中，所述促进剂是通过经胃肠道给药和非经胃肠道给药途径给药。
特别是，所述的经胃肠道给药制剂选择片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂或糖浆剂等。
其中，所述促进剂用于治疗或/和预防动脉粥样硬化病症，预防或/和治疗胆固醇水平高，在血管内皮堆积、沉淀引起的动脉粥样硬化。
特别是，预防动脉粥样硬化斑块的形成；缩小动脉粥样硬化斑块面积；预防胆固醇水平高，在血管内皮堆积、沉淀引起的动脉粥样硬化斑块；降低胆固醇含量，缩小由于胆固醇水平高，在血管内沉积引起的动脉粥样硬化斑块面积。
其中，所述促进剂用于治疗或/和预防以动脉粥样硬化为病理基础的疾病。
特别是，所述动脉粥样硬化为病理基础的疾病为脑动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化，肾动脉、肠系膜动脉、颈动脉及其他外周血管相关病变，并包括该病理基础继发的脑缺血、脑萎缩、脑血管破裂出血，心绞痛、心肌梗死、心律失常，顽固性高血压、肾功能不全，消化不良、便秘、便血、麻痹性肠梗阻，间歇性跛行、足背动脉搏动消失、坏疽等，优选为脑动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗或心梗等。
本发明另一方面提供一种穿心莲内酯在制备用于抗动脉粥样硬化的药物中的应用。
其中，所述药物由穿心莲内酯和药学上可接受的载体组成。
特别是，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂形式存在。
其中，所述药物是通过经胃肠道给药和非经胃肠道给药途径给药。
特别是，所述的非经胃肠道给药途径选择注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药。
其中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等形式存在。
其中，非经胃肠道给药药剂选择注射剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂等。
特别是，所述的经胃肠道给药制剂选择片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂或糖浆剂等。
穿心莲内酯用于预防动脉粥样硬化斑块形成、缩小动脉粥样硬化斑块。
穿心莲内酯用于抗胆固醇在血管内皮堆积、沉淀引起的动脉粥样硬化斑块形成、缩小胆固醇在血管内皮堆积、沉淀引起的动脉粥样硬化斑块。
本发明再一方面提供一种穿心莲内酯在制备用于治疗心血管疾病的药物中的应用。
其中，所述心血管疾病为动脉粥样硬化性心血管疾病。
特别是，所述心血管疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病。
本发明又一方面提供一种穿心莲内酯在制备用于抗动脉粥样硬化性心脏病的药物中的应用。
本发明另一方面提供一种促进胆固醇逆转运促进剂，其中所述胆固醇逆转运促进剂包括穿心莲内酯。
本发明再一方面提供一种用于抗动脉粥样硬化的胆固醇逆转运促进剂，其中所述胆固醇逆转运促进剂包括穿心莲内酯。
其中，所述胆固醇逆转运促进剂还包括药学上可接受的载体。
本发明还提供一种促进胆固醇逆转运的促进剂穿心莲内酯的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)将穿心莲药材浸泡于乙醇溶液中，加热回流提取2-3次，合并回流提取液并进行浓缩处理，回收乙醇，制得提取-浓缩液；
2)向提取-浓缩液中加入活性炭，进行脱色处理30-60min；然后过滤，收集制得脱色滤液；
3)对脱色滤液进行大孔吸附树脂柱分离，采用乙醇溶液为洗脱溶剂对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱液并浓缩，回收乙醇，获得大孔树脂分离混合液；
4)大孔树脂分离混合液于温度≤10℃(优选为0-4℃)的条件下，进行静置、沉淀处理，静置至少12h后，弃去上清液，沉淀加无水乙醇溶解，制得粗品复溶液；
5)将粗品复溶液于温度≤4℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯结晶粗品；
6)穿心莲内酯结晶粗品溶于热的无水乙醇中，接着加入活性炭进行脱色；然后进行过滤，滤液浓缩，回收乙醇；
7)浓缩液于温度≤4℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理，即得。
其中，步骤1)中所述乙醇溶液的质量百分比浓度为50-95％，优选为75％。
特别是，步骤1)中所述乙醇溶液的体积与穿心莲药材的重量之比为5-20：1，优选为8-12：1，即当穿心莲药材重量(干重)为1kg时，提取溶液乙醇溶液的体积为5-20L，当穿心莲药材重量(干重)为1g时，提取溶液乙醇溶液的体积为5-20ml。
尤其是，步骤1)中所述提取-浓缩液的重量与原料药穿心莲药材的重量之比为1-5：1，优选为1:1。
其中，步骤2)中活性炭的用量为原药材穿心莲药材量的5-20％，优选为10％；脱色处理时间45-60min；脱色处理至澄清后进行过滤。
其中，步骤3)中洗脱溶剂乙醇溶液的浓度为60-95％，优选为75％。
其中，所述大孔树脂分离混合液的重量与原料药穿心莲药材的重量之比为0.5:1～2:1，优选为2：1。
特别是，步骤3)中大孔树脂柱内所述的大孔吸附树脂的体积与穿心莲药材的重量之比为0.5:1～2:1，优选为2：1，即当穿心莲药材重量(干重)为1kg时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2L，当穿心莲药材重量(干重)为1g时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2ml。
尤其是，所述大孔吸附树脂为AB-8型大孔吸附树脂、D101型大孔树脂或HP20型大孔树脂，优选为AB-8型大孔吸附树脂。
步骤3)中所述乙醇溶液的质量百分比浓度为50-95％，优选为70％。
步骤3)中所述乙醇溶液与大孔树脂的体积之比为3-5：1。
本发明还提供了一种促进胆固醇逆转运，抗动脉粥样硬化的方法，包括向受试者给予治疗有效量的穿心莲内酯，其治疗有效量为1～100mg/kg·d，优选为10～90mg/kg·d，进一步优选为60～90mg/kg·d。
除非另外说明，本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量；“治疗有效量”是可以调整和变化的，最终由医务人员确定，其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。
与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：
1、本发明对已知化合物穿心莲内酯发掘了新的药用价值，将其用于抗动脉粥样硬化，促进细胞内胆固醇逆转运(细胞内胆固醇含量显著降低，抑制胆固醇在细胞内堆积作用明显)，并可制备成预防、调理和/或治疗抗动脉粥样硬化的药物或保健食品，可制备成治疗、调理心血管疾病的药物或保健品，从而为穿心莲内酯的应用开拓了一个新的领域。
2、本发明的系列细胞试验研究证明穿心莲内酯具有显著的预防和治疗动脉粥样硬化的作用，穿心莲内酯将吞噬到细胞内的胆固醇逆转运出细胞，降低细胞内胆固醇含量，平滑肌细胞增生的危险，抑制泡沫细胞形成，显著抑制动脉粥样硬化病变的发展。
3、本发明使用穿心莲内酯，通过口服给药途径进行了大量的动物试验，试验结果表明：穿心莲内酯能显著降低动脉中动脉粥样硬化斑块，主动脉中斑块面积显著降低，明显抑制动脉中动脉粥样硬化斑块的形成和面积，表明穿心莲内酯能明显降低细胞内胆固醇含量的作用，显著促进细胞内胆固醇逆转运的功效。
本发明的穿心莲内酯具有调节血脂，降低血中胆固醇、甘油三酯等作用，调节脂蛋白，抑制血管动脉粥样硬化，抗动脉粥样硬化性心脏病作用；
4、本发明的穿心莲内酯药理作用强，用于抗动脉粥样硬化；预防、调理和治疗心血管疾病的功效显著，见效快、毒副作用小、安全性好，能够长期服用，且可用现代药理学分析其抗动脉粥样硬化的作用机理，具有良好的药用前景。
本发明的细胞和动物实验研究证明，穿心莲内酯具有调节血脂，降低血清中胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白胆固醇，同时具有一定升高高密度脂蛋白胆固醇的作用，并具有预防动脉粥样硬化病变进展的作用。
5、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型，且服量小，使用方便，因此易于推广。
附图说明
图1为RAW264.7细胞及其脂质油红0染色变化结果图；其中：
NORMAL为正常组细胞；MODEL为模型组细胞；ATOR为阿托伐他汀钙处理细胞；B LOW为穿心莲内酯低剂量处理细胞；B HIGH为穿心莲内酯高剂量处理细胞；
图2为小鼠主动脉树油红染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。
本发明具体实施方式中使用的仪器和材料
1、试验仪器
2、试验试剂
3、试验药品
实施例1制备穿心莲内酯
将药材穿心莲(1kg)粉碎成粗粉后，加入乙醇溶液(质量浓度为75％，通常为50-95％)，加热回流提取，提取次数为2次(通常为2-3次)，每次提取时乙醇溶液的体积为8L(通常为8-12L)，即每次提取时乙醇溶液的体积与穿心莲药材的8-12倍量。
提取液进行减压浓缩处理，浓缩至无醇味，制得提取-浓缩液，其中减压浓缩的温度为70℃，相对真空度为-0.09～-0.075MPa，提取-浓缩液的重量与原料药穿心莲的重量之比为1：1(通常为1-5：1)。
向提取-浓缩液中加入活性炭，搅拌，脱色处理30min(通常为30-60min)后过滤，收集制得脱色滤液；其中，活性炭用量为原料药穿心莲量的10％(通常为5-20％)。
脱色处理时间优选为45-60min；脱色处理至澄清可以进行后续过滤。
对脱色滤液进行大孔吸附树脂柱分离，采用乙醇溶液(质量浓度为75％，通常为60-95％)为洗脱溶剂对大孔树脂柱进行洗脱，收集乙醇洗脱液并浓缩，回收乙醇，获得大孔树脂分离混合液；其中，大孔吸附树脂选择AB-8型大孔吸附树脂(还可以是D101、HP20)，所述的大孔吸附树脂的体积与穿心莲药材的重量之比为2：1(通常为0.5-2：1，即当穿心莲药材重量(干重)为2kg时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2L，当穿心莲药材重量(干重)为1g时，大孔吸附树脂的体积为0.5-2ml，优选为2:1)；收集的乙醇洗脱液浓缩至无醇味，制得的大孔树脂分离混合液，其中大孔树脂分离混合液的重量与原料药穿心莲乙醇的重量之比为0.5:1～2:1(通常为2：1)。
大孔树脂分离混合液于温度4℃(通常为≤10℃)的条件下，进行静置、沉淀处理，静置至少12h后，弃去上清液，沉淀加入少量无水乙醇，搅拌至沉淀刚好完全溶解，制得粗品复溶液；
将粗品复溶液于温度≤4℃(优选为0-4℃)的条件下，进行结晶处理(即冷藏结晶)，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯结晶粗品；
穿心莲内酯结晶粗品溶于适量的无水乙醇，加热搅拌至结晶粗品刚好完全溶解，接着加入活性炭进行脱色；然后进行过滤，滤液浓缩，回收乙醇，制得结晶-脱色-浓缩液；
将结晶-脱色-浓缩液于温度≤4℃的条件下，进行结晶处理，即得穿心莲内酯结晶。
将穿心莲内酯结晶在减压条件下，进行真空干燥，制得脱水穿心莲内酯，备用。
制备的穿心莲内酯的含量测定：
色谱条件：以乙腈-磷酸盐缓冲液(5mmol·L-1磷酸氢二钾-5mmol·L-1磷酸二氢钾1:2，磷酸调节pH＝6.80)为流动相梯度洗脱，检测波长230nm，柱温为30℃；流速为1.0mL·min-1，进样体积为10μL。经穿心莲内酯对照品比较，本发明制备的穿心莲内酯含量大于98.5％。
试验例1穿心莲内酯对RAW264.7胆固醇逆转运的影响
1、实验材料
1.1、细胞
RAW264.7细胞系于2014年9月15日从北京协和医学院细胞资源中心(其为细胞系资源的国家基础设施，NSTI的总部)购得。通过PCR和培养检查细胞系没有支原体污染用PCR鉴定其种源，用STR谱(FBI，CODIS)鉴定细胞系的鉴定结果，所有结果均可在网站(http://cellresource.cn)上查看。
细胞复苏：
将RAW264.7细胞株从液氮罐中取出，快速放入恒温水浴锅，37℃水浴，期间反复轻摇使其快速融化，将融化后的细胞悬液移入离心管中，加入1ml含10％FBS的DMEM培养基混匀，置于离心机，1000rpm，3min，弃上清，并再次加入培养基反复吹打成细胞悬液，接种于细胞培养皿中，放入37℃，5％CO2培养箱内培养，12h后观察细胞复苏贴壁情况，当细胞贴壁达80％以上时更换培养基，予以继续培养。
细胞培养：
将复苏成功的RAW264.7细胞置入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每48h更换一次新鲜培养基。当培养皿中的细胞生长覆盖面积达90％以上时即可进行细胞传代处理。细胞传代时，轻轻反复吹打混匀后将细胞悬液移入15ml离心管中，上机离心，1000rpm，3-5min，弃上清，加入新鲜培养基反复吹打成细胞悬液后接种于细胞培养皿内，继续放入培养箱培养24h后，更换新鲜培养基。
1.2、药品及试剂
穿心莲内酯：白色方棱形或片状结晶(乙醇)，含量99.7％，中国食品药品检定研究院；
阿托伐他汀钙，购自美国sigma公司(货号：PZ0001)。
氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，购自上海源叶生物公司。
油红O粉末，购自美国sigma公司(货号：O0625)。
2、实验方法
2.1、分组及给药
实验分别设空白对照组，模型组，阿托伐他汀钙组；穿心莲内酯低、高剂量组。
按5000cell/孔铺96孔板，除空白对照组(即正常组)给予DMEM培养基(10％FBS(胎牛血清))外，其余各组均建立泡沫细胞模型：即先用无血清培养基(即不含血清的DMEM培养基)预处理细胞24h，然后加入终浓度为50μg·m L-1的ox-LDL于37℃，5％CO2培养箱中孵育24h，光学显微镜镜下观察细胞形态；吸出处理液后，加入培养基、相应的处理药物，对各组细胞进行如下处理：
空白对照组：DMEM培养基(10％FBS，胎牛血清)；模型组：DMEM培养基(10％FBS)；阿托伐他汀钙组：DMEM培养基(10％FBS)+10uM阿托伐他汀钙；穿心莲内酯低剂量组：DMEM培养基(10％FBS)+10μM穿心莲内酯；穿心莲内酯高剂量组：DMEM培养基(10％FBS)+50μM穿心莲内酯。
2.2染色
孵育24h后，向各组细胞中加入细胞油红O进行染色：
1.储备液配制：称取油红O 0.5g，溶于异丙醇100ml，60℃水浴加热溶解；
2.用PBS洗板两次，吸弃；
3.用4％的多聚甲醛固定30分钟；
4.油红储备液与去离子水3:2混合，然后染色细胞15分钟，pbs洗两次。
2.3统计
显微镜下观察并拍照，照片如图1所示，其中：
NORMAL为正常组细胞；MODEL为模型组细胞；ATOR为阿托伐他汀处理细胞；BHIGH为穿心莲内酯高剂量(50μmol/L)处理细胞；B LOW为穿心莲内酯低剂量(10μmol/L)处理细胞，Image-Pro Plus 6.0图像识别软件计算红色面积。SPSS 22.0进行单因素方差分析。结果如表1所示。
表1穿心莲内酯对RAW264.7细胞的胆固醇逆转运的影响
与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001
由实验结果可知：本发明的药物穿心莲内酯对RAW264.7细胞内胆固醇的含量有明显影响，可显著降低细胞内胆固醇的含量，而且穿心莲内酯用量高，能显著降低细胞内胆固醇含量，说明穿心莲内酯可以将吞噬至细胞内的胆固醇逆转运出细胞，促进胆固醇逆转运，降低细胞内胆固醇的含量，降低和抑制泡沫细胞的形成，预防和治疗动脉粥样硬化病变的进展。
本发明的穿心莲内酯在机体脂类代谢调控中起作用，它可通过促进胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)来动员机体外周组织富余的胆固醇经由HDL(高密度脂蛋白)携带、转运至肝脏或甾体激素合成组织，并最终被利用或排出体外。在该过程中，巨噬细胞吞噬至细胞内的胆固醇，在穿心莲内酯的作用下，通过促进细胞膜上的胆固醇外排蛋白ABCA1/ABCG1将细胞你的胆固醇运输到细胞外部，再由HDL介导运回肝脏，从而被代谢。本发明穿心莲内酯通过干预巨噬细胞胆固醇逆转运，促进胆固醇通过细胞膜，从细胞内转运至细胞外，逆转运至细胞外的胆固醇被运回肝脏而代谢，从而对动脉粥样硬化病变产生抑制作用。
实施例3、穿心莲内酯对APOE小鼠的作用
1.实验材料
60只8周龄雄性APOE(-/-)小鼠，10只野生型(wide type，WT)C57BL/6J小鼠，体重22±2g，购于北京维通利华公司。
药品与实施例2的相同。
2.分组及干预方法
所有小鼠适应性喂养1周后按体重随机分组，分组如下：
正常对照组(C57组)：10只C57BL/6J小鼠，普通饮食+生理盐水灌胃。
模型对照组(Model组)：10只APOE(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+生理盐水灌胃。
阳性对照组(ATOR组，Atorvastatin组)：10只APOE(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+阿托伐他汀钙(10mg/kg/d)灌胃。
穿心莲内酯高剂量组(B high组)：10只APOE(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+穿心莲内酯(100mg/kg/d)灌胃。
穿心莲内酯中剂量组(B middle组)：10只APOE(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+穿心莲内酯(50mg/kg/d)灌胃。
穿心莲内酯低剂量组(B low组)：10只APOE(-/-)小鼠，高胆固醇饮食+穿心莲内酯(25mg/kg/d)灌胃。
高胆固醇饮食采用“西方饮食”配方，由华阜康公司提供(货号：H10141，配方如表2所示)，各组小鼠灌胃容积为10ml/kg，各组小鼠连续灌胃给药4周，以正式实验起为第1天，共28天。
表2高胆固醇饲料配方表
所有实验组小鼠均置于SPF级实验动物中心，5只/笼，小鼠房的温度保持在18-22℃之间，湿度恒定在50％左右，12h光照，12h黑暗。试验期间动物自由摄食和饮水(高压消毒灭菌水)。每周称重一次，各组按照上述分组灌胃给药，连续给药4周。
3.试验方法
连续给药28d后，小鼠禁食不禁水12h后，于第29d用异氟烷气体麻醉。麻醉小鼠摘取眼球取血，置于含分离胶的生化管中，室温放置2h后，3500r/min离心15min，取出上层血清，用无菌管分装后-80℃冰箱保存，待测。
小鼠置于冰上操作。打开腹腔，暴露心脏，沿左心室插入注射器，剪开右心房，注入预冷生理盐水(4℃)20ml，进行灌注，可见肝脏变白，心脏无血水流出，表明灌注干净。灌注完毕，剥离主动脉。部分用4％多聚甲醛固定，部分放于-80℃中保存。
4.主动脉树制备，及动脉粥样硬化斑块面积测定
小鼠由左心室主动脉开始，可明显见主动脉弓上的3个分支，直至髂主动脉分支处，取出全部主动脉。用4％多聚甲醛固定。将固定好的主动脉置于放有预冷的玻璃皿中，冰上操作，小心剥离动脉外周的脂肪。纵向剖开主动脉。蒸馏水中浸洗10min。60％异丙醇中脱水5min。油红染色1h，染色过程避光，密封。60％异丙醇观察分化至背景无色。将主动脉树固定在黑色背景上，在体视显微镜下观察并拍照。照片如图2所示。
图2为油红O染色后主动脉纵向剖开后所示动脉内侧染色照片图，红色部分为染色后的斑块区域。
主动脉树照片采用图像识别软件计算动脉粥样硬化斑块(红色)面积，结果见下表3。
表3穿心莲内酯对APOE小鼠模型主动脉中动脉粥样硬化斑块的影响(％,n＝3)
与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01，★★★P＜0.001
由上表3可见，APOE小鼠给予高脂饲料后，模型对照组小鼠的主动脉中动脉粥样硬化斑块明显多于正常对照组；阿托伐他汀钙(阳性药物)对模型小鼠的主动脉中斑块面积有明显抑制作用；与模型组比较，穿心莲内酯高、中剂量对动脉斑块面积也有较显著抑制作用，低剂量体现呈一定变化趋势，但统计学意义不明显(P>0.05)。
5.肝肾功能测定
利用Beckman AU5822全自动生化仪测定小鼠血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)的含量，测定结果如表4。
表4穿心莲内酯对APOE小鼠模型肝肾功能的影响
由表4的测定结果可知：穿心莲内酯和阳性药物对肝肾功能无显著性影响，说明穿心莲内酯和阳性药物阿托伐他汀钙在本实验使用剂量范围内无明显的肝肾毒性。
通过上述实验结果可以看出：本发明的穿心莲内酯对动脉粥样硬化斑块面积有抑制作用，降低高血脂导致的动脉硬化斑块；可用于预防和治疗动脉粥样硬化，高血脂症、心血管疾病等。在本实验使用穿心莲内酯预防和治疗的剂量范围内，对肝肾功能影响未发现显著统计学意义。动物实验剂量范围的相对安全，有助于下一步药物的临床开发与转化。
本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.穿心莲内酯在制备用于促进胆固醇逆转运的促进剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述促进剂还包括药学上可接受的载体。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述促进剂以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂形式存在。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述促进剂用于治疗或/和预防动脉粥样硬化。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述治疗或/和预防动脉粥样硬化是预防动脉粥样硬化斑块的形成；缩小动脉粥样硬化斑块面积。
6.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述促进剂用于治疗或/和预防以动脉粥样硬化为病理基础的疾病。
7.一种促进胆固醇逆转运的促进剂，其特征是，所述胆固醇逆转运促进剂包括穿心莲内酯。
8.一种促进胆固醇逆转运的促进剂穿心莲内酯的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
1)将穿心莲药材浸泡于乙醇溶液中，加热回流提取2-3次，合并回流提取液并进行浓缩处理，回收乙醇，制得提取-浓缩液；
2)向提取-浓缩液中加入活性炭，进行脱色处理30-60min；然后过滤，收集制得脱色滤液；
3)对脱色滤液进行大孔吸附树脂柱分离，采用乙醇溶液为洗脱溶剂对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱液并浓缩，回收乙醇，获得大孔树脂分离混合液；
4)大孔树脂分离混合液于温度≤10℃的条件下，进行静置、沉淀处理，静置至少12h后，弃去上清液，沉淀加无水乙醇溶解，制得粗品复溶液；
5)将粗品复溶液于温度≤4℃的条件下，进行结晶处理，结晶混合物进行离心处理，制得穿心莲内酯结晶粗品；
6)穿心莲内酯结晶粗品溶于热的无水乙醇中，接着加入活性炭进行脱色；然后进行过滤，滤液浓缩，回收乙醇；
7)浓缩液于温度≤4℃的条件下，进行结晶处理，即得。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征是，步骤1)中所述提取-浓缩液的重量与原料药穿心莲药材的重量之比为1～5:1。
10.穿心莲内酯在制备用于抗动脉粥样硬化的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20191206 |