CN110467554A - 一种丁二酰亚胺的生物制备方法 - Google Patents

一种丁二酰亚胺的生物制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括：黑曲霉菌粉与丙酮，回流提取得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩、石油醚萃取，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物硅胶柱层析得不同浓缩液；Sephadex LH‑20凝胶柱层析得不同浓缩组分；再次Sephadex LH‑20凝胶柱层析，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值在0.3‑0.5的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。本发明底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低。

Description

一种丁二酰亚胺的生物制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种 丁二酰亚胺的生物制备方法。
背景技术
丁二酰亚胺,又名琥珀酰亚胺、2，5-二吡咯烷酮,是一类重要的有机化工原料。丁二酰亚胺主要用于合成N-氯代丁二酰亚胺（NCS）、N-嗅代丁二酰亚胺 和N-碘代丁二酰亚胺（NIS），是医药与农药产品制备中重要的中间体，同时广泛用于化学分析和无氰镀银工艺。目前报道的丁二酰亚胺的合成工艺主要是由丁二酸与其它外加氮源通过酰胺化反应实现，在合成丁二酰亚胺的过程中,均需要通过额外添加氨类化合物,但是氨类化合物具有高腐蚀性,从而增加了制备丁二酰亚胺的难度。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低的丁二酰亚胺的生物制备方法。
本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明的一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
黑曲霉经麦麸发酵收集孢子粉后经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与丙酮，在一个标准大气压下、温度为40-60℃下回流提取3次，每次3h，得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩至总体积的1/5-1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的石油醚萃取得石油醚萃取液，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物；
（2）硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，用40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，同时水浴挥干石油醚后上样在已制备好的200～300目硅胶层析柱上进行常压硅胶柱洗脱；洗脱梯度为100%石油醚，石油醚:丙酮=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%丙酮等比例洗脱，流速为10～20ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩液；
（3）Sephadex LH-20凝胶柱层析
收集石油醚:丙酮=1：1之后的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，再用体积比为1:1的氯仿与甲醇混合溶剂溶解后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为20～25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩组分；
（4）再次Sephadex LH-20凝胶柱层析
通过薄层色谱层析情况选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值在0.3-0.5的流分，再次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用适量氯仿甲醇1:混合溶液溶解流分后上样凝胶层析柱；洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为20-25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；
（5）重结晶
选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值在0.3-0.5的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。
上述丁二酰亚胺的生物制备方法，其中：黑曲霉为黑曲霉xj（Aspergillus nigerxj），已于2006年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学），保藏号：CCTCC NO：M 206021。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明通过丙酮回流提取黑曲霉孢子粉，然后于石油醚萃取段经过有目的的分离程序，通过对不同薄层色谱层析的结果分析，可针对丁二酰亚胺行分离，为解决丁二酰亚胺原料生物来源提供一条新途径。且黑曲霉（Aspergillus niger xj）菌株来源可靠，对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，可作为提取5-羟甲基-呋喃甲酸的菌株。该技术生产成本低，分离提取方法操作简单，重复性好，溶剂残留少且易回收，减少了能源的消耗和废气的排放，大大降低了环境污染。
附图说明
图1是实施例1提取的丁二酰亚胺EI-MS质谱分析图
图2是实施例2提取的丁二酰亚胺的1H NMR谱图；
图3是实施例2提取的丁二酰亚胺的13C-NMR谱图。
具体实施方式
实施例1
一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
黑曲霉xj（Aspergillus niger xj），保藏号：CCTCC NO：M 206021，经麦麸发酵收集孢子粉后经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与丙酮，在一个标准大气压下、温度为40℃下回流提取3次，每次3h，得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩至总体积的1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的石油醚萃取得石油醚萃取液，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物；
（2）硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，用40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，同时水浴挥干石油醚后上样在已制备好的200～300目硅胶层析柱上进行常压硅胶柱洗脱；洗脱梯度为100%石油醚，石油醚:丙酮=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%丙酮等比例洗脱，流速为13ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩液；
（3）Sephadex LH-20凝胶柱层析
收集石油醚:丙酮=1：1之后的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，再用体积比为1:1的氯仿与甲醇混合溶剂溶解后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为20ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩组分；
（4）再次Sephadex LH-20凝胶柱层析
通过薄层色谱层析情况选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值为0.3的流分，再次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用适量氯仿甲醇1:混合溶液溶解流分后上样凝胶层析柱；洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；
（5）重结晶
选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值为0.3的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。
实施例2：
一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
黑曲霉xj（Aspergillus niger xj），保藏号：CCTCC NO：M 206021，经麦麸发酵收集孢子粉后经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与丙酮，在一个标准大气压下、温度为50℃下回流提取3次，每次3h，得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩至总体积的1/7后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的石油醚萃取得石油醚萃取液，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物；
（2）硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，用40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，同时水浴挥干石油醚后上样在已制备好的200～300目硅胶层析柱上进行常压硅胶柱洗脱；洗脱梯度为100%石油醚，石油醚:丙酮=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%丙酮等比例洗脱，流速为14ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩液；
（3）Sephadex LH-20凝胶柱层析
收集石油醚:丙酮=1：1之后的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，再用体积比为1:1的氯仿与甲醇混合溶剂溶解后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩组分；
（4）再次Sephadex LH-20凝胶柱层析
通过薄层色谱层析情况选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值为0.4的流分，再次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用适量氯仿甲醇1:混合溶液溶解流分后上样凝胶层析柱；洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；
（5）重结晶
选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值为0.4的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。
实施例3：
一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
黑曲霉xj（Aspergillus niger xj），保藏号：CCTCC NO：M 206021，经麦麸发酵收集孢子粉后经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与丙酮，在一个标准大气压下、温度为59℃下回流提取3次，每次3h，得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩至总体积的1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的石油醚萃取得石油醚萃取液，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物；
（2）硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，用40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，同时水浴挥干石油醚后上样在已制备好的200～300目硅胶层析柱上进行常压硅胶柱洗脱；洗脱梯度为100%石油醚，石油醚:丙酮=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%丙酮等比例洗脱，流速为17ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩液；
（3）Sephadex LH-20凝胶柱层析
收集石油醚:丙酮=1：1之后的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，再用体积比为1:1的氯仿与甲醇混合溶剂溶解后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为23ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩组分；
（4）再次Sephadex LH-20凝胶柱层析
通过薄层色谱层析情况选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值为0.3的流分，再次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用适量氯仿甲醇1:1混合溶液溶解流分后，上样凝胶层析柱；洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为20ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；
（5）重结晶
选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值为0.3的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。
试验例：丁二酰亚胺的鉴定：
样品的制备
取实施例1-3制得的晶体用甲醇溶解后，采用EI-MS对所述样品进行波谱解析分析。并取25mg实施例1-3制得的晶体用0.5ml氘代甲醇溶解，转入核磁管进行NMR扫描，得到氢谱碳谱图。
②EI-MS分析条件
质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1482Ｖ；接口温度280℃；质量范围29～500amu。溶剂延迟时间：5min。
③NMR分析条件
核磁共振：采用ID-PFG探头，扫描宽度（sw）16.0 ppm，中心频率（O1P）：4.9 ppm;
脉冲序列s1pul;时间域数据点（td）：32 K；测定温度：303 K；延迟时间（dl）：20 s；采样次数（ns）：32次；窗函数（lh）：0.3 Hz。
④结论：通过EI-MS与NMR检测，从黑曲霉xj（Aspergillus niger xj）菌体分离提取得到的样品EI-MS显示为丁二酰亚胺（Succinimide）。经氢谱碳谱鉴定为丁二酰亚胺，结果见图1、2、3。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括以下步骤：
（1）粗提物的制备
黑曲霉经麦麸发酵收集孢子粉后经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与丙酮，在一个标准大气压下、温度为40-60℃下回流提取3次，每次3h，得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩至总体积的1/5-1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的石油醚萃取得石油醚萃取液，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物；
（2）硅胶柱层析
将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，用40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，同时水浴挥干石油醚后上样在已制备好的200～300目硅胶层析柱上进行常压硅胶柱洗脱；洗脱梯度为100%石油醚，石油醚:丙酮=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%丙酮等比例洗脱，流速为10～20ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩液；
（3）Sephadex LH-20凝胶柱层析
收集石油醚:丙酮=1：1之后的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，再用体积比为1:1的氯仿与甲醇混合溶剂溶解后进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为20～25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干，得不同浓缩组分；
（4）再次Sephadex LH-20凝胶柱层析
通过薄层色谱层析情况选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值在0.3-0.5的流分，再次进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，用适量氯仿甲醇1:混合溶液溶解流分后上样凝胶层析柱；洗脱体系为氯仿:甲醇=1:1，流速为20-25ml/min，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；
（5）重结晶
选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值在0.3-0.5的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。
2.如权利要求1所述丁二酰亚胺的生物制备方法，其中：黑曲霉为黑曲霉xj（Aspergillus niger xj），保藏号：CCTCC NO：M 206021。
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冉江: "黑曲霉抗菌活性组分分离及作用机制研究", 《贵州大学硕士研究生学位论文》 *

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