CN110437455B - 一种用于稳定固相化蛋白的高分子聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于稳定固相化蛋白的高分子聚合物及其制备方法和应用。所述的高分子聚合物为式I所示的甲氧基聚乙二醇‑十六烷基醇‑牛血清白蛋白‑葡聚糖复合物。所述制备方法包括如下步骤：1)合成氨基化葡聚糖；2)制备甲氧基聚乙二醇‑对硝基苯基氯甲酸酯和十六烷基醇‑对硝基苯基氯甲酸酯复合物；3)合成甲氧基聚乙二醇‑十六烷基醇‑葡聚糖复合物；4)制备甲氧基聚乙二醇‑十六烷基醇‑牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)‑葡聚糖复合物。本发明所提供的高分子聚合物单独或制备成复溶液均能够大大增强试剂稳定性，且制备方法相对比较简单，工艺路线非常成熟，应用非常简单，配置方便，易于储存。
Figure DDA0003313032170000011

Description

一种用于稳定固相化蛋白的高分子聚合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种用于稳定固相化蛋白的高分子聚合物，还涉及该高分子聚合物的制备方法以及在稳定固相化蛋白中的应用。本发明属于生物化学技术领域。
背景技术
在生化检测(胶乳免疫比浊)、免疫分析(磁微粒发光、板式化学发光、POCT)、蛋白芯片、生物传感器和生物芯片中，抗原-抗体特异性结合被广泛应用,生物分子工程、材料化学与交联剂化学的进步极大地促进了抗体固定化技术的发展，因此抗体的固定化已经发展的非常成熟，但固相化蛋白的稳定性是研发诊断试剂的重要环节。抗体可以通过物理吸附、共价偶联和亲和相互作用固定到不同类型的固相表面。抗体固定化的目标是以一种正确的空间取向将抗体固定到固相表面，在完全保留抗体构象和活性的同时最大化抗原的结合能力，但稳定固相化蛋白也至关重要，这对固相化蛋白能否应用于实际非常关键。
抗体通常是分子量大约为150kDa的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)，其分子三维大小约为14×10×4nm，含有两个Fab片段和一个Fc片段，两个Fab片段由铰链区的二硫键结合在一起形成F(ab’)2片段。不同抗体的Fab片段其氨基酸组成、等电点以及物理结构均有较大差异，这对抗体在固相表面的取向起决定作用，与此同时抗体的稳定尤为重要。
常用的固定抗体的固相材料包括胶乳微球、磁微粒、硝酸纤维膜、金属表面，其中聚苯乙烯是最广泛应用于体外检测的固相载体，包括生化检测、免疫检测或分析、蛋白芯片、POCT。为了改善固相抗体稳定性，很多研究者通过对固相载体进行修饰从而提高其亲水性及生物相容性从而稳定固相材料固定化的抗体。因此，这相对比较困难，并且增加实际应用中的复杂性以及大大增加生产成本。
与传统稳定固定化抗体方法相比较，传统方法通常通过调试缓冲溶液、盐离子种类及浓度、调试糖种类、加入蛋白保护剂和表面活性剂，在调试过程中步骤繁琐、非常耗时、在稳定性方面改善非常有限。与此同时随着市场竞争压力越来越激烈，因此开发质量高、成本节约型的稳定固相化蛋白的产品在市场的竞争中变得尤为重要。
发明内容
鉴于对传统固相材料修饰来稳定固相化蛋白有一定难度、步骤繁琐、不利于生产、大大升高成本和不能进行跨平台应用的局限性，传统稳定固相表面蛋白的方法过程中步骤繁琐、非常耗时、在稳定性方面改善非常有限。本发明的目的是提供一种新型高分子聚合物及其制备方法，使用该高分子聚合物对固相化蛋白保护大大提升，同时使用简单，能够降低生产过程中繁琐性，可以跨平台使用，大大减低生产成本，
为了实现上述目的及其相关目的，本发明采用了以下技术手段：
一方面，本发明提供了一种新型的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物，其具有式I所示的结构：
Figure GDA0003313032150000021
另一方面，本发明还提供了一种制备所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物的方法，包括以下步骤：
1)将葡聚糖氧化开环生成醛基，然后与赖氨酸反应，合成氨基化葡聚糖；
2)分别制备甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸酯复合物和十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸酯复合物；
3)将步骤1)的氨基化葡聚糖和步骤2)的甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂复合物和十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂复合物混合制备甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物；
4)将步骤3)中的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物与牛血清白蛋白(BSA)合成最终的高分子化合物，即甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物。
其中，优选的，步骤1)包括以下步骤：
1-1)将葡聚糖溶于乙酸缓冲溶液中，磁力搅拌，充分溶解，加入高碘酸钠，避光，室温反应；随后室温下加入亚硫酸钠终止反应，用超滤管进行超滤处理，脱除小分子后，将醛基化葡聚糖用碳酸缓冲溶液复溶至原体积，以备后续使用；
1-2)将赖氨酸加入到醛基化葡聚糖中，搅拌均匀，室温反应，反应完成后，用盐酸调节溶液pH到7.5，在通风橱中将氰基硼氢化钠加入葡聚糖衍生物中，室温反应，最后加入乙醇胺进行封闭，反应完成后超滤纯化，得到氨基化葡聚糖，以供后续使用。
其中，优选的，步骤1-1)中葡聚糖分子量为10KDa-500KDa，优选为70Kda；乙酸缓冲溶液浓度为0.01-0.1M，pH为3.6-6，优选为0.05M，pH为4.7；高碘酸钠与葡聚糖的质量比为1：20到4：1，优选为4：5；亚硫酸钠与高碘酸钠的质量比为1：1到10：1，优选为11：10；步骤1-2)中赖氨酸与醛基化葡聚糖的质量比为2:1到20：1，优选为5：1；氰基硼氢化钠与醛基化葡聚糖的质量比为1：10到1：1，优选为2：5。
其中，优选的，步骤2)包括以下步骤：
2-1)将甲氧基聚乙二醇溶于四氢呋喃溶剂中，加入三乙醇胺，搅拌均匀，将对硝基苯基氯甲酸脂加入到溶液中，搅拌均匀，室温反应，反应完成后正己烷沉淀，过滤后再用二氯甲烷进行重新溶解，用5％w/v柠檬酸洗涤，有机相用无水氯化镁进行干燥，过滤后，减压浓缩。通过正己烷进行沉淀，在4℃放置12h，随后进行过滤，真空干燥，得到甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂；
2-2)将十六烷基醇溶于四氢呋喃溶剂中，加入三乙醇胺，搅拌均匀，加入对硝基苯基氯甲酸脂，搅拌均匀，室温反应，用乙醇进行沉淀，三乙胺小分子溶解于乙醇中，过滤除去，得到粗品，用二氯甲烷进行重新溶解，用5％w/v柠檬酸洗涤，有机相用无水氯化镁进行干燥，过滤后，减压浓缩；通过滴加乙醇再次进行沉淀，在4℃放置12h，随后进行过滤，真空干燥，得到十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂，以备后续使用。
其中，优选的，所述步骤2-1)中，甲氧基聚乙二醇分子量从200到20000，优选的，甲氧基聚乙二醇分子量为200、800、2000、5000、8000、20000，更优选为20000；三乙醇胺在溶液中含量从0.1％(v/v)到5％(v/v)，优选为1％(v/v)；对硝基苯基氯甲酸脂与甲氧基聚乙二醇质量比从1：10到1：1，优选为2：5；步骤2-2)中三乙醇胺在溶液中含量从0.1％(v/v)到5％(v/v)，优选为0.8％(v/v)；对硝基苯基氯甲酸脂与十六烷基醇质量比为1：1。
其中，优选的，步骤3)包括以下步骤：
取步骤1)制备完成的氨基化葡聚糖，将步骤2)制备的甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂加入氨基化葡聚糖溶液中，将步骤2)制备的十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂溶解于丙酮中，随后缓慢加入到氨基化葡聚糖中，充分搅拌，室温反应2h，经过透析除去未反应完成的甲氧基聚乙二醇和十六烷基醇以及丙酮有机物，浓缩，得到甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物，以备后续使用。
其中，优选的，所述步骤3)中，氨基葡聚糖与甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂的质量比为1：15到15：1，优选为2：25，氨基化葡聚糖与十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂的质量比为1：50到1：1，优选为1：25。
其中，优选的，步骤4)包括以下步骤：
将步骤3)制备的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液透析换液，浓缩后，加入牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)混合均匀，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，充分混合，室温反应2h，通过选用100KD透析袋进行透析除去游离BSA和其他小分子，得到甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物。
其中，优选的，所述步骤4)中，BSA所用质量为2mg-18mg，优选为10mg；EDC.HCl所用质量为2mg-20mg，优选为5mg；MES缓冲溶液pH＝4.5-6.5，优选为20mmol/L，pH＝4.7。
再一方面，本发明还提供了一种用于稳定固相化蛋白的复溶液，包括以下原料：缓冲溶液、电解质、防腐剂以及甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物；
其中，缓冲溶液包括碳酸钠-碳酸氢钠、PBS、TRIS-HCl、甘氨酸-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、MOPs或TAPs缓冲溶液，pH＝4-9，优选为50mM pH＝7.8甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液；，
其中，电解质包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾以及羧酸铵中的一种或者二种任意组合的电解质，优选为150mmol/L氯化钠；
其中，防腐剂包括叠氮钠、proClin 300、proClin 950、苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸钾以及KroVin 300中一种或者二种任意组合的防腐剂，优选为0.1％KroVin 300；
其中，甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物的浓度优选为5mg/ml。
再一方面，本发明还提供了所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物或所述的复溶液在稳定固相化载体表面蛋白中的应用。
即本发明所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物即可以直接加入成品固相化蛋白溶液中，即直接加入现有胶乳试剂中，或者以一种简单地复溶液形式进行使用。
其中，优选的，所述的固相化载体包含聚苯乙烯胶乳微球、磁微粒、聚苯乙烯微球、胶体金、聚苯乙烯荧光微球，优选为聚苯乙烯胶乳微球。
其中，优选的，所述的所述固相化载体表面蛋白(固相化蛋白)包含抗体和蛋白载体，抗体包含羊单抗、鼠单抗、兔单抗、羊多抗、兔多抗、鼠多抗、人多抗，蛋白载体包含小分子偶联牛血清白蛋白载体或蛋白载体包含亲和素和链霉亲和素。
再一方面，本发明还提供了所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物或所述的复溶液在制备体外诊断试剂中的应用。
在本发明中，根据蛋白三维结构的稳定性的作用力主要是弱的相互作用或称非共价键或称为次级键，包括：氢键、范德华力、疏水作用、离子键，这对稳定蛋白构象方面也起着重要的作用。
氢键在稳定蛋白的结构中起着极其重要的作用，多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成氢键稳定蛋白二级结构的主要作用力，另外氢键还可以在侧链与侧链、侧链与其他分子、侧链与介质水、主链肽键与侧链或主链肽键与其他分子之间形成。大多数蛋白分子所采取的折叠策略是主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键，如a螺旋、β折叠，保持大多数能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面与水介质结合。范德华力是一种很弱的作用力，而且随非共价键合原子与分子间距离的6次方的倒数而变化，虽然范德华力是很弱，但范德华相互作用数量大，并且具有加和效应。疏水作用是将水介质中球状蛋白的折叠趋向于把疏水残基埋藏在分子内部，并不是疏水基团之间有什么吸引力，而是疏水基团和疏水侧链为避开水的需要而被迫接近。盐键是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用，在生理pH下，蛋白质的酸性氨基酸的侧链可以解离成负离子，碱性氨基酸的侧链可以解离成正离子。在大多数情况下，这些基团分布在球状蛋白分子标满，而与介质水分子发生电荷-偶极之间的相互作用，形成排列有序的水化层，这对稳定蛋白的构象有一定的作用。根据非共价相互作用力设计新型高分子，稳定固相化蛋白。本发明通过制备高分子甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物，目的是为了提高固定化蛋白的稳定性，可以跨平台使用，使用方便，大大节约生产成本。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、制备方法相对比较简单，工艺路线非常成熟，应用非常简单，配置方便，易于储存。
2、大大提升固相化载体表面蛋白稳定性，通过新型高分子甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物提供大量氢键以及离子键、疏水作用、支撑结构对蛋白稳定起关键作用，葡聚糖是多羟基复合物，第一方面提供多元糖稳定蛋白，第二方面多羟基线性复合物提供分子骨架；甲氧基聚乙二醇接枝到葡聚糖增加三维网状结构，同时大幅度提升与蛋白氢键的相互作用；烷基链作用充当疏水表面活性剂的部分，降低水的张力；牛血清白蛋白是为了填充胶乳微球表面的疏水区，占据位点，支撑蛋白，防止蛋白三维结构变化；赖氨酸化表面羧基可以形成区域化离子键，增加蛋白表面水水化层，几种作用力相互作用形成网状结构作用，大大增加固相化蛋白的稳定性。
附图说明
图1为制备氨基化葡聚糖的化学反应式；
图2为制备甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂的化学反应式；
图3为制备十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂的化学反应式；
图4为制备甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物的化学反应式；
图5为制备甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物的化学反应式；
图6为试剂A、B、C校准曲线；
图7为30天加速低值质控变化率图；
图8为30天加速高值质控变化率图。
具体实施方式
以下通过具体实例说明发明的实施方式，本领域技术人员可以通过本发明阐述的内容简单地明白本发明的优点与作用。在没有背离本发明的思路下，各个细节可以进行各种修饰与变化。
进一步阐述本发明具体实施方式之前，本发明的保护范围不局限于下列特定的具体实施方案；同时还应该理解，本发明实施案例中使用的术语目的是阐述特定具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当本发明给出的数值范围时，应当认为，除了本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值都可以选用。除了另外定义，本发明中使用的所有技术、科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、实验方法都是采用本技术领域常规的生物化学、糖类化学、胶体化学、高分子化学和有机化学以及相关领域的常规技术。本发明中的技术在现有的文献以及书籍中已经详细的说明，具体可以参考生物化学,第三版，王镜岩等；糖类化学，2005年化学工业出版社出版的图书，郭振楚；Dextran，AmershamBiosciences，A.N.de Belder；Bioconjugatetechniques，ThirdEdition,Academic Press,2013,Greg T.Hermanson等；ChemistryofBioconjugates，First Edition，2014，RavinNarain，JohnWiley&Sons等；Wikipedia等。
进一步说明，本发明所用的原料均为市售产品，其中羧基胶乳微球溶液来自日本JSR公司；羊抗肌红蛋白(MYO)多克隆抗体为利德曼自产，聚苯乙烯胶乳微球购自日本JSR公司、葡聚糖、甲氧基聚乙二醇和十六烷基醇购自Aladdin公司、Trash-Tech公司等；所使用常规化学试剂，例如三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、三乙胺、四氢呋喃、赖氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)均购自Sigma；牛血清白蛋白购自罗氏；生化检测仪为贝克曼AU680，。
实施例1新型高分子聚合物甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖(mPEG-BSA-Hexadecanol-Dextran,PBHD)的制备
1、氨基化葡聚糖制备
制备流程图如图1所示。
1-1)将1g葡聚糖T70溶于10ml乙酸缓冲溶液中，磁力搅拌，充分溶解，加入0.8g高碘酸钠，避光，室温反应30min。随后加入1.1g亚硫酸钠终止高碘酸钠，室温反应10min，之后用10KD超滤管进行超滤处理，用pH＝9的15mMol/L碳酸缓冲溶液换液三次，复溶至10ml体积，以备后续使用。
1-2)将5g赖氨酸加入到10ml醛基化葡聚糖中，搅拌均匀，室温反应2h，反应完成后，将pH用1N盐酸调节到7.5，在通风橱中将0.4g氰基硼氢化钠加入葡聚糖衍生物中，避光室温反应30min，最终加入0.5ml 1mol/L乙醇胺进行封闭，室温反应30min，用10KD超滤管进行超滤处理，用pH＝7.4的15mmol/L磷酸缓冲溶液换液三次，得到氨基化葡聚糖(赖氨酸化葡聚糖)，稀释至100ml溶液，以供后续使用；
葡聚糖(Dextran)：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.06(d,J＝6.6Hz,1H),4.43(d,J＝7.0Hz,1H),4.31(d,J＝6.8Hz,1H),4.21(s,1H),4.15(dtd,J＝7.4,5.3,2.0Hz,1H),4.09(dd,J＝8.2,6.6Hz,1H),3.86(dddd,J＝8.2,6.9,6.1,2.0Hz,1H),3.82–3.69(m,2H),3.47(dd,J＝11.5,5.3Hz,1H).
醛基化葡聚糖(Aldehyde Dextran)：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.64(d,J＝5.7Hz,1H),8.28(s,1H),5.21(d,J＝6.8Hz,1H),5.15(d,J＝7.0Hz,1H),4.91(s,1H),4.55–4.45(m,2H),4.20–4.04(m,3H),3.96(dt,J＝6.2,5.4Hz,1H),3.85–3.76(m,2H),3.68(td,J＝7.2,6.0Hz,1H),3.65–3.52(m,3H),3.47(dd,J＝11.7,5.3Hz,1H).
氨基化葡聚糖(LysinatedDextran)：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.59(d,J＝5.7Hz,1H),8.28(d,J＝4.8Hz,2H),7.25(t,J＝4.4Hz,1H),6.18(dd,J＝7.1,5.9Hz,1H),6.09(dd,J＝7.1,5.9Hz,1H),5.21(d,J＝6.7Hz,2H),4.92(s,1H),4.59(dt,J＝8.0,5.3Hz,1H),4.50–4.42(m,3H),4.35–4.23(m,4H),4.20(d,J＝6.7Hz,1H),4.15(s,1H),4.13–4.05(m,2H),4.08–4.00(m,2H),4.00–3.68(m,10H),3.64–3.54(m,3H),3.54(td,J＝7.3,6.1Hz,1H),3.51–3.43(m,2H),3.33–3.20(m,2H),3.14(dtd,J＝14.3,6.4,4.4Hz,1H),1.84(dtd,J＝13.7,6.5,4.9Hz,1H),1.81–1.70(m,1H),1.66–1.54(m,1H),1.52–1.27(m,3H).
本实施例中NMR谱是用Gemini 500MHz光谱仪记录的(VarianAssociates Inc.NMRInstrucments,PaloAlto,CA)。1H NMR使用氘代氯仿(7.26ppm)作参考线，接近30mg的样品溶于0.8ml的溶剂中，脉冲长度为4.5秒，弛豫延迟为15秒，下同。
2.制备甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸酯复合物和十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸酯复合物
2-1)将1g甲氧基聚乙二醇2000溶于10ml四氢呋喃溶剂中，加入0.1ml三乙醇胺，搅拌均匀，将0.1g对硝基苯基氯甲酸脂加入到溶液中，搅拌均匀，室温反应12h，反应完成后用20ml正己烷沉淀，得到粗品，用15ml二氯甲烷进行重新溶解，用45ml5％柠檬酸洗涤，有机相用无水氯化镁进行干燥，过滤后，减压浓缩体积至10ml。通过滴加50ml正己烷进行沉淀，在4℃放置12h，随后进行过滤，真空干燥，得到大约0.6g甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂。制备流程图如图2所示。
2-2)将1g十六烷醇溶于10ml四氢呋喃溶剂中，加入0.08ml三乙醇胺，搅拌均匀，将1g对硝基苯基氯甲酸脂加入到溶液中，搅拌均匀，室温反应12h，用乙醇进行沉淀，三乙胺小分子溶解于乙醇中，过滤除去，得到粗品，用15ml二氯甲烷进行重新溶解，用45ml 5％柠檬酸洗涤，有机相用无水氯化镁进行干燥，过滤后，减压浓缩体积至10ml。通过滴加50ml乙醇再次进行沉淀，在4℃放置12h，随后进行过滤，真空干燥，得到大约0.7g十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂，以备后续使用。制备流程图如图3所示。
甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸酯(mPEG-p-nitrophenyl carbonate)
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.27–8.21(m,2H),7.42–7.36(m,2H),4.42–4.36(m,2H),3.73(t,J＝6.2Hz,2H),3.67(td,J＝2.2,1.0Hz,86H),3.65–3.52(m,6H),3.39(s,3H).
十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂(hexadecyl(4-nitrophenyl)carbonate)：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.26–8.21(m,2H),7.44–7.37(m,2H),4.21(t,J＝6.1Hz,2H),1.77–1.68(m,2H),1.40–1.32(m,2H),1.35–1.23(m,24H),0.93–0.84(m,3H).
3、合成甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物
取10ml已经制备完成的氨基化葡聚糖，将0.08g甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂加入氨基化葡聚糖溶液中，将0.04g十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂溶解于2ml丙酮中，随后缓慢加入到氨基化葡聚糖中，充分搅拌，室温反应2h，用30KDa透析袋透析36h，用pH4.7MES缓冲溶液进行换液，换液三次后，浓缩至10ml，得到甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物，以备后续使用。制备流程图如图4所示。
甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖(mPEG-Hexadecanol-dextran)：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.34(d,J＝5.7Hz,2H),8.28(d,J＝4.9Hz,4H),7.25(t,J＝4.4Hz,2H),5.69(ddd,J＝7.0,5.8,1.1Hz,1H),5.60(ddd,J＝7.1,5.8,1.2Hz,1H),5.24–5.18(m,4H),4.59(dt,J＝8.0,5.3Hz,2H),4.57–4.43(m,9H),4.40(dd,J＝8.0,6.7Hz,2H),4.21(d,J＝6.8Hz,1H),4.15–3.94(m,10H),3.90–3.79(m,16H),3.77–3.67(m,6H),3.71–3.65(m,2H),3.68–3.59(m,4H),3.62–3.55(m,4H),3.57–3.46(m,103H),3.42(d,J＝6.2Hz,1H),3.31(d,J＝3.5Hz,6H),3.27–3.06(m,5H),1.85–1.67(m,4H),1.56–1.36(m,4H),1.39–1.15(m,37H).
4、甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物
将上述制备的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物10ml中加入1ml10mg/ml牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin,BSA)混合均匀，随后加入5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，充分混合，室温反应2h，用100KDa透析袋透析36h，12h更换一次水溶液，得到甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物，制备流程图如图5所示。
浓缩至10ml，补加0.1％proclin 300防腐剂，即为10％甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物溶液，2-8℃保存。
实施例2一种稳定固相化蛋白的复溶液的制备
本发明中复溶液，配置如下：称取甘氨酸-盐酸375mg溶于80ml水中，随后加入0.8g氯化钠，加入0.1ml KroVin 300，取5ml 10％本发明实施例1制备的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物(PBHD)加入溶液中，充分搅拌，混合均匀，用4NNaOH调试pH至7.4，定容至100ml，4℃保存。
实施例3固相化抗体稳定性验证
将MYO R2胶乳试剂，即为试剂A，取8ml，20000g 30min离心后用4ml实施例2制备的复溶液进行复溶，20％功率进行超声复溶，分散均匀，42℃进行老化4h，即为试剂B，再取8mlMYO R2胶乳试剂直接加入0.4ml10％甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物溶液(实施例1制备)，混合均匀，即为试剂C。随后分别取R120ml三支，分别为试剂a、b、c，与试剂A、B、C对应，进行37摄氏度加速30天试验。
用AU680生化仪进行检测，试剂参数设置完成后，将试剂A、B、C分别放入仪器中进行测试。反应过程如下：R1试剂与校准品混合均匀，37℃孵育5分钟，之后加入R2试剂，37℃孵育12s后开始读取吸光度值，即A1，反应4分钟后读取吸光度值，即A2，计算吸光度变化值δ＝A2-A1；以δ为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制校准曲线，试剂A、B、C校准曲线如图6所示，数据如表1所示：
表1
Figure GDA0003313032150000111
37℃加速老化测试低值与高值质控的稳定性测试：
稳定性测试，低值和高值质控分别分装1ml/支，各8支，分别冻存于-20℃。将试剂a、试剂b、试剂c分别分装2ml/支，各7支，放入4℃冰箱。将试剂A、试剂B、试剂C分别分装1ml/支，各7支，都放入37℃恒温箱中。分别在第1天、第4天、第8天、第12天、第16天、第24天、第30天各取出一支本发明和对照试剂的低值高值质控和试剂进行检测。稳定性对比数据表如下，即表2，低值质控变化率图如图7，高值质控变化率图如图8。
表2
Figure GDA0003313032150000112
Figure GDA0003313032150000121
综上所述，本发明制备的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物(PBHD)即可以直接加入成品固相化蛋白溶液中，即直接加入现有胶乳试剂中，或者一种简单地复溶液形式进行使用，均可大幅度改善试剂的稳定性。
上述实施案例仅仅作为例子说明发明的原理以及特点，然而并不是限制本发明。任何相关领域技术的人士皆可在不违背本发明的思路以及范畴内，对上述实施案例进行修饰与改变。因此，凡所属技术领域中具有通常知识在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰与改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (22)

1.甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白(BSA)-葡聚糖复合物，其特征在于，具有式I所示的结构：
Figure FDA0003313032140000011
2.一种制备权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将葡聚糖氧化开环生成醛基，然后与赖氨酸反应，合成氨基化葡聚糖；
2)分别制备甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸酯复合物和十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸酯复合物；
3)将步骤1)的氨基化葡聚糖和步骤2)的甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂复合物和十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂复合物混合制备甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物；
4)将步骤3)中的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物与牛血清白蛋白(BSA)合成最终的高分子化合物，即甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)包括以下步骤：
1-1)将葡聚糖溶于乙酸缓冲溶液中，磁力搅拌，充分溶解，加入高碘酸钠，避光，室温反应；随后室温下加入亚硫酸钠终止反应，用超滤管进行超滤处理，脱除小分子后，将醛基化葡聚糖用碳酸缓冲溶液复溶至原体积，以备后续使用；
1-2)将赖氨酸加入到醛基化葡聚糖中，搅拌均匀，室温反应，反应完成后，用盐酸调节溶液pH到7.5，在通风橱中将氰基硼氢化钠加入所述溶液中，室温反应，最后加入乙醇胺进行封闭，反应完成后超滤纯化，得到氨基化葡聚糖，以供后续使用。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤1-1)中葡聚糖分子量为10KDa-500KDa；乙酸缓冲溶液浓度为0.01-0.1M，pH为3.6-6；高碘酸钠与葡聚糖的质量比为1：20到4：1；亚硫酸钠与高碘酸钠的质量比为1：1到10：1；步骤1-2)中赖氨酸与醛基化葡聚糖的质量比为2:1到20：1；氰基硼氢化钠与醛基化葡聚糖的质量比为1：10到1：1。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤1-1)中葡聚糖分子量为70Kda；乙酸缓冲溶液浓度为0.05M，pH为4.7；高碘酸钠与葡聚糖的质量比为4：5；亚硫酸钠与高碘酸钠的质量比为11：10；步骤1-2)中赖氨酸与醛基化葡聚糖的质量比为5：1；氰基硼氢化钠与醛基化葡聚糖的质量比为2：5。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)包括以下步骤：
2-1)将甲氧基聚乙二醇溶于四氢呋喃溶剂中，加入三乙醇胺，搅拌均匀，将对硝基苯基氯甲酸脂加入到溶液中，搅拌均匀，室温反应，反应完成后正己烷沉淀，过滤后再用二氯甲烷进行重新溶解，用5％w/v柠檬酸洗涤，有机相用无水氯化镁进行干燥，过滤后，减压浓缩；通过正己烷进行沉淀，在4℃放置12h，随后进行过滤，真空干燥，得到聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂；
2-2)将十六烷基醇溶于四氢呋喃溶剂中，加入三乙醇胺，搅拌均匀，加入对硝基苯基氯甲酸脂，搅拌均匀，室温反应，用乙醇进行沉淀，三乙胺小分子溶解于乙醇中，过滤除去，得到粗品，用二氯甲烷进行重新溶解，用5％w/v柠檬酸洗涤，有机相用无水氯化镁进行干燥，过滤后，减压浓缩；通过滴加乙醇再次进行沉淀，在4℃放置12h，随后进行过滤，真空干燥，得到十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂，以备后续使用。
7.如权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述步骤2-1)中，甲氧基聚乙二醇分子量从200到20000；三乙醇胺在溶液中含量从0.1％v/v到5％v/v；对硝基苯基氯甲酸脂与甲氧基聚乙二醇质量比从1：10到1：1；步骤2-2)中，三乙醇胺在溶液中含量从0.1％v/v到5％v/v；对硝基苯基氯甲酸脂与十六烷基醇质量比为1:1。
8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述步骤2-1)中，甲氧基聚乙二醇分子量为200、800、2000、5000、8000、20000；三乙醇胺在溶液中含量为1％v/v；对硝基苯基氯甲酸脂与甲氧基聚乙二醇质量比为2：5；步骤2-2)中，三乙醇胺在溶液中含量为0.8％v/v；对硝基苯基氯甲酸脂与十六烷基醇质量比为1：1。
9.如权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述步骤2-1)中，甲氧基聚乙二醇分子量为20000。
10.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)包括以下步骤：
取步骤1)制备完成的氨基化葡聚糖，将步骤2)制备的甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂加入氨基化葡聚糖溶液中，将步骤2)制备的十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂溶解于丙酮中，随后缓慢加入到氨基化葡聚糖中，充分搅拌，室温反应2h，经过透析除去未反应完成的甲氧基聚乙二醇和十六烷基醇以及丙酮有机物，浓缩，得到甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物，以备后续使用。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，氨基化葡聚糖与甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂的质量比为1：15到15：1，氨基化葡聚糖与十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂的质量比为1：50到1：1。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，氨基化葡聚糖与甲氧基聚乙二醇-对硝基苯基氯甲酸脂的质量比为2：25，氨基化葡聚糖与十六烷基醇-对硝基苯基氯甲酸脂的质量比为1：25。
13.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)包括以下步骤：
将步骤3)制备的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-葡聚糖复合物用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲溶液透析换液，浓缩后，加入牛血清白蛋白(BSA)混合均匀，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，充分混合，室温反应2h，通过选用100KD透析袋进行透析除去游离BSA和其他小分子，得到甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物。
14.如权利要求13所述制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，BSA所用质量为2mg-18mg；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐所用质量为5mg；MES缓冲溶液pH＝4.5-6.5。
15.如权利要求14所述制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，BSA所用质量为10mg；EDC.HCl所用质量为5mg；MES缓冲溶液浓度为20mmol/L,pH＝4.7。
16.一种用于稳定固相化蛋白的复溶液，其特征在于，包括以下原料：缓冲溶液、电解质、防腐剂以及权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物；
其中，缓冲溶液包括碳酸钠-碳酸氢钠、PBS、TRIS-HCl、甘氨酸-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、MOPs或TAPs缓冲溶液，pH＝4-9；
其中，电解质包括氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾以及羧酸铵中的一种或者二种任意组合的电解质；
其中，防腐剂包括叠氮钠、proClin 300、proClin 950、苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸钾以及KroVin 300中一种或者二种任意组合的防腐剂。
17.如权利要求16所述的用于稳定固相化蛋白的复溶液，其特征在于，其中，缓冲溶液为50mM pH＝7.8甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液；其中，电解质为150mmol/L的氯化钠；其中，甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物的浓度为5mg/ml；其中，防腐剂为0.1％KroVin 300。
18.权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物或权利要求16所述的复溶液在稳定固相化载体表面蛋白中的应用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的固相化载体包含磁微粒、聚苯乙烯微球、胶体金，其中所述的聚苯乙烯微球包括聚苯乙烯胶乳微球、聚苯乙烯荧光微球。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的固相化载体为聚苯乙烯胶乳微球。
21.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的所述固相化载体表面蛋白包含抗体和蛋白载体，抗体包含羊单抗、鼠单抗、兔单抗、羊多抗、兔多抗、鼠多抗、人多抗，蛋白载体包含小分子偶联牛血清白蛋白载体或者蛋白载体包含亲和素和链霉亲和素。
22.权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇-十六烷基醇-牛血清白蛋白-葡聚糖复合物或权利要求16所述的复溶液在制备体外诊断试剂中的应用。
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