CN110314414A - 免疫亲和层析柱填料、免疫亲和层析柱、凝血因子xiii的分离纯化方法及其应用 - Google Patents

免疫亲和层析柱填料、免疫亲和层析柱、凝血因子xiii的分离纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种免疫亲和层析柱填料、免疫亲和层析柱、凝血因子XIII的分离纯化方法及其应用，涉及功能性凝血因子制备技术领域。该免疫亲和层析柱填料主要由抗凝血因子XIII的单克隆抗体与亲和层析介质经偶联得到。根据抗原抗体高特异性选择的原理，包含该填料的免疫亲和层析柱在进行凝血因子XIII纯化的过程中，抗凝血因子XIII的单克隆抗体能够特异性的吸附凝血因子XIII，从而有效提高凝血因子XIII的纯度以及提取效率，其制备得到的凝血因子XIII纯度高达95％以上，可以广泛的应用于粘弹性凝血分析检测试剂的制备中。

Description

免疫亲和层析柱填料、免疫亲和层析柱、凝血因子XIII的分离 纯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及功能性凝血因子制备技术领域，尤其是涉及一种免疫亲和层析柱填料、免疫亲和层析柱、凝血因子XIII的分离纯化方法及其应用。
背景技术
粘弹性凝血分析检测，是通过将微量全血样本置于体外模拟体内生理止血，全面动态观察凝血及纤溶全过程，能快速完整地检测从凝血开始至血凝块形成及稳固的全过程，实时监测血液凝固状态的变化，并提供有关凝血及纤溶的性质和动态方面的资料，从而分析凝血系统各组分的功能及相互作用。在粘弹性凝血分析检测的过程中，需要凝血因子XIII(FXIII)作为一种激活剂，该凝血因子XIII的分子量为325.8KD，是由2个A亚单位(83.2KD)和2个B亚单位(79.7KD)以非共价键结合而成的四聚体，用以激活纤维蛋白原进而发生的血液凝结。因此，凝血因子XIII在粘弹性凝血分析检测过程中起着至关重要的作用。
然而，现有的凝血因子纯化方法，仍采用经典的沉淀法，提取效率低、得率低，产物纯度低，极大地影响了FXIII的应用效果。同时，现有的粘弹性凝血分析中所使用的FXIII均提取自人的血液，FXIII在人血液中的含量极低，故要获得足量FXIII需要消耗大量人血液，而人血液是一种稀缺资源，只能用于临床使用。此外，使用人血产品，也有较高的生物安全风险。
因此，研究开发一种高纯度、高活性的动物源FXIII，变得十分必要的迫切，具有极大的经济价值和社会价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用抗体免疫亲和纯化的方法制备凝血因子XIII的制备工艺，本发明制备得到的凝血因子XIII相较于现有的沉淀法制得的凝血因子XIII具有高纯度、高活性的优点。
本发明提供的一种免疫亲和层析柱填料，所述填料主要由抗凝血因子XIII的抗体与亲和层析介质经偶联得到。
进一步的，所述抗凝血因子XIII的抗体主要由含凝血因子XIII的活性组分作为抗原经免疫反应制得。
优选的，所述抗凝血因子XIII的抗体为单克隆抗体。
更进一步的，所述含凝血因子XIII的活性组分提取自哺乳动物血液；
优选的，所述含凝血因子XIII的活性组分提取自猪或牛的血液。
进一步的，所述免疫反应的免疫动物为小鼠；
优选的，所述免疫动物为BalB/C小鼠。
进一步的，所述含凝血因子XIII的活性组分的制备方法，包括以下步骤：
首先分离哺乳动物血浆并进行膜过滤得到组分A；随后将组分A制备为冷沉淀后重悬，固液分离收集上清，得到含凝血因子XIII的活性组分。
更进一步的，所述重悬的溶剂为柠檬酸钠溶液；
进一步的，所述亲和层析介质为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶；
优选的，所述亲和层析介质为琼脂糖凝胶；
更优选的，所述亲和层析介质为Sepharose 4B琼脂糖凝胶。
本发明提供的一种包括上述免疫亲和层析柱填料的免疫亲和层析柱。
本发明提供的一种凝血因子XIII的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(a)、首先分离哺乳动物血浆并进行膜过滤得到组分A；随后将组分A制备为冷沉淀后重悬，固液分离收集上清，得到含凝血因子XIII的活性组分；
(b)、通过上述免疫亲和层析柱纯化步骤(a)得到含凝血因子XIII的活性组分，得到凝血因子XIII。
优选的，所述步骤(a)得到的含凝血因子XIII的活性组分与上述填料中的含凝血因子XIII的活性组分具有同源性。
本发明提供的上述免疫亲和层析柱填料、上述的免疫亲和层析柱、上述凝血因子XIII的分离纯化方法在制备粘弹性凝血分析检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的免疫亲和层析柱填料以及包含该填料的免疫亲和层析柱，该免疫亲和层析柱以抗凝血因子XIII的单克隆抗体为配基与亲和层析介质偶联得到。根据抗原抗体高特异性选择的原理，该免疫亲和层析柱在进行凝血因子XIII纯化的过程中，抗凝血因子XIII的单克隆抗体能够特异性的吸附凝血因子XIII，从而有效提高凝血因子XIII的纯度以及提取效率。
本发明提供的凝血因子XIII的分离纯化方法，该分离纯化方法利用了抗原抗体反应的高特异性和高亲和力的特性，通过上述免疫亲和层析柱对含凝血因子XIII的活性组分进行抗体亲和纯化，相比较传统的沉淀法蛋白质纯化工艺，其仅需一步纯化即可将凝血因子XIII纯化至95％以上的纯度，同时也避免了传统沉淀法提取导致的蛋白活性降低的问题。
本发明提供的凝血因子XIII，上述凝血因子XIII主要由上述分离纯化方法制备得到，经纯化后得到的凝血因子XIII纯度高达95％以上。
本发明提供的上述凝血因子XIII可以广泛的应用于粘弹性凝血分析检测试剂的制备领域中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例5提供的纯化后凝血因子XIII的液相色谱分析图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种免疫亲和层析柱填料，所述填料主要由抗凝血因子XIII的单克隆抗体与亲和层析介质经偶联得到。
本发明提供的免疫亲和层析柱填料，该免疫亲和层析柱填料以抗凝血因子XIII的单克隆抗体为配基与亲和层析介质偶联得到。根据抗原抗体高特异性选择的原理，该免疫亲和层析柱在进行凝血因子XIII纯化的过程中，抗凝血因子XIII的单克隆抗体能够特异性的吸附凝血因子XIII，从而有效提高凝血因子XIII的纯度以及提取效率。
在本发明的一种优选实施方式中，所述抗凝血因子XIII的抗体主要由含凝血因子XIII的活性组分作为抗原经免疫反应制得。
优选的，所述抗凝血因子XIII的抗体为单克隆抗体。作为一种优选的实施方式，上述抗凝血因子XIII的单克隆抗体为针对凝血因子XIII特定抗原表位的抗体，其通过利用含凝血因子XIII的活性组分作为抗原免疫实验动物得到。
优选的，所述抗凝血因子XIII的单克隆抗体通过杂交瘤技术制备。
在上述优选实施方式中，所述含凝血因子XIII的活性组分提取自哺乳动物血液；
优选的，所述含凝血因子XIII的活性组分提取自猪或牛的血液。
作为一种优选的实施方式，上述含凝血因子XIII的活性组分提取自哺乳动物血液。根据文献，猪FXIII、牛FXIII和人FXIII的蛋白质序列具有极高的相似性，同源性达到86.7％，本发明使用猪或牛的血液作为提取原料制备得到的凝血因子XIII，经试验证明同样具有高纯度、高活性的特性，可以有效替代人FXIII，用于粘弹性凝血分析检测。
在本发明的一种优选实施方式中，所述免疫反应的免疫动物为小鼠。
作为一种优选的实施方式，所述免疫反应的免疫动物为BalB/C小鼠。BalB/C小鼠经注射矿物油可迅速引发浆细胞瘤，该品系被广泛应用于杂交瘤和单克隆抗体的生产。本方案中使用BALB/c小鼠可提高单克隆抗体制备的效率和成本。在本发明的一种优选实施方式中，所述含凝血因子XIII的活性组分的制备方法，包括以下步骤：
首先分离哺乳动物血浆并进行膜过滤得到组分A；随后将组分A制备为冷沉淀后重悬，固液分离收集上清，得到含凝血因子XIII的活性组分。
作为一种优选的实施方式，上述含凝血因子XIII的活性组分通过利用哺乳动物血液制备冷沉淀的方法进行提取，重悬后的冷沉淀中富含有丰富的凝血因子XIII，该方法具有提取效率高、制备工艺简单的优点。
其中，作为抗原的含凝血因子XIII的活性组分的制备过程中，还包括冷乙醇重悬、柠檬酸提取和水浴去除纤维蛋白原的步骤，在一个具体的实施方式中，抗原制备步骤为：
(a)、称取新鲜枸橼酸化抗凝猪全血20kg，用离心机8000转、4℃离心分离20min，收集上层血浆，得到组分1；
(b)、将组分1用0.45um微孔滤膜过滤，得到组分2；
(c)、将组分2置于-40℃冷柜中过夜，使血浆全部冻结，然后取出置4℃冷柜中缓慢解冻，在解冻过程中，会析出大量冷沉淀。于4℃条件下，用GL-21M离心机10000g离心30min收集冷沉淀，得到组分3；
(d)、将组分3冷沉淀用1000mL 8％冷乙醇溶液重悬，于-3℃条件下离心，收集沉淀，沉淀用1000mL 10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH7.4溶液重悬，重悬液用于4℃条件下离心30min收集上清，得组分4；
(e)、将组分4用280mM柠檬酸提取30min，离心得沉淀，沉淀加入1000mL 10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH7.4溶液重悬，同法离心收集上清，得组分5；
(f)、将组分5置于55℃水浴中3min，使纤维蛋白原析出沉淀，离心去除纤维蛋白原。
(g)将离心上清用50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液透析过夜，使电导低于3ms/cm。上样Q HP层析柱，用含50mM NaCl的缓冲液洗脱FXIII。
(h)将50mM洗脱组分上样Protein A亲和柱，收集穿透液。本步骤的目的是去除样品中的抗体组分。
本步骤收集的穿透液即为纯化的FXIII。经BCA法蛋白浓度测定，FXIII浓度为1.58mg/mL。
在上述优选实施方式中，所述步骤(d)中的溶剂为柠檬酸钠溶液；
作为一种优选的实施方式，上述柠檬酸钠溶液作为一种抗凝剂，防止抗原制备过程中被激活导致血液凝固；其次，作为一种溶剂和沉淀剂，柠檬酸钠在低浓度条件下，可以溶解蛋白质，但在高浓度条件下，又可以选择性沉淀FXIII。
优选的，所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.01～0.5mol/L。
在本发明的一种优选实施方式中，所述亲和层析介质为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶；
优选的，所述亲和层析介质为琼脂糖凝胶；作为一种优选的实施方式，上述亲和层析介质为琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶具有亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶作用的优点，同时对蛋白质几乎没有非特异性吸附，将其作为亲和层析的载体介质可以有效避免免疫纯化过程中的非特异性吸附等现象。
更优选的，所述亲和层析介质为Sepharose 4B琼脂糖凝胶，即含糖浓度为4％的琼脂糖凝胶。上述Sepharose 4B凝胶颗粒上的羧基经NHS活化后，可以和抗体分子上的伯氨基反应生成酰胺键，得到偶联了特异性抗体的亲和柱。
根据本发明的一个方面，一种凝血因子XIII的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(a)、首先分离哺乳动物血浆并进行膜过滤得到组分A；随后将组分A制备为冷沉淀后重悬，固液分离收集上清，得到含凝血因子XIII的活性组分；
(b)、通过上述免疫亲和层析柱纯化步骤(a)得到含凝血因子XIII的活性组分，得到凝血因子XIII。
优选的，所述步骤(a)得到的含凝血因子XIII的活性组分上述填料中的含凝血因子XIII的活性组分具有同源性。
本发明提供的凝血因子XIII的分离纯化方法，该分离纯化方法利用了抗原抗体反应的高特异性和高亲和力的特性，通过上述免疫亲和层析柱对含凝血因子XIII的活性组分进行抗体亲和纯化，相比较传统的沉淀法蛋白质纯化工艺，其仅需一步纯化即可将凝血因子XIII纯化至95％以上的纯度，同时也避免了传统沉淀法提取导致的蛋白活性降低的问题，制得的凝血因子XIII比活性≥400U/mg。
根据本发明的一个方面，一种免疫亲和层析柱，所述免疫亲和层析柱包括上述免疫亲和层析柱填料。
本发明提供的免疫亲和层析柱，该免疫亲和层析柱包括上述免疫亲和层析柱填料，该免疫亲和层析柱在进行凝血因子XIII纯化的过程中，抗凝血因子XIII的单克隆抗体能够特异性的吸附凝血因子XIII，从而有效提高凝血因子XIII的纯度以及提取效率。
根据本发明的一个方面，一种上述免疫亲和层析柱填料、上述免疫亲和层析柱、上述凝血因子XIII的分离纯化方法在制备粘弹性凝血分析检测试剂中的应用。
本发明提供的免疫亲和层析柱填料、免疫亲和层析柱、凝血因子XIII的分离纯化方法可以广泛的应用于粘弹性凝血分析检测试剂的制备领域中。
下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1从猪血液中制备含凝血因子XIII的活性组分作为抗原
所述含凝血因子XIII活性组分的制备方法，包括以下步骤：
(a)、称取新鲜枸橼酸化抗凝猪全血20kg，用离心机8000转、4℃离心分离20min，收集上层血浆，得到组分1；
(b)、将组分1用0.45um微孔滤膜过滤，得到组分2；
(c)、将组分2置于-40℃冷柜中过夜，使血浆全部冻结，然后取出置4℃冷柜中缓慢解冻，在解冻过程中，会析出大量冷沉淀。于4℃条件下，用GL-21M离心机10000g离心30min收集冷沉淀，得到组分3；
(d)、将组分3冷沉淀用1000mL 8％冷乙醇溶液重悬，于-3℃条件下离心，收集沉淀，沉淀用1000mL 10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH7.4溶液重悬，重悬液用于4℃条件下离心30min收集上清，得组分4；
(e)、将组分4用280mM柠檬酸提取30min，离心得沉淀，沉淀加入1000mL 10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH7.4溶液重悬，同法离心收集上清，得组分5；
(f)、将组分5置于55℃水浴中3min，使纤维蛋白原析出沉淀，离心去除纤维蛋白原；
(g)将离心上清用50mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液透析过夜，使电导低于3ms/cm。上样Q HP层析柱，用含50mM NaCl的缓冲液洗脱FXIII。
(h)将50mM洗脱组分上样Protein A亲和柱，收集穿透液。本步骤的目的是去除样品中的抗体组分。
本步骤收集的穿透液即为纯化的FXIII。经BCA法蛋白浓度测定，FXIII浓度为1.58mg/mL。
实施例2制备鼠单克隆抗体
(一)免疫Balb/C小鼠
取Balb/C小鼠5只，第1天首次免疫,抗原+等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化，100μg/只，皮下注射。注射总量200μl。第14天进行二次免疫，抗原+等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，100μg/只，皮下注射。
一周后ELISA法测效价，如效价达不到融合要求，则每14天按二次免疫方法免疫一次，并于一周后测效价。最后一次加强免疫3天后，摘眼球放血处死，血液贮存备用。
(二)融合细胞制备
将处死后的小鼠无菌取脾脏，培养液洗脾脏一次，以无菌5ml注射器内芯研磨，过不锈钢滤网，收集细胞补充不完全1640培养液至40ml，1000r/min离心5min。
取对数生长期骨髓瘤细胞，补充不完全1640培养液至40ml，1000r/min离心5min。以1：10或1：5混合骨髓瘤细胞与免疫脾细胞，补充不完全1640培养液至40ml，1000r/min离心5min清洗一次。倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状。置含融合细胞的离心管于37℃水浴，吸取37℃预温的PEG 0.8ml，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完后37℃静置1.5min。5min内加入37℃预温的不完全培养基10ml，补至30ml，静置5min，800rpm离心6min。弃上清后，缓慢加入完全培养液50m1，分到1-2个250ml培养瓶中，培养12-24hr。
(三)制备单克隆抗体
取BALB/C小鼠，拉颈处死，浸泡在75％酒精内3～5min。用无菌剪刀剪开皮肤暴露腹膜，更换剪刀剪开腹膜，注入5～10ml的培养液，反复冲洗，吸出冲洗液配制为2×105/ml细胞悬液，得到饲养细胞。
将融合细胞与饲养细胞混合，同时加入50×HAT 2m1/100ml培养物、0.2m1/100ml培养物的HAT培养液分细胞于4×96孔培养板100μl/孔，置细胞培养箱培养，未加融合细胞的孔为阴性对照，5天时补充100μl HAT培养液/孔。至克隆出现铺满1/4孔底时，不需换液，开始检测抗体分泌。
抗体分泌阳性的克隆转种入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞。制备饲养细胞层100μl/孔(2×104/孔)，吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至100、50、10/ml，分别加入三种密度的细胞悬液于含饲养细胞的培养板中，100μl/孔，使每孔分别含有10、5、1个细胞。
在培养箱中培养10-14天，取上清检测，阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量培养，冻存。
接种杂交瘤细胞1～2周前，小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡(经该处理后的小鼠可保持1～2个月)。解冻一致冻存的杂交瘤细胞，用250mL玻璃培养瓶扩大培养，至细胞贴壁量为60-80％。重悬细胞于无血清培养液，制成1×106－2×106/ml悬液，每只小鼠注射0.5mL。带腹水长出后，收集腹水用Protein A抗体亲和纯化介质纯化，即得到用于偶联的特异性单克隆抗体。
实施例3制备免疫亲和层析柱
取Sepharose 4B琼脂糖凝胶亲和层析介质(GE healthcare，17-0981-03)装柱，柱体积10mL。用10-15倍柱体积的1mM HCl洗涤层析柱。用偶联缓冲液(0.1M NaHCO3pH8.3，0.5M NaCl)平衡层析柱，加入实施例2中得到的抗凝血因子XIII的单克隆抗体，4℃反应过夜。用4-5倍偶联缓冲液冲洗层析柱以去掉过量的抗体。然后用1M乙醇胺，pH8.0封闭未反应基团。用偶联缓冲液平衡后，得到免疫亲和层析柱。
实施例4制备纯化用含凝血因子XIII的活性成分
(1)、称取新鲜枸橼酸化抗凝猪全血20kg，用离心机8000转、4℃离心分离20min，收集上层血浆，得到组分a；
(2)、将组分a用0.45um微孔滤膜过滤，得到组分b；
(3)、将组分b置于-40℃冷柜中过夜，使血浆全部冻结，然后取出置4℃冷柜中缓慢解冻，在解冻过程中，会析出大量冷沉淀。于4℃条件下，用GL-21M离心机10000g离心30min收集冷沉淀，得到组分c；
(4)、将组分c用1000mL 10mM柠檬酸钠，50mM NaCl，pH7.4溶液重悬，重悬液用于4℃条件下10000转、4℃离心30min收集上清，得到纯化用含凝血因子XIII的活性组分。
实施例5凝血因子XIII的分离纯化
将实施例4制得的纯化用含凝血因子XIII的活性组分上样实施例3制得的免疫亲和层析柱，随后用PBS平衡层析柱后，待流穿峰平衡至基线后，改用亲和层析洗脱液(50mMTris-HCl，0.5M NaCl，7％Arg，pH7.8)洗脱。收集洗脱峰，用Satorius Vivaflow超滤系统浓缩，得到纯化后的凝血因子XIII。
图1为纯化后凝血因子XIII的液相色谱分析图。如图1所示，凝血因子XIII的主峰面积大于95％(保留时间9.16分钟时)，具有较高的纯度。
具体色谱峰分析结果如下表所示：
实验例1
为表明本申请制备得到的凝血因子XIII能够替代现有的人源凝血因子XIII用于制备粘弹性凝血分析检测试剂。现特选取本发明实施例5制备得到的FXIII为原料，与各种稳定剂和防腐剂等辅料配合，制备得到了粘弹性凝血分析检测试剂(自制检测试剂)。
具体试剂的配方如下：
其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。
按1L总体积计算并精密称取或量取相应上述组分，用蒸馏水分散均匀，并定容至1L。搅拌均匀后分装至样品管，每支50μL。然后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，充填氮气后进行密封保存。
将上述制备得到的粘弹性凝血分析检测试剂(自制检测试剂)和美国血液技术公司生产的进口试剂(货号07-014、)用相同血样在TEG5000分析仪进行对比测试，其结果如下表所示：
注：BP：巴曲酶，ADP：二磷酸腺苷，AA：花生四希酸；所述MA直接反映纤维蛋白与血小板通过GPIIb/IIIa相互联结的最强的动力学特性，代表纤维蛋白凝块的最大强度。所述P1代表美国血液技术公司生产的货号为07-014的进口粘弹性凝血分析检测试剂；P2代表美国血液技术公司生产的货号为07-014的进口粘弹性凝血分析检测试剂加ADP(二磷酸腺苷)；P3代表美国血液技术公司生产的货号为07-014的进口粘弹性凝血分析检测试剂加AA(花生四烯酶)。
由上表可看出，本发明制备得到的粘弹性凝血分析检测试剂与对比进口试剂效果相当，能够有效替代现有的人源FXIII，用于粘弹性凝血分析检测。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种免疫亲和层析柱填料，其特征在于，所述填料主要由抗凝血因子XIII的抗体与亲和层析介质经偶联得到。
2.根据权利要求1所述的免疫亲和层析柱填料，其特征在于，所述抗凝血因子XIII的抗体主要由含凝血因子XIII的活性组分作为抗原经免疫反应制得；
优选的，所述抗凝血因子XIII的抗体为单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的免疫亲和层析柱填料，其特征在于，所述含凝血因子XIII的活性组分提取自哺乳动物血液；
优选的，所述含凝血因子XIII的活性组分提取自猪或牛的血液。
4.根据权利要求2所述的免疫亲和层析柱填料，其特征在于，所述免疫反应的免疫动物为小鼠；
优选的，所述免疫动物为BalB/C小鼠。
5.根据权利要求1～4任一项所述的免疫亲和层析柱填料，其特征在于，含凝血因子XIII的活性组分的制备方法，包括以下步骤：
首先分离哺乳动物血浆并进行膜过滤得到组分A；随后将组分A制备为冷沉淀后重悬，固液分离收集上清，将上清分别进行离子交换层析和Protein A亲和层析，穿透得到含凝血因子XIII的活性组分。
6.根据权利要求1～4任一项所述的免疫亲和层析柱填料，其特征在于，所述亲和层析介质为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶；
优选的，所述亲和层析介质为琼脂糖凝胶；
更优选的，所述亲和层析介质为Sepharose 4B琼脂糖凝胶。
7.一种包括权利要求1～6任一项所述的免疫亲和层析柱填料的免疫亲和层析柱。
8.一种凝血因子XIII的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(a)、首先分离哺乳动物血浆并进行膜过滤得到组分A；随后将组分A制备为冷沉淀后重悬，固液分离收集上清，得到含凝血因子XIII的活性组分；
(b)、通过权利要求7所述的免疫亲和层析柱纯化步骤(a)得到含凝血因子XIII的活性组分，得到凝血因子XIII。
9.根据权利要求8所述的凝血因子XIII的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(a)得到的含凝血因子XIII的活性组分与权利要求1～6任一项所述填料中的含凝血因子XIII的活性组分具有同源性。
10.如权利要求1～6任一项所述的免疫亲和层析柱填料、如权利要求7所述的免疫亲和层析柱、如权利要求8、9所述的凝血因子XIII的分离纯化方法在制备粘弹性凝血分析检测试剂中的应用。
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