CN103396494A

CN103396494A - 一种凝血因子ⅸ的单克隆抗体

Info

Publication number: CN103396494A
Application number: CN2013101511508A
Authority: CN
Inventors: 焦永军; 张黎; 曾晓燕; 郭喜玲; 史智扬; 崔仑标; 周明浩
Original assignee: JIANGSU DISEASE PREVENTION CONTROL CENTRAL
Current assignee: Zhejiang great bio Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-04-27
Also published as: CN103396494B

Abstract

本发明公开了一种凝血因子IX的单克隆抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.3，重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.4，本发明公开了制备上述抗体的方法。本发明所述的抗体能特异性识别凝血因子IX。本发明还公开了利用所述抗体从血浆中纯化凝血因子IX的方法。利用本发明所述的抗体可以方便、高效的从血浆中纯化凝血因子IX，从而降低患者因输血补充凝血因子IX感染甲肝、乙肝、艾滋病等疾病的风险。

Description

一种凝血因子Ⅸ的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种抗体，具体而言涉及一种抗凝血因子IX的单克隆抗体。

背景技术

凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它们的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口，这个过程被称为凝血。它们部分由肝生成，可以被香豆素所抑制。为统一命名，世界卫生组织按其被发现的先后顺序用罗马数字编号，有凝血因子I，II，III，IV，V，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII，XIII等，因子XIII以后发现的凝血因子，经过多年验证，认为对于凝血功能，无决定性影响，不再列入凝血因子的编号。其中凝血因子IX(Factor IX，FIX)又叫抗乙型血友病球蛋白，在肝脏中合成，有400多个氨基酸残基构成，在人体内的半衰期18～20小时。作为凝血过程中的主要因子，FIX是治疗乙型血友病的特效药物。

凝血因子缺乏可造成凝血障碍，血友病就是其中最典型的例子。血友病(hemophilia)，是一组遗传性出血性疾病，它是由血液中单个凝血因子的缺乏或活性水平低而导致的严重的凝血功能障碍。此病为X染色体连锁的隐性遗传病，所以患者绝大部分为男性，根据国际流行病学统计，其发病率为1/5000～10000，女性患者极少见。全球大约有40万患者，我国患者有6万～10万。到目前为止，还没有根治的办法。但通过增加患者凝血因子的活性水平，可以有效地消除患者的症状。

血友病根据缺乏的凝血因子不同可以分为甲型(A型)、乙型(B型)和丙型(C型)三类。临床上最常见的是甲型血友病，由于缺乏凝血因子VIII(抗血友病球蛋白A，AHGA)导致的，约占血友病人数的80％-85％，在某些高发地区甚至更高。乙型血友病约占血友病人数的15％左右，由于缺乏凝血因子IX(抗血友病球蛋白B，AHG B)导致的，而由于缺乏凝血因子XI导致的丙型血友病在临床上很罕见。

血友病的严重程度与所缺乏的凝血因子血浆水平成正比，根据其严重程度可以分为重型、中型和轻型。这是由于：每个凝血因子的基因都是一串脱氧核醣核酸(DNA)形成的复杂序列，不同类型的凝血因子缺乏，造成的影响不同；即使是同一种凝血因子发生变异，因为变异发生的位置不同、方式不同，导致凝血因子的活性水平也不相同。

由于患者血浆中缺乏某种凝血因子，患者的血管破裂后，血液较正常人不易凝结，出血不能自发停止，因而会流去更多的血，严重者在较剧烈活动后也可自发性出血。体表的伤口所引起的出血通常并不严重，而内出血则严重得多。内出血一般发生在关节、组织和肌肉内部。当内脏出血或颅内出血发生时，常常危及生命。

血友病患者中经常出现关节出血，最常出血的是膝关节、肘关节和踝关节。血液淤积到患者的关节腔后，会使关节活动受限，使其功能暂时丧失，例如膝关节出血后患者常常不能正常站立行走。淤积到关节腔中的血液常常需要数周时间才能逐渐被吸收，从而逐渐恢复功能，但如果关节反复出血则可导致滑膜炎和关节炎，造成关节畸形，使关节的功能很难恢复正常，因此很多血友病患者有不同程度的残疾。

血友病目前的治疗方法为：使用促进血小板聚集药物的一般性治疗，此种方法的效果有限。目前，主要采用补充所缺乏凝血因子的治疗方法。此种治疗可以输血浆、血浆冷沉淀物、凝血酶原复合物或因子VIII(IX)浓缩制剂。在关节出血的急性期应予固定。出血停止后应早日进行适当的活动，理疗和功能锻炼。对易接触部位发生的小出血，可采用压迫止血，使用凝血酶、纤维蛋白原、明胶海绵局部敷贴止血。也可以通过使用6-氨基己酸、止血环酸、肾上腺皮质激素等，但效果很差。此外，其基因治疗方法仍处于研发过程中。

补充凝血因子是目前最有效的方法，但也有其弊端。此种方法受到血液来源的限制，在血液缺乏的时候不可能实现。此外，输血的安全性比较低，容易感染甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病等很多由血液传播的疾病，因此，在血浆中纯化或通过基因工程的方法表达凝血因子成为需要。

发明内容

为解决上述问题，本发明用人血浆来源的FIX蛋白免疫小鼠，制备杂交瘤细胞，筛选出高效表达特异性FIX蛋白抗体的单克隆细胞株，进一步用rProtein G层析柱纯化FIX蛋白的单克隆抗体，将所得抗体偶联到Sepharose4B树脂上，用此树脂从血浆或重组蛋白表达上清中纯化FIX蛋白，为后续制备FIX蛋白奠定了基础。

本发明采用人血浆来源的FIX蛋白免疫小鼠，分离脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，筛选到6株可以表达抗FIX抗体的杂交瘤细胞。利用免疫转印及免疫共沉淀验证所述抗体与天然FIX蛋白的结合，其中命名为11B4-C3的抗体，较其它抗体更能捕获具有天然构象的FIX蛋白。

本发明通过SouthemBiotech公司的SBA Cloning System/HRP同种型鉴定试剂盒(5300-05)鉴定了11B4-C3抗体的轻、重链同种型，结果显示单克隆抗体11B4-C3的重轻链同种型分别为：G1和κ。利用分子生物学的方法扩增了单克隆抗体11B4-C3的基因，得到其基因序列，进一步得到其蛋白序列，通过比对，得出其骨架区和超变区的氨基酸序列。

本发明公开了上述抗凝血因子IX的单克隆抗体11B4-C3的序列，所述单克隆抗体11B4-C3包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

本发明所述的单克隆抗体11B4-C3的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。所述单克隆抗体11B4-C3的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10所示。

本发明还公开了上述单克隆抗体11B4-C3的制备方法及与FIX蛋白特异性结合的检测，具体方法如下：

1、Balb/c小鼠免疫、脾细胞分离

人血浆来源FIX(Prospec公司)蛋白免疫5周龄雌性Balb/c小鼠，首次免疫100μg/只。100μg抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合，腹腔注射；第3周后用等量抗原与不完全佐剂混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐剂。小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数，备用。

2、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天，收获骨髓瘤细胞，计数，用无血清培养基洗涤2次备用。将第一步得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞经PEG融合，将融合细胞接种至无菌96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天。

3、杂交瘤细胞的筛选和克隆

融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有FIX的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠的二抗，用HRP底物显色，检测A450nm值。

收集阳性孔细胞，采用有限稀释法稀释细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定只有一个细胞克隆生长的孔，作ELISA进行鉴定。对阳性孔细胞进行有限稀释，经过3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上清，用protein G亲和层析柱进行纯化，并透析到PBS中，测浓度，-20℃冻存备用。

4、单克隆抗体与FIX蛋白特异性结合检测

本发明首先免疫转印的方法检测了筛选的单克隆抗体与FIX蛋白的特异性结合。FIX蛋白经SDS-PAGE电泳后，转NC膜，经5％奶粉封闭后，用筛选的单克隆抗体杂交，充分洗涤后，再与HRP-山羊抗小鼠二抗孵育，充分洗涤后，加DAB底物显色。

此外，本发明用免疫共沉淀实验进一步验证上述方法筛选得到的单克隆抗体捕获天然FIX蛋白的能力；偶联有rProtein G的Sepharose4B(Invitrogen)树脂加入FIX蛋白，分别加入不同单抗培养上清液，并用一株肠道病毒71型(EV71)单抗作为阴性对照，用偶联了HRP的FIX蛋白的单克隆抗体做免疫转印。结果显示11B4-C3抗体较其它抗体更能捕获具有天然构象的FIX蛋白。

5、单克隆抗体11B4-C3轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定

取对数生长期的杂交瘤细胞，用Trizol抽提总RNA，逆转录成cDNA后用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析。测序结果显示单克隆抗体11B4-C3轻、重链可变区其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。用www.expasy.org在线软件将编码抗FIX的抗体11B4-C3的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，11B4-C3的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

此外，本发明将筛选到的细胞株进行大规模培养，纯化11B4-C3抗体，并将其共价偶联在CNBr-activated Sepharose4B树脂上，按层析柱说明书装柱，并用此亲和柱成功地从血浆中纯化到FIX蛋白，这为治疗乙型血友病奠定了基础。

本发明还公开了一种纯化凝血因子IX的方法，具体步骤如下：

1)亲和层析柱的制备：将层析柱树脂CNBr-activated Sepharose4B(GE Healthcare)放至1mM HCl中溶胀，然后用1mM HCl充分洗涤。将单克隆抗体11B4-C3溶于偶联缓冲液(0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3)中，4℃摇动过夜。用偶联缓冲液洗去未偶联到树脂上的抗体分子，树脂上多余的活性基团则用0.1M Tris-HClpH8.0封闭。抗体-树脂偶联物先后用两种缓冲液洗涤，分别为0.1M醋酸钠缓冲液(含0.5M NaCl，pH4.0)和0.1M Tris-HCl缓冲液(含0.5M NaCl，pH8.0)，轮流洗3个循环。按层析柱说明书装柱，用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)4℃平衡过夜。

2)纯化：将血浆离心收集上清，并用0.45μm微孔滤膜过滤后上样，流速为0.5-4ml/min。用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)洗至基线，用5个柱床体积洗脱缓冲液(0.1M Glycine-HCl，pH2.0)洗脱，收集洗脱峰。用中和液(1M Tris-HCl pH9.0)调节pH至7.0，洗脱液即为含有凝血因子IX的溶液。

本发明所述的11B4-C3抗体可以偶联到市售常见的层析柱上及其他载体，用于FIX蛋白的分离和浓缩。

附图说明

图1免疫转印验证杂交瘤细胞分泌的抗体与FIX蛋白的特异性结合；

图2免疫共沉淀实验检测杂交瘤细胞分泌的抗体对FIX蛋白的捕获，PC为天然FIX蛋白，NC为无关抗体EV71的阴性对照；

图3筛选出的单克隆抗体11B4-C3重、轻链同种型(Isotype)的鉴定；

图4筛选出的单克隆抗体11B4-C3重、轻链可变区基因克隆，图A为提取杂交瘤细胞的总RNA琼脂糖电泳图，图B为钓取的单克隆抗体重、轻链可变区基因片段琼脂糖电泳图；

图5用单克隆抗体11B4-C3亲和层析柱从血浆中纯化的FIX蛋白鉴定图。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一Balb/c小鼠免疫及脾细胞分离

1.材料

人血浆来源FIX蛋白(Prospec公司)，5周龄雌性Balb/c小鼠。

2.方法与结果

首次免疫，将人血浆来源FIX蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，腹腔注射5周龄雌性Balb/c小鼠，100μg/只；第3周后进行第二次免疫，将FIX蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，腹腔注射，100μg/只；第5周后进行第三次免疫，此次不加佐剂，每只小鼠腹腔注射100μgFIX蛋白。

小鼠经第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、处死。无菌操作取出小鼠脾脏，置灭菌平皿中，用无菌PBS洗两遍，踢出脾脏周围的组织，注意不要把脾脏剪破。准备一张直径2cm，200目的滤网膜。把脾脏放滤网膜上剪成3段，然后把滤网膜双层对折，用止血钳夹紧放入3.5cm dish中(2ml OPTI-MEM含抗生素)，用注射器内芯研磨。把含脾细胞的悬液收集到15ml离心管，800rpm5min弃上清。用OPTI-MEM(含抗生素)重悬细胞，800rpm5min弃上清，倒入OPTI-MEM(含抗生素)颠倒重悬细胞，计数，备用。

实施例二小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合及杂交瘤细胞筛选

1.材料

小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0为本研究室保存，OPTI-MEM、HAT培养基和胎牛血清购自Gibco，PEG购自Sigma公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Piece公司，HRP标记羊抗鼠的二抗购自中杉金桥公司。

2.方法与结果

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，融合前3天，将细胞传代一次。融合当天，收获骨髓瘤细胞，计数，把5.0×10⁷骨髓瘤细胞用无血清培养基洗涤2次备用。

将等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，1300rpm离心5min，弃上清，且尽可能去除干净。在1.5min内加入1.5ml的50％的PEG，边加边摇匀；然后在8.5min内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。把经PEG融合的细胞1000rpm离心5min，弃上清，且尽可能去除干净，加150mi的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养4天，每孔补加100μl选择培养基。

融合后10天，从每孔中吸50μl上清，加到包被有FIX蛋白的96孔ELISA板(用1％的BSA封闭)，室温孵育1.5h，0.05％PBST洗2次。用1％BSA按1∶2000的比例稀释辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠的二抗，每孔加50μl，室温孵育1.5h，0.05％PBST洗涤4次。每孔加入100μl HRP底物(H₂O₂+TMB)，室温孵育0.5h，每孔加入100μl 2M H₂SO₄，检测450nm处的吸光值。

收集阳性孔细胞，重悬于HAT选择培养基中，采用有限稀释法稀释阳性细胞，并种植于96孔细胞培养板中，5天后观察，对确定单细胞克隆生长的孔进行ELISA鉴定。重复此步骤，对阳性孔细胞进行3-4次单细胞分离培养，直至获得稳定的杂交瘤细胞克隆。大量培养杂交瘤细胞，收集含有抗体的培养上清，用protein G亲和层析柱进行纯化，用1×PBS透析，BCA方法测定浓度，-20℃冻存备用。

完成上述操作后，共获得6株单克隆抗体，其编号分别为：

1A7-B8、6G5-F10、7G2-A2、10A3-B8、11B4-C3、13E7-A11。

实施例三采用免疫转印的方法检测抗原抗体结合的特异性

1.材料

DAB底物购自Piece公司，脱脂奶粉购自BD公司。

2.方法与结果

FIX蛋白100μg与SDS-PAGE5×loading buffer混合均匀，100℃煮沸10min，上样、电泳，电转移至NC膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，上述6株单克隆抗体分别用5％脱脂奶粉按1∶1000稀释，于室温杂交1h，0.05％PBST充分洗涤。HRP-山羊抗小鼠二抗用5％脱脂奶粉按1∶2000稀释，于室温杂交1小时，0.05％PBST充分洗涤后，加DAB底物显示，结果如图1，除了单抗7G2-A2(第三泳道)为非特异性结合外，其余5株单抗均能与人血浆来源的FIX杂交，分子量约为56KDa。

实施例四免疫共沉淀实验检测抗体对FIX蛋白的捕获能力

1.材料

辣根过氧化物酶购自北京泰天和生物科技有限公司，偶联有rProtein G的Sepharose4B购自Invitrogen公司。

2.方法与结果

将单抗1A7-B8与HRP的偶联，操作步骤参照其说明书。首先调节单抗1A7-B8浓度至1mg/ml，取100ul抗体溶液，加入50ul(＝1mg)Reagent I活化辣根氧化物酶。以Reagent II调节pH值至9.5左右，37℃放置1h，加入微量硼氢化钠，加入约为Reagent II3倍体积的Reagent III，混匀终止反应。加甘油至50％，-20℃冻存备用。

在1.5ml的EP管中，加入40μl偶联有rProtein G的Sepharose4B树脂和浓度为20μg/ml的FIX蛋白300μl，并分别加入单克隆抗体培养上清液200μl(1A7-B8、6G5-F10、7G2-A2、10A3-B8、11B4-C3、13E7-A11)，此实施例用一株肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体作为阴性对照，于室温中轻摇孵育过夜。次日，用1×PBS充分洗涤3-4次，吸干上清。于填料沉淀中加入40μl的1×PBS和10μl SDS-PAGE5×Loading buffer，100℃煮沸10分钟，每孔上样20μl，140V电泳1h，电转移至NC膜，用5％脱脂奶粉于室温封闭2h，HRP-1A7-B8用5％脱脂奶粉按1∶500的比例稀释，于37℃杂交1-2h，0.05％PBST充分洗涤后，加DAB底物显示，结果如图2，表明11B4-C3较其它抗体更能捕获具有天然构象的FIX蛋白。

实施例五单抗11B4-C3重、轻链同种型(Isotype)的鉴定

1.材料

SBA Cloning System/HRP同种型鉴定试剂盒(5300-05)购自SouthemBiotech公司。

2.方法与结果

用1×PBS，pH7.4，稀释山羊抗小鼠(H+L)抗体至10μg/ml，加至ELISA酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜。弃包被液，用含有0.05％Tween20的PBS(PBST)洗涤3次，每孔加入200μl的1％的BSA，4℃封闭过夜。用PBST洗涤3次，于12个孔中每孔加入100μl杂交瘤培养上清液，置于37℃水浴中孵育1小时，用PBST洗涤3次。用含有1％BSA的PBS按1∶500分别稀释HRP标记的山羊抗小鼠二抗，其特异性如下：重链为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，轻链为κ、λ，每个特异性二抗加入2个孔，每孔100μl，置于37℃水浴中孵育1小时，用PBST洗涤5次。每孔加入100μl底物(TMB+H₂O₂)，室温放置20分钟，每孔加入2M H₂SO₄100μl终止反应，置于450nm下测量吸光度。结果如图3，可以看出单克隆抗体11B4-C3的重轻链同种型分别为：G1和κ。

实施例六单克隆抗体11B4-C3可变区基因的克隆

1.材料

Trizol购自Invitrogen公司，pMD-18T载体购自TAKARA公司，反转录试剂盒购自Promega公司。

引物：

V_H基因扩增引物：

MHV1：5’ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC3’

MHV2：5’ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT3’

MHV3：5’ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT3’

MHV4：5’ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT3’

MHV5：5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT3’

MHV6：5’ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC3’

MHV7：5’ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT3’

MHV8：5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3’

MHV9：5’ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG3’

MHV10：5’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG3’

MHV11：5’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’

MHV12：5’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG3’

MHCG1：5’CAGTGGATAGACAGATGGGGG3’

VL基因扩增引物：

MKV1：5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG3’

MKV2：5’ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG3’

MKV3：5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG3’

MKV4：5’ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG3’

MKV5：5’ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC3’

MKV6：5’ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG3’

MKV7：5’ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG3’

MKV8：5’ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG3’

MKV9：5’ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG3’

MKV10：5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT3’

MKV11：5’ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC3’

MKC：5’ACTGGATGGTGGGAAGArGG3’

兼并密码子：R＝A or G Y＝C or C M＝A or C K＝G or T S＝Cor G W＝A or T H＝A or C or T B＝C or G or T V＝A or C or G D＝Aor G or T N＝A or C or G or T。

2.方法与结果

取对数生长期的杂交瘤细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，结果如图4A，可以看出所提取的总RNA质量良好，没有降解，可以用于后续的基因扩增。随后，用oligo(dT)20为引物，逆转录合成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入pMD-18T载体，测序、进行序列分析。有关操作步骤如下：

以抽提的总RNA为模板，oligo(dT)20为引物，逆转录合成cDNA。

65℃孵育5分钟，然后快速置于冰上3分钟，加入以下成分：

42℃孵育50分钟，然后70℃孵育15分钟灭活逆转录酶。

PCR扩增单抗重、轻链可变区基因VH和VL

扩增条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸1min，共30个循环。

结果如图4B所示，对于11B4-C3重链可变区，只有MHV7/MHCG1引物组合能够扩增出阳性条带，对于轻链可变区MKV2/MKC引物组合能够扩增出阳性条带，条带大小均为450bp左右。

根据大连TAKARA公司TA克隆试剂盒说明书，将上述单抗重、轻可变区基因PCR产物分别插入pMD-18T载体，送Invitrogen公司测序。测序结果显示单克隆抗体11B4-C3轻、重链可变区核苷酸分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。用www.expasy.org在线软件将编码抗FIX的抗体11B4-C3的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，11B4-C3的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

实施例七用单克隆抗体11B4-C3亲和层析柱纯化FIX

1.材料

CNBr-activated Sepharose4B购自GE Healthcare公司。

2.方法和结果

亲和层析柱的制备。称量1g柱层析树脂CNBr-activated Sepharose4B(GE Healthcare)至1mM HCl中溶胀，然后用1mMHCl充分洗涤。单克隆抗体11B4-C3溶于偶联缓冲液(0.1MNaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3)，浓度为10mg/ml，取5ml加入溶胀后的树脂中，4℃摇动过夜。用偶联缓冲液洗去未偶联到树脂上的抗体分子，树脂上多余的活性基团则用0.1M Tris-HCl pH8.0封闭，室温作用2h。抗体-树脂偶联物先后用两种缓冲液洗涤，分别为0.1M醋酸钠缓冲液(含0.5M NaCl，pH4.0)和0.1M Tris-HCl缓冲液(含0.5M NaCl，pH8.0)，轮流洗3个循环。按层析柱说明书装柱，用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)4℃平衡过夜。

纯化过程。取血浆50ml，20000rpm离心20min，并用0.45μm微孔滤膜过滤后上样，流速为1ml/min。用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)洗至基线，用5个柱床体积洗脱缓冲液(0.1MGlycine-HCl，pH2.0)洗脱，收集洗脱峰。用中和液(1M Tris-HClpH9.0)调节pH至7.0。把纯化的FIX蛋白用透析袋透析至1×PBS中，用HRP标记的FIX特异性单抗1A7-B8与之杂交鉴定(用DAB显色)。结果显示(图5)纯化的蛋白为FIX蛋白，且纯度较高。

Claims

1.一种抗凝血因子IX的单克隆抗体及其片段，包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：5所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：6所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：7所示；

所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：8所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：9所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：10所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体及其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述重链可变区的核甘酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

4.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测凝血因子IX的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

5.权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段在纯化和/或制备凝血因子IX中的应用。

6.一种纯化凝血因子IX的方法，具体步骤如下：

1)亲和层析柱的制备：将层析柱树脂CNBr-activated Sepharose4B放至1mM HCl中溶胀，然后用1mM HCl充分洗涤，将权利要求2所述的抗体溶于偶联缓冲液(0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3)中，4℃摇动过夜，用偶联缓冲液洗去未偶联到树脂上的抗体分子，树脂上多余的活性基团则用0.1M Tris-HCl pH8.0封闭。抗体-树脂偶联物先后用两种缓冲液洗涤，分别为0.1M醋酸钠缓冲液和0.1MTris-HCl缓冲液，轮流洗3个循环，按层析柱说明书装柱，用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)4℃平衡过夜。

2)纯化：将血浆离心收集上清，并用0.45μm微孔滤膜过滤后上样，流速为0.5-4ml/min。用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5)洗至基线，用5个柱床体积洗脱缓冲液(0.1M Glycine-HCl，pH2.0)洗脱，收集洗脱峰。用中和液(1M Tris-HCl pH9.0)调节pH至7.0，中和液即为含有凝血因子IX的溶液。

7.根据权利要求6所述的纯化凝血因子IX的方法，其特征在于，其中所述的0.1M醋酸钠缓冲液含有0.5M NaCl，所述的0.1M Tris-HCl缓冲液含有0.5M NaCl。