CN110312787B - 细胞培养方法以及细胞培养系统 - Google Patents

细胞培养方法以及细胞培养系统 Download PDF

Info

Publication number
CN110312787B
CN110312787B CN201880012633.0A CN201880012633A CN110312787B CN 110312787 B CN110312787 B CN 110312787B CN 201880012633 A CN201880012633 A CN 201880012633A CN 110312787 B CN110312787 B CN 110312787B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
ethylene
laminin
cells
copolymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201880012633.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110312787A (zh
Inventor
户谷贵彦
松冈洋佑
田中乡史
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Original Assignee
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Seikan Group Holdings Ltd filed Critical Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Publication of CN110312787A publication Critical patent/CN110312787A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110312787B publication Critical patent/CN110312787B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供细胞培养方法及细胞培养系统，以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物等中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材形成培养容器的培养面的至少一部分，在培养容器中收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基和细胞，培养贴壁细胞，由此能够不向培养容器涂布层粘连蛋白地合适地培养贴壁细胞。

Description

细胞培养方法以及细胞培养系统
技术领域
本发明涉及细胞的培养技术，特别涉及使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养方法以及细胞培养系统。
背景技术
近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞或组织、微生物等。
在此种状况下，实行向培养容器注入细胞和培养基、并培养细胞的做法。
通常，在培养容器中对多能干细胞(iPS细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞)进行粘附培养的情况下，需要向培养容器的培养面涂布层粘连蛋白等细胞粘附因子的前处理(参照专利文献1)。具体而言，例如将层粘连蛋白溶液加入培养容器，在37℃静置1小时以上而进行层粘连蛋白的涂布后，从培养容器除去层粘连蛋白溶液，将细胞和培养基加入培养容器，进行细胞的粘附培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015－178526号公报
发明内容
发明所要解决的问题
然而，为了像这样对细胞进行粘附培养，必须向培养容器涂布层粘连蛋白，存在有操作烦杂的问题。另外，在供给已涂布层粘连蛋白的培养容器的情况下，存在有其制造、品质管理辛苦的问题。
因而，本发明人等对于是否可以如下所示地培养进行了研究，即，不向培养容器涂布层粘连蛋白，而是使层粘连蛋白混合于培养基中而进行培养，由此使细胞粘附于培养容器而培养。
其结果是，在使用了由疏水性材料形成的培养容器的情况下，即使使层粘连蛋白混合于培养基中而进行培养，也无法使细胞粘附于培养容器而培养。对于其理由可以如下所示地推测。
如图1所示，在培养基中含有各种各样的蛋白质，培养容器的培养面成为由白蛋白等蛋白质覆盖的状态。此时，在培养面由亲水性材料形成的情况下，可以认为，因层粘连蛋白与白蛋白等在培养面发生交换吸附，而将层粘连蛋白涂布于培养面。另一方面，在培养面由疏水性材料形成的情况下，可以认为，由于白蛋白等与培养面疏水结合，因此无法与层粘连蛋白交换吸附，无法将层粘连蛋白涂布于培养面。
此处，专利文献1中记载的发明中，虽然向培养容器涂布层粘连蛋白，然而对于使用添加有层粘连蛋白的培养基培养细胞的情况也有记载。
然而，对于用于实现它的具体构成没有给出，对于使用何种特性的培养容器才可以使用添加有层粘连蛋白的培养基培养细胞没有研究。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供能够在不向培养容器涂布层粘连蛋白的情况下合适地培养贴壁细胞的细胞培养方法及细胞培养系统。
用于解决问题的方法
为了达成上述目的，本发明的细胞培养方法是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养方法，采用了如下的构成，即，以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材来形成所述培养容器的培养面的至少一部分，在所述培养容器中，收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基和所述细胞，对所述细胞进行培养的构成。
另外，本发明的细胞培养系统是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养系统，采用了如下的构成，即，具备培养容器和培养基容器，所述培养容器以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材形成了所述培养容器的培养面的至少一部分，所述培养基容器收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基，通过从所述培养基容器向所述培养容器转移所述培养基并且向所述培养容器注入所述细胞，而进行所述细胞的培养的构成。
另外，本发明的细胞培养系统是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养系统，采用了如下的构成，即，具备培养容器、培养基容器和层粘连蛋白供给容器，所述培养容器以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材形成所述培养容器的培养面的至少一部分，所述培养基容器收容培养基，所述层粘连蛋白供给容器收容作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段，通过从所述培养基容器向所述培养容器转移所述培养基、从所述培养容器注入所述细胞以及从所述层粘连蛋白供给容器向所述培养容器转移层粘连蛋白或其片段，而进行所述细胞的培养的构成。
发明效果
根据本发明，能够提供可以不向培养容器涂布层粘连蛋白地合适地培养贴壁细胞的细胞培养方法及细胞培养系统。
附图说明
图1是关于无法将本发明的细胞培养方法应用于具有疏水性的培养面的培养容器的理由的说明图。
图2是表示本发明的实施方式的细胞培养系统的概略构成的说明图。
图3是表示本发明的实施方式的细胞培养系统的变形例的概略构成的说明图。
图4是表示比较例1～4及实施例1～9的培养容器的培养面的处理条件、接触角、培养天数以及细胞粘附的结果的图。
图5是表示实施例10～11的培养容器的培养面的处理条件、接触角、培养天数以及细胞粘附的结果的图。
图6是表示利用比较例1～4的培养容器的培养结果(培养面的状态)的显微镜照片的图。
图7是表示利用实施例1～4的培养容器的培养结果(培养面的状态)的显微镜照片的图。
图8是表示利用实施例5～9的培养容器的培养结果(培养面的状态)的显微镜照片的图。
图9是表示利用实施例10的培养容器的培养结果(培养面的状态)的显微镜照片的图。
图10是表示利用实施例11的培养容器的培养结果(培养面的状态)的显微镜照片的图。
具体实施方式
以下，对本发明的细胞培养方法及细胞培养系统的实施方式进行详细说明。
本实施方式的细胞培养方法的特征在于，是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养方法，以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材形成培养容器的培养面的至少一部分，在培养容器中收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基和细胞，对细胞进行培养。
所谓培养容器的培养面，是粘附细胞而进行培养的培养容器内的表面。
所谓接触角，是静止了的液体的表面与固体壁接触处液面与固体面所成的角，也称作静态接触角。存在有接触角大时表面的疏水性强、接触角小时表面的亲水性强的关系。
本实施方式的细胞培养方法中，培养容器的培养面的至少一部分使用选自上述的各种材料中的基材形成。另外，也优选使用这些基材形成培养面的全部。此外，也优选使用这些基材形成整个培养容器。通过使用这些基材形成培养容器，能够合适地制造用于培养贴壁细胞的柔软的袋状(bag形状)的培养容器。若使用此种柔软的袋状的培养容器，则能够在培养容器内使培养基的液厚大幅度变化。
另外，本实施方式的细胞培养方法中，以使接触角为84°以下的方式处理培养容器的培养面的至少一部分。另外，也优选以使接触角为84°以下的方式处理培养面的全部。
具体而言，对于培养容器的培养面，可以使用基于准分子照射或电晕处理的亲水化处理、或基于辐射处理的灭菌的任意一种、或它们的组合进行处理。此时，就准分子照射而言，通过变更处理速度可以调整亲水化的程度，就电晕处理而言，通过变更处理次数等条件可以调整亲水化的程度。
另外，辐射处理可以合适地使用电子束处理、或γ射线处理的任意一种。
在利用准分子照射以使接触角为84°以下的方式进行处理的情况下，例如优选设为12V、照射距离5毫米、处理速度1～10mm/秒，更优选设为2～8mm/秒。另外，在利用电晕处理以使接触角为84°以下的方式进行处理的情况下，例如优选以电极间距离5毫米、施加电流3.5A、工作台移动速度5m/分钟进行1～3次左右。
另外，本实施方式的细胞培养方法中，培养容器的培养面的接触角优选为40°以上且84°以下。这是因为，若接触角为该范围内，则可以使贴壁细胞更加合适地粘附于培养面。
此处，特别是在以聚对苯二甲酸乙二醇酯形成培养容器的培养面的情况下，若不进行辐射处理或亲水化处理，则即使接触角为84°以下，也无法在培养容器中收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基和细胞后对细胞进行粘附培养。对于其理由可以如下所示地考虑。
聚对苯二甲酸乙二醇酯在主链骨架具有大量具有极性的酯键，表观上的亲水性提高，其接触角与聚乙烯等其他树脂相比变低，然而亲水部的自由度低，多数被埋藏于树脂中，因此无法对白蛋白的吸附反应产生影响。
另一方面，若对聚对苯二甲酸乙二醇酯进行亲水化处理，则通过对其最表面赋予羟基、羧基，由此可以妨碍白蛋白的疏水键合。另外可以认为，若对聚对苯二甲酸乙二醇酯进行辐射处理，则因树脂内部的分子链的切断、开裂而使分子的运动性提高，因此亲水基可以移动到最表面，可以妨碍白蛋白的疏水键合。
需要说明的是，本说明书及技术方案的范围中记载的聚对苯二甲酸乙二醇酯可以使用一般作为“PET”销售的产品，例如也包含含有间苯二甲酸、萘二甲酸、1，4－丁二醇、丙二醇、新戊二醇、CHDM(环己烷二甲醇)等辅助成分的产品。
利用本实施方式的细胞培养方法培养的细胞只要是贴壁细胞，就没有特别限定，可以举出多能干细胞(iPS细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞)等。
根据本实施方式的细胞培养方法，可以将这些细胞粘附于培养面而合适地培养。
本实施方式的细胞培养方法中，作为细胞粘附因子，除了可以使用层粘连蛋白或其片段以外，还可以使用纤连蛋白、纤维蛋白原等粘附蛋白。作为层粘连蛋白的片段，例如可以合适地使用层粘连蛋白511－E8。
根据本实施方式的细胞培养方法，通过在如上所述地形成的培养容器中收容含有层粘连蛋白(或其片段)的培养基和细胞，可以使层粘连蛋白吸附于培养容器的培养面。
由此，由于不用在细胞培养前向培养容器的培养面涂布层粘连蛋白，就可以使细胞粘附于培养容器的培养面而进行培养，因此可以省略以往的烦杂的向培养容器的层粘连蛋白的涂布，并且能够省略已涂布层粘连蛋白的培养容器的制造、品质管理。
本发明的实施方式的细胞培养系统的特征在于，是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养系统，其具备培养容器和培养基容器，所述培养容器以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材形成培养容器的培养面的至少一部分，所述培养基容器收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基，通过从培养基容器向培养容器转移培养基、并且向培养容器注入细胞，而进行细胞的培养。
具体而言，例如如图2中示意性所示，本实施方式的细胞培养系统可以采用如下的构成，即，培养容器10与培养基容器20由管道30连接，在该管道30安装有泵40的构成。
在培养容器10的培养面，粘附贴壁细胞1而进行培养。在培养基容器20中填充有加入层粘连蛋白的培养基2，通过驱动泵40，将加入层粘连蛋白的培养基2经由管道30向培养容器10供给。
培养容器10的培养面使用上述的各种基材的任意一种或其组合形成，以使接触角为84°以下的方式进行了亲水化处理等。需要说明的是，也可以通过仅将培养面的一部分如此所述地形成并处理，而仅在该一部分培养贴壁细胞。
若将本实施方式的细胞培养系统设为此种构成，则即使不向培养容器10的培养面涂布层粘连蛋白，也可以使从培养基容器20转移至培养容器10的加入层粘连蛋白的培养基2中所含的层粘连蛋白吸附于培养容器10的培养面，因此能够使贴壁细胞1粘附于培养面而合适地培养。
培养容器10可以通过将热塑性树脂片利用热封等方法密封来形成，另外也可以利用吹塑成形等各种成形方法来形成。
另外，培养容器10优选由具有透气性的构件形成。具体而言，优选为氧透过系数为400ml·mm/m2·day·atm(37℃－80％RH)以上、二氧化碳透过系数为1200ml·mm/m2·day·atm(37℃－80％RH)以上的培养容器，更优选为氧透过系数为1000ml·mm/m2·day·atm(37℃－80％RH)以上、二氧化碳透过系数为3000ml·mm/m2·day·atm(37℃－80％RH)以上的培养容器。若培养容器10具有此种透气性，则可以获得优异的细胞增殖效率。
此外，为了可以确认内容物，培养容器10优选一部分或全部具有透明性。另外，本实施方式的培养容器10优选设为使用挠曲性构件形成的培养容器。
培养基容器20是收容用于注入培养容器10的加入层粘连蛋白的培养基2的容器。加入层粘连蛋白的培养基2可以通过将培养基与层粘连蛋白或其片段混合而制成。
管道30可以使用一般常用的管道，例如可以使用以硅橡胶、软质氯乙烯树脂、聚丁二烯树脂、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、氯代聚乙烯树脂、聚氨酯系热塑性弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、苯乙烯系弹性体、例如SBS(苯乙烯-丁二烯-苯乙烯)、SIS(苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯)、SEBS(苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯)、SEPS(苯乙烯-乙烯-丙烯-苯乙烯)等形成的管道。这些材料的透气性优异。
作为泵40，可以合适地使用能够通过挤压管道30而从培养基容器20将加入层粘连蛋白的培养基2转移至培养容器10的蠕动方式的泵。
另外，关于本发明的实施方式的细胞培养系统，作为其变形例，也优选设为如下的细胞培养系统，其特征在于，具备培养容器、培养基容器和层粘连蛋白供给容器，所述培养容器以接触角为84°以下、并且选自聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中、并且进行了辐射处理或亲水化处理的基材形成培养容器的培养面的至少一部分，所述培养基容器收容培养基，所述层粘连蛋白供给容器收容作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段，通过从培养基容器向培养容器转移培养基、从培养容器注入细胞以及从层粘连蛋白供给容器向培养容器转移层粘连蛋白或其片段，而进行细胞的培养。
具体而言，例如如图3中示意性所示，本实施方式的细胞培养系统的变形例可以将培养容器10与培养基容器20a与层粘连蛋白供给容器50利用管道30a连接、并在该管道30a安装泵40和泵40a而构成。
此外，通过驱动泵40，而从培养基容器20a将培养基3(不包含层粘连蛋白)经由管道30a转移至培养容器10，另外通过驱动泵40a，而从层粘连蛋白供给容器50将层粘连蛋白4经由管道30a转移至培养容器10，由此向培养容器10供给层粘连蛋白浓度调整培养基5。
除了可以同时驱动泵40和泵40a以外，也可以在驱动泵40时，将与层粘连蛋白供给容器50连接的管道30a的分支部分用夹子等设为关闭的状态，另外在驱动泵40a时，将与培养基容器20a连接的管道30a的分支部分用夹子等设为关闭的状态，分别进行培养基3和层粘连蛋白4的转移。另外，也可以在与培养容器10连接的管道30a的分支部分安装泵，用1个泵进行培养基3和层粘连蛋白4的各自的转移。
具体而言，例如可以将收容于培养基容器20a的培养基3(不包含层粘连蛋白)199ml、和收容于层粘连蛋白供给容器50的层粘连蛋白4(例如以浓度0.1mg/ml制备的层粘连蛋白溶液)1ml分别利用泵驱动转移至培养容器10，向培养容器10供给浓度为0.5μg/ml的层粘连蛋白浓度调整培养基5。在培养容器10的培养面的面积为200cm2的情况下，可以以使液体的厚度为1cm、每单位面积的层粘连蛋白浓度为0.5μg/cm2的方式进行调整。
另外，在出于不想改变该每单位面积的层粘连蛋白的浓度、然而想以高密度培养细胞等理由，暂时想将液体的厚度加倍时，可以通过将以浓度0.1mg/ml制备的层粘连蛋白溶液设为1ml、将培养基3设为399ml并转移至培养容器10，来进行该操作。
此外，有时在培养途中细胞的粘附的程度减弱。此种情况下，可以从层粘连蛋白供给容器50向培养容器10追加层粘连蛋白4，使细胞的粘附的强度增加。
此处，当层粘连蛋白供给容器50中的层粘连蛋白的浓度为高浓度时，送出的层粘连蛋白溶液的液量即变得极小，利用泵驱动的送液时的精度有可能降低。例如，在培养面积200cm2的培养容器10中想将层粘连蛋白的浓度设为0.5μg/cm2的情况下，必需的层粘连蛋白量为0.1mg。即，在收容于层粘连蛋白供给容器50的层粘连蛋白的浓度大于0.1mg/ml的情况下，送液量变得小于1ml，是难以用通用的泵精度优良地送液的液量。因此，层粘连蛋白供给容器50中的层粘连蛋白的浓度优选设为0.1mg/ml以下。
本实施方式的细胞培养方法的变形例中，对于其他的方面，可以设为与上述的本实施方式的细胞培养方法相同。
若如该变形例所示地构成本实施方式的细胞培养系统，则可以通过将培养基3和层粘连蛋白4单独地转移至培养容器10，来调整培养容器10的培养面的层粘连蛋白浓度，能够柔性地调整贴壁细胞1的培养环境。这是在使用以往的涂布有层粘连蛋白的培养容器的情况下无法获得的效果。
如上说明所示，根据本实施方式的细胞培养方法及细胞培养系统，能够不向培养容器涂布层粘连蛋白地合适地培养贴壁细胞。另外，可以调整吸附于培养容器的培养面的层粘连蛋白的浓度，也能够柔性地调整贴壁细胞的培养环境。
[实施例]
以下，对为了评价本实施方式而进行的试验进行说明。
以使使用各种材料形成的培养容器的培养面的接触角为各种各样的值的方式进行处理，进行了利用本实施方式的细胞培养方法的细胞培养。具体而言，如下所示。
[培养容器]
作为培养容器，准备了将聚乙烯(PE，宇部丸善聚乙烯株式会社制，品名UMERIT125FN)制成膜后加工为盘型的培养容器、将环状烯烃共聚物(COC，Polyplastics株式会社制，品名TOPAS8007F-04)制成膜后加工为盘型的培养容器、将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET，SK Chemical株式会社制，品名BR8040)注射成形后制成盘型的培养容器。PE、COC的膜变成盘型的加工是通过折曲膜的端部、并利用脉冲热封机熔接来进行的。
[培养面的处理]
如图4及图5所示，对除去比较例4以外的各个培养容器，进行利用准分子照射装置(株式会社M.D.COM(エム·ディ·コム)制)的亲水化处理、利用间歇式电晕处理装置(春日电机株式会社制)的亲水化处理、或电子束处理的任意一种，或者使用它们的组合进行处理。电子束处理委托Radia工业株式会社进行。
在各处理中，就准分子照射而言，可以通过变更处理速度来调整亲水化的程度，就电晕处理而言，可以通过变更处理次数等条件来调整亲水化的程度。通过调整这些条件，准备了具有图4及图5所示的接触角的培养面的培养容器。
需要说明的是，准分子照射设为12V，照射距离设为5mm，电晕处理设为电极间距离5mm，施加电流设为3.5A，工作台移动速度设为5m/min。
[接触角的测定]
在接触角的测定中，使用了固液界面分析系统DropMaster 700(协和界面科学株式会社制)。向膜上滴下纯水3μl而测定出接触角。
[细胞培养方法]
所使用的贴壁细胞为iPS细胞(1231A3株)。
所使用的培养基为StemFit AK02N(型号RCAK02N，味之素株式会社制)。
向各培养容器注入包含10mM的Rho结合激酶抑制剂Y-27632(型号253-00511，和光纯药工业株式会社制)的上述培养基，并且以达到0.5μg/cm2的方式向各培养容器加入0.5mg/ml层粘连蛋白511－E8(型号892012，株式会社Nippi制)。其后，注入包含iPS细胞的细胞悬浮液，在37℃进行7天培养。此时，培养基为1.5ml，细胞悬浮液为5μl。接种的细胞数约为1.3×104cells。另外，从培养开始起经过1天后，将培养基更换为不含有Y-27632的培养基，其后每天进行培养基更换。
[粘附性的评价]
利用显微镜观察培养1天、6天、或7天后的细胞的粘附状态，以是否观察到细胞的粘附、伸展为基准，评价了细胞的粘附性。
需要说明的是，通常在对培养容器的培养面进行了能够培养贴壁细胞的恰当的处理的情况下，细胞在1天发生粘附。另外，在细胞未发生粘附的情况下，其后无论经过几天也不粘附，因此在比较例1～4中，仅在培养1天后就判断出各培养容器的培养适合性(细胞粘附的可否)。
[层粘连蛋白的浓度的影响]
除了以使层粘连蛋白的浓度分别为0.125μg/cm2、0.5μg/cm2、4.0μg/cm2的方式向各培养容器添加层粘连蛋白511－E8以外，利用上述的步骤进行了细胞培养。
对于如上所述地进行了细胞培养的结果，在图4及图5中，将可以粘附培养细胞的情况用○表示，将无法粘附培养细胞的情况用×表示。另外，在图6～10中，给出拍摄培养面的状态而得的显微镜照片。
在比较例1～3中，为由聚乙烯(PE)或环状烯烃共聚物(COC)形成、且其培养面的接触角大于84°的培养容器时，无法恰当地培养贴壁细胞。另外，在比较例4中，为由聚对苯二甲酸乙二醇酯形成、且没有进行辐射处理、亲水化处理的任意一个的培养容器时，无法恰当地培养贴壁细胞。
与之不同，在实施例1～9中，为由聚乙烯(PE)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、或环状烯烃共聚物(COC)形成、且其培养面的接触角为84°以下、并且进行了辐射处理或亲水化处理的培养容器时，可以培养贴壁细胞。
另外，在实施例10、11中，为由聚乙烯(PE)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)形成、且其培养面的接触角为84°以下、并且进行了辐射处理或亲水化处理的培养容器时，无论在层粘连蛋白浓度为0.125μg/cm2、0.5μg/cm2、4.0μg/cm2的任意情况下，都可以培养贴壁细胞。
本发明并不限定于以上的实施方式、实施例，当然可以在本发明的范围内中进行各种变更实施。
例如，上述实施例中使用iPS细胞作为贴壁细胞，然而并不限定于此，只要是贴壁细胞，则可以使用其他的细胞。另外，培养基的种类等也可以适当地变更。
将该说明书中记载的文献及成为本申请的巴黎优先权的基础的日本申请说明书的内容全都引用到此处。
产业上的可利用性
本发明能够合适地用于使用培养容器大量培养贴壁细胞的情况。
符号的说明
1贴壁细胞，2加入层粘连蛋白的培养基，3培养基(不包含层粘连蛋白)，4层粘连蛋白，5层粘连蛋白浓度调整培养基，10培养容器，20、20a培养基容器，30、30a管道，40、40a泵，50层粘连蛋白供给容器。

Claims (7)

1.一种细胞培养方法，其特征在于，
是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养方法，
以从聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中选择、并且实施辐射处理或亲水化处理使接触角为84°以下的基材形成所述培养容器的培养面，且不用层粘连蛋白涂布所述培养面，
所述辐射处理使用电子束处理或γ射线处理的任意一种，
所述亲水化处理使用准分子照射或电晕处理的任意一种，
在所述培养容器中，收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基和所述细胞，
使所述培养面吸附所述细胞粘附因子，并使所述细胞粘附于吸附了所述细胞粘附因子的所述培养面，从而对所述细胞进行培养。
2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，
所述基材为进行了辐射处理或亲水化处理的、聚乙烯、环状烯烃共聚物或聚对苯二甲酸乙二醇酯的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，
所述细胞为多能干细胞、胚胎干细胞或它们的分化细胞。
4.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，
利用所述培养容器在封闭系统中培养所述细胞。
5.一种细胞培养系统，其特征在于，
是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养系统，且以如下方式构成：
其具备培养容器和培养基容器，
所述培养容器中，以从聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中选择、并且实施辐射处理或亲水化处理使接触角为84°以下的基材形成所述培养容器的培养面，且所述培养容器未用层粘连蛋白涂布，
所述培养基容器收容含有作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段的培养基，
所述辐射处理使用电子束处理或γ射线处理的任意一种，
所述亲水化处理使用准分子照射或电晕处理的任意一种，
通过从所述培养基容器向所述培养容器转移所述培养基、并且向所述培养容器注入所述细胞，而进行所述细胞的培养。
6.一种细胞培养系统，其特征在于，
是使细胞粘附于培养容器而进行培养的细胞培养系统，且以如下方式构成：
其具备培养容器、培养基容器和层粘连蛋白供给容器，
所述培养容器中，以从聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环状烯烃聚合物、环状烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、离聚物、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、乙烯－乙烯醇共聚物、乙烯－丙烯酸共聚物、乙烯－丙烯酸甲酯共聚物、乙烯－甲基丙烯酸共聚物、乙烯－甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、氟系树脂中选择、并且实施辐射处理或亲水化处理使接触角为84°以下的基材形成所述培养容器的培养面，且所述培养容器未用层粘连蛋白涂布，
所述培养基容器收容培养基，
所述层粘连蛋白供给容器收容作为细胞粘附因子的层粘连蛋白或其片段，
所述辐射处理使用电子束处理或γ射线处理的任意一种，
所述亲水化处理使用准分子照射或电晕处理的任意一种，
通过从所述培养基容器向所述培养容器转移所述培养基、向所述培养容器注入所述细胞并且从所述层粘连蛋白供给容器向所述培养容器转移层粘连蛋白或其片段，而进行所述细胞的培养。
7.根据权利要求6所述的细胞培养系统，其特征在于，
收容于所述层粘连蛋白供给容器的层粘连蛋白的浓度为0.1mg/ml以下。
CN201880012633.0A 2017-02-20 2018-01-25 细胞培养方法以及细胞培养系统 Active CN110312787B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-029163 2017-02-20
JP2017029163A JP6957893B2 (ja) 2017-02-20 2017-02-20 細胞培養方法、及び細胞培養システム
PCT/JP2018/002317 WO2018150841A1 (ja) 2017-02-20 2018-01-25 細胞培養方法、及び細胞培養システム

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110312787A CN110312787A (zh) 2019-10-08
CN110312787B true CN110312787B (zh) 2024-03-01

Family

ID=63170599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880012633.0A Active CN110312787B (zh) 2017-02-20 2018-01-25 细胞培养方法以及细胞培养系统

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200056148A1 (zh)
EP (1) EP3584309A4 (zh)
JP (1) JP6957893B2 (zh)
KR (1) KR102360048B1 (zh)
CN (1) CN110312787B (zh)
WO (1) WO2018150841A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6801728B2 (ja) * 2019-03-08 2020-12-16 住友ベークライト株式会社 分析用デバイス

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103649112A (zh) * 2011-04-08 2014-03-19 国立大学法人大阪大学 改造层粘连蛋白及其利用
WO2016136251A1 (ja) * 2015-02-25 2016-09-01 荏原実業株式会社 細胞担持用基材及びその製造方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60036385T2 (de) * 1999-06-21 2008-06-26 The General Hospital Corp., Boston Zellkultursysteme und verfahren für einrichtungen zur organunterstützung
DK1675944T3 (da) * 2003-10-10 2011-02-28 Ge Ming Lui Humane corneale endotelceller og fremgangsmåder til opnåelse og dyrkning af celler til corneal celletransplantation
DE602006019618D1 (de) * 2005-08-23 2011-02-24 Oriental Yeast Co Ltd Technik zur kultivierung einer mesenchymalen stammzelle unter verwendung von laminin-5
US8034434B2 (en) * 2007-02-09 2011-10-11 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Transparent molded body and antireflective member using the same
JP5733986B2 (ja) * 2008-02-21 2015-06-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 細胞の付着、培養、及び剥離のための方法、表面改質されたプレート、並びに組成物
US20110117645A1 (en) * 2008-03-31 2011-05-19 Oriental Yeast Co., Ltd. Method for proliferation of pluripotent stem cells
US20100129910A1 (en) * 2008-07-02 2010-05-27 Denis Evseenko Cell matrix related compositions and their use for generating embryoid bodies
WO2014103534A1 (ja) * 2012-12-28 2014-07-03 国立大学法人大阪大学 コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用
JP6421453B2 (ja) * 2014-05-21 2018-11-14 大日本印刷株式会社 細胞培養容器の管理方法
JP6770435B2 (ja) * 2014-10-31 2020-10-14 京都府公立大学法人 ラミニンによる網膜および神経の新規治療
JP6849957B2 (ja) * 2015-11-10 2021-03-31 国立大学法人京都大学 ラミニンフラグメント含有培地を用いる細胞培養方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103649112A (zh) * 2011-04-08 2014-03-19 国立大学法人大阪大学 改造层粘连蛋白及其利用
WO2016136251A1 (ja) * 2015-02-25 2016-09-01 荏原実業株式会社 細胞担持用基材及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110312787A (zh) 2019-10-08
WO2018150841A1 (ja) 2018-08-23
EP3584309A1 (en) 2019-12-25
KR102360048B1 (ko) 2022-02-07
EP3584309A4 (en) 2020-11-25
KR20190099323A (ko) 2019-08-26
JP6957893B2 (ja) 2021-11-02
US20200056148A1 (en) 2020-02-20
JP2018134007A (ja) 2018-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103180430B (zh) 粘附细胞用培养容器以及粘附细胞用培养容器的制造方法
KR101086916B1 (ko) 세포 또는 조직의 배양 장치 및 배양 방법
CN106170540B (zh) 多腔室培养容器以及细胞培养方法
JPH02501529A (ja) 細胞培養装置用の生体適合性ポリオルガノシロキサン組成物
KR20170093866A (ko) 세포 배양에서의 복수 용기 사이의 송액 방법
US20170073626A1 (en) Cell culture method and cell culture device
CN110312787B (zh) 细胞培养方法以及细胞培养系统
CN111511898A (zh) 细胞培养方法及装置
EP4048773A1 (en) Cell culture chamber with improved cell-contacting surfaces
CN112074597B (zh) 培养容器基材、培养容器、以及培养容器基材的制造方法
US20120040455A1 (en) Curved polyhedrons
CA3170695A1 (en) Multilayered membrane for spheroid culture
JP4496318B2 (ja) 超薄型マルチウェルプレートの製造法
WO2021182316A1 (ja) 袋状培養容器
JP7196419B2 (ja) 細胞培養容器、及び細胞培養容器の製造方法
WO2018135289A1 (ja) 培養容器、及び細胞培養方法
WO2018066287A1 (ja) 細胞培養容器、細胞培養システム、細胞培養方法、及び細胞培養容器の製造方法
JP2021061771A (ja) 遺伝子検査容器用部材、及び遺伝子検査容器
JP2024060180A (ja) 細胞培養方法、細胞培養装置、及び培養容器
JP2018139500A (ja) 培養容器、及び培養容器の製造方法
JP2013179915A (ja) 劣化耐性を有する表面親水性基材の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant