WO2018135289A1 - 培養容器、及び細胞培養方法 - Google Patents

培養容器、及び細胞培養方法 Download PDF

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WO2018135289A1
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cells
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culture container
cell
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貴彦 戸谷
洋佑 松岡
郷史 田中
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東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture technique, and more particularly to a culture vessel and a cell culture method for adhesion culture of cells.
  • pluripotent stem cells iPS cells or the like
  • embryonic stem cells ES cells
  • the current mainstream culture method is to coat a cell adhesion factor and adhere the cells to the culture surface.
  • cultivation a cell is peeled and collect
  • the method of exfoliating the cells from the culture container first drains the medium from the culture container, soaks the cells in the exfoliation solution for a certain period of time, and then places the medium in the culture container.
  • the medium was stirred by pipetting and the cells were detached.
  • cells that could not be detached from the culture vessel were detached by scraping with a scraper or the like.
  • the inventors of the present invention manufactured a culture vessel using polyethylene terephthalate (PET) that had been subjected to a certain treatment, and performed adhesion culture using this culture vessel, thereby converting the cells into a stripping solution. It has been found that it can be easily peeled off simply by dipping for a short time.
  • PET polyethylene terephthalate
  • Patent Document 1 manufacturing a culture vessel for adherent cells using polyethylene terephthalate is described in Patent Document 1.
  • a culture vessel in which a film subjected to charge treatment such as plasma discharge to be hydrophilized is disposed.
  • Patent Document 1 is not devised to detach cells from the culture vessel, and does not describe or suggest physical properties of the culture vessel suitable for cell detachment.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a culture container and a cell culture method capable of easily peeling the cells from the culture container after the cells are adhered and cultured in the culture container. .
  • the culture vessel of the present invention is a culture vessel that adheres and cultures cells, wherein at least a part of the culture surface of the culture vessel is made of polyethylene terephthalate, and the culture surface advances when water slides down.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method in which cells are adhered and cultured in a culture vessel, wherein at least a part of the culture surface of the culture vessel is made of polyethylene terephthalate, and the culture surface advances when water slides down.
  • Adhesion culture is performed using the culture vessel in which the contact angle and receding contact angle satisfy the formula (1), and when the cells are detached, the medium is discharged from the culture vessel to remove the cells in the culture vessel.
  • a cell culture method comprising the steps of: dipping in a cell, adding a medium to the culture vessel, and applying a constant external force to the cells to selectively detach the cells. 34.7 ° ⁇ advancing contact angle ⁇ retreating contact angle ⁇ 80.3 ° (1)
  • the present invention after cells are adhered and cultured in a culture container, they can be easily detached when the cells are detached from the culture container.
  • the culture container of the present embodiment is a culture container that adheres and cultures cells, and at least a part of the culture surface is made of polyethylene terephthalate (PET).
  • PET polyethylene terephthalate
  • the culture surface is a surface to which cells are adhered.
  • the culture container is in a dish shape, the bottom surface in the dish is the culture surface.
  • the entire culture vessel is made of polyethylene terephthalate.
  • the advancing contact angle and receding contact angle at the time of water sliding on the culture surface of the culture container of the present embodiment satisfy the following formula (1). 34.7 ° ⁇ advancing contact angle ⁇ retreating contact angle ⁇ 80.3 ° (1)
  • the contact angle is an angle formed by the liquid surface and the solid surface where the surface of the stationary liquid contacts the solid wall ( ⁇ s in FIG. 1), and means a static contact angle.
  • the contact angle of the culture surface suitable for culturing adherent cells is said to be about 60 ° to 80 ° (Journal of Biomedical Materials Research, Vol.28, 783-789 (1994)), and the contact angle is within this range. If it is inside, the hydrophilicity of the culture surface is high, and it is known that adherent cells adhere favorably to the culture surface.
  • Hysteresis is contact angle hysteresis and indicates the difference between the forward contact angle ( ⁇ a) when the water droplet slides down the culture surface and the backward contact angle ( ⁇ r) (hysteresis during sliding ( ⁇ a- ⁇ r)). . That is, it is calculated based on the advancing contact angle and the receding contact angle when the water droplet is dropped on the horizontally supported surface, the surface is gradually inclined, and the droplet starts to fall. This hysteresis is used as an index indicating the dynamic wettability of the surface.
  • the culture surface hysteresis (advancing contact angle ⁇ retreating contact angle) in the culture container of the present embodiment is preferably greater than 34.7 ° and less than 80.3 °.
  • the hysteresis is 34.7 ° or less, the cells may not adhere sufficiently to the culture surface and may be detached from the culture surface during the culture.
  • the hysteresis is 80.3 ° or more, the cells are on the culture surface. This is because it is too strongly bonded and difficult to peel.
  • the hysteresis is more preferably greater than 34.7 ° and less than or equal to 55.9 °, more preferably greater than or equal to 43.6 ° and less than or equal to 55.9 °.
  • the hysteresis is set in such a range, the cells can be appropriately adhered to the culture surface and the cells can be easily detached from the culture surface.
  • the culture container of this embodiment in which the hysteresis of the culture surface is in such a range can be obtained by subjecting polyethylene terephthalate, which is a material thereof, to radiation treatment (for example, electron beam treatment). Specifically, it can be obtained by forming polyethylene terephthalate as a container and then performing electron beam treatment. It is also possible to obtain polyethylene terephthalate by treating it with an electron beam and then forming it as a container.
  • the static contact angle of the culture surface in the culture container of the present embodiment is preferably greater than 55.8 °, more preferably 66.9 ° or more, from the viewpoint of ease of cell peeling. More preferably, it is larger than °.
  • the absorbed dose of this electron beam treatment is preferably 10 to 50 kGy, more preferably 15 to 45 kGy.
  • the contact angle of the culture surface is not greatly changed, and thus the culture surface is not hydrophilized.
  • such an electron beam treatment increases the hysteresis of the culture surface to a certain degree.
  • the hydrophilicity of the culture surface is increased and the cell adhesion rate is improved.
  • the culture container of this embodiment does not hydrophilize the culture surface, it can be manufactured without exposing the culture surface.
  • the culture container of this embodiment should just be what the culture surface consists of a polyethylene terephthalate, and may consist of two or more layers. In this case, another resin or the like may be provided in the lower layer of polyethylene terephthalate.
  • the polyethylene terephthalate described in the present specification and claims can be generally those commercially available as “PET”, such as isophthalic acid, naphthalenedicarboxylic acid, 1,4-butanediol, Those containing auxiliary components such as propylene glycol, neopentyl glycol, and CHDM (cyclohexanedimethanol) are also included.
  • the culture vessel of this embodiment shall have the culture surface coated with the cell adhesion factor.
  • a cell adhesion factor it is preferable to use adhesion proteins, such as laminin, fibronectin, vitronectin, and fibrinogen, and it is particularly preferable to use laminin.
  • adhesion proteins such as laminin, fibronectin, vitronectin, and fibrinogen.
  • the cell adhesion factor is adsorbed to the culture surface by injecting the cell adhesion factor into the culture container without coating the cell adhesion factor on the culture surface, and integrin on the surface of the adherent cell It can also interact with and bind to cell adhesion factors to adhere adherent cells to the culture surface.
  • the shape of the culture vessel of the present embodiment is not particularly limited, and may be a general dish or flask shape, or a bag or bottle shape.
  • the cell cultured using the culture container of this embodiment will not be specifically limited if it is an adhesion cell, A pluripotent stem cell (iPS cell etc.), an embryonic stem cell (ES cell), etc. can be mentioned.
  • these cells can be suitably cultured by adhering to the culture surface, and these cultured cells can be easily detached from the culture surface and collected. It is.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method in which cells are adhered and cultured in a culture vessel, wherein at least a part of the culture surface of the culture vessel is made of polyethylene terephthalate, and the culture surface advances when water slides down.
  • Adhesion culture is performed using the culture vessel in which the contact angle and receding contact angle satisfy the formula (1), and when the cells are detached, the medium is discharged from the culture vessel to remove the cells in the culture vessel.
  • a cell culture method comprising the steps of: dipping in a cell, adding a medium to the culture vessel, and applying a constant external force to the cells to selectively detach the cells. 34.7 ° ⁇ advancing contact angle ⁇ retreating contact angle ⁇ 80.3 ° (1)
  • the adherent cells can be appropriately adhered to the culture surface of the culture container and cultured, and the medium is added after being immersed in a stripping solution.
  • the cells can be detached without having to scrape the cells from the culture surface with a scraper.
  • a certain external force to the cells such as bending the culture surface or applying a water flow, it is possible to selectively peel only cells having a certain adhesion.
  • the adherent cells can be cultured in the culture container, and the cultured adherent cells can be easily detached from the culture container by using a stripping solution. Is possible. This makes it possible to reduce cell damage due to detachment and to recover cells compared to when cells are immersed in a detachment solution for a long time, when a strong detachment solution is used, or when a cell is detached using a scraper. It is also possible to reduce the required work time.
  • Example 1 As a culture vessel, a 6-well plate for cell culture (product number 3810-006, manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd., Comparative Example 1) made of polystyrene (PS) which has been subjected to hydrophilic treatment by charge treatment in advance and is commercially available, and polyethylene A terephthalate (PET, manufactured by SK Chemicals, product name BR8040) was injection-molded to form a dish mold and subjected to electron beam treatment (absorbed dose 18 kGy) (Example 1). The electron beam treatment in Example 1 was performed by requesting Raje Industries Co., Ltd.
  • PS polystyrene
  • PET polyethylene A terephthalate
  • the adherent cells used are iPS cells (1231A3 strain).
  • the medium used was StemFit AK02N (Part No. RCAK02N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.).
  • PBS product number 14249-24, manufactured by Nacalai Tesque
  • 0.5 mg / ml laminin 511E8 product number 892012, manufactured by Nippi
  • coating was performed at 37 degreeC for 1 hour. After discharging the excess coating solution, the above medium containing 10 mM Y-27632 (Part No.
  • the medium was 1.5 ml and the cell suspension was 5 ⁇ l.
  • the number of cells seeded was approximately 1.3 ⁇ 10 4 cells.
  • the medium was replaced with a Y-27632-free medium after one day from the start of the culture, and thereafter the medium was changed every day.
  • the stripping solution is a 1: 1 mixture of PBS (product number 14249-24, manufactured by Nacalai Tesque) containing 0.5 mM EDTA (product number 0689414, manufactured by Nacalai Tesque) and TrypLE select (product number A1285901, manufactured by Thermo Fisher Scientific). Using. The result is shown in FIG. Comparative Example 1 in FIG.
  • Example 1 in FIG. 2 is a photograph of the culture surface taken 2 minutes after injecting the stripping solution into the culture vessel, and an enlarged photograph is shown in the box below.
  • Example 1 As shown in FIG. 2, in Comparative Example 1, almost no cells were detached from the colonies, and the cells could not be detached without using a scraper. On the other hand, in Example 1, it was seen that the cells were gradually detached from the colonies, and it was possible to collect the cells only by pipetting. Further, the exfoliated cells in Example 1 were maintained in a more normal form than the exfoliated cells in Comparative Example 1, and the undifferentiated cell rate could be maintained high.
  • PET polyethylene terephthalate
  • Example 2 As a culture container, polyethylene terephthalate (PET, manufactured by SK Chemicals, product name BR8040) is injection-molded and formed into a dish mold (not subjected to radiation treatment or charge treatment (Comparative Example 2)), PET is injection-molded and dish-molded
  • a sample formed with an electron beam treatment (absorbed dose of 18 kGy) (Example 2), a PET injection molded and formed into a dish mold, and subjected to an electron beam treatment (absorbed dose of 43 kGy) ( Example 3), PET injection-molded and formed into a dish type, which has been subjected to hydrophilic treatment by charge treatment (Comparative Example 3), and commercially available after hydrophilic treatment by charge treatment.
  • a 6-well plate Part No. 3810-006, manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd., Comparative Example 4) made of polystyrene (PS) was prepared.
  • the electron beam processing in Examples 2 and 3 was performed by requesting Raji Industries Co., Ltd.
  • the charge treatment in Comparative Example 3 was performed using a batch-type corona treatment apparatus (manufactured by Kasuga Denki Co., Ltd.).
  • the contact angle and hysteresis of these culture vessels were measured.
  • a solid-liquid interface analysis system DropMaster 700 manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.
  • the contact angle ( ⁇ s) was measured by dropping 3 ⁇ l of pure water on the film.
  • the sliding hysteresis ( ⁇ a- ⁇ r) was measured by dropping 30 ⁇ l of pure water onto the film and tilting the measuring table by 1 ° every second, and the forward contact angle ( ⁇ a) and the backward contact angle ( ⁇ r) was calculated by the tangent method.
  • the adherent cells used are iPS cells (1231A3 strain).
  • the medium used was StemFit AK02N (Part No. RCAK02N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.). This medium was injected into the culture vessels in Examples 2 and 3 and Comparative Examples 2, 3, and 4, and a cell suspension containing iPS cells was injected, and spot culture was performed at 37 ° C. for 4 days. At this time, the medium was 300 ⁇ l, and the cell suspension was 5 ⁇ l (total amount of liquid: 305 ⁇ l). The number of cells seeded was approximately 13000 cells. The culture area was 2 cm 2 .
  • the culture container was washed with 200 ⁇ l of PBS (product number 14249-24, manufactured by Nacalai Tesque), then 50 ⁇ l of a stripping solution was added, and the cultured cells were immersed in the stripping solution at 37 ° C. for 3 minutes.
  • the stripping solution is a 1: 1 mixture of PBS (Part No. 14249-24, Nacalai Tesque) containing 0.5 mM EDTA (Part No. 0689414, Nacalai Tesque) and TrypLE select (Part No. A1285901, Thermo Fisher Scientific).
  • 200 ⁇ l of medium was added, and pipetting was performed 20 times using a pipette. And the number of detached cells was counted.
  • the number of cells was measured using a one-cell counter (product number OC-C-S02, manufactured by FPI). The same applies to the following.
  • the medium was discharged from the culture container, and the culture container was washed with 200 ⁇ l of PBS (product number 14249-24, manufactured by Nacalai Tesque). Subsequently, 200 ⁇ l of 0.25% trypsin (product number 25200-056, manufactured by Thermo Fisher Fisher Scientific) was added and immersed for 5 minutes at 37 ° C., and all cells were detached from the culture vessel. And the number of remaining cells was counted. Furthermore, the percentage of the number of exfoliated cells relative to the total of the number of exfoliated cells and the number of remaining cells was calculated as the cell exfoliation rate. The result is shown in FIG.
  • a detachment solution composed of EDTA, PBS and TrypLE select was used as a detachment solution for detaching and recovering cultured cells, and 0.25% trypsin was used as a detachment solution for detaching to count the number of remaining cells.
  • the reason is that 0.25% trypsin is a relatively strong exfoliating agent, so that cells are damaged when used for exfoliation to recover iPS cells.
  • the culture container of Comparative Example 2 had a contact angle of 70.8 ° and a hysteresis of 34.7 °. The cells could not adhere sufficiently, and the cells were detached from the culture surface during the culture.
  • the culture container of Example 2 had a contact angle of 72.8 ° and a hysteresis of 43.6 °, and the cells adhered to the culture surface and could be appropriately cultured.
  • the cell detachment rate after 20 pipettings was 42.1%, and an excellent cell detachment rate was obtained.
  • the culture container of Example 3 had a contact angle of 66.9 ° and a hysteresis of 55.9 °, and the cells adhered to the culture surface and could be appropriately cultured.
  • the cell detachment rate after 20 pipettings was 34.5%, and a relatively excellent cell detachment rate was obtained.
  • the culture container of Comparative Example 3 had a contact angle of 55.8 ° and a hysteresis of 80.3 °, and the cells adhered to the culture surface and could be appropriately cultured. However, the cells were obtained by pipetting 20 times. The peel rate was 23.5%, which was a relatively low cell peel rate.
  • the culture container of Comparative Example 4 had a contact angle of 75.8 ° and a hysteresis of 35.4 °, and the cells adhered to the culture surface and could be properly cultured. However, the cells were obtained by pipetting 20 times. The peel rate was 15.8%, which was a low cell peel rate.
  • the cells can be appropriately cultured by adhering to the culture vessel and can be easily detached. It became clear that it was possible to do.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • iPS cells are used as adherent cells in the above-described examples
  • the present invention is not limited to this, and other cells can be used as long as they are adherent cells.
  • the type of medium and the like can be changed as appropriate.
  • the present invention can be suitably used when a large amount of adherent cells are cultured using a culture vessel.

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Abstract

細胞を接着培養する培養容器であって、培養容器の培養面の少なくとも一部がポリエチレンテレフタレートからなり、培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が式（１）を満足する培養容器とすることによって、細胞を培養容器で接着培養した後、培養容器から細胞を剥離する際に、容易に剥離可能な培養容器を提供することを可能とする。また、細胞を培養容器で接着培養する細胞培養方法であって、前述の培養容器を用いて接着培養を行い、細胞の剥離時、培養容器から培地を排出して、培養容器における細胞を剥離液に浸漬し、培養容器に培地を添加し、細胞に一定の外力を与えて細胞を選択的に剥離する工程を含む細胞培養方法によって、細胞を培養容器で接着培養した後、培養容器から細胞を剥離する際に、容易に剥離可能な培養方法を提供することを可能とする。　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）

Description

培養容器、及び細胞培養方法
　本発明は、細胞の培養技術に関し、特に細胞を接着培養するための培養容器、及び細胞培養方法に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
　このような状況において、培養容器に細胞と培地を注入して、細胞を大量培養することが行われている。
　ここで、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を培養容器で接着培養する場合、プラズマ処理などを施して親水化したポリスチレン製の培養容器の培養面にラミニンなどの細胞接着因子をコートし、その培養面に細胞を接着させて培養するのが、現在主流の培養方法である。そして、培養終了後、培養容器から細胞を剥離して回収し、上記の様々な分野において使用されている。
　培養容器から細胞を剥離する方法は、具体的には、図４に示すように、まず培養容器から培地を排出して、細胞を剥離液に一定時間浸漬させた後、次いで培地を培養容器に入れてピペッティングにより培地を攪拌して、細胞の剥離が行われていた。また、培養容器から剥がれない細胞は、スクレーパーなどで掻き取ることによって、剥離されていた。
特開２０１４－１８３７５２号公報
　しかしながら、ポリスチレンやポリオレフィンなどからなる一般的な培養容器を使用した場合、実際には、細胞を剥離液に短時間浸漬させることでは剥がしにくく、剥離剤に長時間浸漬するか、又はスクレーパーで物理的に剥離する必要があり、細胞へのダメージが懸念されるという問題があった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、一定の処理を施したポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を用いて培養容器を製造し、この培養容器を用いて接着培養を行うことで、細胞を剥離液に短時間浸漬させるだけで、容易に剥離できることを見いだした。
　ここで、ポリエチレンテレフタレートを用いて接着細胞用の培養容器を製造することは、特許文献１に記載されている。この文献において、細胞の接着性を向上させるために、プラズマ放電などの電荷処理を施して親水化したフィルムを配置した培養容器が開示されている。
　しかしながら、特許文献１は、細胞を培養容器から剥離することについて工夫がされたものではなく、細胞の剥離に適した培養容器の物性について記載や示唆がされたものではなかった。
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、細胞を培養容器で接着培養した後、培養容器から細胞を容易に剥離することが可能な培養容器、及び細胞培養方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、細胞を接着培養する培養容器であって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部がポリエチレンテレフタレートからなり、前記培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が式（１）を満足することを特徴とする培養容器。
　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）
　また、本発明の細胞培養方法は、細胞を培養容器で接着培養する細胞培養方法であって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部がポリエチレンテレフタレートからなり、前記培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が式（１）を満足する前記培養容器を用いて接着培養を行い、前記細胞の剥離時、前記培養容器から培地を排出して、前記培養容器における前記細胞を剥離液に浸漬し、前記培養容器に培地を添加し、前記細胞に一定の外力を与えて前記細胞を選択的に剥離する工程を含む細胞培養方法。
　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）
　本発明によれば、細胞を培養容器で接着培養した後、培養容器から細胞を剥離する際に、容易に剥離することが可能となる。
接触角及びヒステリシスの測定についての説明図である。 試験１における実施例及び比較例の細胞剥離結果を示す図である。 試験２における実施例及び比較例の培養容器の接触角、ヒステリシス、及び細胞剥離率を示す図である。 従来の細胞剥離工程を示す図である。
　以下、本発明の培養容器、及び細胞培養方法の一実施形態について詳細に説明する。
　本実施形態の培養容器は、細胞を接着培養する培養容器であって、その培養面の少なくとも一部が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）からなる。この培養面とは、細胞を接着する表面であり、培養容器がディッシュ形状の場合、そのディッシュ内の底面が培養面となる。また、培養容器全体をポリエチレンテレフタレートからなるものとすることも好ましい。
　また、本実施形態の培養容器は、培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が、次の式（１）を満足する。
　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）
　ここで、接触角とヒステリシスについて、図１を参照して説明する。
　接触角とは、静止した液体の表面が固体壁に接するところで液面と固体面がなす角であり（図１のθｓ）、静的接触角を意味する。接触角が大きい場合には表面の疎水性が強く、接触角が小さい場合には表面の親水性が強いという関係がある。
　一般に、接着細胞の培養に適する培養面の接触角は、６０°～８０°程度と言われており（Journal　of　Biomedical　Materials　Research,　Vol.28,　783-789(1994)）、接触角がこの範囲内であれば培養面の親水性は高く、接着細胞が培養面に好適に接着することが知られている。
　ヒステリシスとは、接触角ヒステリシスであり、水滴が培養面を滑落するときの前進接触角（θa）と、後退接触角（θr）との差（滑落時ヒステリシス（θa－θr））を示している。すなわち、水平に支持した表面に水滴を摘下し、表面を徐々に傾け、液滴が転落を開始したときの前進接触角と後退接触角にもとづき算出される。このヒステリシスは、表面の動的な濡れ性を示す指標として用いられる。
　本実施形態の培養容器における培養面のヒステリシス（前進接触角－後退接触角）は、３４．７°より大きく、８０．３°未満であることが好ましい。ヒステリシスが３４．７°以下の場合、細胞が培養面に十分に接着できず、培養途中で培養面から剥離する場合があり、ヒステリシスが８０．３°以上の場合には、細胞が培養面に強く接着し過ぎて剥離が困難になるためである。
　このような観点から、ヒステリシスは、３４．７°より大きく、５５．９°以下であることがより好ましく、４３．６°以上、５５．９°以下であることがさらに好ましい。
　後述する実施例から明らかなように、ヒステリシスをこのような範囲にすれば、細胞を培養面に適切に接着できると共に、細胞を培養面から容易に剥離することが可能となる。
　培養面のヒステリシスがこのような範囲である本実施形態の培養容器は、その材料であるポリエチレンテレフタレートを放射線処理（例えば電子線処理）することによって、得ることができる。
　具体的には、ポリエチレンテレフタレートを容器として形成した後、電子線処理することで得ることができる。また、ポリエチレンテレフタレートを電子線処理した後、これを容器として形成することによって得ることも可能である。
　本実施形態の培養容器における培養面の静的接触角は、細胞の剥離のし易さの観点から、５５．８°より大きいことが好ましく、６６．９°以上であることがより好ましく、７０°より大きいことがさらに好ましい。
　この電子線処理の吸収線量としては、１０～５０ｋＧｙとすることが好ましく、１５～４５ｋＧｙとすることがより好ましい。このような電子線処理を行うことで、ヒステリシスを上記範囲とすることが可能であり、これによって、接着細胞を培養面に適切に接着させて培養でき、かつ、接着細胞を培養面から容易に剥離可能にすることができる。
　このような電子線処理によれば、培養面の接触角には大きな変化は見られず、従って培養面の親水化は行われない。
　一方、このような電子線処理によって、培養面のヒステリシスが一定の程度で増大する。その結果、培養容器に培地を封入したときに、培養面の親水性が高くなり、細胞接着率が向上するようになっている。
　なお、本実施形態の培養容器は、培養面を親水化するものではないため、培養面を露出させることなく製造することが可能である。
　これに対して、従来の培養容器の親水化において使用される、高周波電源装置を用いて行われるコロナ放電やプラズマ放電等の電荷処理では、高エネルギーの電子が、培養容器を構成する樹脂の表面層に達し、基材における高分子結合の主鎖や側鎖が切断されて、気相中の酸素ラジカルなどが主鎖や側鎖と再結合し、水酸基、カルボニル基等の極性官能基が導入されて、培養面が親水化される。
　したがって、このような培養面の改質が行われる電荷処理（表面処理、親水化処理ともいう）と、本実施形態の培養容器で行われる電子線処理とは、大きく相違する。
　本実施形態の培養容器は、培養面がポリエチレンテレフタレートからなるものであればよく、二層以上の多層からなるものであってもよい。この場合、ポリエチレンテレフタレートの下層に、他の樹脂などを備えてもよい。
　なお、本明細書及び特許請求の範囲に記載のポリエチレンテレフタレートは、一般的に「ＰＥＴ」として市販されているものを用いることができ、例えばイソフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、１，４－ブタンジオール、プロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、ＣＨＤＭ（シクロヘキサンジメタノール）などの補助成分を含むものも含まれる。
　また、本実施形態の培養容器は、その培養面に細胞接着因子がコーティングされたものとすることが好ましい。また、細胞接着因子としては、ラミニンやフィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン等の接着タンパクを用いることが好ましく、特にラミニンを用いることが好ましい。
　このように培養容器の培養面に細胞接着因子をコーティングすることによって、接着細胞をより安定的に培養容器に接着させて培養することが可能となる。
　なお、細胞接着因子を培養面にコーティングすることなく、培地に細胞接着因子を含有させて培養容器に注入することによって、細胞接着因子を培養面に吸着させ、接着細胞の表面にあるインテグリン等が細胞接着因子と相互作用して結合し、接着細胞を培養面に接着させることもできる。
　本実施形態の培養容器の形状は、特に限定されるものではなく、一般的なディッシュやフラスコの形状、あるいはバッグやボトル等の形状とすることができる。
　本実施形態の培養容器を用いて培養する細胞は、接着細胞であれば特に限定されないが、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等を挙げることができる。
　本実施形態の培養容器によれば、これらの細胞を培養面に接着して好適に培養することができ、かつ、培養したこれらの細胞を培養面から容易に剥離して、回収することが可能である。
　また、本発明の細胞培養方法は、細胞を培養容器で接着培養する細胞培養方法であって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部がポリエチレンテレフタレートからなり、前記培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が式（１）を満足する前記培養容器を用いて接着培養を行い、前記細胞の剥離時、前記培養容器から培地を排出して、前記培養容器における前記細胞を剥離液に浸漬し、前記培養容器に培地を添加し、前記細胞に一定の外力を与えて前記細胞を選択的に剥離する工程を含む細胞培養方法。
　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）
　本実施形態の細胞培養方法によれば、このような培養容器を用いることによって、接着細胞を培養容器の培養面に適切に接着させて培養でき、かつ、剥離液に浸漬した後に培地を添加して撹拌することによって、スクレーパーで細胞を培養面から掻き取る必要なく剥離することが可能である。また、培養面を撓ませる、水流を与える等の一定の外力を細胞に付与することで、一定の接着性を有する細胞のみを選択的に剥離することが可能である。
　以上説明したように、本実施形態の培養容器、及び細胞培養方法によれば、接着細胞を培養容器で培養でき、かつ、剥離液を用いることで、培養した接着細胞を培養容器から容易に剥離することが可能である。これにより、細胞を剥離液に長時間浸漬したり、強い剥離液を用いたり、あるいはスクレーパーを用いて細胞を剥離する場合等に比べて、剥離による細胞のダメージを低減でき、また細胞の回収に必要な作業時間を短縮することも可能となる。
　以下、本実施形態の培養容器の性能を評価するために行った試験について、図２及び図３を参照して説明する。
（試験１）
　培養容器として、電荷処理によって親水化処理が予め施されて市販されているポリスチレン（ＰＳ）からなる細胞培養用６ウェルプレート（品番3810-006，ＡＧＣテクノグラス社製，比較例１）と、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ，ＳＫケミカル製，品名ＢＲ８０４０）を射出成形しディッシュ型に形成し、電子線処理（吸収線量１８ｋＧｙ）を施したもの（実施例１）を準備した。
　実施例１における電子線処理は、ラジエ工業株式会社に依頼して行った。
　使用した接着細胞は、ｉＰＳ細胞（1231A3株）である。
　使用した培地は、StemFit AK02N（品番RCAK02N，味の素社製）である。
　実施例１及び比較例１における培養容器に、ＰＢＳ（品番14249-24，ナカライテスク社製）を１．５ｍｌ、０．５ｍｇ/ｍｌラミニン511E8（品番892012，ニッピ社製）を各容器に０．５μｇ/ｃｍ２となるように加え、３７℃で１時間コーティングを行った。余剰のコーティング溶液を排出した後、１０ｍＭ Y-27632（品番253-00511，和光純薬工業社製）を含む上記培地を注入すると共に、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、３７℃で７日間培養を行った。このとき、培地は１．５ｍｌ、細胞懸濁液５μｌであった。播種した細胞数は、およそ１．３×１０４ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に培地をY-27632不含有の培地へ交換し、その後毎日培地交換を行った。
　培養開始1週間後に、それぞれの培養容器の培地を排出し、ＰＢＳ（品番14249-24，ナカライテスク社製）で洗浄した。剥離液３００μｌを添加して、培養した細胞を剥離液に３７℃で実施例１では２分間、比較例１においては５分間浸漬した。剥離液は０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ（品番0689414，ナカライテスク社製）を含むＰＢＳ（品番14249-24，ナカライテスク社製）とTrypLE select（品番A1285901，Thermo Fisher Scientific社製）の１：１混合液を用いた。 その結果を図２に示す。
　図２の比較例１は、培養容器に剥離液を注入してから５分後の培養面を撮影した写真であり、その下の囲み部分に拡大写真が示されている。
　また、図２の実施例１は、培養容器に剥離液を注入してから２分後の培養面を撮影した写真であり、その下の囲み部分に拡大写真が示されている。
　図２に示されるように、比較例１ではコロニーから離脱している細胞はほとんどなく、スクレーパーを使用しなければ細胞を剥離することができなかった。これに対して、実施例１ではコロニーから細胞が少しずつ剥離している様子が見られ、ピペッティングのみで細胞を回収することが可能であった。
　また、実施例１における剥離された細胞の方が、比較例１における剥離された細胞よりも正常な形態が保たれており、また未分化細胞率も高く維持できていた。
（試験２）
　培養容器として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ，ＳＫケミカル製、品名ＢＲ８０４０）を射出成形しディッシュ型に形成したもので放射線処理や電荷処理を施していないもの（比較例２）、ＰＥＴを射出成形しディッシュ型に形成したもので電子線処理（吸収線量１８ｋＧｙ）が行われたもの（実施例２）、ＰＥＴを射出成形しディッシュ型に形成したもので電子線処理（吸収線量４３ｋＧｙ）が行われたもの（実施例３）、ＰＥＴを射出成形しディッシュ型に形成したもので電荷処理によって親水化処理が施されたもの（比較例３）、及び、電荷処理によって親水化処理が予め施されて市販されているポリスチレン（ＰＳ）からなる細胞培養用６ウェルプレート（品番3810-006，ＡＧＣテクノグラス社製，比較例４）、を準備した。
　実施例２、３における電子線処理はラジエ工業株式会社に依頼して行った。また、比較例３における電荷処理は、バッチ式コロナ処理装置（春日電機社製）を用いて行った。
　次に、これらの培養容器の接触角及びヒステリシスを測定した。接触角及びヒステリシスの測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ　７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。
　接触角（θｓ）は、フィルム上に純水３μｌを滴下して測定した。また、滑落時ヒステリシス（θａ－θｒ）は、フィルム上に純水３０μｌを滴下し、１秒毎に１°ずつ測定台を傾け、滑落時の前進接触角（θａ）と後退接触角（θｒ）を接線法により算出して得た。
　使用した接着細胞は、ｉＰＳ細胞（1231A3株）である。
　使用した培地は、StemFit AK02N（品番RCAK02N，味の素社製）である。
　実施例２、３及び比較例２、３、４における培養容器に、この培地を注入すると共に、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、３７℃で４日間、スポット培養を行った。このとき、培地は３００μｌ、細胞懸濁液５μｌ（液の総量：３０５μｌ）であった。播種した細胞数は、およそ１３０００ｃｅｌｌｓであった。
　また、培養面積は、２ｃｍ２であった。
　次に、培養容器をＰＢＳ（品番14249-24，ナカライテスク社製）２００μｌで洗浄し、次いで剥離液５０μｌを添加して、培養した細胞を剥離液に３７℃で３分間浸漬した。剥離液は０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ（品番0689414，ナカライテスク社製）を含むＰＢＳ（品番14249-24，ナカライテスク社製）とTrypLE select（品番A1285901，Thermo Fisher Scientific社製）の１：１混合液を用いた。その後、培地を２００μｌ添加し、ピペットを使用して、２０回ピペッティングを行った。そして、剥離した細胞数を計測した。細胞数の計測は、ワンセルカウンター（品番OC-C-S02，ＦＰＩ社製）を用いて行った。以下においても同様である。
　また、培養容器における残存細胞数を計測するために、培養容器から培地を排出し、培養容器をＰＢＳ（品番14249-24，ナカライテスク社製）２００μｌで洗浄した。次いで、０．２５％トリプシン（品番25200-056，Thermo Fisher Scientific社製）２００μｌを添加して３７℃で５分間浸漬し、全ての細胞を培養容器から剥離した。そして、残存細胞数を計測した。さらに、剥離細胞数と残存細胞数の合計に対する剥離細胞数の百分率を細胞剥離率として算出した。その結果を図３に示す。
　なお、培養した細胞を剥離して回収するための剥離液としてＥＤＴＡ、ＰＢＳ、TrypLE selectからなる剥離液を使用し、残存細胞数を数えるために剥離する剥離液として０．２５％トリプシンを使用した理由は、０．２５％トリプシンは相対的に強い剥離剤であることから、ｉＰＳ細胞を回収するための剥離に用いると、細胞が傷むためである。
　比較例２の培養容器は、接触角が７０．８°でヒステリシスが３４．７°であり、細胞が十分に接着できず、培養途中で細胞が培養面から剥離した。
　実施例２の培養容器は、接触角が７２．８°でヒステリシスが４３．６°であり、細胞は培養面に接着して適切に培養することができた。また、２０回のピペッティングによる細胞剥離率は４２．１％であり、優れた細胞剥離率が得られた。
　実施例３の培養容器は、接触角が６６．９°でヒステリシスが５５．９°であり、細胞は培養面に接着して適切に培養することができた。また、２０回のピペッティングによる細胞剥離率は３４．５％であり、比較的優れた細胞剥離率が得られた。
　比較例３の培養容器は、接触角が５５．８°でヒステリシスが８０．３°であり、細胞は培養面に接着して適切に培養することができたが、２０回のピペッティングによる細胞剥離率は２３．５％であり、比較的低い細胞剥離率であった。
　比較例４の培養容器は、接触角が７５．８°でヒステリシスが３５．４°であり、細胞は培養面に接着して適切に培養することができたが、２０回のピペッティングによる細胞剥離率は１５．８％であり、低い細胞剥離率であった。
　以上のことから、電子線処理が行われたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）からなる培養容器によれば、細胞を培養容器に接着して適切に培養することができ、かつ、容易に剥離可能なものとすることが可能であることが明らかとなった。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、上記実施例では接着細胞としてｉＰＳ細胞を用いているが、これに限定されるものではなく、接着細胞であればその他の細胞を用いることができる。また、培地の種類等も適宜変更することが可能である。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　本発明は、培養容器を用いて、接着細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。

Claims (8)

  1. 　細胞を接着培養する培養容器であって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部がポリエチレンテレフタレートからなり、前記培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が式（１）を満足することを特徴とする培養容器。
    　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）
  2. 　前記細胞が、接着細胞であることを特徴とする請求項１記載の培養容器。
  3. 　前記接着細胞が、多能性幹細胞、胚性幹細胞、又はそれらの分化細胞であることを特徴とする請求項２記載の培養容器。
  4. 　前記培養面に、細胞接着因子がコーティングされていることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の培養容器。
  5. 　前記培養容器の全体が、ポリエチレンテレフタレートからなることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の培養容器。
  6. 　前記培養容器の前記培養面に、電荷処理が施されていないことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の培養容器。
  7. 　前記培養容器の前記培養面に、放射線処理が施されていることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の培養容器。
  8. 　細胞を培養容器で接着培養する細胞培養方法であって、前記培養容器の培養面の少なくとも一部がポリエチレンテレフタレートからなり、前記培養面における水滑落時の前進接触角及び後退接触角が式（１）を満足する前記培養容器を用いて接着培養を行い、前記細胞の剥離時、前記培養容器から培地を排出して、前記培養容器における前記細胞を剥離液に浸漬し、前記培養容器に培地を添加し、前記細胞に一定の外力を与えて前記細胞を選択的に剥離する工程を含む細胞培養方法。
    　３４．７°＜　前進接触角－後退接触角　＜８０．３°　・・・式（１）
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