CN110283286A - 一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，具体步骤如下：惰性气氛下，先将α‑D‑甘露糖单体M1和Grubbs三代催化剂在溶剂中反应；接着再加入β‑D‑半乳糖单体M2反应；加入乙烯基乙醚终止聚合反应，再经后处理得到含α‑D‑甘露糖和β‑D‑半乳糖的嵌段共聚物。与现有技术相比，本发明聚合物单体合成方法简单，聚合物合成方法可靠，聚合物结构为线性、分子量可控，可应用于高分子材料和生物医药工程领域。

Description

一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法
技术领域
本发明涉及高分子合成技术领域，尤其是涉及一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法。
背景技术
糖是自然界中许多天然产物的组成单元，是生物体中常见的能量来源，对许多生物过程起着至关重要的作用。近年来，通过糖基单体制备含糖聚合物已成为化学界和生物学界的研究热点。含糖聚合物指糖组分通过不同的化学反应途径引入到聚合物分子链中而形成的功能高分子材料。此类聚合物由于糖基的存在，可提高聚合物的生物相容性、亲水性和生物降解性，且对蛋白质具有很好的识别和结合能力，从而在生物、医药、精细化工、材料科学等方面得到了广泛应用。
目前，含糖聚合物的常见合成方法主要包括离子聚合法、可控/活性自由基聚合法和大分子反应法等。离子聚合法可用于合成结构明确、分子量分布宽度窄的聚合物，但反应条件较为苛刻，对单体的纯度要求较高。其中，可控/活性自由基聚合法可用于合成结构及分子量可控、较窄分子量分布宽度的含糖聚合物，因而备受广大研究者青睐。然而，通过化学方法合成较纯的含糖不饱和单体具有一定难度，且利用该法制备的含糖聚合物带有一定的颜色或有残留金属，不易除去。大分子反应法是指将预先合成的聚合物与糖进行反应，在聚合物侧链上引入糖分子，从而制备含糖聚合物。此法反应效率高、产物立体选择性好，但有些官能团不能参加反应，且制备含糖聚合物的周期较长。
近年来，开环易位聚合(ROMP)由于反应条件温和、单体普适性高且具备活性聚合的特点受到工业界的广泛关注并成为制备功能化含糖聚合物的重要方法之一。同时，将开环易位聚合与“Click”化学相结合为设计合成结构规整的含糖聚合物又提供了新的途径。其中铜(I)催化的叠氮-端炔[3+2]环加成反应(CuAAC)具有高产率、高选择性、反应条件温和等优点是“Click”化学中的典型代表。
树枝化聚合物是一类重要的非线形聚合物，是由线型聚合物主链和作为侧基的树枝化基元组成的一类树形聚合物。与线性聚合物相比，树枝化聚合物具有分子尺寸较大，结构高度支化，内层富含空腔而外层富集官能团有利于进一步修饰等优异的结构特点，这使得树枝化聚合物得到了广泛的研究。该类聚合物最大特点是分子尺寸在纳米级别、刚性相对较高，整个聚合物呈现柱状结构，因而可以实现对其单分子进行观测和操作，并且通过对树枝化基元的种类或代数，树枝化基元的空间位阻以及聚合物主链进行调控，可以有效实现对聚合物的构型和柔顺性的控制。目前为止，各类树枝化聚合物相继被报道，利用其结构的多层次性和大量的端基易于进行功能化等特点，诸多具有特定功能性的树枝化聚合物被合成，且在可溶性催化载体、生物医用材料、纳米材料和光电材料等方面的应用研究得到广泛关注。树枝化聚合物的制备方法主要有两种：1)先合成树枝化大单体再进行聚合的大单体路线；2)通过共价键或者非共价键在聚合物表面接枝树枝化基元的聚合物表面接枝路线。
然而目前报道的关于无保护基含糖单体的ROMP聚合得到的含糖聚合物多为线性聚合物，尽管树枝化含糖聚合物可显著提升“糖簇效应”，然而目前树枝化含糖聚合物的合成较为困难。此外，除了“糖簇效应”可以强化特异性识别以外，目前已有报道，利用结构有序的含糖聚合物来研究异类糖单元与特定的凝集素进行特异性识别，结果发现尽管半乳糖不能与Con A识别，但是可以促进甘露糖与Con A的识别。这一发现无疑对拓宽含糖聚合物的发展具有很大的学术价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，合成路线如下：
其中，m，n为整数，其限定范围为20<m<80，20<n<80；
具体步骤如下：
(1)惰性气氛下，先将α-D-甘露糖单体M1和Grubbs三代催化剂在溶剂中反应；
(2)接着再加入β-D-半乳糖单体M2反应；
(3)加入乙烯基乙醚终止聚合反应，再经后处理得到含α-D-甘露糖和β-D-半乳糖的嵌段共聚物；
(4)将保护的含糖嵌段共聚物溶于MeOH/DCM的混合溶液中，加入甲酸钠反应，除去溶剂后将粗产物溶于水，调节pH至中性，干燥后得到含糖共聚物。
优选的，步骤(1)中：反应温度为40-60℃，反应时间为6-10h。
优选的，步骤(1)中所述溶剂为四氢呋喃。
优选的，步骤(2)中：反应温度为40-60℃，反应时间为6-10h。
优选的，α-D-甘露糖单体M1、β-D-半乳糖单体M2和Grubbs三代催化剂的摩尔比为(1-3):(1-3):(0.9-1.8)。
优选的，步骤(3)中后处理步骤如下：向乙烯基乙醚终止后反应液中加入无水乙醚进行搅拌沉降，析出的固体洗涤、干燥。
优选的，步骤(4)中：反应温度为室温，反应时间为12h，干燥采用冷冻干燥。
优选的，α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2的合成路线如下：
具体步骤如下：
(a)取顺-5-降冰片烯-外-2,3-二羧酸酐和胺甲基丙二醇于溶剂中反应生成化合物2；
(b)取步骤(a)得到的化合物2与炔丙基溴在碱作用下反应生成化合物3；
(c)将步骤(b)得到的化合物3与α-D-甘露糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中，随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，搅拌后，过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体，即为α-D-甘露糖单体M1；
(d)将步骤(b)得到的化合物3与β-D-半乳糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中，随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，搅拌后，过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体，即为β-D-半乳糖单体M2。
优选的，步骤(c)中：化合物3、α-D-甘露糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1，搅拌温度为25-35℃，搅拌时间为10-14h，叔丁醇与水的体积比为(0.5-2):1。
优选的，步骤(d)中：化合物3、β-D-半乳糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1，搅拌温度为25-35℃，搅拌时间为10-14h，叔丁醇与水的体积比为(0.5-2):1。
本发明中，首先利用降冰片烯二甲酸酐与胺甲基丙二醇将降冰片烯羟基化得到降冰片烯二甲酰胺丙二醇，再利用威廉森成醚反应在末端引入端炔基。然后分别与乙酰基保护的α-D-甘露糖叠氮化合物和乙酰基保护的β-D-半乳糖叠氮化合物进行CuAAC反应，得到了两种含双边甘露糖和双边半乳糖的降冰片烯衍生物单体M1和M2，随后通过开环易位聚合(ROMP)获得嵌段共聚物，接着进行脱保护得到最终的含糖的嵌段共聚物。
本发明提供了一种简单、高效的含α-D-甘露糖和β-D-半乳糖的嵌段和无规树枝化共聚物的合成方法。解决了含保护基糖聚合物的脱保护、低产率以及后修饰等步骤的合成劣势，进一步拓宽了含糖聚合物的合成途径以及ROMP的实际应用范围，该含糖共聚物可与刀豆蛋白A(concanavalin A)进行特异性识别，可应用于生物医药工程领域。
本发明利用CuAAC反应和开环易位聚合(ROMP)相结合的方法，制备得到侧链含α-D-甘露糖和β-D-半乳糖的分子量可控、窄分子量分布的含糖共聚物。其中CuAAC反应具有高产率、高选择性、反应条件温和等优点，同时ROMP可得到分子量可控且结构明确的高分子化合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明利用CuAAC反应和开环易位聚合相结合的方法，简单、高效的制备出了含双类糖的嵌段共聚物，分子量可控且较窄的分子量分布宽度。
2.本发明所合成的含双类糖嵌段共聚物结构明确，可与生物蛋白特异识别，应用于生医药领域。
3.本发明聚合物单体合成方法简单，聚合物合成方法可靠，聚合物结构为线性、分子量可控，可应用于高分子材料和生物医药工程领域。
附图说明
图1为实施例1中2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺丙二醇NB-2OH的核磁氢谱图；
图2为实施例1中2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚NB-2Alkyne的核磁氢谱图；
图3为实施例1中2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚NB-2Alkyne的核磁碳谱图；
图4为实施例1中降冰片烯衍生物含双边甘露糖单体NB-2Man-OAc的核磁氢谱图；
图5为实施例1中降冰片烯衍生物含双边甘露糖单体NB-2Man-OAc的核磁碳谱图；
图6为实施例1中降冰片烯衍生物含双边半乳糖单体NB-2Gal-OAc的核磁氢谱图；
图7为实施例1中降冰片烯衍生物含双边半乳糖单体NB-2Gal-OAc的核磁碳谱图；
图8为实施例1中含双类糖的嵌段共聚物P(NB-2Man-OAc)-b-(NB-2Gal-OAc)的核磁氢谱图；
图9为实施例1中含双类糖的嵌段共聚物P(NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH)的核磁氢谱图；
图10为实施例1中含双类糖的嵌段共聚物P(NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH)凝胶渗透色谱图；
图11浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图；
图12等温滴定量热法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的量热曲线变化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本实施例中采用的试剂如下：顺-5-降冰片烯-外-2,3-二羧酸酐(98％)、HEPES(99％)、刀豆蛋白A(≥99.5％)、甲苯(99％)、乙酸乙酯(99％)、叔丁醇(≥99.5％)、甲醇(99％)和二氯甲烷(99.5％)均购自上海探索科技股份有限公司；胺甲基丙二醇(99％)、乙烯基乙醚(98％)、N,N-二甲基甲酰胺(99.8％)和无水四氢呋喃(99％)均购自上海麦克林生化科技有限公司；炔丙基溴(>99％)、抗坏血酸钠(99％)和Grubbs三代催化剂(98％)均购自上海阿达玛斯试剂有限公司；氢氧化钾(95％)、五水合硫酸铜(99％)、无水硫酸钠(95％)和甲醇钠(95％)均购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
本实施例以炔烃为端基的降冰片烯衍生物及含叠氮基的糖类化合物为原料，利用铜催化的叠氮-端炔[3+2]环加成(CuAAC)反应合成制备NB-2Man-OAc和NB-2Gal-OAc两类带有保护基的含糖聚合物单体，随后通过开环易位聚合(ROMP)制备出含双类糖单元的嵌段共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))。
1.降冰片烯二甲酰胺丙二醇NB-2OH(2)的合成
取经高温处理后冷却的三口圆底瓶，加入顺-5-降冰片烯-外-2,3-二羧酸酐(1g，6.1mmol)和胺甲基丙二醇(0.96g，9.15mmol)，并加入30mL的甲苯。在瓶口接上h型分水器，在其上方接上蛇型冷凝管，在油浴中135℃回流反应16h，反应结束后，减压蒸馏除去甲苯。直接经硅胶色谱柱纯化，得到白色固体1.07g，产率为70％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝1.17(s,3H),1.49(d,J＝8.7Hz 1H),1.57(d,J＝8.8Hz,1H),3.23(m,2H),3.40(m,2H),3.58-3.68(m,4H),4.19(d,J＝11.8,2H),6.15(s,2H).
2.2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚NB-2Alkyne(3)的合成
将降冰片烯二甲酰胺丙二醇(1.88g，7.5mmol)加入到干燥的单口圆底反应瓶中，接着加入35mL的N,N-二甲基甲酰胺，在0℃条件下缓慢滴入炔丙基溴(3.2mL，30mmol)，继续反应10min后，加入氢氧化钾(1.68g，30mmol)。继续在0℃条件反应1h，接着移去冰浴，在室温条件下搅拌24h。反应结束后，加入20mL的乙酸乙酯和20mL的去离子水，水相用乙酸乙酯洗涤三次，之后收集有机相用饱和食盐水洗涤三次。有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱分离得到淡黄色固体1.36g，产率为55％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ＝6.14(s,2H),4.12(s,4H),3.98(d,J＝9.1Hz,2H),3.79(d,J＝9.1Hz,2H),3.34(s,2H),3.14(s,2H),2.43(s,2H),1.66(d,J＝8.6Hz,1H),1.48(d,J＝10.3Hz,4H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ＝178.86,134.55,79.67,74.42,70.50,63.01,58.28,51.63,45.37,19.42.HRMS(ESI):calc.for C19H21NO4H(M+H+):328.154335；found:328.154268.
3.含双边α-D-甘露糖降冰片烯衍生物单体NB-2Man-OAc(M1)的合成
在干燥的反应瓶中加入2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚(1.4g，4.3mmol)和乙酰基保护的α-D-甘露糖叠氮化合物(1.4g，3.75mmol)，并加入叔丁醇(8mL)和去离子水(8mL)。接着加入五水合硫酸铜(0.46g，1.87mmol)和抗坏血酸钠(0.74g，3.75mmol)，通入氮气，室温(25℃)条件下，反应12h，反应结束后，过滤除去不溶物，直接进行柱层析，得到白色固体0.52g，产率为32％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H),6.03(d,J＝7.0Hz,2H),5.97(s,1H),5.90(dd,J＝11.5,2.5Hz,2H),5.34(t,J＝9.0Hz,1H),4.61(s,2H),4.31(dd,J＝12.2,4.5Hz,1H),4.05-3.88(m,7H),3.81-3.74(m,2H),3.27(s,2H),3.09(s,2H),2.40(s,1H),2.14(s,3H),2.04-1.97(m,9H),1.60(d,J＝8.5Hz,1H),1.43(d,J＝9.0Hz,1H),1.40(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ178.97,170.49,169.67,169.62,169.32,146.02,134.51,122.85,83.56,79.70,74.55,72.00,70.88,70.31,68.80,68.30,66.02,64.47,63.14,61.53,58.27,51.68,45.44,45.32,20.71,20.67,20.55,19.35,19.33.HRMS(ESI):calc.for C33H40N4O13H(M+H+):701.25237；found:701.25658.
4.含双边β-D-半乳糖单体降冰片烯衍生物NB-2Gal-OAc(M2)的合成
在干燥的反应瓶中加入2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚(1.4g，4.3mmol)和乙酰基保护的β-D-半乳糖叠氮化合物(1.4g，3.75mmol)，并加入叔丁醇(8mL)和去离子水(8mL)。接着加入五水合硫酸铜(0.46g，1.87mmol)和抗坏血酸钠(0.74g，3.75mmol)，通入氮气，室温(25℃)条件下，反应12h，反应结束后，过滤除去不溶物，直接进行柱层析，得到白色固体0.56g，产率为35％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(s,2H),6.01(s,2H),5.90(d,J＝9.3Hz,2H),5.52(d,J＝2.8Hz,4H),5.30-5.23(m,2H),4.57(t,J＝6.6Hz,4H),4.27(s,2H),4.18-4.09(m,4H),3.90(dd,J＝23.1,9.1Hz,2H),3.83-3.76(m,2H),3.28(s,2H),3.11(s,2H),2.19(s,6H),2.01-1.96(m,12H),1.82(s,3H),1.78(s,3H),1.61(d,J＝8.6Hz,1H),1.43(d,J＝8.5Hz,1H),1.38(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ178.96,170.52,169.97,169.47,168.84,145.91,134.45,121.13(s,8H),85.56,77.33,77.08,76.82,74.98,72.80,70.77,70.60,70.20,67.79,64.46,63.24,61.59,51.68,45.36,20.63,20.57,20.52,20.10,20.04,19.17,14.17.HRMS(ESI):calc.for C47H59N7O22H(M+H+):1074.37548；found:1074.37853.
5.含双类糖的嵌段共聚物P((NB-2Man-OAc)-b-(NB-2Gal-OAc))的合成
取双边α-D-甘露糖降冰片烯衍生物单体(50mg，0.046mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(50mg，0.046mmol)和Grubbs三代催化剂(13.7mg，0.0153mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水四氢呋喃(1mL)。在水浴50℃条件下反应8h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的乙醚中沉降出灰白色固体82mg，产率为82％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝17.3Hz,2H),5.93(s,5H),5.41(d,J＝31.6Hz,5H),4.59(s,5H),4.29(s,2H),4.12-3.63(m,10H),3.08(s,4H),2.22-1.77(m,30H),1.44(s,5H).
6.含双类糖的嵌段共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))的合成
取步骤5制备的保护的含糖聚合物(80mg，0.01mmol)溶于MeOH/DCM(2mL，1:1v/v)的混合溶液中，随后加入甲醇钠(8mg,10wt％)。反应于室温条件下反应12h，通过减压蒸馏除去溶剂后，粗产物溶于水，用离子交换树脂调节pH值至中性条件，最终冷冻干燥得到棕色固体38mg，产率为98％。图9为得到的含糖共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))核磁氢谱谱图。图10为得到的含糖共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))的凝胶渗透色谱图。该聚合物的数均分子量为9300，分子量分布为1.20。1H NMR(500MHz,D2O)δ8.09(d,J＝24.4Hz,2H),6.56-5.04(m,5H),4.46(s,3H),4.10-3.36(m,12H),3.15(s,6H),1.79(s,4H),1.43-0.86(m,5H).
应用：浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A的特异性识别作用
配制刀豆蛋白A(1mg/mL)的HBS缓冲溶液(HEPES，10mmol/L)，pH＝7.4，NaCl(50mmol/L)，CaCl2(5mmol/L)，MnCl2(5mmol/L)和含糖聚合物的HBS缓冲溶液(1mg/mL)。测试时取400μL的刀豆蛋白A溶液置于比色皿中，接着加入100μL的含糖聚合物溶液，混匀后迅速放入样品池中，每3s记录一次420nm处的吸光值，并持续记录至10min。图11为浊度法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图。结果显示，含糖的共聚物与刀豆蛋白A混合后很快变浑浊，在4min内吸光值也随着时间的增长而增长，4min后吸光值趋于平衡，结果表明含糖的共聚物可与Con A快速识别且信号比较明显。
应用：等温滴定量热仪(ITC)法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A的特异性识别作用
配制刀豆蛋白A(1mg/mL)的HBS缓冲溶液(HEPES，10mmol/L)，pH＝7.4，NaCl(50mmol/L)，CaCl2(5mmol/L)，MnCl2(5mmol/L)和含糖聚合物的HBS缓冲溶液(1mg/mL)。在注射器中加入浓度为0.13-0.3mM的含糖聚合物的HBS缓冲溶液40μL，样品池中注入0.05-0.07mM的刀豆蛋白A的缓冲溶液200μL。含糖聚合物连续滴定20滴，每滴2μL，间隔时间为180s，滴入含有刀豆蛋白A的样品池中。测试的温度为25℃，控制搅拌速率为1000r/min。滴定实验所得的原始数据用One Set of Sites模型按照非线性最小方差法拟合滴定反应热。图12为等温滴定量热仪(ITC)法检测含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的吸光值变化谱图。结果显示，含糖聚合物与刀豆蛋白A识别的过程中自由能ΔH为-2134cal/mol，说明此反应是放热反应，含糖的共聚物与刀豆蛋白A的结合是自发进行结合的。含糖的共聚物与刀豆蛋白A的结合常数为9.23×105，比更加表明了含糖的共聚物可与Con A快速识别且信号比较明显。
实施例2
本实施例以炔烃为端基的降冰片烯衍生物及含叠氮基的糖类化合物为原料，利用铜催化的叠氮-端炔[3+2]环加成(CuAAC)反应合成制备NB-2Man-OAc和NB-2Gal-OAc两类带有保护基的含糖聚合物单体，随后通过开环易位聚合(ROMP)制备出含双类糖单元的嵌段共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))。
1.降冰片烯二甲酰胺丙二醇NB-2OH(2)的合成
取经高温处理后冷却的三口圆底瓶，加入顺-5-降冰片烯-外-2,3-二羧酸酐(1g，6.1mmol)和胺甲基丙二醇(0.96g，9.15mmol)，并加入30mL的甲苯。在瓶口接上h型分水器，在其上方接上蛇型冷凝管，在油浴中135℃回流反应16h，反应结束后，减压蒸馏除去甲苯。直接经硅胶色谱柱纯化，得到白色固体。
2.2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚NB-2Alkyne(3)的合成
将降冰片烯二甲酰胺丙二醇(1.88g，7.5mmol)加入到干燥的单口圆底反应瓶中，接着加入35mL的N,N-二甲基甲酰胺，在0℃条件下缓慢滴入炔丙基溴(3.2mL，30mmol)，继续反应10min后，加入氢氧化钾(1.68g，30mmol)。继续在0℃条件反应1h，接着移去冰浴，在室温条件下搅拌24h。反应结束后，加入20mL的乙酸乙酯和20mL的去离子水，水相用乙酸乙酯洗涤三次，之后收集有机相用饱和食盐水洗涤三次。有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱分离得到淡黄色固体。
3.含双边α-D-甘露糖降冰片烯衍生物单体NB-2Man-OAc(M1)的合成
在干燥的反应瓶中加入2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚(1.34g，4.125mmol)和乙酰基保护的α-D-甘露糖叠氮化合物(1.4g，3.75mmol)，并加入叔丁醇(4mL)和去离子水(8mL)。接着加入五水合硫酸铜(0.375g，1.5mmol)和抗坏血酸钠(0.74g，3.75mmol)，通入氮气，30℃条件下，反应14h，反应结束后，过滤除去不溶物，直接进行柱层析，得到白色固体。
4.含双边β-D-半乳糖单体降冰片烯衍生物NB-2Gal-OAc(M2)的合成
在干燥的反应瓶中加入2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚(1.34g，4.125mmol)和乙酰基保护的β-D-半乳糖叠氮化合物(1.4g，3.75mmol)，并加入叔丁醇(4mL)和去离子水(8mL)。接着加入五水合硫酸铜(0.375g，1.5mmol)和抗坏血酸钠(0.74g，3.75mmol)，通入氮气，30℃条件下，反应14h，反应结束后，过滤除去不溶物，直接进行柱层析，得到白色固体。
5.含双类糖的嵌段共聚物P((NB-2Man-OAc)-b-(NB-2Gal-OAc))的合成
取双边α-D-甘露糖降冰片烯衍生物单体(50mg，0.046mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(100mg，0.092mmol)和Grubbs三代催化剂(53.7mg，0.06mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水四氢呋喃(1mL)。在水浴40℃条件下反应10h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的乙醚中沉降出灰白色固体。
6.含双类糖的嵌段共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))的合成
取步骤5制备的保护的含糖聚合物(80mg，0.01mmol)溶于MeOH/DCM(2mL，1:1v/v)的混合溶液中，随后加入甲醇钠(8mg，10wt％)。反应于室温条件下反应12h，通过减压蒸馏除去溶剂后，粗产物溶于水，用离子交换树脂调节pH值至中性条件，最终冷冻干燥得到棕色固体。
实施例3
本实施例以炔烃为端基的降冰片烯衍生物及含叠氮基的糖类化合物为原料，利用铜催化的叠氮-端炔[3+2]环加成(CuAAC)反应合成制备NB-2Man-OAc和NB-2Gal-OAc两类带有保护基的含糖聚合物单体，随后通过开环易位聚合(ROMP)制备出含双类糖单元的嵌段共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))。
步骤1和步骤2与实施例1相同。
3.含双边α-D-甘露糖降冰片烯衍生物单体NB-2Man-OAc(M1)的合成
在干燥的反应瓶中加入2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚(1.465g，4.5mmol)和乙酰基保护的α-D-甘露糖叠氮化合物(1.4g，3.75mmol)，并加入叔丁醇(8mL)和去离子水(4mL)。接着加入五水合硫酸铜(0.5625g，2.25mmol)和抗坏血酸钠(0.74g，3.75mmol)，通入氮气，35℃条件下，反应10h，反应结束后，过滤除去不溶物，直接进行柱层析，得到白色固体。
4.含双边β-D-半乳糖单体降冰片烯衍生物NB-2Gal-OAc(M2)的合成
在干燥的反应瓶中加入2,2-二炔-降冰片烯二甲酰胺乙二醚(1.465g，4.5mmol)和乙酰基保护的β-D-半乳糖叠氮化合物(1.4g，3.75mmol)，并加入叔丁醇(8mL)和去离子水(4mL)。接着加入五水合硫酸铜(0.5625g，2.25mmol)和抗坏血酸钠(0.74g，3.75mmol)，通入氮气，35℃条件下，反应10h，反应结束后，过滤除去不溶物，直接进行柱层析，得到白色固体。
5.含双类糖的嵌段共聚物P((NB-2Man-OAc)-b-(NB-2Gal-OAc))的合成
取双边α-D-甘露糖降冰片烯衍生物单体(100mg，0.092mmol)、β-D-葡萄糖7-氧杂降冰片烯衍生物单体(50mg，0.046mmol)和Grubbs三代催化剂(74.14mg，0.0828mmol),塞入橡胶塞，并用封口膜封住，通入氮气10min后，通入无水四氢呋喃(1mL)。在水浴60℃条件下反应6h后，加入0.1mL的乙烯基乙醚，继续搅拌半小时后，在10mL的乙醚中沉降出灰白色固体。
6.含双类糖的嵌段共聚物P((NB-2Man-OH)-b-(NB-2Gal-OH))的合成
取步骤5制备的保护的含糖聚合物(80mg，0.01mmol)溶于MeOH/DCM(2mL，1:1v/v)的混合溶液中，随后加入甲醇钠(8mg，10wt％)。反应于室温条件下反应12h，通过减压蒸馏除去溶剂后，粗产物溶于水，用离子交换树脂调节pH值至中性条件，最终冷冻干燥得到棕色固体。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)惰性气氛下，先将α-D-甘露糖单体M1和Grubbs三代催化剂在溶剂中反应；
(2)接着再加入β-D-半乳糖单体M2反应；
(3)加入乙烯基乙醚终止聚合反应，再经后处理得到保护的含糖嵌段共聚物；
(4)将保护的含糖嵌段共聚物溶于MeOH/DCM的混合溶液中，加入甲酸钠反应，除去溶剂后将粗产物溶于水，调节pH至中性，干燥后得到含糖共聚物。
2.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(1)中：反应温度为40-60℃，反应时间为6-10h。
3.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶剂为四氢呋喃。
4.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(2)中：反应温度为40-60℃，反应时间为6-10h。
5.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，α-D-甘露糖单体M1、β-D-半乳糖单体M2和Grubbs三代催化剂的摩尔比为(1-3):(1-3):(0.9-1.8)。
6.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(3)中后处理步骤如下：向乙烯基乙醚终止后反应液中加入无水乙醚进行搅拌沉降，析出的固体洗涤、干燥。
7.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(4)中：反应温度为室温，反应时间为12h，干燥采用冷冻干燥。
8.根据权利要求1所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，α-D-甘露糖单体M1、β-D-葡萄糖单体M2的制备方法如下：
(a)取顺-5-降冰片烯-外-2,3-二羧酸酐和胺甲基丙二醇于溶剂中反应生成化合物2；
(b)取步骤(a)得到的化合物2与炔丙基溴在碱作用下反应生成化合物3；
(c)将步骤(b)得到的化合物3与α-D-甘露糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中，随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，搅拌后，过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体，即为α-D-甘露糖单体M1；
(d)将步骤(b)得到的化合物3与β-D-半乳糖叠氮化合物溶于叔丁醇/水的混合溶剂中，随后加入催化剂五水合硫酸铜和抗坏血酸钠，搅拌后，过滤除去不溶物后柱层析得到白色固体，即为β-D-半乳糖单体M2。
9.根据权利要求8所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(c)中：化合物3、α-D-甘露糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1，搅拌温度为25-35℃，搅拌时间为10-14h，叔丁醇与水的体积比为(0.5-2):1。
10.根据权利要求8所述的一种具有生物特异性识别的含糖共聚物的合成方法，其特征在于，步骤(d)中：化合物3、β-D-半乳糖叠氮化合物、五水合硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比例为(1.1-1.2):1:(0.4-0.6):1，搅拌温度为25-35℃，搅拌时间为10-14h，叔丁醇与水的体积比为(0.5-2):1。
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