CN110256430A

CN110256430A - 具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110256430A
Application number: CN201910623285.7A
Authority: CN
Inventors: 李永辉; 张俊清; 张旭光; 李海龙; 赖伟勇; 麦世瑛; 吴娇霞
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: HAINAN SENQI PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: CN110256430B

Abstract

本发明公开一种具有促进内皮损伤修复作用的胆木生物碱新化合物，该化合物通过以下方法制得：取胆木茎，粉碎，加入水浸泡提取，收集提取液，减压浓缩得到胆木浸膏，浸膏经萃取获得二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，取乙酸乙酯部位，上硅胶柱，以体积比为95:5～10:90的二氯甲烷‑甲醇为洗脱溶剂洗脱，以TLC分析合并相似部位，然后上制备液相，以甲醇水作为洗脱剂，经液相色谱制备，得到胆木新化合物。本发明基于细胞修复相关机制，在理论指导下，深入研究胆木的新化合物的增殖活性研究，通过实验研究表明，该胆木新化合物，能明显促进HUVEC细胞的增殖和内皮细胞划痕修复，能够用于制备防治炎症性内皮损伤的药物。

Description

具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种从胆木胆木中分离得到的一个化合物，具体涉及一种具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物。

背景技术

胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard.)为茜草科乌檀属植物，又名乌檀、熊胆树、黄胆木、山熊胆等，具有清热解毒、消肿止痛的功效，用于治疗咽喉炎、支气管炎、急性扁桃体炎等症。胆木生物碱具有多方面的药理功效，包括减轻LPS诱导的炎症，抗肿瘤活性等。

内皮细胞损伤修复是感染性疾病恢复的重要环节，促进内皮细胞增殖可以加速各种原因诱导的内皮损伤的修复，从而促进机体感染性疾病的愈合。

现有技术中还没有报道从胆木中分离到具有抗内皮损伤修复的胆木化合物。

发明内容

发明目的：本发明目的是为了解决现有技术的不足，从胆木中分离得到一个具有很好的促进细胞修复作用的胆木化合物。本发明另外一个目的是提供该化合物的制备方法与其应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物，其结构式如下：

本发明命名该化合物为16-去羟甲基胆木碱B。

本发明提供的具有促进内皮损伤修复作用的胆木新化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)取胆木茎枝，切段，粉碎，用5～15倍体积的水浸泡提取3次，合并提取液，浓缩得浸膏；

(2)取步骤(1)浸膏分别用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，分别浓缩；取乙酸乙酯部位，上硅胶柱，以体积比为95:5～10:90的二氯甲烷-甲醇为洗脱溶剂洗脱硅胶色谱柱，以TLC分析合并相似部位，然后上制备液相，以体积浓度为50％-90％甲醇作为洗脱剂，经液相色谱制备，得到胆木新化合物。

作为优选方案，以上所述的具有促进内皮损伤修复作用的胆木新化合物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)取胆木茎枝，切段，粉碎，加入胆木重量6倍体积量的水，分3次浸泡提取，每次5h，合并提取液，浓缩得浸膏；

(2)取步骤(1)得到的浸膏，加入浸膏重量3倍体积的萃取液，分别萃取得到二氯甲烷、乙酸乙酯萃取部位；取乙酸乙酯部位，上硅胶色谱柱，以体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂进行洗脱分离，并以TLC分析合并相似部位，然后用制备液相进行分离，以体积浓度为60％和70％甲醇洗脱，得到胆木新化合物。

本发明所述的具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物与药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、合剂、丸剂、涂剂、膏剂或透皮吸收制剂。

本发明所述的具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物在制备防治炎症性内皮损伤药物中的应用。炎症性内皮损伤包括：急性扁桃体炎、肺炎、咽喉炎、支气管炎、烧伤感染、上呼吸道感染引起的内皮损伤疾病。

一种具有促进内皮损伤修复的药物制剂，它包括本发明从胆木中分离得到的胆木新化合物。

本发明在制成片剂时，将胆木新化合物与载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

本发明在制成胶囊剂时，将胆木新化合物与载体糊精或淀粉混合均匀，制粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

本发明在制成颗粒剂时，将胆木新化合物与糊精等混合均匀，制粒，干燥，制成颗粒剂。

本发明在制成合剂时，在胆木新化合物中加纯化水溶解，制成合剂。

本发明在制成口服液时，把胆木新化合物加纯化水溶解，加入甜菊素或阿斯巴坦，调pH，制成口服液。

有益效果：本发明提供的具有促进细胞修复作用的胆木新化合物和现有技术相比具有以下优点：

(1)本发明通过对胆木的化学成分进行系统筛选研究，从中分离得到一个新的生物碱类化合物。

(2)本发明提供的具有促进细胞修复作用的胆木新化合物，通过实验研究表明，该新化合物(16-去羟甲基胆木碱B)能明显促进HUVEC细胞的增殖，具有很好的促进内皮损伤修复的功效。

(3)本发明提供的具有促进细胞修复作用的胆木新化合物，可以方便和药学载体制备成多种剂型，临床上服用方便。

附图说明

图1为16-去羟甲基胆木碱B的HR-TOFMS图

图2为16-去羟甲基胆木碱B的1H-NMR图

图3为16-去羟甲基胆木碱B的13C-NMR图

图4为16-去羟甲基胆木碱B对内皮细胞活力影响的柱状图。

图5为16-去羟甲基胆木碱B对内皮细胞划痕修复作用的显微镜观察图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

1、一种具有促进细胞修复作用的胆木新化合物，它通过以下方法制备得到：

(1)取胆木茎，粉碎，加入胆木重量6倍体积量的水，分3次浸泡提取，每次5h，合并提取液，浓缩得浸膏；

(2)取步骤(1)得到的浸膏，加入浸膏重量3倍体积的二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取，分别萃取得到二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位；取乙酸乙酯部位，上硅胶色谱柱，以体积比为95:5-85:15-70:30-50:50-10:90的二氯甲烷-甲醇洗脱溶剂进行洗脱分离，并以TLC分析合并相似部位，然后用制备液相进行分离，以体积浓度为60％甲醇洗脱，得到胆木新化合物(16-去羟甲基胆木碱B)。

该化合物结构解析的具体数据如下：

淡黄色粉末，如图1所示，高分辨ESI-MS质谱给出的准分子离子峰：311.1752[M+H]⁺(计算值为311.1760)，由此确定化合物分子式为C₁₉H₂₂N₂O₂。

如图2所示，¹HNMR(400MHz,MeOD)δ7.30(d,J＝8.0Hz,1H,H-9),7.21(d,J＝8.0Hz,1H,H-12),6.96(m,1H,H-11),6.90(m,1H,H-10),5.50(q,J＝6.8Hz,1H,H-18),4.94(s,1H,H-3),4.81(m,1H,H-5a),3.98(m,2H,H-20),2.95(m,1H,H-5b),2.85(m,1H,H-6a),2.75(m,2H,H-14),2.60(m,1H,H-16a),2.56(m,1H,H-6b),2.35(m,1H,H-15),2.15(m,1H,H-16b),1.41(d,J＝6.8Hz,3H)。

如图3所示，¹³C NMR(100MHz,MeOD)δ133.4(C-2),54.3(C-3),42.4(C-5),20.5(C-6),109.1(C-7),127.1(C-8),117.3(C-9),118.7(C-10),121.1(C-11),110.7(C-12),1136.6(C-13),29.5(C-14),30.7(C-15),36.6(C-16),11.5(C-17),123.7(C-18),139.5(C-19),64.1(C-20),171.35(C-21).

结构鉴定：在¹H NMR(400MHz,MeOD)图谱上，低场区未发现1位NH的活泼氢的信号，但是，在7.30，6.90，6.96和7.21ppm处各有1个芳氢信号，其峰形和化学位移为典型的A环未被取代的吲哚环上的4个芳氢。其中两个双峰分别归属于H-9(δ7.30,1H,d,8.0Hz)和H-12(δ7.21,1H,d,8.0Hz)，一个m峰归属H-10(δ7.00,m)，一个m峰归属H-11(δ6.96,m)；4.81(1H,m)，2.95(1H,m)，2.85(1H,m)，2.56(1H,m)分别出现了5位和6位上的亚甲基的两个孪生质子磁不等同，提示3，14位可能为饱和键，即D环可能为饱和内酰胺环。

对照文献中胆木碱B的碳谱数据发现，新化合物由19个碳组成，胆木碱B由20个碳组成，继续分析新化合物在化学位移60-70之间有1个羟基碳，而胆木碱B在该位置区间有2个羟基碳，可以确定新化合物为单羟甲基取代，因此确定新化合物为胆木碱B去羟甲基的化合物，即16-去羟甲基胆木碱B。

取胆木新化合物16-去羟甲基胆木碱B加入适量淀粉，制粒，干燥，装胶囊，即得。

实施例2

取16-去羟甲基胆木碱B加入纯化水溶解，加入甜菊苷适量，调节pH至5.5，分装，灭菌即得。

实施例3

取16-去羟甲基胆木碱B加入糊精和淀粉混合均匀，制粒，然后装胶囊制成胶囊剂。

实施例4

取16-去羟甲基胆木碱B加入载体乳糖和玉米淀粉，并加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。

实施例5促细胞增殖的药效学实验

1.CCK-8细胞活力测试实验：实验分为对照组、处理组及本底组。HUVEC细胞用F-12k完全培养基培养，待细胞汇聚度达80％-90％，胰酶消化，调整细胞数为10×10⁴个/mL，按2×10⁴个/孔/200μL接种于96孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱中孵育24h后，以只加培养基且未经任何处理孔作为空白对照，只含培养基(无细胞)的孔作为本底组。于细胞培养箱中孵育刺激24h。弃掉培养基，每孔以100μL PBS清洗3次(最后一次保留)，各加入10μL CCK-8，分别于0.5，1，2，4h检测其450nm处的OD值。

2.结果：CCK-8活力检测结果如图4所示。结果表明，本发明实施例1制备得到的16-去羟甲基胆木碱B不同浓度处理组(0.5μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和/20μg/mL)细胞活力均大于对照组，经统计学分析有非常显著的差异(***P<0.001.)，表明本发明制备得到的16-去羟甲基胆木碱B对HUVEC细胞生长具有促进作用。

实施例6内皮细胞划痕愈合实验

1.内皮细胞划痕愈合实验：HUVEC细胞以6.0×10⁴个细胞/mL的密度接种于96孔培养板，每孔0.2mL含10％胎牛血清和10％肝素钠的青霉素/链霉素补充的F-12k中培养，并在细胞培养箱中孵育。将细胞稀释至7.5×10⁴细胞/mL，接种在96孔板中，使用无菌10μL移液管尖端制造细胞划痕，每样3复孔。用PBS洗去划痕处残存细胞及碎片，吸弃PBS缓冲液。以不含样品的无血清培养基用作空白对照，观察不同浓度的16-去羟甲基胆木碱B对划痕的愈合作用。在配备有数码相机的倒置显微镜下于0，4，8，12，16，24h拍摄照片，并在随机选择的四个点进行宽度测量(Image J软件处理)。伤口闭合的程度按下面公式计算：

愈合率(％)＝(T₀的宽度－T的宽度)/T₀的宽度×100％

T：拍照时间；T₀：初始时间。

2.实验结果：

如图5所示，HUVEC细胞划痕24h后，显微镜观察，与对照组相比，10μg/mL和50μg/mL的16-去羟甲基胆木碱B处理时，HUVEC细胞划痕距离明显缩短(P<0.05)，且HUVEC细胞的密度明显增大，说明16-去羟甲基胆木碱B在10μg/mL和50μg/mL时，可促进HUVEC细胞的增殖和迁移。

以上实验结果表明，本发明提供的16-去羟甲基胆木碱B有一定的促增殖药理活性，且安全性高，可以作为有效成分用来制备内皮损伤疾病或是治疗与内皮修复相关疾病的药物。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物，其特征在于，其结构式如下：

2.权利要求1所述的具有促进内皮损伤修复作用的胆木新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的具有促进内皮损伤修复作用的胆木新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.权利要求1所述的具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物与药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液、合剂、丸剂、涂剂、膏剂或透皮吸收制剂。

5.权利要求1所述的具有促进内皮损伤修复的胆木新化合物在制备防治炎症性内皮损伤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，炎症性内皮损伤包括：急性扁桃体炎、肺炎、咽喉炎、支气管炎、烧伤感染、上呼吸道感染引起的内皮损伤疾病。

7.一种具有促进内皮损伤修复的药物制剂，其特征在于，它包括权利要求1所述的胆木新化合物。