CN110208410B - 一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法 - Google Patents

一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析检测技术领域，公开了一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法。将壳聚糖样品用盐酸溶液溶解后移取一定体积于顶空瓶中封盖，用注射器注入不同体积碳酸氢钠溶液，同时以不加壳聚糖的盐酸溶液作为空白；然后制备好的样品进行顶空气相色谱检测，记录二氧化碳的气相色谱信号值；将得到的样品信号与空白信号作差值，并以此差值对碳酸氢钠溶液体积绘制曲线，得到两个显著转折点，据此计算得到壳聚糖的脱乙酰度。本方法具有良好的测量精度(RSD<0.82％)和准确度(与参考方法测量的结果相比，相对误差<6.46％)。由于HS‑GC可以进行自动化样品反应平衡和测量，因此在批量样品测试分析中更为有效。

Description

一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法。
背景技术
壳聚糖(又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素等)是天然多糖甲壳素的脱乙酰产物，是由甲壳素和壳聚糖两种单体(β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖单糖和β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖单糖)组成的共聚物。
壳聚糖大分子链上除了含有羟基外还分布着游离的胺基，使其具有良好的反应活性和在酸性介质中的溶解性，因此在食品、纺织、造纸、医药、环保及化工等行业有着广阔的应用前景，如：食品上被用作保鲜防腐剂、增稠剂，医学上可用作止血剂，环保上被用作絮凝剂等。脱乙酰度(DD)是指壳聚糖分子中脱去乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总糖残基数的百分比，它直接影响到在稀酸中的溶解能力、粘度、离子交换能力、絮凝性能和氨基有关的化学反应能力，也是鉴定和衡量壳聚糖产品质量的一个极为重要的指标。因此，准确测定壳聚糖的DD值，对于壳聚糖生产中的品质保证及其后续产品的使用性能的提高，都将具有重要意义。
目前，壳聚糖脱乙酰度测定较为常用的方法是基于酸碱中和的手动滴定法，包括pH滴定法和电位滴定法。该方法是利用酸将壳聚糖的自由氨基质子化，形成壳聚糖的胶体溶液，然后采用标准的碱液(NaOH)返滴定胶体溶液中过量的氢离子的浓度，根据甲基橙指示剂的变色、或pH电极或其他电极的电位变化，确定滴定的终点，从而计算壳聚糖中氨基含量而获得DD值。该方法的主要问题是被滴定的溶液粘度较大，滴定剂必须非常缓慢地加入，以免导致测定结果较大的负偏差。因此，该方法是非常耗时的，例如：一个样品通常需要花两个小时。事实上，在滴定即将达到终点时，壳聚糖胶体凝集现象非常显著，严重地干扰着对甲基橙指示剂的颜色突变的判断，或是pH电极点位响应的滞后，对测定的准确性产生很大的影响。
尽管在前期的研究中，也有一些基于现代分析仪器，如：NMR法，紫外光谱法，红外光谱法，元素分析法，气相色谱法，液相色谱法，热分析(DSC)，测定壳聚糖的脱乙酰度方法的报道。但由于这些方法在检测原理上存在着这样或那样的问题，如：壳聚糖样品中的结晶水、吸附水或少量杂质对光谱法的干扰，因此，这些方法基本上没能用于壳聚糖的脱乙酰度的日常检测中。
在前期的研究中，我们采用碳酸氢钠为反应试剂，通过直接或间接的方式与样品溶液进行反应，通过顶空气相色谱技术(HS-GC)检测由碳酸氢钠被转变为CO2的含量，从而计算被测成分，如：纸浆上的羧酸和葡萄酒中有机酸等的含量。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法，包括如下步骤：
(1)样品准备：准确称取一定质量的壳聚糖样品，用盐酸溶液溶解后，用移液枪准确移取一定体积的上述混合液于顶空瓶中，立即封盖，用注射器注入不同体积碳酸氢钠溶液，同时以不加壳聚糖的盐酸溶液作为空白；
(2)样品检测：将(1)中制备好的样品瓶置于顶空进样器中，设置顶空进样器及气相色谱仪操作条件，进行顶空气相色谱检测，记录二氧化碳的气相色谱信号值；
(3)结果计算：将步骤(2)得到的样品信号与空白信号作差值，并以此差值对碳酸氢钠溶液体积绘制曲线，得到两个显著转折点，根据以下公式计算得到壳聚糖的脱乙酰度：
Figure BDA0002086308590000031
其中，n＝C(V2-V1)，V1和V2分别是曲线中第一转折点和第二转折点处对应的碳酸氢钠溶液体积，C是碳酸氢钠溶液的摩尔浓度；m是称取的壳聚糖样品重量(g)，w是100份壳聚糖样品中的水含量份。
优选地，步骤(1)中称取的壳聚糖样品重量为0.200g；所用盐酸溶液浓度为0.1mol/L，体积为20mL；移取的混合液体积为1mL；注入的碳酸氢钠溶液浓度为0.1mol/L，体积分别为0.40mL，0.50mL，0.60mL，0.70mL，0.80mL，0.85mL，0.90mL，0.95mL，1.00mL，1.05mL，1.10mL，1.15mL，1.20mL，1.30mL，1.40mL，1.50mL。
优选地，步骤(2)中所述顶空进样器操作条件为：平衡温度60℃，平衡时间为10min，辅助气压力50KPa，顶空瓶中载气平衡时间12s，管路充气时间12s，管路平衡时间3s，环路平衡时间12s。
优选地，步骤(2)中所述气相色谱仪操作条件为：色谱柱温为105℃，保留时间2min；氮气作为载气，TCD作为检测器；所述氮气流量为2.7mL/min，TCD检测器温度为220℃。
本发明的原理为：
在基于顶空滴定的分析方法中，壳聚糖中的R-NH3 +基团被NaHCO3(代替NaOH)中和，其反应产生的二氧化碳被用作指示剂。与传统方法相同，需要过量的HCl来溶解壳聚糖，以便将其分子中的R-NH2转化为R-NH3 +形式，因此，在滴定过程中发生了两种反应，即，
Figure BDA0002086308590000033
Figure BDA0002086308590000032
对于HCl空白样品，HCO3 -与从盐酸上解离出的过量氢离子完全反应，产生等摩尔量的CO2(即反应(1))。图1显示的是CO2信号与逐步滴加的NaHCO3体积的关系曲线，很明显，HS-GC信号对HCO3 -添加的响应是线性的。
而对于含有壳聚糖的测试溶液，溶液中存在过量的HCl。因此，必须通过HCO3 -完全中这部分HCl，然后进行反应(2)，同时产生CO2。由于R-NH3 +是弱酸物质，因此该溶液在此期间是pH缓冲系统，因此，CO2信号与HCO3 -逐步添加呈非线性关系，R-NH3 +完全中和后，CO2信号不再发生变化。从该滴定曲线，可以得到方程(4)中的V1和V2两个转折点。然而对于图1中的壳聚糖样品，V1转折点并不明显，为此我们将得到的壳聚糖样品信号与HCl空白信号作差值，并以此差值对碳酸氢钠体积作图，可以得到两个显著转折点，见图2，据此由公式(3)可以进一步计算得到壳聚糖的脱乙酰度。
Figure BDA0002086308590000041
n＝C(V2-V1) (4)
其中，C是碳酸氢钠溶液的摩尔浓度(mol/L)；203和42分别是甲壳素残基和乙酰基的分子量；n是壳聚糖中R-NH3 +基团消耗的NaHCO3量(摩尔)；m是样品重量(g)，w是样品中的水含量(％)；V1和V2分别是曲线中第一转折点和第二转折点处对应的碳酸氢钠溶液体积。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)采用本发明方法测定壳聚糖脱乙酰度，省去了传统电导滴定方法中繁琐费时的操作步骤。
(2)采用本发明方法检测壳聚糖脱乙酰度，实验结果客观准确，精确度高，操作方便，在短时间内就可以给出检测结果，大大提高了实验效率，非常适用于壳聚糖脱乙酰度的检测。
(3)本发明的自动顶空气相色谱方法具有温控、振荡，批量化采样的自动操作功能，不仅可以有效地加速由于被测溶液粘度高或反应的活化能高的反应进程，还可以实现样品的批量化自动检测。
附图说明
图1为本发明方法中HCl空白样品的CO2信号与逐步滴加的NaHCO3溶液体积的关系曲线。
图2为本发明方法中壳聚糖样品的CO2信号与HCl空白信号的差值与逐步滴加的NaHCO3溶液体积的关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。
以下实施例所使用的仪器设备及试剂：自动顶空取样器(Thermo HS TriPlus300，US)，安捷伦7890气相色谱仪(热导检测器，GS-Q型毛细管色谱柱，长30m，内径0.53mm)，顶空瓶，硅胶隔垫(螺旋铁盖)。
使用试剂为：壳聚糖，盐酸，碳酸氢钠。
实施例
本实施例测定4种市售壳聚糖的脱乙酰度，具体测定步骤如下：
(1)样品准备：准确称取0.200g的壳聚糖样品，用浓度为0.1mol/L，体积为20mL盐酸溶液溶解后，用移液枪准确移取1mL的上述混合液于21.6mL的顶空瓶中，立即封盖，用注射器注入体积分别为0.40mL，0.50mL，0.60mL，0.70mL，0.80mL，0.85mL，0.90mL，0.95mL，1.00mL，1.05mL，1.10mL，1.15mL，1.20mL，1.30mL，1.40mL，1.50mL的碳酸氢钠溶液，同时以不加壳聚糖的盐酸溶液作为空白；
(2)样品检测：将(1)中制备好的样品瓶置于顶空进样器中，设置顶空进样器及气相色谱仪操作条件(顶空进样器操作条件是：平衡温度60℃，样品平衡时间为10min，辅助气压力50Kpa，顶空瓶中载气平衡时间12s，管路充气时间12s，管路平衡时间3s，环路平衡时间12s；气相色谱操作条件：色谱柱温为105℃，保留时间2min；氮气作为载气，氮气流量为2.7mL/min；TCD检测器温度为220℃)，进行顶空气相色谱检测，记录二氧化碳的气相色谱信号值；
(3)结果计算：将步骤(2)得到的样品信号与空白信号作差值，并以此差值对碳酸氢钠体积作图，得到两个显著转折点，据此根据公式可以计算壳聚糖的脱乙酰度。
采用本实施例方法(HS-GC)计算出4种市售壳聚糖的脱乙酰度，并和电导滴定法检测结果进行对比，结果如表1所示。本方法的测定重复性实验如表2所示。
表1
Figure BDA0002086308590000061
表2
Figure BDA0002086308590000062
由表1可以看出，尽管本发明方法和电导法检测结果相对误差最高是6.46％，满足壳聚糖脱乙酰度检测精确度要求；从表2可以看出本发明方法的RSD<0.82％。因此。本发明的检测方法客观准确，精确度高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)样品准备：准确称取一定质量的壳聚糖样品，用盐酸溶液溶解后，用移液枪准确移取一定体积的上述混合液于顶空瓶中，立即封盖，用注射器注入不同体积碳酸氢钠溶液，同时以不加壳聚糖的盐酸溶液作为空白；
(2)样品检测：将(1)中制备好的样品瓶置于顶空进样器中，设置顶空进样器及气相色谱仪操作条件，进行顶空气相色谱检测，记录二氧化碳的气相色谱信号值；
(3)结果计算：将步骤(2)得到的样品信号与空白信号作差值，并以此差值对碳酸氢钠溶液体积绘制曲线，得到两个显著转折点，根据以下公式计算得到壳聚糖的脱乙酰度：
Figure FDA0002086308580000011
其中，n＝C(V2-V1)，V1和V2分别是曲线中第一转折点和第二转折点处对应的碳酸氢钠溶液体积，C是碳酸氢钠溶液的摩尔浓度；m是称取的壳聚糖样品重量，w是100份壳聚糖样品中的水含量份。
2.根据权利要求1所述的一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法，其特征在于：步骤(1)中称取的壳聚糖样品重量为0.200g；所用盐酸溶液浓度为0.1mol/L，体积为20mL；移取的混合液体积为1mL；注入的碳酸氢钠溶液浓度为0.1mol/L，体积分别为0.40mL，0.50mL，0.60mL，0.70mL，0.80mL，0.85mL，0.90mL，0.95mL，1.00mL，1.05mL，1.10mL，1.15mL，1.20mL，1.30mL，1.40mL，1.50mL。
3.根据权利要求1所述的一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法，其特征在于步骤(2)中所述顶空进样器操作条件为：平衡温度60℃，平衡时间为10min，辅助气压力50KPa，顶空瓶中载气平衡时间12s，管路充气时间12s，管路平衡时间3s，环路平衡时间12s。
4.根据权利要求1所述的一种快速测定壳聚糖脱乙酰度的自动顶空气相色谱方法，其特征在于步骤(2)中所述气相色谱仪操作条件为：色谱柱温为105℃，保留时间2min；氮气作为载气，TCD作为检测器；所述氮气流量为2.7mL/min，TCD检测器温度为220℃。
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