CN110151675A - 一种富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液及其制备方法与用途 - Google Patents

一种富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液及其制备方法，属于化妆品技术领域，所述保湿精华液按重量份数组成如下：纯净水60‑80份、透明颤菌发酵产物3‑6份、银耳多糖5‑8份、泛酸0.05‑0.2份、茶叶提取物0.5‑2份、马齿苋提取物1‑3份、抗坏血酸1.5‑3份、海藻提取物2‑5份、卡波姆0.01‑0.06份、角鲨烷1.5‑3.5份、丙二醇2‑5份、苯氧乙醇0.35‑0.5份、香精0.05‑0.15份。本发明不仅以提高多糖产物为导向，通过培养基中不同碳源、氮源、盐溶液以及酶的选择，显著提升透明颤菌发酵产物的抗氧化活性，旨在通过发酵法显著提升精华液的抗氧化性，同时通过银耳多糖、茶叶提取物、马齿苋提取物等复合物的添加显著提高保湿精华液延缓皮肤衰老，使皮肤光滑有光泽的功效。

Description

一种富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液及其制备方 法与用途
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液及其制备方法。
背景技术
透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌，常见于沼泽、腐烂植物等缺氧的环境中。这种细菌可以合成一种特别的血红蛋白，而这种血红蛋白很可能具有运输氧的功能且氧解离速率常数很大，从而可以将氧较快地释放到呼吸膜，并且有助于细菌在低氧条件下生长。近年来有研究表明，透明颤菌发酵产物在抗氧化方面有很好的效果，可以增加皮肤对氧气的利用，促进细胞生长和产物合成，从而让皮肤更年轻。
银耳多糖是一种植物源性类透明质酸物质，分子量达到100-130万。此种多糖可以提高化妆品的稳定性，降低界面张力，是一种植物源性高效保湿剂。
由于年龄的增长外加长期处于辐射环境中，不良的生活习惯等导致皮肤不能适应内外环境的变化，容易出现皮肤老化现象。主要表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、皮肤变色、毛细血管扩张、形成色素斑等。而目前对于皮肤老化的治疗方法基本为激光治疗。激光治疗虽然疗程短、能嫩肤，但同时也存在着很多的问题。在用高能的光波深入皮肤底层时，老化细胞被打散后会在我们肌肤表层结痂脱落，在结痂的过程中我们的肌肤很可能会出现缺水干燥的情况，同时刚做完激光手术后一定要注意防晒，否则经过太阳的照射后脸部老化会变得更严重，所以治疗完后需要做好术后护理。而防止皮肤老化的最好方法是做好日常防护，注意防晒且多多配合保湿产品进行使用。所以研发一款抗氧化保湿的护肤品很有必要。
发明内容
为了充分利用透明颤菌发酵产物抗氧化的优良特性，发挥其在化妆品工业领域的应用，改进现有技术的不足，本发明提供了一种富含透明颤菌发酵产物的组合物及其应用，不仅以提高多糖产物为导向，通过培养基中不同碳源、氮源、盐溶液以及酶的选择，显著提升透明颤菌发酵产物的抗氧化活性，旨在通过发酵法显著提升精华液的抗氧化性，延缓皮肤衰老，使皮肤光滑有光泽。
为实现上述目的，本发明采用如下方案：
一种抗氧化保湿护肤精华液，按重量份数组成如下：纯净水60-80份、透明颤菌发酵产物3-6份、银耳多糖5-8份、泛酸0.05-0.2份、茶叶提取物0.5-2份、马齿苋提取物1-3份、抗坏血酸1.5-3份、海藻提取物2-5份、卡波姆0.01-0.06份、角鲨烷1.5-3.5份、丙二醇2-5份、苯氧乙醇0.35-0.5份、香精0.05-0.15份；
优选地，一种抗氧化保湿护肤精华液，按重量份数组成如下：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份、银耳多糖5.5份、泛酸0.15份、茶叶提取物0.5份、马齿苋提取物1.5份、抗坏血酸2份、海藻提取物3份、卡波姆0.01份、角鲨烷2份、丙二醇2.5份、苯氧乙醇0.35份、香精0.05份；
优选地，所述透明颤菌发酵产物的制备步骤如下：
将透明颤菌按照接种量1-4％接种于发酵培养基中，在26-30℃，110-130rpm条件下，发酵2-5天，经离心除去菌体，得到透明颤菌发酵产物。
优选地，所用的菌种为透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)ATCC 15551；
更优选地，所述步骤(1)中，透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖20-40g/L、蛋白胨4-6g/L、硫酸铵0.1-0.5g/L、磷酸氢二钾0.3-0.5g/L、磷酸二氢钾0.1-0.2g/L、盐溶液0.5-1.5mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁16-20g/L、硫酸锰3-7g/L、硫酸亚铁0.1-0.3g/L、氯化钙0.1-0.3g/L，过氧化氢酶8000-10000U/L，其余为水；
更优选地，所述步骤(1)中，透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
所述加入过氧化氢酶可以有效提高透明颤菌胞外多糖产量，从而显著提高透明颤菌的抗氧化效果。
此外，通过对常用碳、氮源以及无机盐进行响应面实验，选择对培养基影响较大的因子并对其浓度进行优化，最终选择将乳糖作为主要碳源，将蛋白胨作为主要氮源，不仅降低成本，而且实现了提高胞外多糖产量的技术效果，从而显著提高透明颤菌发酵产物的抗氧化效果。
更优选地，所述步骤(1)中的发酵周期为4-5天；
更优选地，所述步骤(1)中的发酵周期为5天。
优选地，所述步骤(1)中，离心条件为6000-10000rpm，离心时间为4-6min。
更优选地，所述步骤(2)中，转速为8000rpm，离心时间为5min。
进一步地，所述茶叶提取物的制备方法由常规方法获得，如溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法，超声波辅助溶剂提取法。
优选地，所述茶叶提取物的制备方法为超声波辅助溶剂提取法，具体步骤如下：
(1)将新鲜的茶叶晒干粉碎过筛；
(2)将所述茶叶与75％的乙醇按照料液比1g：6-10mL混合均匀；
(3)在60℃-80℃的条件下利用超声波进行浸提15min-30min；
(4)冷却后在3500-5000rpm的条件下离心8-10min；
(5)利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至膏状物即可；
优选地，所述茶叶提取物的制备中，步骤(1)中的过筛目数为30目；
优选地，所述茶叶提取物的制备中，步骤(2)中的料液比为1：8g/mL；
优选地，所述茶叶提取物的制备中，步骤(3)中的温度为60℃，浸提时间为15min；
优选地，所述茶叶提取物的制备中，步骤(4)中的转速为3500rpm，时间为10min。
进一步地，所述马齿苋提取物的制备方法由常规方法获得，如溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法。
优选地，所述马齿苋提取物的制备方法为溶剂提取法，具体步骤如下：
(1)将新鲜的马齿苋洗净晒干粉碎过筛；
(2)将经粉碎的所述马齿苋与75％的乙醇按照料液比1g：8-15mL混合，静置1.5h-3.5h；
(3)将混合溶液反复抽滤3-6次；
(4)利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至膏状物即可；
优选地，所述马齿苋提取物的制备，步骤(1)中的过筛目数为40目；
优选地，所述马齿苋提取物的制备，步骤(2)中的料液比为1g；10mL，静置时间为3h；
优选地，所述马齿苋提取物的制备，步骤(3)中的抽滤次数为5次。
进一步地，所述银耳多糖的的制备方法由常规方法获得，如溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法等。
优选地，所述银耳多糖的制备方法为溶剂提取法，具体步骤如下：
(1)将银耳干品粉碎，将粉碎后的银耳与去离子水按照料液比1g：55-65ml进行复水处理；
(2)在55-65℃的情况下搅拌浸提4-6h，对浸提物进行离心处理，8500-12000rpm下离心4-6min，得到银耳上清液；
(3)将所述银耳上清液通过旋蒸进行浓缩，得到浓缩液；
(4)向所述浓缩液中加入4-5倍体积的乙醇进行醇沉处理，并在5000-8500rpm下离心6min，得到的沉淀即为银耳粗多糖。
更优选地，所述银耳多糖的的制备方法还包括多糖纯化步骤，所述纯化步骤为常规的溶
剂除杂纯化方法。
更优选地，所述银耳多糖的纯化步骤，具体如下：
(1)将所述银耳粗多糖进行复水溶解；并与氯仿正丁醇混合试剂以体积比4：1的比例混合，震荡离心，除去杂蛋白，得到银耳粗多糖；所述氯仿正丁醇混合试剂中氯仿与正丁醇以体积比4：1混合；
(2)将所述银耳粗多糖进行旋蒸处理，在旋蒸过程中氯仿正丁醇混合试剂挥发殆尽，并进一步通过透析除去小分子杂质，得到银耳多糖。
优选地，所述银耳多糖的制备中，步骤(2)中的温度为60℃，浸提时间为5h，转速为10000rpm，离心时间为5min；
优选地，所述银耳多糖的制备中，步骤(4)中的转速为8000rpm，离心时间为6min。
本发明的另一目的是提供所述富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液的用途。
优选地，所述抗氧化保湿精华液用于化妆品中。
有益效果：
1、本发明所述含有透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿护肤精华液，具有抗氧化、锁水保湿的功效，与添加的茶叶提取物及马齿苋提取物共同使用大大增加其抗氧化效果，其中马齿苋提取物还有抗菌效果。银耳多糖、海藻提取物以及泛酸可以起到很好的锁水保湿效果，其中海藻提取物还可以起到部分增稠效果。抗坏血酸(维生素C)可以美白肌肤、祛纹防皱。角鲨烷可以调节水油平衡，起到润肤剂的作用。该产品气味清香，使用效果极佳，而且所述组合物用于护肤精华配方具有生产工艺简单、生产效率高，不污染环境的特点。
2、本发明在选择透明颤菌的发酵培养基时，特别以提高透明颤菌胞外多糖产量为导向，从而显著提高透明颤菌发酵产物的抗氧化效果。而对于多糖产量的大小对于透明颤菌的抗氧化效果的影响还未曾有过相关报道。
3、本发明在所述的银耳多糖的制备工艺中加入了纯化工艺，使其保湿功效增强。
附图说明
图1为本发明实施例5胞外多糖产量与自由基清除率关系图。
具体实施方式
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，但不用来限制本发明的范围。
本发明采用的菌株为透明颤菌，以下实施例中将以透明颤菌ATCC 15551为例对本发明的方法进行说明，以上选用的菌种应理解为示例性的而非具体限定，本发明所述方法对于目前已知的同种属的生产菌株均适用。
本发明实施例提出一种富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液，按重量份数组成如下：纯净水60-80份、透明颤菌发酵产物3-6份、银耳多糖5-8份、泛酸0.05-0.2份、茶叶提取物0.5-2份、马齿苋提取物1-3份、抗坏血酸1.5-3份、海藻提取物2-5份、卡波姆0.01-0.06份、角鲨烷1.5-3.5份、丙二醇2-5份、苯氧乙醇0.35-0.5份、香精0.05-0.15份；
所述透明颤菌发酵产物的制备步骤为：
(1)向发酵培养基中，按照接种量1-4％接入透明颤菌，在30℃，120rpm条件下，发酵2-5天；
(2)发酵结束后将发酵液在8000rpm下离心5min除去菌体，得到发酵液，即为透明颤菌发酵产物；
所述透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖20-40g/L、蛋白胨4-6g/L、硫酸铵0.1-0.5g/L、磷酸氢二钾0.3-0.5g/L、磷酸二氢钾0.1-0.2g/L、盐溶液0.5-1.5mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁16-20g/L、硫酸锰3-7g/L、硫酸亚铁0.1-0.3g/L、氯化钙0.1-0.3g/L，过氧化氢酶8000-10000U/L，其余为水。
所用的菌种为透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)ATCC 15551；
在本发明一实施例中，所述富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿精华液中，所述透明颤菌发酵产物可为3、4、5、6份、银耳多糖可为5、6、7、8份、茶叶提取物可为0.5、1、1.5、2份、马齿苋提取物可为1、2、3份。
在本发明一实施例中，所述透明颤菌的接种量可为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％。
在本发明一实施例中，所述透明颤菌的发酵时间可为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5天。
在本发明一实施例中，所述透明颤菌的发酵培养基的组成中，乳糖可为20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40g/L；所述蛋白胨可为4、5、6g/L，所述硫酸亚铁可为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3g/L；所述过氧化氢酶的酶活可为8000、8500、9000、9500、10000U/L等，其中，加入过氧化氢酶可以大大提高胞外多糖产量，从而使得透明颤菌的抗氧化活性显著增强。
实施例1一种抗氧化保湿精华液的制备
一种抗氧化保湿护肤精华液，按重量份数组成如下：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份、银耳多糖5.5份、泛酸0.15份、茶叶提取物0.5份、马齿苋提取物1.5份、抗坏血酸(维生素C)2份、海藻提取物3份、卡波姆0.01份、角鲨烷2份、丙二醇2.5份、苯氧乙醇0.35份、香精0.05份；
所述透明颤菌发酵产物的发酵方法为：
(1)向发酵培养基中，按照接种量1％接入透明颤菌，在30℃，120rpm条件下，发酵5天；
(2)发酵结束后将发酵液在8000rpm下离心5min除去菌体，得到发酵液，即为透明颤菌发酵产物；
其中透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
所用的菌种为透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)ATCC 15551；
所述茶叶提取物通过以下工艺制得：
(1)将新鲜的茶叶晒干粉碎过30目筛；
(2)与75％的乙醇以1：8g/mL的比例混合均匀；
(3)在60℃的条件下利用超声波进行浸提15min；
(4)冷却后在3500rpm的条件下离心10min；
(5)利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至膏状物即可；
所述马齿苋提取物通过以下方法制得：
(1)将新鲜的马齿苋洗净晒干粉碎过40目筛；
(2)将经过筛的马齿苋与75％的乙醇按照料液比以1g：10mL的比例混合均匀，静置3h；
(3)将混合溶液反复抽滤5次；
(4)利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至膏状物即可；
所述银耳多糖通过以下方法制得：
(1)将银耳干品粉碎，将粉碎后的银耳与去离子水按照料液比1g：60ml进行复水处理；
(2)在60℃的情况下搅拌浸提5h，对浸提物进行离心处理，10000rpm下离心5min，得到银耳上清液；
(3)将所述银耳上清液通过旋蒸进行浓缩，得到浓缩液；
(4)向所述浓缩液中加入5倍体积的乙醇进行醇沉处理，并在8000rpm下离心6min，得到银耳多糖沉淀，将所述银耳多糖沉淀进行复水溶解；
(5)将经复水溶解的银耳多糖沉淀与氯仿正丁醇混合试剂以体积比4：1的比例混合，震荡离心，除去杂蛋白，得到银耳粗多糖；所述氯仿正丁醇混合试剂中氯仿与正丁醇以体积比4：1混合；
(6)将所述银耳粗多糖进行旋蒸处理，在旋蒸过程中使氯仿正丁醇混合试剂挥发殆尽，并进一步通过透析除去小分子杂质，得到银耳多糖。
所述香精为迷迭香萃取精油。
实施例2一种抗氧化保湿精华液的制备
一种抗氧化保湿护肤精华液，按重量份数组成如下：纯净水60份、透明颤菌发酵产物3份、银耳多糖5份、泛酸0.05份、茶叶提取物0.5份、马齿苋提取物1份、抗坏血酸1.5份、海藻提取物2份、卡波姆0.01份、角鲨烷1.5份、丙二醇2份、苯氧乙醇0.35份、香精0.05份；
所述透明颤菌发酵产物的发酵方法为：
(1)向发酵培养基中，按照接种量2％接入透明颤菌，在28℃，110rpm条件下，发酵3天；
(2)发酵结束后将发酵液在7000rpm下离心5min除去菌体，得到发酵液，即为透明颤菌发酵产物；
其中透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖20g/L、蛋白胨4g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、盐溶液0.5mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁16g/L、硫酸锰3g/L、硫酸亚铁0.1g/L、氯化钙0.1g/L，过氧化氢酶8000U/L，其余为水。
所用的菌种为透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)ATCC 15551；
所述茶叶提取物、马齿苋提取物制备步骤同实施例1
所述银耳多糖通过以下方法制得：
(1)将银耳干品粉碎，将粉碎后的银耳与去离子水按照料液比1g：55ml进行复水处理；
(2)在55℃的情况下搅拌浸提4h，对浸提物进行离心处理，11000rpm下离心4min，得到银耳上清液；
(3)将所述银耳上清液通过旋蒸进行浓缩，得到浓缩液；
(4)向所述浓缩液中加入4倍体积的乙醇进行醇沉处理，并在5000rpm下离心6min，得到银耳多糖沉淀，将所述银耳多糖沉淀进行复水溶解；
(5)将经复水溶解的银耳多糖沉淀与氯仿正丁醇混合试剂以体积比4：1的比例混合，震荡离心，除去杂蛋白，得到银耳粗多糖；所述氯仿正丁醇混合试剂中氯仿与正丁醇以体积比4：1混合；
(6)将所述银耳粗多糖进行旋蒸处理，在旋蒸过程中使氯仿正丁醇混合试剂挥发殆尽，并进一步通过透析除去小分子杂质，得到银耳多糖。
所述香精为迷迭香萃取精油。
实施例3一种抗氧化保湿精华液的制备
一种抗氧化保湿护肤精华液，按重量份数组成如下：纯净水80份、透明颤菌发酵产物6份、银耳多糖8份、泛酸0.2份、茶叶提取物2份、马齿苋提取物3份、抗坏血酸3份、海藻提取物5份、卡波姆0.06份、角鲨烷3.5份、丙二醇5份、苯氧乙醇0.5份、香精0.15份；
所述透明颤菌发酵产物的发酵方法为：
(1)向发酵培养基中，按照接种量1.5％接入透明颤菌，在30℃，110rpm条件下，发酵4天；
(2)发酵结束后将发酵液在8000rpm下离心5min除去菌体，得到发酵液，即为透明颤菌发酵产物；
其中透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖40g/L、蛋白胨6g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、盐溶液1.5mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁20g/L、硫酸锰7g/L、硫酸亚铁0.3g/L、氯化钙0.3g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
所用的菌种为透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)ATCC 15551；
所述茶叶提取物、马齿苋提取物、银耳多糖的制备步骤同实施例1
实施例4培养基中有无过氧化氢酶与产物的显著性对比
(一)为测定过氧化氢酶的加入对产物及抗氧化性的影响，特将培养基分为以下两组：
对照组：发酵培养基组成：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，其余为水。
实验组：发酵培养基组成：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
发酵方法：分别将透明颤菌接种于对照组和实验组的发酵培养基中，按照接种量1％接入透明颤菌，在30℃，120rpm条件下，发酵6天；
分别在发酵的第2、3、4、5、6天取样进行多糖和抗氧化性能的测定，将取出的发酵菌体液在8000rpm下离心5min除去菌体，得到发酵液。
(二)多糖测定的实验方法：
取2ml发酵液过0.45um的水相膜去掉菌体，取1ml于EP管中，加5倍体积的无水乙醇，在4℃条件下过夜，8000rpm离心5min，弃去上清，得到多糖沉淀，加5ml水复溶，得到的溶液用蒽酮-硫酸法测定多糖含量。每个培养基组分至少做3组平行实验并连续检测2-6天的胞外多糖产量。
(三)抗氧化显著性的测定方法：
(1)实验原理：采用结晶紫分光光度法测定，此方法是基于H2O2和Fe2+发生Fenton反应产生羟自由基，羟自由基很容易进攻高电子云密度点，会与结晶紫中具有高电子云密度的—C＝C—基团发生亲电加成反应，从而使结晶紫褪色，通过测定结晶紫吸光度值的变化从而间接测出羟自由基的含量。
(2)实验仪器及试剂：UVmini-1240型紫外分光光度计(日本岛津公司)、SG78-SevenGo Duo proTM型pH计(Mettler Toledo)、0.4mmol/L结晶紫溶液、1.0mmol/L硫酸亚铁、2.0mmol/L过氧化氢溶液、以上五组不同样品；以上试剂均为分析纯。
(3)实验方法：在一系列50mL具塞比色管中分别顺序加入1.5mL 0.4mmol/L结晶紫溶液、2.0mL 1.0mmol/L硫酸亚铁溶液、1.0mL2.0mmol/L过氧化氢溶液。调节pH值到4.0，稀释到50mL，并摇匀，放置30min后，测定580nm处的吸光度记为Ab，同时测定不加过氧化氢溶液时在580nm处的吸光度，记为Aa。在上体系中分别加入以上两组不同的样品。每个组分至少做3组平行实验并连续检测10-40min在580nm处的吸光度并记为Ac，则待测样品对自由基的消除率可用如下公式进行计算：
S(％)＝(Ac-Ab)/(Aa-Ab)*100％
(四)实验结论：(实验结果见表1)
表1加酶与不加酶培养基的不同性能测定
注：与对照组相比**(P<0.01)，***(P<0.001)，****(P<0.0001)
实验结果表明，在实验组中，在透明颤菌发酵的2-5天内，加入过氧化氢酶的培养基与未加入过氧化氢酶的培养基相比胞外多糖产量显著提高(P<0.01)，除第三天外自由基清除率效果显著(P<0.01)，由此可以看出加入过氧化氢酶可以大大提高胞外多糖产量且显著促进了透明颤菌发酵液的抗氧化性能的提高。随着时间的推移看，胞外多糖产量先降低后升高然后逐渐趋于稳定，同样，透明颤菌发酵液的自由基消除率(即抗氧化活性)具有与之对应的变化趋势，由此验证以提高透明颤菌的多糖产量为导向来提高透明颤菌发酵液的抗氧化活性具有紧密的关联性。
需要说明的是，本发明实施例2、3可获得同实验组相近的技术效果。
实施例5透明颤菌培养基中碳、氮源以及盐溶液对于产物的影响
对照组：透明颤菌初始培养基组成：葡萄糖30g/L、牛肉膏4g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.17g/L、磷酸二氢钾0.51g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁5g/L、氯化钙0.3g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
实验组：透明颤菌优化后培养基组成：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
发酵方法：分别将透明颤菌接种于对照组和实验组的发酵培养基中，按照接种量1％接入透明颤菌，在30℃，120rpm条件下，发酵6天；
分别在发酵的第2、3、4、5、6天取样进行多糖和抗氧化性能的测定，将取出的发酵菌体液在8000rpm下离心5min除去菌体，得到发酵液。
实验测定方法：方法与实施例4中(二)多糖测定的实验方法、(三)抗氧化显著性的测定方法相同。
实验结果与结论(结果见表2)：
表2优化前后培养基的不同性能测定
注：与优化前培养基产糖量相比，**(P<0.01)，***(P<0.001)，****(P<0.0001)
实验结果表明，透明颤菌培养基产糖量随着周期变长呈现先下降后增长再趋于稳定的趋势。本发明的中实验组的碳、氮源以及盐溶液的选择区别于对照组，其有效成分胞外多糖产量差异均为极显著(P<0.01)，且与对照组培养基相比自由基清除效果显著(P<0.01)，表明该发酵培养基具有很好的抗氧化效果。需要说明的是，本发明实施例2、3可获得同实验组相近的技术效果。
以胞外多糖产量/(mg/L)为横坐标，自由基消除率S(％)为纵坐标，均取稳定后的自由基消除率值研究不加酶、优化前培养基以及优化后胞外多糖产量与自由基消除率之间的关系，绘制的曲线图如附图1所述。
实验结果表明，胞外多糖产量越高，自由基清除率越高，所以通过优化培养基提高产糖量可以大大提高抗氧化性能。
实施例6不同培养基条件下透明颤菌生长曲线测定
为测定不同培养基条件下的透明颤菌生长曲线，将培养基分为以下三组：
实验组：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
对照组1：葡萄糖30g/L、牛肉膏4g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.17g/L、磷酸二氢钾0.51g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁5g/L、氯化钙0.3g/L，过氧化氢酶10000U/L，其余为水。
对照组2：乳糖35g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵0.2g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、盐溶液1mL/L。其中盐溶液组成为：硫酸镁19.5g/L、硫酸锰5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钙0.17g/L，其余为水。
(1)实验方法
将透明颤菌以1％的接种量接到100mL不同培养基中，30℃，120rpm条件下培养，以开始培养前测定每组培养液的OD值(600nm)作为起点。每培养2h取一次样，在600nm波长下测定菌浓直至菌浓稳定，至菌浓稳定后每隔一天取一次样，在600nm波长下分别测定不同培养基对应菌浓。
(2)实验结果
表3不同发酵时间的OD值
时间/h 实验组 对照组1 对照组2
0 0.2208 0.2415 0.2414
2 0.2650 0.2635 0.2638
4 0.2997 0.3085 0.2789
6 0.5319 0.5277 0.4772
8 0.5942 0.6187 0.5331
10 0.6772 0.6969 0.6521
12 0.7213 0.7323 0.6974
14 0.7410 0.7169 0.7335
16 0.7139 0.7327 0.7146
18 0.7086 0.7413 0.7386
20 0.7205 0.7589 0.7435
22 0.6987 0.7149 0.7464
时间/天 实验组 对照组1 对照组2
2 0.5713 0.6092 0.6751
3 0.5462 0.6354 0.6835
4 0.5894 0.6712 0.6681
5 0.5581 0.5934 0.6834
6 0.5628 0.5833 0.5981
随着时间的推移，透明颤菌先增长在22h左右基本趋于稳定，第二天直至第六天菌浓基本处于稳定状态。三种培养基菌浓基本没有差别。本实施例验证了本发明提高透明颤菌发酵产物的抗氧化性并不是以常规的菌体生长活力提高(OD值)为导向来进行判断了，通过现有技术中OD值的提高以及在发酵2-5天的稳定期，是无从通过有限次实验来确定如何获得高抗氧化活性的透明颤菌发酵产物。
实施例7抗氧化功效性评价
(1)为了测定不同组成的精华液的抗氧化功效性能，特将样品分为以下5组，其中：
对照组1：精华液组成：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份，所述透明颤菌发酵产物是由中国专利(申请公布号：CN 108697633 A)中已经公开的发酵培养基发酵制备获得，培养基组分如下：自溶酵母提取物4g/L、大豆木瓜蛋白酶蛋白胨3g/L、葡萄糖3g/L、磷酸氢二钾0.088g/L、氯化钙0.05g/L、五水硫酸铜60ug/L、一水硫酸锰152ug/L、碘化钾1ug/L、七水硫酸锌200ug/L、六水氯化铝100ug/L，剩余部分为渗透水；
在培养期间，pH保持恒定(7.00)，温度(26℃),120rpm，溶解氧(0.5)也保持恒定。当固体含量达到0.6％并且葡萄糖含量达到0.035％时停止培养，得到透明颤菌发酵产物(即透明颤菌发酵液)。
对照组2：精华液组成：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份，所述透明颤菌发酵产物是由本发明实施例1发酵培养基发酵制备获得(即透明颤菌发酵液)；发酵方法同本发明实施例1.
对照组3：与本发明实施例1制备的精华液组成相近，唯一不同的是不含有茶叶提取物；
对照组4：与本发明实施例1制备的精华液组成相近，唯一不同的是不含有马齿苋提取物；
实验组1：本发明实施例1制备的精华液。
(2)实验方法：方法与实施例4中(三)抗氧化显著性的测定方法相同。
(3)实验结果：
表4自由基消除率S(％)
注：与对照组1相比**(P<0.01)；
与对照组2相比#(0.01<P<0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.001)；
与实验组相比**(P<0.01)，***(P<0.001)；
实验结果表明，对照组1和对照组2相比，显然对照组2中，本发明制备的透明颤菌发酵液的抗氧化活性更为显著。
随着时间的推移，自由基清除率先增加，在30min时趋于稳定状态。透明颤菌、茶叶提取物以及马齿苋提取物均具有抗氧化的效果。添加茶叶提取物与马齿苋提取物混合物在10min时与只添加透明颤菌发酵产物有显著差异(0.01<P<0.05)，且与只添加单一提取物有极显著差异(P<0.01)；在20min-40min时，添加任何一种提取物或两种提取物与只添加透明颤菌发酵产物有极显著差异(P<0.01)，且添加两种提取物与只添加单一提取物也有极显著差异(P<0.01)；与已公开培养基相比有显著差异。表明透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿护肤精华液，具有抗氧化的功效，与添加的茶叶提取物及马齿苋提取物共同使用可大大增加其抗氧化效果。需要说明的是，本发明实施例2、3可获得同实验组相近的技术效果。
实施例8锁水保湿功效性评价
为了测定不同组成的精华液的锁水保湿功效性能，特将样品分为以下4组，其中：
对照组1精华液组成：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份，所述透明颤菌发酵产物是由中国专利(申请公布号：CN 108697633 A)中已经公开的发酵培养基发酵制备获得，培养基组分如下：自溶酵母提取物4g/L、大豆木瓜蛋白酶蛋白胨3g/L、葡萄糖3g/L、磷酸氢二钾0.088g/L、氯化钙0.05g/L、五水硫酸铜60ug/L、一水硫酸锰152ug/L、碘化钾1ug/L、七水硫酸锌200ug/L、六水氯化铝100ug/L，剩余部分为渗透水；
在培养期间，pH保持恒定(7.00)，温度(26℃),120rpm，溶解氧(0.5)也保持恒定。当固体含量达到0.6％并且葡萄糖含量达到0.035％时停止培养，得到透明颤菌发酵产物(即为发酵液)。
对照组2：精华液组成：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份，所述透明颤菌发酵产物是由本发明实施例1发酵培养基发酵制备获得；
对照组3：与本发明实施例1制备的精华液组成相近，唯一不同的是银耳多糖的制备方法中未经过除蛋白与透析的处理；
实验组1：本发明实施例1制备的精华液。
实验原理和测定方法如下：
(1)实验原理：依据QB/T 4256-2011《化妆品保湿功效性评价指南》，采用电容法测定人体皮肤角质层的水分含量的方法。此种方法是基于水和其他物质的介电常数差异显著，按照皮肤角质层水分含量的不同，从而测得的皮肤的电容值不同，此参数可代表皮肤水分含量。
(2)实验试剂材料及仪器：干面纸巾；乳胶指套；注射器或移液器；皮肤水分含量测试探头：Corneometer CM825；分析天平：精度0.1mg。
(3)实验条件：选取年龄在18-50岁之间(妊娠或哺乳期妇女除外)的无活动性过敏、无体质高度敏感、近一个月内未曾使用激素类药物以及免疫抑制剂、现在或近三个月受试部位未参加其他临床试验的志愿者30人，在环境温度20-22℃，湿度40％-60％条件下进行实时动态监测。
(4)测试前准备：测试前2-3天受试者不能在受试部位使用任何产品(化妆品或外用药品)，测试前1h-3h不能接触水，试验前，受试者需要统一用干的面巾纸清洁双手前臂内侧。在双手前臂内侧随机选取区域并做好标记，试验区域面积3cm×3cm。分别标记空白区和试验区，两域间隔至少1cm。正式测试前在干净房间内静坐20min，禁止饮水，前臂暴露，呈测试状态放置，保持放松。
(5)而后在试验区按(2.0±0.1)mg/cm2的用量单次分别涂抹上述不同组分的产品，使用乳胶指套将试样均匀涂布于试验区内，并记录实际涂样量。按电容法皮肤水分测定仪使用说明书调整仪器后，进行产品区域和对照区域的测量，每个区域平行测定至少3次。先测量各测试区域的初始值(样品使用前)，然后分别在样品使用后2h、4h、6h、8h、10h后进行测量，每次测量由同一仪器同一测量人并清洁测量探头。
(6)实验结论：
表5锁水保湿功效性评价
注：与空白组相比，**(P<0.01)，***(P<0.001)，****(P<0.0001)
实验结果显示，透明颤菌发酵产物、银耳多糖均具有保湿的功效，且优化后的透明颤菌发酵产物与公开透明颤菌发酵产物相比效果显著(P<0.01)，纯化后的银耳多糖与未纯化的银耳多糖相比效果显著(P<0.01)。表明次工艺生产的产品有良好的锁水保湿性能。需要说明的是，本发明实施例2、3可获得同实验组相近的技术效果。
除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：按重量份数组成如下：纯净水60-80份、透明颤菌发酵产物3-6份、银耳多糖5-8份、泛酸0.05-0.2份、茶叶提取物0.5-2份、马齿苋提取物1-3份、抗坏血酸1.5-3份、海藻提取物2-5份、卡波姆0.01-0.06份、角鲨烷1.5-3.5份、丙二醇2-5份、苯氧乙醇0.35-0.5份、香精0.05-0.15份。
2.如权利要求1所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：所述富含透明颤菌发酵产物的抗氧化保湿护肤精华液，按重量份数组成如下：纯净水60份、透明颤菌发酵产物5份、银耳多糖5.5份、泛酸0.15份、茶叶提取物0.5份、马齿苋提取物1.5份、抗坏血酸2份、海藻提取物3份、卡波姆0.01份、角鲨烷2份、丙二醇2.5份、苯氧乙醇0.35份、香精0.05份。
3.如权利要求1所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：
所述透明颤菌发酵产物的制备步骤如下：
将透明颤菌按照接种量1-4％接种于发酵培养基中，在26-30℃，110-130rpm条件下，发酵2-5天，经离心除去菌体，得到透明颤菌发酵产物；
所述透明颤菌的发酵培养基组成为：乳糖20-40g/L、蛋白胨4-6g/L、硫酸铵0.1-0.5g/L、磷酸氢二钾0.3-0.5g/L、磷酸二氢钾0.1-0.2g/L、盐溶液0.5-1.5mL/L；其中盐溶液组成为：硫酸镁16-20g/L、硫酸锰3-7g/L、硫酸亚铁0.1-0.3g/L、氯化钙0.1-0.3g/L，过氧化氢酶8000-10000U/L，其余为水。
4.如权利要求3所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：所述步骤(1)中的发酵周期4-5天。
5.如权利要求1所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：所述茶叶提取物的制备步骤如下：
(1)将新鲜的茶叶晒干粉碎过筛；
(2)将所述茶叶与75％的乙醇按照料液比1g：6-10mL混合均匀；
(3)在60℃-80℃的条件下利用超声波进行浸提15min-30min；
(4)冷却后在3500-5000rpm的条件下离心8-10min；
(5)利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至膏状物即可。
6.如权利要求1所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：所述马齿苋提取物的制备步骤如下：
(1)将新鲜的马齿苋洗净晒干粉碎过筛；
(2)将经粉碎的所述马齿苋与75％的乙醇按照料液比1g：8-15mL混合，静置1.5h-3.5h；
(3)将经静置的混合溶液反复抽滤3-6次；
(4)利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至膏状物即可。
7.如权利要求1所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：所述银耳多糖的制备步骤如下：
(1)将粉碎后的银耳与去离子水按照料液比1g：55-65ml进行复水处理；
(2)在55-65℃的情况下搅拌浸提4-6h，对浸提物进行离心处理，8500-12000rpm下离心4-6min，得到银耳上清液；
(3)将所述银耳上清液通过旋蒸进行浓缩，得到浓缩液；
(4)向所述浓缩液中加入4-5倍体积的乙醇进行醇沉处理，并在5000-8500rpm下离心6min，得到银耳多糖沉淀，将所述银耳多糖沉淀进行复水溶解；
(5)将经复水溶解的银耳多糖沉淀与氯仿正丁醇混合试剂以体积比4：1的比例混合，震荡离心，除去杂蛋白，得到银耳粗多糖；所述氯仿正丁醇混合试剂中氯仿与正丁醇以体积比4：1混合；
(6)将所述银耳粗多糖进行旋蒸处理，并进一步通过透析除去小分子杂质，得到银耳多糖。
8.如权利要求7所述一种抗氧化保湿精华液，其特征在于：所述银耳多糖的制备步骤中，步骤(2)中的温度为60℃，浸提时间为5h，转速为10000rpm，离心时间为5min。
9.权利要求1-8任一所述抗氧化保湿精华液的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述抗氧化保湿精华液用于化妆品。
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