CN110169944A - 一种抗衰老护肤组合物、其制备工艺及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗衰老护肤组合物、其制备工艺及应用。本发明的组合物主要由黑灵芝、太子参、滇黄精、连翘、紫花地丁，经合适的制备方法制备获得。该组合物对于皮肤的改善作用非常理想，能够增加I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症。并且，该组合物的原材料为天然成分、易于获得、成本低廉，制备方法简单。

Description

一种抗衰老护肤组合物、其制备工艺及应用

技术领域

本发明属于化妆品领域，更具体地，本发明涉及一种抗衰老护肤组合物、其制备工艺及应用。

背景技术

皮肤分布于人体表层，一般由外至内分为表皮、真皮和皮下组织三大部分，而表皮又分为角质层、透明层、颗粒层、棘层及基底层。皮肤衰老的进展性发生是现代女性最为担心的问题。

皮肤衰老的因素繁多，是由许多内在因素以及外在因素的综合作用导致的，内在因素主要包括：皮肤附属器官功能的自然减退例如皮肤的汗腺、皮肤腺功能降低，分泌物减少，使皮肤的皮肤膜、角质层缺乏滋润；皮肤新陈代谢减慢，真皮内的保湿因子减少，真皮内弹力纤维和胶原纤维功能减退，造成皮肤张力、弹力减弱，容易出现皱纹；皮肤的营养障碍，使得皮下脂肪储存逐渐减少，细胞和纤维组织营养不良，性能下降；生物体内活性酶逐渐减少，身体各方面机能减退，大量的自由基破坏人体细胞，使细胞死亡；肌肤衰老。外在因素主要包括：缺乏对皮肤的护理或不正确的皮肤护理程序；寒冷、干燥的气候，使得皮肤的各项机能减退，皮肤缺乏水分；3)过度暴露在阳光下，皮肤过度氧化，引起皮肤老化；毛孔平常受到死亡细胞的阻塞，影响新陈代谢所致等。

如何护理好皮肤，恢复皮肤的润泽弹性，抵抗或尽可能地延缓衰老，是本领域的热点。一方面，人们可以通过合理调节饮食结构，坚持多喝水等，多吃水果、不要过度劳累等方式来改善皮肤状态；另一方面，加强皮肤的日常护理保养，这也是很重要的。

中药化妆品不同于其他化妆品，其是以中药理论为基础，讲究天然和药用，绿色天然，安全可靠。中药拥有几千年的人体临床应用经验，积累了许多作用独特、效果显著的单品和复方，并且中药来源于大自然，纯正温和，毒副作用小，相对于化学合成品更加安全可靠；品类齐全，剂型多样。

但是，中药领域博大精深，如何从中获得功效显著的有效部分，进行怎样的配伍，需要大量的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗衰老护肤组合物、其制备工艺及应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于制备抗衰老护肤组合物的中药混合物，包括以下组分：

在一个优选例中，所述的混合物包括以下组分：

在本发明的另一方面，提供一种用于制备抗衰老护肤组合物的提取物，该提取物为水性溶剂提取物，该水性溶剂提取物由所述的混合物经由水性溶剂提取获得；较佳地，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合。

在一个优选例中，所述水性溶剂提取物的制备方法为：对所述的组分进行粉碎、混匀，以水性溶剂在75～95℃提取；冷却，过滤，收集滤液；较佳地，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合；较佳地，所述的水性溶剂为水和甘油的混合溶剂，其中按照体积比甘油为20±8％；较佳地20±5％；更佳地20±2％；较佳地，对获得的滤液还进行真空精滤。

在本发明的另一方面，提供所述的中药混合物或所述的提取物的用途，用于作为活性成分，制备抗衰老护肤组合物；较佳地，所述的抗衰老护肤包括：增加I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症。

在本发明的另一方面，提供一种抗衰老护肤组合物，包括：所述的提取物，以及化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体；较佳地，所述水性溶剂提取物占组合物总重量的1～99％；如2％，3％，5％，10％，15％，20％， 30％，50％，60％，80％，85％，90％，95％，98％。

在一个优选例中，所述的组合物的剂型包括：凝胶剂、乳剂、溶液、啫喱、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。

在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于皮肤抗衰老；较佳地，所述的抗衰老护肤包括：增加I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症。

在本发明的另一方面，提供一种制备抗衰老护肤提取物或组合物的方法，所述方法包括：(1)提供前述的5种中药组分；(2)进行粉碎、混匀，以水性溶剂在75～95℃提取；冷却，过滤，收集滤液；较佳地，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合；较佳地，所述的水性溶剂为水和甘油的混合溶剂，其中按照体积比甘油为20±8％；较佳地20±5％；更佳地20±2％；较佳地，对获得的滤液还进行真空精滤。

在一个优选例中，粉碎、混匀后的组分先在水性溶剂中浸泡0.5～3小时，较佳地0.5～2小时，如1小时；之后进行加热提取。

在另一优选例中，粉碎、混匀后的组分与水性溶剂的质量比为1:(20～ 60)；较佳地为1:(30～50)；更佳地为1:(35～45)。

在另一优选例中，加热到78～90℃，更佳地80～85℃进行提取。

在另一优选例中，提取的时间为0.8～4小时，较佳地为1～3小时；更佳地为1.2～2小时。

在另一优选例中，将提取液冷却至50℃以下，较佳地45℃以下，更佳地40℃以下，进一步更佳地35℃以下，再进行精滤。

在另一优选例中，所述真空精滤包括：过滤板平均孔径为1.0±0.2μm，真空度为-0.095±0.02MPa；较佳地-0.095±0.01MPa。

在另一优选例中，所述的方法还包括：(3)将步骤(2)获得的提取物与化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体混合，获得具有抗衰老护肤功效的组合物；较佳地，所述的组合物的剂型包括(但不限于)：凝胶剂、乳剂、溶液、啫喱、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒(包括：包装盒、包装袋、化妆品盒)，所述的试剂盒中包括前述的5种中药组分，其提取物，或含有其提取物以及化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体的组合物。

在另一优选例中，所述的试剂盒中，各组分分别被独立包装，或被粉碎混合于容器中，或以提取物的形式存在于容器中，或以护肤品成品的形式存在于容器中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明组合物的DPPH自由基清除率曲线。

图2、本发明组合物COX-2活性抑制率。

图3、本发明组合物对成纤维细胞毒性试验结果。

图4、组1中COL-I的表达量(+：p<0.1；*：p<0.05；**：p<0.01)。

图5、组2中COL-I的表达量(+：p<0.1；*：p<0.05；**：p<0.01)。

图6、使用本发明组合物后的肌肤水分含量的相较于使用前的平均变化率。图中，使用样品1h、2h和4h各组中柱形，由左至右依次代表：2％本发明组合物、5％本发明组合物，啫喱基质。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种对于抗衰老护肤有效的组合物，该组合物主要由黑灵芝、太子参、滇黄精、连翘、紫花地丁，经合适的制备方法制备获得。该组合物对于皮肤的改善作用非常理想，且原材料为天然成分、易于获得、成本低廉，制备方法简单。

如本文所用，所述的“本发明组合物”与所述的“抗衰老护肤组合物”可替换使用。

如本文所用，“抗衰老护肤”包括：增加I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症等。

如本文所用，所述的“包括”或“含有”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“化妆品学上、化学上或生物学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所所用，所述“水性溶剂”是指水或亲水性溶剂，所述亲水性溶剂包括例如：甘油、乙醇、甲醇、丙醇、丙二醇、二丙二醇、丁二醇等。

如本文所用，术语“化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体”包括各种赋形剂、增稠剂或稀释剂。该术语指这样一些载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在该载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。一些优选的载体例如但不限于：A165乳化剂，混醇，季戊四醇二硬脂酸酯(PES)，乳木果油，辛酸/癸酸甘油三酯 (GTCC)，澳洲坚果油，硅油，合成角鲨烷，透明汉生胶，甘油，卡波940，丁二醇，EDTA二钠，戊二醇，尿囊素，仙人掌提取液，刺激抑制因子，氢氧化钠，甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮(MTI)，苯氧乙醇和乙基己基甘油(PEHG)，或它们的类似物。

如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b 构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。

本发明中，术语“混合物”含有：黑灵芝、太子参、滇黄精、连翘以及紫花地丁。它们可以是经粉碎的或是经炮制的。

所述的混合物在经过适当的方法提取后，获得本发明的提取物。作为本发明的优选方式，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合。在更优选的实施方式中，所述的水性溶剂为水和甘油的混合溶剂，其中按照体积比甘油为20±8％；较佳地20±5％；更佳地 20±2％。

作为本发明的优选方式，用于制备本发明的提取物的各原料的用量如表 1所示。

表1、原料及用量

	含量	较佳含量	更佳含量
				黑灵芝	1～5重量份	1～3重量份	1～2重量份
太子参	1～5重量份	1～3重量份	1～2重量份
				滇黄精	1～5重量份	1～3重量份	1～2重量份
连翘	1～5重量份	1～3重量份	1～2重量份
				紫花地丁	1～5重量份	1～3重量份	1～2重量份

所述的各原料可在粉碎、混合后，利用适当的方法提取有效成分，制成本发明的提取物；此外，也可分别提取(如分别采用相同的或不同的提取或加工方法)有效成分后，合并制成本发明的提取物。

作为本发明的优选方式，所述提取物为水性溶剂提取物；较佳地，所述水性溶剂提取物的制备方法为：粉碎各组分，混匀，以水性溶剂在75～95℃提取；冷却，过滤，收集滤液；较佳地，对获得的滤液还进行真空精滤。优选地，匀后的组分先在水性溶剂中浸泡0.5～3小时，较佳地0.5～2小时，如1小时；之后进行加热提取。优选地，提取的时间为0.8～4小时，较佳地为1～3小时；更佳地为1.2～2小时。优选地，粉碎、混匀后的组分与水性溶剂的质量比为1:(20～60)；较佳地为1:(30～50)；更佳地为1:(35～45)。利用所述提取方法获得的提取物，功效理想。

本发明的提取物，采集了黑灵芝、太子参、滇黄精、连翘、紫花地丁多种药物植物的天然成分，有效组合，达到了抗衰老护肤的效果，包括：增加 I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症等。

在本发明的具体实施例总，从生化、细胞、人体水平对本发明组合物功效试验进行了系统的总结分析。试验结果证明：1)本发明组合物可有效清除 DPPH自由基，具有良好的抗氧化活性；2)本发明组合物可有效抑制COX-2 酶活性，在生化水平具有一定的抗炎活性。3)本发明组合物可有效促进成纤维细胞I型胶原蛋白的表达。4)本发明组合物可以有效提高皮肤的水分含量，可以使肌肤保湿滋润。

本发明中，术语“抗衰老护肤组合物”包括但不限于：化妆品组合物、护肤品组合物、药物组合物，只要它们含有黑灵芝、太子参、滇黄精、连翘、紫花地丁的提取物，较佳地为水性溶剂提取物。

本发明所述的提取物与化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体混合后，可以被制备成多种任何适用于外用的护肤品组合物，剂型例如，所述的剂型可选自：凝胶剂、乳剂、溶液、啫喱、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。

本发明的抗衰老护肤组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、或包衣材料等。

基于本发明人的新发现，还提供了一种组合，该组合包括黑灵芝1～5 重量份；太子参1～5重量份；滇黄精1～5重量份；连翘1～5重量份；紫花地丁1～5重量份。

作为本发明的优选方式，所述组合中，各组分被独立地包装于袋、盒或其它各种容器中。所述的组合可以是一种试剂盒、包装盒、包装袋、化妆品盒等。本发明的试剂盒、包装盒、包装袋或化妆品盒中，也可直接装入上述各原料的提取物，以便于使用。本发明的试剂盒、包装盒、包装袋或化妆品盒中，也可直接装入本发明的组合物。

所述的试剂盒、包装盒、包装袋或化妆品盒中，还可包括说明书，其中说明了各组分的使用方法，例如包括提取方法，提取时间等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、本发明组合物的中药组成及比例

1、本发明组合物的中药组成比例

按照重量份，各个组分如表2。

表2

2.本发明组合物的工艺

(1)将各原料粉碎，过6目筛，取筛下全部粉末，按上述重量份配比称取，混匀。

(2)提取：原料药与20％甘油水溶液的质量比为1:40，浸泡1小时， 80-85℃提取(甘油)1.5小时，得提取液。

(3)将步骤(2)得到的提取液冷却至35℃以下，进行真空精滤，得到S1滤液。

(4)将步骤(3)中的滤液，1.0％己二醇、1.0％戊二醇，90～95％灭菌，得到成品。

所述步骤(3)中真空精滤条件为：在布氏漏斗里铺过滤纸板，纸板平均孔径为1.0μm，真空度为-0.095MPa。

实施例2、本发明组合物的功效试验——生化水平

1、DPPH自由基清除率IC50值

(1)实验原理

DPPH(非人体自由基)，化学命名为1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，此化合物中在氮桥的一个原子上有一个未成对的价电子，而此电子的轨道运动几乎由分子结构所抵消，通常以捕获DPPH自由基作为评定抗氧化能力的指标。 DPPH是一种稳定的有机自由基，在可见光区最大吸收峰为517nm，在乙醇溶液中，每个DPPH分子在溶液中可生成一个稳定的含氮自由基，具有典型紫色，当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，使溶液的典型紫色变浅。其褪色程度与配对电子数成化学计量关系。因而可用分光光度法进行定量分析，来检测自由基清除情况，从而评价样品的清除自由基的能力。若提取物能将其清除，则表明提取物具有降低羟自由基、烷自由基或氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。

DPPH清除率越大，则表明本发明组合物清除自由基抗氧化能力越强。 IC₅₀：半数抑制浓度，为DPPH自由基剩余一半时所需要的抗氧化剂的浓度。通过设置5～7个梯度浓度，制作浓度-清除率曲线，计算得到，IC₅₀值越小，抗氧化活性越好。

(2)实验方法

1)称取20mg DPPH，加入无水乙醇溶解，加入到250mL容量瓶中定容，摇匀，制成0.2mmol/L的DPPH溶液。

不同受试浓度的组合物的配制：将实施例1(组合物1～4)获得的精滤液与去离子水混合，使之浓度分别为0.5％(w/w)，0.8％(w/w)，1.0％(w/w)， 1.5％(w/w)，2.0％(w/w)，3.0％(w/w)，5.0％(w/w)。

2)取三支试管，编号A、B、C组，A组试管中加入1.00mL 0.2mmol/L 的DPPH溶液和1.00mL测试样溶液(不同受试浓度的本发明组合物)；B号试管中加入1.00mL 0.2mmol/L的DPPH溶液和1.00mL无水乙醇；C号试管中加入1.00mL无水乙醇和1.00mL测试样溶液(表3)。

3)测定各组在571nm处的吸光度OD值，并计算自由基清除率。DPPH 自由基清除率计算公式如下：

表3、DPPH自由基清除试验反应体系

(3)实验结果

本发明组合物对DPPH自由基清除率试验结果见表4，根据数据得到清除率曲线见图1。DPPH自由基清除率数据处理计算得到，DPPH自由基清除率的IC₅₀值为1.81％。

表4、本发明组合物对DPPH自由基清除率

同样地，以实施例1中组合物2～4获得的精滤液，按照与组合物1同样的受试浓度进行配制后作为测试样品，测定结果显示，组合物2～4表现出显著的DPPH自由基清除率(均超过10％)；并且，随着受试浓度的增高，其清除率呈现显著地提高。

上述结果说明，本发明的组合物具有显著的清除DPPH自由基的能力。在一定的浓度范围内，随着受试浓度的增加，对DPPH自由基的清除率越大。结果说明，本发明组合物在生化水平具有显著的抗氧化活性。

2、COX-2抑制率IC50值

(1)实验原理

COX-2是一种诱导酶，在组织损伤或炎症反应发生等情况下表达增强，而在正常机体中几乎不表达。在辅助因子存在的情况下，COX-2使用其环氧化酶(COX)活性把花生四烯酸等底物环氧化生成PGG2(前列腺素G2)等中间产物，继而COX-2使用其过氧化物酶活性把PGG2等中间产物催化生成PGH2(前列腺素H2)等最终产物，同时把几乎没有荧光的COX-2探针催化生成有强荧光的探针。这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测COX-2 的酶活性。如果在反应中加入COX-2抑制剂，荧光的生成就会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。通过抑制COX-2试验评估出本发明组合物的对抗炎症损伤的能力。

COX-2酶活抑制率越大，则表明本发明组合物对抗炎性损伤的能力越强。IC₅₀：半数抑制浓度，为COX-2抑制率达到一半时所需要抑制剂的浓度。通过设置5～7个抑制剂浓度，制作浓度-抑制率曲线，计算得到，IC₅₀值越小，COX-2抑制活性越好，则本发明组合物的抗炎能力越强。

(2)实验方法

(1)COX-2抑制试验在试剂盒中进行检测，反应体系见表5。

样品组的配制：将实施例1(组合物1～4)获得的精滤液与去离子水混合，使之浓度分别为0.005％(w/w)，0.01％(w/w)，0.0250％(w/w)，0.05％(w/w)，0.1％(w/w)。

阳性对照为Celecoib，阴性对照为COX-2缓冲液，均为试剂盒中提供。

COX-2酶活抑制率的计算公式如下：

表5、反应体系设计

(3)实验结果

本发明组合物的COX-2酶活抑制率试验结果见表6，所得的抑制率变化曲线如图2所示。计算得到，COX-2酶活抑制率IC₅₀值为0.047％。在一定的浓度范围内，随着样品受试浓度的增加，酶活抑制率随着增大。

表6、本发明组合物的抑制COX-2酶活试验

同样地，以实施例1中组合物2～4获得的精滤液，按照与组合物1同样的受试浓度进行配制后作为测试样品，测定结果显示，受试浓度在0.01％就表现出显著的COX-2酶抑制活性(均超过8％)；并且，随着受试浓度的增高，其抑制率呈现显著地提高。

以上结果说明，本发明的组合物在生化水平能很好地抑制COX-2的酶活性，表现出良好的抗炎活性。

实施例3、本发明组合物功效试验——细胞水平

本实施例总，基于UV诱导成纤维细胞损伤模型的I型胶原蛋白含量进行检测。

1、实验原理

皮肤的衰老可以分为内在因素引起的内源性衰老和外在因素导致的外源性衰老；其中氧化是皮肤衰老的最大威胁，主要由环境压力因素，如紫外线辐照、环境污染、烟雾、生活压力等造成，其中紫外线辐射是最主要的因素。当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，引起衰老相关基因表达，诱发炎症级联反应并降低弹力蛋白和胶原蛋白的表达量，导致皮肤出现松弛、皱纹等老化现象。I型胶原蛋白(COL-I)的检测是评价光老化的一项重要指标。采用2D成纤维细胞模型，考察本发明组合物对成纤维细胞中 COL-I表达的影响。

2、实验方法

(a)基于成纤维细胞的细胞毒性检测(MTT法)

本次检测，每个样品设置1个浓度梯度，设置3个重复孔，同时，实验设置阴性对照孔、调零孔(去离子水)和阳性对照孔(5％DMSO)。本实验采用 MTT细胞活性检测方法，筛选细胞给药的最大安全浓度。具体操作步骤如下：

1)制备细胞悬液：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板。

2)在细胞悬液中加入不同浓度(v/v)梯度的受试物，分别为0.0625％、 0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％、4.0％、8.0％。

3)待细胞铺板率达到50～60％时进行给药。给药完成后将培养板放置在 37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

4)检测：细胞孵育培养24h，弃掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加DMSO溶解，用酶标仪读取OD_490nm值。

5)用如下公式计算细胞活性

(b)基于UVA诱导成纤维细胞损伤模型的COL-Ⅰ含量检测

1)接种：将细胞接种至6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜；

2)配液：根据表7配制受试物和阳性对照；

3)给药：实验分组设计见表7，待6孔板中细胞铺板率达到50％～60％时，进行分组给药，每组设3个复孔。组1中，阴性对照加入细胞培养基，受试样品组加入含有相应浓度受试物的细胞培养基；组2中，阴性对照组均加入含1‰DMSO的细胞培养液，阳性对照加入含有20μg/mL维生素E的角质形成细胞培养液。37℃，5％CO₂培养箱继续培养24h。

4)照射：按实验要求对阴性对照组、样品组和阳性对照组进行UVA辐照，之后将所有组别的孔内液体更换为细胞培养基。37℃，5％CO₂培养箱继续培养24h后收集上清液。

5)I型胶原蛋白含量检测：取上清液，用试剂盒进行检测。

表7、实验设计

3、实验结果

(a)基于成纤维细胞的细胞毒性检测结果

本发明组合物由高到低设定8个给药浓度，在成纤维细胞上开展细胞毒性检测实验，细胞毒性检测结果见表8，细胞活性变化趋势如图3所示。

表8、本发明组合物对成纤维细胞毒性试验结果(MTT法)

根据细胞毒性实验结果，当本发明组合物的质量分数浓度大于4％时，细胞活性有明显的下降，并且小于90％，所以最终确定本发明组合物对成纤维细胞的安全作用浓度为4.0％。

(b)基于UVA诱导成纤维细胞损伤模型的COL-Ⅰ含量检测

按照设计的分组进行检测，结果如表9、表10、图4、图5所示。

表9、组1数据结果

表10、组2数据结果

如表9和图4所示，组1中，与阴性对照相比，本发明组合物在4％、 2％的给药剂量下，对COL-I蛋白的表达量有非常显著提升作用(p<0.01)，本发明组合物仅在1％的给药剂量下，就对COL-I蛋白的表达量有显著提升作用(p<0.1)。

如表10和图5所示，组2中，与阴性对照相比，阳性对照(维生素E， 20μg/mL)对COL-I蛋白的表达量有非常显著提升作用(p<0.01)。

实施例4、本发明组合物功效试验——人体水平的功效评价

本实施例中，通过4小时保湿实验来进行人体水平的测试。

1、实验原理

为体现滋水的功效，对不同的受试浓度(2％、5％)的本发明组合物，通过 4h保湿实验评价产品对肌肤水分含量改善效果。

皮肤水分含量测试Corneometer(CM 825，Courage and Khazaka，德国) 是基于电容的原理进行测量。水的介电常数是81，其他物质的介电常数通常小于7，水是皮肤上介电常数最大的物质。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值分析皮肤表面的含水量。

本测试使用肌肤水分含量(Moisture Measurement Value，MMV)的变化率，作为评价保湿功效参数指标。水分含量(MMV)的变化率，计算公式如下，该值越高，说明补水效果越显著。

式中：M0为未涂抹样品时皮肤基底数据采集值；Mn为样品组各时间点数据采集值。

2、实验方法

志愿者人数：8名；

使用仪器：肌肤水分含量测试仪(Corneometer CM825)；

测试部位：志愿者前臂屈测；

测试时间点：0、1、2、4h；

样品配制：

样品1：啫喱基质，不含实施例1中组合物1；

样品2：实施例1中组合物1，加入到啫喱基质中，浓度2％；

样品3：实施例1中组合物1，加入到啫喱基质中，浓度5％；

试验方法：本试验参考《QB/T 4256-2011化妆品保湿功效评价指南》；

(1)测试前，对测试受试部位进行基底数据采集、拍照；

(2)测试中：在测试区域，进行标记，分别涂抹样品1、2、3，间隔1、 2、4h后，进行数据采集；

(3)数据处理：对比涂抹各样品前、后肌肤水分含量的变化值，进行数据分析。

3、实验结果

受试者使用本发明组合物后的肌肤水分含量的相较于使用前的平均变化率测定结果见表11。数据分析图见图6。

表11、平均变化率测定

使用时间	使用样品1h后	使用样品2h后	使用样品4h后
				2％本发明组合物	33.5	33.0	27.0
5％本发明组合物	48.5	52.1	44.9
				啫喱基质	12.9	14.5	10.3

结果显示，相对于空白啫喱，本发明的组合物可有效改善皮肤的水分含量，在使用样品1h、2h、4h后，相对于啫喱基质均具有显著性差异(P＜0.05)。

应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于制备抗衰老护肤组合物的中药混合物，其特征在于，包括以下组分：

2.一种用于制备抗衰老护肤组合物的提取物，其特征在于，该提取物为水性溶剂提取物，该水性溶剂提取物由权利要求1所述的混合物经由水性溶剂提取获得；较佳地，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合。

3.如权利要求2所述的提取物，其特征在于，所述水性溶剂提取物的制备方法为：对权利要求1的组分进行粉碎、混匀，以水性溶剂在75～95℃提取；冷却，过滤，收集滤液；较佳地，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合；较佳地，所述的水性溶剂为水和甘油的混合溶剂，其中按照体积比甘油为20±8％；较佳地20±5％；更佳地20±2％；较佳地，对获得的滤液还进行真空精滤。

4.权利要求1所述的中药混合物或权利要求2或3所述的提取物的用途，用于作为活性成分，制备抗衰老护肤组合物；较佳地，所述的抗衰老护肤包括：增加I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症。

5.一种抗衰老护肤组合物，其特征在于，包括：权利要求2或3所述的提取物，以及化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体；较佳地，所述水性溶剂提取物占组合物总重量的1～99％。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的剂型包括：凝胶剂、乳剂、溶液、啫喱、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。

7.权利要求5或6所述的组合物的用途，用于皮肤抗衰老；较佳地，所述的抗衰老护肤包括：增加I型胶原蛋白含量，增加皮肤弹性，清除自由基，抗氧化，提高皮肤水分含量，消除炎症。

8.一种制备抗衰老护肤提取物或组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供以下组分：

(2)进行粉碎、混匀，以水性溶剂在75～95℃提取；冷却，过滤，收集滤液；较佳地，所述的水性溶剂包括：水、甘油、乙醇、甘油、丁二醇、丙二醇、二丙二醇，或它们的组合；较佳地，所述的水性溶剂为水和甘油的混合溶剂，其中按照体积比甘油为20±8％；较佳地20±5％；更佳地20±2％；较佳地，对获得的滤液还进行真空精滤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：

(3)将步骤(2)获得的提取物与化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体混合，获得具有抗衰老护肤功效的组合物；较佳地，所述的组合物的剂型包括：凝胶剂、乳剂、溶液、啫喱、气雾剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、或悬浮液。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括以下组分，其提取物，或含有其提取物以及化妆品学上、化学上或生物学上可接受的载体的组合物：