CN110122572B - 一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉 - Google Patents

Abstract

本发明属于功能性食品技术领域，公开了一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉，所述的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉包括牛奶、双歧糖和富铬菌丝；将培养好的富铬香菇菌丝，3000r/min离心，水洗2次后，60℃24h烘干，得到成品菌丝用搅打干物质的搅拌机打碎；将牛奶中加入富铬香菇菌丝及香菇胞外多糖，双歧糖按0.4％和香菇多糖按0.3％加入到牛奶中；对添加有富铬香菇菌丝及香菇胞外多糖的牛奶进行喷雾干燥，即得。本发明在100ml牛奶中加入双歧糖0.4g，富铬菌丝体0.016g，最后经喷雾干燥得到。

Description

一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉

技术领域

本发明属于功能性食品技术领域，尤其涉及一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

由于现代生活节奏的加快、环境的不断变化、用眼过度、手机不离、饮食不当等对视力的影响越来越大，特别是青少年，越来越多的青少年小小年纪就戴上眼镜，对孩子的身心健康带来了影响。

影响视力的因素

影响视力的因素很多，如不良的生活方式，饮食不当，疾病引发等。

不良的生活方式：躺着看书有害视力，因躺着看书时人的双眼和书难于保持同等的距离，易使眼肌疲劳，久而久之，会引起视力下降；光线较暗时看书，也会影响视力；吸烟有害视力，因烟草中含有一种叫“氰化物”的有毒物质，该物质在体内积存过多，会引起“烟草中毒性弱视症”，以辨别红色的能力减退最为明显，晚期还可发展为“视神经萎缩”。

饮食不当：据医学家报告，长期嗜好甜食的人易患近视、白内障、球后视神经炎等眼疾，专家们提议，要防止甜食引发的眼疾，关键是各年龄段均少吃甜食；酗酒也会影响视力，因为酗酒会加重眼底的血管负担，日久可导致视力减退。另据报道，缺钙可使眼球壁失去正常的弹性、眼球易伸长，从而引起轴性近视；缺铬可使眼球晶状体和房水渗透压上升、屈光度增加，进而导致近视。

疾病引发：高血压、动脉粥样硬化和心功能不良患者出现头痛、头昏及雾视等症状时，应及时治疗。因为上述症状是视网膜中央动脉栓塞的先兆，它表明供应视网膜营养的血液循环受阻；如不及时解决，可发生组织坏死，使视细胞失去视觉功能。

视力下降也可能由脑肿瘤引起。患者早期可为一时性黑朦。并有短暂的视觉丧失，随病情的加重逐渐变成持续性的视力减退。最后可能完全失明。如果一侧视力逐渐减退，甚至失明(应排除单纯眼部疾病)，同时伴有嗅觉丧失，则意味着脑肿瘤接近视神经处，脑肿瘤已压迫视神经。

环境因素：另外研究证明，长期在中等强度噪声的环境中工作，视力也会受到一定程度的损害。90分贝的噪声，会使眼睛区别光亮的敏感度降低；在115分贝的噪声环境中工作，可使眼睛对光亮度的适应性下1—20％，噪声越大，视物的清晰度就越差。这是因为，噪声在作用于听觉器官的同时，也作用于视觉器官，使其功能不能正常发挥。美国眼科专家还发现，家庭成员之问的不和，如父母虐待孩子、夫妻经常吵架等，对学龄前儿童的视力会产生不良影响^[4]。专家指出，空气污染或夏天过度暴晒，使眼睛释放出较多的自由基，是诱发近视的一个重要原因。

营养素对视力的重要性：

在影响视力的诸多因素中，饮食因素有着重要位置。

营养不均危机视力。据统计我国近视的发生率位居世界第一，2018年教育部、国家卫生健康委员会共同起草《综合防控儿童青少年近视实施方案(征求意见稿)》其中提到，到2030年，小学生近视率下降到38％以下，初中生近视率下降到60％以下，高中生近视率下降到70％以下，由此可见近视有多严重。近视已经是困扰许多学生和家长的问题，造成孩子近视的原因除了课业重、电子产品的频繁使用、光线来源不正当之外，还与孩子的营养有关。有关资料显示，多数近视患者血钙偏低、维生素A缺乏、血清蛋白和血色素也偏低，同时还与体内钙、锌、铬等微量元素缺乏有关。绝大多数近视发生在儿童和青少年时期的身体生长发育期。在此期间，孩子处于生长发育期若营养跟不上或是孩子食欲不好、挑食、厌食都会导致孩子出现营养不足，从而促成近视的产生。

维生素的缺乏：

维生素A：是眼球发育必需的营养元素。一旦缺乏会使眼眶内压力增大，进而导致眼球外凸，前后距拉长，形成近视。维生素A还能参与维持上皮组织，可以预防角膜干燥和软化，增强眼睛在黑暗中的视力；如果严重缺乏维生A可导致夜盲症，而持续性夜盲症会使角膜软化甚至失明。

维生索B：即核黄素。它能保证角膜，视网膜的正常代谢。缺乏维生素B，就会出现畏光、流泪、视力减弱、眼睑痉挛等症状。

维生索C：是组成眼球晶状体的成分之一，如果缺乏就容易患白内障。正常的眼内含有丰富的维生素C，其含量是血液中的30倍，可以起到抗白内障的作用。

矿物质的缺乏：

钙：钙与眼球构成紧密相关。缺钙也会寻致近视眼。青少年正处在生长高峰期。钙的需要量相对增加。若不注意钙的补充，不仅会影响骨骼发育，而且会使正在发育的眼球壁——巩膜的弹性降低，晶状体内压上升，致使眼球的前后径拉长而导致近视。

铬：缺铬也易发生近视。铬在糖和脂肪的代谢中能协助胰岛素发挥重要的生理作用。如果人体铬含量不足就会使胰岛素调节血糖功能发生障碍，血浆渗透压增高。致使眼球晶状体----房水的渗透压增高，屈光度增大，从而诱发近视。另外，铬元素在人体中与球蛋白结合，为球蛋白的正常代谢所必需，处于生长发育旺盛时期的青少年对铬的需求量比成年人大。

锌：锌元素的缺乏会导致视力障碍。锌在体内主要分布在骨骼和血液中。眼角膜表皮、虹膜、视网膜及晶状体内也都含有锌。锌在眼内参与维生素A的代谢与运输维持视网膜色素上皮的正常组织状态，维护正常视力功能。

高糖食品摄入过多：

食入过量的糖在体内可使血液偏酸，而人体欲保持酸碱平衡，不得不动员大量钙质去中和酸根，从而引起血钙不足，引起眼球壁的弹性减弱，使眼轴伸长，埋下了近视的隐患。同时，血糖升高可使晶体复凸而形成近视。

硬质食品过少：

硬质食品过少也是引起青少年近视增加的原因之一。在日常饮食过于精细、咀嚼不良也会造成视力下降。因为视力是由相当于透镜的水晶体根据脉络膜组织活动进行调节的，虽然脉络膜组织和咀嚼没有直接关系。但如果长期不咀嚼，面部肌肉变弱，水晶体的调节机能就会受到影响，从而导致近视，故咀嚼运动被誉为眼的保健操。

蛋白质的缺乏：

缺乏蛋白质，尤其是动物蛋白质，能诱发近视。蛋白质是细胞的主要成分，缺少是会导致视力极易疲劳、眼肌紧张而诱发近视。

高脂食品损害视力：

最近加拿大的研究人员发现，高脂食品会损害青少年正在发育的神经通道，可能对青少年的大脑和思维素质造成永久性伤害。芬兰科学家一项研究也提出，不给孩子吃他们喜欢的油腻食物并不会影响孩子大脑发育。但是，饮食中脂肪含量过少也不好。会使人具有攻击性，而且人会精神抑郁。最好的方案是，摄取一定的优质脂肪，尤其是来自植物、牛奶和海产品中的脂肪，并保持一定的运动量，才能保证孩子的身心发展。

合理饮食改善视力：

通过饮食可以增加营养.改善视力。如能在日常膳食的基础上，选用适当的具有改善视力功能的保健食品，则可起到良好的辅助治疗的作用。

常吃鱼不仅可以保护大脑和心脏，还有助于预防老年性眼底黄斑病变。老年性黄斑病变是导致老年人失明的主要原因之一，一般无法治愈。外国的眼科医生发现，平均每周吃两次鱼的人比其他人患该病的几率低36％。

干眼症的症状为结膜干燥、失去光泽、泪液分泌减少、畏光不适、眼痛、干涩等。干眼症的发生与视黄醇缺乏有很大关系。视黄醇不但是感光物质的来源，而且有维护上皮细胞和结缔组织的功能。而视黄醇的主要来源就是食物中的维生素A和β胡萝卜素。肉类、鱼类、蛋类、动物肝脏、豆类、番茄、深绿色蔬菜、青苹果、芒果、哈密瓜等皆含有丰富的维生素A和β胡萝卜素。因此，我们可以通过饮食的摄取来预防干眼症。

夜盲症是营养不良性眼病中比较常见的一种，因此注重饮食尤为重要。在日常饮食中多食用动物肝脏和粗粮，有益于夜盲症的康复。另外，在饮食中最好荤素搭配，取长补短，均衡营养。在食品烹调中煎煮时间不能太长，温度也不能过高，以免破坏其中的维生素A和β胡萝卜素。若患者有腹泻或消化不良时，应积极治疗，以免影响营养物质的吸收。

对于手机电脑一族，在饮食中加入一些营养眼睛的食物，是最方便、最为有效的保护眼睛方法。维生素A是预防眼干、视力衰退、夜盲症的良药，以胡萝卜及绿、黄色蔬菜及红枣中的含量最多。维生素B不足，容易引起角膜炎，可多吃些芝麻、大豆、鲜奶、小麦胚芽等食物以补充维生素B。

老花眼表现为近视力逐渐减退，近距离阅读发生困难。这是一种正常的衰老现象。但体虚多病或患有某些眼病时，老花眼常会提早出现，症状也较严重。中医认为，老花眼是由肾水亏损、精血不足而引起的，平时常食黑豆、蜂蜜，可补肾、养血、明目。

原发性青光眼的主要特征为眼压升高，由此引起血液循环障碍，眼内组织水肿，视神经纤维变性萎缩。急性者可在数日内失明，慢性者视力逐渐减退，视野逐渐缩小。多食用黄花菜、佛手、桂圆、红枣、枸杞子、童子鸡、花生、核桃、豆浆、茯苓、猪肉、牛肉等补益肝肾的食品，可起到防治青光眼的作用。青光眼患者不宜多饮水，以免加重病情，牛奶、豆浆、果汁等流质饮食也应注意适量。

大蒜是不少人偏爱的一种食物，还常被用来防治某些疾病。但是，若长期大量地吃大蒜，尤其是眼病患者，是有害的。中医认为，长期大量地食用大蒜，伤人气血，损目伤脑。据《本草纲目》记载“久食伤肝损眼”。因此，眼病患者应少吃大蒜，体质虚弱的病人更应注意。

多吃护眼食品，从饮食上来预防近视是生活中比较实用的办法。中医认为，肝开窍于目，也就是说肝的经脉上系于目，因此，眼睛的正常功能有裁于肝的疏泄和肝血的滋养。专家建议患有近视的人日常可多吃有舒肝明目作用的食物，如深海鱼、蓝莓、枸杞、西红柿、红萝卜等此外，一些干的海产，如鲍鱼、珍珠肉、蚌肉等都有很强的明目功效。可以用来煲汤食疗。

在植物性食物中.拘杞所含胡萝卜素很高，在人体内可转化为维生素A，促进视网膜内视紫质的合成或再生，维持正常视力。因此.枸杞向来被广泛应用在眼病的治疗中。专家推荐，适合日常食用的护眼佳品有以下几种：枸杞粥，有补肝肾、明目功效，对肝肾阴虚型近视者很适合。参杞馈，适合各类视力疲劳者。羊肝枸杞汤，是有助于眼睛保健的民间食疗，可用于肝肾精血不足导致的近视。

香菇的生理作用：

香菇(Lentinusedodes)又名香蕈，香信、冬菇、花菇等，是我国传统的著名食有菌，也是世界上最著名的食用菌之一。属担子菌纲(Basidaiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomatacete)、香菇属(Lentinus)。祖国不少古籍中记载香菇“益气不饥，治风破血和益胃助食”，民间用来助痘疮、麻疹的诱发，治头痛、头晕，中国是世界上最早人工驯化栽培香菇的国家。香菇营养丰富，味道鲜美，香气沁人，名列草菇、蘑菇、平菇之上，因此成为人们经常食用的菌类，被视为“菇中之王”。

干香菇中含蛋白质18.64％，脂肪4.8％，碳水化合物71％，香菇含有的十多种氨基酸中，有异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸等7种人体必需的氨基酸，还含有维生素D、B1、1B2、PP及矿物盐和粗纤维等。香菇中的碳水化合物中以半纤维素居多，主要成分是甘露醇、海藻糖和菌糖(mycose)，葡萄糖、戊聚糖、甲基戊聚糖等。

香菇的保健价值较高：近年来实验证实，香菇含有“葡萄糖甘酶”，能提高人体抑制恶性肿瘤能力。还含有香菇丝体细胞液和香菇多糖，不仅有较好的抗肿瘤能力，还诱导人体产生干扰素，提高机体免疫力，抵抗病毒侵袭。香菇中的核酸类物质，能抑制血清及内脏中胆固醇，预防和治疗高脂血症，进而防止动脉硬化和血管变脆。香菇中含不饱和脂肪酸甚高，还含有大量的可转变为维生素D的麦角甾醇和菌甾醇，对于增强抗疾病和预防感冒及治序有良好效果。经常食用对预防人体，特别是婴儿因缺乏维生素D而引起的血磷、血钙代谢障碍导致的佝偻病有益，可预防人体各种粘膜及皮肤炎病。香菇中所含香菇太生(lentysin)可预防血管硬化，可降低人的血压。从香菇中还分离出降血清胆固醇的成分(C₈H₁₁O₄N₅，C₉H₁₁O₃N₅)。香菇灰分中含有大量钾盐及其它矿质元素，被视为防止酸性食物中毒的理想食品。

香菇多糖：

香菇多糖的性质：

香菇多糖以一种β-D-{1-3}葡萄糖残基为主链，侧链是一种(1-6)葡萄糖残基的葡聚糖。重复结构单位一般含有7个葡萄糖残基，其中2个残基在侧链上。通过采用凝胶过滤法(hplc)和激光拉曼散射法测得香菇多糖的相对分子量为4×10⁵～8×10⁵。香菇多糖为白色粉末状固体，对光和热稳定，在水中最大溶解度为3mg/ml。能溶解于0.5mol/1NaOH溶液中，溶解度可达50～100mg/ml，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。目前在香菇多糖原有的结构上，接硫酸根基团，在不改变药品功效的基础上，可大大提高水溶性。香菇多糖具有吸湿性，在相对湿度为92.5％的25℃室温环境中放置15天，吸水量可达40％，因此，香菇多糖应保存在干燥状态下。

香菇多糖的功能及用途：

有文献报道，香菇中的多糖结构有利于诱生干扰素的活性，因此在治疗肝炎方面具有积极的意义。香菇具有很高的药用价值，其所含的香菇多糖和双链核糖核酸，具有较强的抗癌防癌作用，适用于包括白血病在内的多种恶性肿瘤的食物治疗。此外还因其含用胆碱、腺嘌呤、氧化酶和某种核酸物质，对心血管系统、内分泌系统的一些疾病乃至肝硬化等也有食疗和预防作用。

其功效如下:

⑴特殊免疫功能

香菇多糖能使感染后机体的免疫能力得以提高，其制剂在动物体内筛选实验中能明显促进体外淋巴细胞培养物的转化作用。因此认为，香菇多糖是一种胸腺依赖型T细胞导向并有巨噬细胞参与的特殊免疫佐剂。其免疫作用特点在于识别脾及肝脏中抗原的巨噬细胞，促进淋巴细胞活化因子(LAE)的产生，释放各种辅助性T细胞因子。增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率，恢复或刺激辅助性T细胞的功能。

⑵抗肿瘤功能

大量实验结果认为香菇多糖提高了NK细胞对某些血清因子的反应性，从而刺激免疫关键细胞并伴有干扰素分泌以达到杀伤肿瘤细胞的效果。香菇多糖还可以激活补体系统的的替代途径，导致巨噬细胞的非特异细胞毒性提高和中性白细胞对肿瘤组织的浸润。在活化T细胞等的同时，也活化了能抵抗肿瘤的羟色胺和5羟色胺的传递。与抗肿瘤活性关系密切的迟发性过敏反应(DHR)也得到恢复和增强。

⑶香菇多糖的其它作用

香菇多糖作为香菇中重要的药用成分，它除具有抑制肿瘤作用外，还具有降低转氨酶、使乙型肝炎表面抗原由阳性转为阴性以及降低胆固醇等作用。香菇多糖能增加宿主动物脾重，由脾切片可见，脾滤泡发生中心扩大，并出现大量浆细胞，说明香菇多糖能促进B细胞增生并转化为浆细胞。香菇多糖具有增强网状内皮系统，提高识别抗原的功能。它对外周免疫器官起促进作用，相应抑制了中枢免疫器官作用，达到抗肿瘤、抗感染免疫调节作用。香菇多糖被称为是免疫学中的外周疗法(schemeefferent)而应用于抗肿瘤临床上，临床表明:在人体中，香菇多糖能增加DNA的合成和外周单核细胞免疫蛋白的产生；在化疗过程中，香菇多糖与丝裂霉素、5氟尿嘧啶、环磷酰胺及阿糖胞苷等多种药物合用时，其免疫反应和宿主存活期都超过单独使用上述药物的效果，表现出显著增效作用。

香菇多糖是直接从香菇子实体中提取的，除含有多糖外，还有氨基酸、蛋白质、微量元素等对人体有益的营养物质。香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能，多糖成份中以葡萄糖为主，含有少量的木糖和甘露糖。它的作用已被世界医学生物界作了较好的分析，尤其在日本，它被广泛应用于药品和保健食品中，以它制成的针剂-香菇多糖针剂，配合放化疗，用于肿瘤患者疗效显著，由于它的特殊的免疫功能，在全世界各地被广泛应用。香菇多糖在健康促进领域中的应用前景随着我国人民生活水平的提高，疾病谱也在改变，营养的概念已进展到认识食品成分、非营养成分与慢性疾病如心血管疾病和癌症等病因的关系。什么食品成分能够、如何预防慢性疾病或能治疗那些病症，成为大众谈论的话题。人们都渴望生活质量的提高，通过日常饮食达到预防疾病、调整机体生理状态，有益健康的保健成为人们感兴趣的领域。香菇多糖无毒性，是非特异性免疫增强剂，具有多种生理活性，能提高人体免疫功能和有显著的抗癌活性。根据有效含量可以将香菇多糖加工成各种剂型的食品，如瓶装浓缩液、口服液、缓释含片或片剂、颗粒饮料、浓缩胶丸、胶囊等，供给不同层次人群的需求，成为促进健康的食品，造福于人民。

三价铬的生理功能：

在众多营养成分中，铬元素对视力的保护作用不可小觑。铬的原子序数为24，原子量为52。铬原子结构的最外层只有1个电子，次外层却有5个电子；在一定条件下，最外层和次外层的电子都可能失去而成为正离子。所以铬元素在化合物中表现为9种氧化态。有实际意义的仅3种：即+2价、+3价和+6价。+3价铬是人体必需的微量元素，以化合物形式存在，如醋酸盐、柠檬酸盐和氯化物，而+6价铬对人体为剧毒。人体对无机3价铬的吸收率为1％，而对食物中3价有机铬吸收率为10％～25％。铬主要由肠道吸收，通过肠粘膜进人血液，由转铁蛋白携带送至各组织器官中。分析人体头发铬可作为营养水平评价指标，人头发的含铬量大约在0.2～2.0毫克/千克。

三价铬的生理功能主要是促进机体糖代谢，促进机体脂代谢和对视力的影响。

三价铬参与体内的糖代谢，是维持机体正常的葡萄糖耐量、生长和寿命不可缺少的微量元素。其作用方式为促进胰岛素和敏感组织的受体起反应。“葡萄糖耐量”是指经口摄人或注射葡萄糖使血糖水平升高后，由机体细胞从血液中带走的糖，使得血糖浓度降到原来正常水平的速度。葡萄糖耐量因子(GTF)是一种类激素，能促进升高的血糖降到正常值。GTF是铬与烟酪及谷氡酸、胱氨酸、甘氨酸以配位络台物的形式存在，其生理活性与铬含量具有平行关系。

胰岛素是一种多肤激素，最显著的功能是降低血糖，抑制脂肪分解，促进蛋白质合成，加速葡萄糖的有氧分解代谢。铬作为一种“协同激素”，具有胰岛素功能所必需的辅助因子的作用，影响体内所有依靠胰岛素调节的生理过程。供给铬可使Ⅱ型糖尿病和低血糖症患者血糖正常化，因为Ⅱ型糖尿病患者血清素水平降低铬的作用是使胰岛素更有效。

1966年，Mertz曾进行用铬治疗糖尿病的临床试验,充分证实铬在改善糖尿病耐糖量方面的有效作用，降低对外源性胰岛素的需求量。有高血糖或低血糖倾向的人,通过补铬可促进正常血糖水平的维持，但对那些几乎有最佳利用葡萄糖能力的人补铬则没有影响。所以目前许多厂家根据铬—烟酸—氨基酸配位络合物的葡萄糖耐量因子，生产作为糖尿病人用的降糖饮品。

铬能影响机体的脂质代谢，缺铬可能会引起脂代谢方面的失调。当人体缺铬时，由于胰岛素的作用降低，而引起糖的利用出现障碍使血内脂肪和类脂，特别是胆固醇的含量增加，于是出现动脉硬化(糖尿病的综合缺铬症)。对人体的试验表明，补充富铬酵母可显著改善葡萄糖耐量，有助于维持血清胆固醇和甘油三脂的正常水平。以冠心病人为对象的临床试验表明，增加铬的摄人量，会明显降低血清胆固醇水平，减轻动脉硬化症状。临床实践证明，给动脉硬化病人补铬，有利于降低其高血脂水平。由此可见，铬有维持正常血清胆固醇水平的作用，缺铬会影响脂肪酸和胆固醇的合成或者清除。

在胰岛素的存在下，铬也能加强眼球晶状体对葡萄糖的吸收，促进用葡萄糖合成糖元过程。糖尿病人白内障的发病率高,这是因为机体糖代谢缓慢,使得聚集在眼球晶状体内糖类增多而引起的.虽然胰岛素能加速糖类化组织中的代谢速度，但补铬效果更明显。近视眼的发生也与人体缺铬有关。一般出现高血糖、糖尿、血管硬化现象时，就会影响眼睛的视力。这是因为血糖增高容易引起渗透压降低，造成眼睛晶状体及眼房水渗透压的改变，促使晶体变凸，屈光度增加，造成近视。铬对儿童、青少年更为重要。从新生儿到l0岁的儿童，身体中铬含量较高，但在10岁以后到30岁，体内铬呈下降趋势，而在这一阶段内也最容易发生近视。所以青少年应该注意增加铬含量高的食物。

铬的摄入量：

铬对人体健康是必需的，特别是Cr3+。铬在人体内主要经肠道吸收。无机铬化合物在人体和动物体中的吸收率很低，大约在0.4％～3％或更少。有证据表明，膳食中的天然铬的络合物较之简单的无机铬盐能更好地被利用，天然铬的络合物的剂量与效应呈直线关系。铬的吸收速度很快，经标记的铬在15min内即被吸收。铬被人体摄入2h内，尿中铬排出量升高。人体对铬的吸收与膳食中的摄入水平呈负相关。每天膳食中铬摄入量为l0μg时，铬的吸收率为2％；当摄入量增加到40μg/d时，铬的吸收率减少至0.5％左右；当摄入量大于40μg/d时，其吸收率大约稳定在0.4％左右。在铬的吸收过程中，氨基酸或维生素C的存在能加强铬的运输和吸收。

人体内铬含量随年龄不同而有差异，新生儿含量高于儿童，儿童三岁前铬含量高于成年人。三岁起逐渐降低至成人水平。成年人随年龄增长体内铬含量逐渐减少，因此老年人常有缺铬现象。流行病学调查发现，血清中铬浓度越高，人的寿命越长，长寿老人的血铬含量较高。国际会议及我国对铬的日需要量均未制定统一标准。中国营养学会制定了一个每日铬的“安全和适宜的摄人量”指标，以供参考。婴儿每天需10～14微克，半岁至1岁为20～60微克，1岁以上每天20～80微克，4岁每天30～120微克，7岁以上至成人每天均为50～200微克。美国营养需要量标准委员会推荐的安全适宜铬摄入量也为50—200μg/d。

微生物富集铬：

富铬酵母是以酵母为载体，将无机铬转化为有机铬的发酵产品。酵母在适宜的培养基和一定的工艺条件下，通过一系列生化过程将胞外的碳源、氮源、磷源、铬源等吸收到生物体内并得到生长繁殖，同时无机铬也被同化到有机大分子上。富铬酵母已作为补铬制剂应用于糖尿病的治疗上，其铬的吸收率和生物利用度高于普通酵母和无机铬，但是对富铬酵母中铬的化学种态及结合形态分析较少，这对于评价其药理和生物效应具有一定影响。目前的分析认为，在生命体系中，微量元素的不同化学种态决定了其生理效应，其分析可以增加对微量元素的代谢动力学了解。在一个复杂的基质中，一些微量元素以游离或单核离子、低分子量化合物、或大分子化合物形式存在，而在细胞学领域，微量元素种态的分析可以了解微量元素在细胞内的分布情况。我国己成功地开发出达到国内外先进水平的富铬酵母，并己实现工业化生产。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)三价铬和香菇的保健价值很明显，而目前富铬食品相对较少，其中仅对富铬酵母的研究比较全面，在食用菌对铬的富集方面的研究却比较少，本发明能拓宽有益微生物对铬的富集途径。

(2)本发明采用液体发酵得到了富铬香菇菌丝体，并提取香菇多糖，将富铬香菇菌丝体和其多糖加入牛奶中制成奶粉，得到既能补充三价格，又能补充多种营养素的奶粉，此种奶粉能增加功能性奶粉的品种。

(3)采用本发明可对保护视力、对护眼食品的研制提供技术支撑。

解决上述技术问题的难度：

如何选育适当的香菇菌种；

如何确定香菇菌丝富集铬的培养基成分；

如何确定香菇菌丝富集铬时的浓度；

如何确定什么时间加入铬既利于香菇菌丝的生成有利于对铬的富集。

需要培养多长时间才能得到富铬的香菇菌丝体，现有技术不能有效解决。

如何提取香菇多糖，溶剂、浓度、时间、次数没有定量数据；如何制备富铬功能性奶粉是现有技术的困难所在。

解决上述技术问题的意义：

由于无机铬的吸收率低，而有机铬的吸收率较高，为了得到有机铬，采用香菇菌丝体来将无机铬转化为有机铬，不适为一种好方法，既得到了有机铬又得到了香菇的各营养成分。通过香菇多糖的提取，将多糖、富铬香菇菌丝体、双歧糖(是以异麦芽低聚糖和果糖低聚糖为原料的水溶性膳食纤维，也是双歧杆菌的增殖剂)加入牛奶中，经喷雾干燥得到奶粉。因奶粉中含有富铬香菇菌丝、香菇多糖、双歧糖以及奶粉本身含有的蛋白质、脂肪等多种营养素对视力保护有着十分重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉。

本发明是是这样实现的，一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉，所述的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉由100ml牛奶、富铬菌丝体0.016g、双歧糖0.4g和0.3％香菇胞外多糖组成。

本发明的另一目的在于提供一种所述基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法，所述的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法包括：通过多种香菇菌种的选育，筛选到武香二号作为富铬香菇菌丝体的菌种；通过多个培养基对富铬香菇菌丝体的培育，得到了本发明中培养基成分：纯玉米粉20g，葡萄糖20g，蔗糖20g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠1g，硫酸镁1g；得到富铬香菇菌丝的优化条件为600μg/ml的铬浓度、加铬时间为菌丝培养后的第1天、培养时间为10天。

进一步，所述的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法包括：

步骤一，将经活化、扩大的武香二号香菇菌种，按10％的接种量接种于培养基中，于摇床110次/min、28℃培养一天后，加入600μg/ml的三氯化铬，在摇床上继续培养9天，得到富铬香菇菌丝；

步骤二，取发酵液在搅拌下加入95％乙醇到30％的乙醇浓度，在冰箱中沉淀过夜，离心得粗多糖沉淀；于上清液中加95％乙醇到60％的乙醇浓度，同法离心后得粗多糖沉淀；再往上清液中继续加入95％乙醇到80％的乙醇浓度，离心后得粗多糖沉淀；合并3次沉淀，水洗、离心、烘干后得到香菇胞外多糖；

步骤三，根据铬的安全推荐量、富铬香菇菌丝中铬的含量以及其他食物的含铬量，富铬香菇菌丝粉末33mg；加入双歧糖；将发酵液中提取的香菇胞外多糖的量按0.6g/200ml加入。

进一步，所述步骤一中培养基的成分为：纯玉米粉20g，葡萄糖20g，蔗糖20g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠1g，硫酸镁1g，水1000ml。

进一步，所述步骤二中在冰箱中沉淀过夜，3000r/min，离心20min得粗多糖沉淀。

进一步，所述步骤三中在200ml奶中应加入0.8g的双歧糖。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过正交实验得到富铬香菇菌丝的优化条件为600μg/ml的铬浓度、加铬时间为菌丝培养好后的第1天、培养时间为10天。功能性奶粉的制备为：在100ml牛奶中加入双歧糖0.4g，富铬菌丝体0.016g，最后经喷雾干燥得到。富铬香菇菌丝水溶性胞外多糖采用分步提取的方式可以得到更多的多糖。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的铬标准溶液曲线示意图。

图3是本发明实施例提供的样品铬溶液含量柱形图。

图4是本发明实施例提供的还原糖消耗表示意图。

图5是本发明实施例提供的一次性提取和分布提取的对比示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉包括牛奶、双歧糖和富铬菌丝体。

本发明实施例提供的优选的一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉由在100ml牛奶、双歧糖0.4g和富铬菌丝体0.016g组成。

下面结合附图对本发明的原理作详细说明；

如图1所示，本发明实施例提供的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法：

S101：富铬香菇菌丝制备方法：将经活化、扩大的武香二号香菇菌种，按10％的接种量接种于培养基中(其成分为：纯玉米粉(无糖和其他添加的维生素及矿物质)20g，葡萄糖20g，蔗糖20g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠1g，硫酸镁1g，水1000ml)，于摇床110次/min、28℃培养一天后，加入600μg/ml的三氯化铬，在摇床上继续培养9天，即可得到富铬香菇菌丝；

S102：香菇胞外多糖的提取：取一定量的发酵液在搅拌下缓慢加入95％乙醇到30％的乙醇浓度，在冰箱中沉淀过夜，3000r/min，离心20min得粗多糖沉淀；于上清液中缓慢加95％乙醇到60％的乙醇浓度，同法离心后得粗多糖沉淀；再往上清液中继续加入95％乙醇到80％的乙醇浓度，离心后得粗多糖沉淀；合并3次沉淀，水洗、离心、烘干后得到香菇胞外多糖；

S103：确定奶粉中营养成分之量：根据铬的安全推荐量、富铬香菇菌丝中铬的含量以及其他食物的含铬量，按每天喝200ml牛奶，使200ml奶中有100μg的铬，计算出加入富铬香菇菌丝粉末33mg。蔗糖含量按4％计，每200ml奶中应加入8g的蔗糖，考虑到蔗糖不利于近视眼的防治、不适宜糖尿病人和中老年人食用，而使用甜味剂—双歧糖代替，双歧糖的甜度为普通蔗糖的10倍，因此最终在200ml奶中应加入0.8g的双歧糖；将发酵液中提取的香菇胞外多糖的量按0.6g/200ml加入。

下面结合具体实验对本发明的应用原理进行进一步说明；

一、材料：

1、菌种：

经选育的武香二号菌种，拉丁名称为Lentinusedodes。

本菌种最早来源于重庆生物技术研究所，现保存于重庆工商大学微生物实验室。

2、药品：

磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、三氯化铬、高锰酸钾、二苯胺基脲、次甲基蓝、氢氧化钠、酒石酸钾钠、碳酸钠、硫酸、重铬酸钾、95％乙醇、五水硫酸铜。

马铃薯、蔗糖、葡萄糖、酵母粉、琼脂、香菇菌种、玉米粉、纯牛奶。

3、仪器：

高压蒸汽灭菌锅、培养箱、干热灭菌箱、离心机、恒温摇床、电子天平、搅拌机、实验电阻炉(马弗炉)、真空喷雾干燥机、显微镜、冰箱、分光光度计、超净工作台。

4、器具：

试管、锥形瓶、移液管、接种铲、量杯、电炉、手术刀、酒精灯、离心机、玻棒、试剂瓶、量筒、培养基分装器、培养皿、酸式滴定管、滤布、玻璃珠、漏斗、牛皮纸、小药剂瓶、保鲜塑料薄膜、天平、瓷坩埚、坩埚钳、容量瓶、铁架台、药匙、玻璃皿、接种环、棉花塞、纱布、滤纸、固体胶、小刀。

二、方法：

1、培养基：

No1.固体培养基(马铃薯培养基)：

②称取新鲜马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18.4g；

②搪瓷量杯中放入足量的水将切成小块的马铃薯煮沸30min；

③将煮好的马铃薯过滤，取上清液加蔗糖和琼脂，加热至融化，再加蒸馏水定容到1000ml；

④用培养基分装器趁热将上述溶液分装于试管和锥形瓶中，试管装量管长的1/5，锥形瓶装量1/2体积；加棉花塞、牛皮纸包扎；

⑤高压蒸汽灭菌锅中的加水到指定位置，然后放入内锅，再将包扎好的培养基放于锅中，盖好锅盖，关闭安全阀，打开放气阀，接通电源，待放气阀开始冒蒸汽时计时5min，使其将锅内冷空气排尽，然后关闭安全阀，当温度升到121℃时保持20min，断电，待压力温度表指针回到“0”时，打开锅盖，将试管摆成斜面，其长度为试管的1/2，培养基冷却后冰箱冷藏备用。

No2.液体培养基(玉米培养基)：

①称取纯玉米粉(无糖和其他添加的维生素及矿物质)20g，葡萄糖20g，蔗糖20g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠1g，硫酸镁1g；

②将玉米粉用适量的水煮沸30min，注意不糊底不溢出，用四层纱布过滤；

③取上清液，加入磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁后，再加入葡萄糖、蔗糖和酵母粉，溶化后蒸馏水定容至1000ml；

④将其煮沸稍冷后离心(3000r/min)，离心15min，分装到300ml锥形瓶中(每个100ml，并加入能覆盖锥形瓶底部的玻璃珠)；

⑤用纱布8层纱布和牛皮纸包扎；

⑥115℃，30min灭菌。

2、菌种培养：

(1)菌种的活化：

①清洁无菌室，用消毒水擦试超净工作台，并制备酒精棉(乙醇浓度为75％)；

②接种铲放入干热灭菌箱灭菌2h(灭菌温度为160-170℃)后取出在无菌室待用；

③入无菌室前半小时，用紫外线灯将整个无菌室进行灭菌；

④关闭紫外线灯，打开无菌风送风系统，经传递窗将制好的斜面和菌种放入无菌室；

⑤人穿好无菌服，进入无菌室，打开超净工作台的无菌风和日光灯并点燃酒精灯；用酒精棉消毒手；

⑥按照无菌操作的过程将菌种接到斜面上；

⑦将接好种的斜面放入恒温培养箱中28℃，培养7天。

(2)菌种扩大培养：

①取干热灭菌的培养皿、手术刀各一；

②用接种铲挑出斜面上长势好的菌丝，放于培养皿上用小刀切成半米粒块，然后接种于液体培养基中(4个)；

③摇床培养，110次/min，28℃，7d。

(3)菌丝的镜检：

将培养好的菌丝(9天后)，无菌操作镜检，步骤如下:

①显微镜，接通电源，打开聚光灯，备用；

②无菌操作挑取少量的菌丝放于洁净的玻璃片上；

③低倍镜观察玻璃片上是否是所要的香菇的菌丝，看看整个菌丝是否有污染的杂菌，显示结果为香菇菌丝，无杂菌污染；否则，将不可用，需重新制备。

3、正交试验：

(1)正交表的绘制：

单因素实验研究了香菇菌种与培养基的选择，得到了本文所用菌种和培养基；单因素实验研究了pH值对菌丝生长的影响、通气量对菌丝生长的影响、培养时间对菌丝生长的影响、铬含量对菌丝生长的影响、加铬时间的选择，根据单因素实验的结果，发现影响富铬香菇菌丝体生长的主要是培养基的铬浓度、加铬时间和培养时间，所以选它们作为正交实验的三个因素。在铬含量对菌丝生长的影响实验中培养基浓度为700μg/ml时，富铬香菇菌丝体铬含量达最高；在第2天加铬时，富铬香菇菌丝体铬含量达最高；培养10天，富铬香菇菌丝体铬含量最高。据此选用L₉(3⁴)正交表来确定实验设计方案。得到因素水平设计表1如下：

表1：因素水平设计表

根据因素水平表得到正交表1-2如下：

表2：正交表

(2)接种及培养：

①无菌室和超净工作台的使用同菌种活化部分；

②将9瓶制好的液体培养基、一瓶液体菌种和9个10ml的灭菌量筒经传递窗于无菌室，准备进行接种；

③无菌操作将菌种振荡后快速地倒入10ml于量筒中，再倒入液体培养基中，封口，编号；为避免污染，接种一瓶换一个量筒，整个过程要求动作迅速；

④将接好种的培养基放于28℃的摇床上(110次/min)培养，培养9-11天。

(3)加铬：

按照加铬时间的不同分3次进行，一次分别加入1ml 6％、7％、8％的三氯化铬溶液，使液体培养基的铬浓度达到600、700、800μg/ml具体操作步骤如下：

①制三氯化铬溶液:分别称取三氯化铬3g、3.5g、4g，再分别定容至50ml，这样就得到浓度分别为6％、7％、8％的三氯化铬溶液，121℃，15min灭菌。

②取3根1ml灭菌移液管于无菌室备用；

③第1天，接种后，从9瓶培养基中取出试验号为1、4、7的三角瓶，分别加入1ml6％、7％、8％的三氯化铬溶液，同样的，为了避免杂菌污染，加溶液的移液管都不能重复使用；

④将已加铬的培养基放于摇床上于另6瓶一起培养，第2天取出试验号为2、5、8号三角瓶加铬，以此类推，第3天，取3、6、9号三角瓶加铬。

4、富铬香菇菌丝样品的获得：

①事先将9个小的试剂瓶及培养皿洗静后，放入恒温烘箱里烘干，备用；

②当培养基培养到第9天的时候，就取出编好号的培养基(分别是1、6、8号培养基)，并将离心杯按培养基的方式编好号后，放入离心机中离心，整个离心的步骤如下：

A.将离心杯从离心机中取出后，用自来水清洗干净，并用蒸馏水润洗，用标签纸将编号贴上；

B.用天平将离心杯的重量调平；

C.往离心杯中对号入座地倒入培养基及菌丝体，放在天平上调平；

D.将调平后的离心杯放入离心机中，3000r/min，离心20min。

③从烘箱里取出已经烘好的三个培养皿，按照培养基的编号方式对其进行编号，然后用适量的塑料薄膜覆盖在其上面；

④离心后，上清液倒入锥形瓶中，用纱布密封好后于冰箱中待用；将沉淀下来的菌丝体用蒸馏水清洗，

离心，3000r/min，20min，2次。

⑤将得到的菌丝倒入事先准备好的带有薄膜的培养皿中，放入60℃烘箱中，24h烘干；

⑥同理，第10天和11天处理另6瓶培养液，菌丝烘干，上清液冰箱中待用；

⑦将烘干的菌丝从薄膜上取下，电子天平称量，具体步骤如下：

A.从烘箱中取出烘好的小试剂瓶，1～9贴标签；

B.将1号试剂瓶称量后，加入1号菌丝，再行称量，两个数据相减，即得菌丝重量。

5、测定：

在进行的测定试验中，包括对富铬菌丝铬的测定、培养基中还原糖的测定两个方面，其中铬的测定说明菌丝对铬的富集能力，培养基中还原糖的测定表明菌丝对培养基的利用率。

(1)富铬菌丝中铬的测定：

1)铬测定的原理(二苯胺基脲法)：

用干法消化的方法(灰化)对菌丝进行有机破坏，将残余的三价铬化合物制成消化液，用KMnO₄溶液在碱性的条件下将三价铬氧化为六价铬，而六价铬离子在碱性条件下与二苯胺基脲作用生成一种紫红色的络合物，六价铬离子浓度越大，络合物的颜色就越深，这样就可以根据颜色的深浅不一，对其进行比色实验，根据吸光度的不同，可得到铬液中铬的含量。

2)铬测定中药品的配制：

①铬标准溶液的配制：精确称取恒重的重铬酸钾0.1415g，用蒸馏水定容至500ml，得到浓度为0.1mg/ml的铬标准贮备液，临用前再稀释至2μg/ml为标准铬工作液

②20％碳酸钠溶液：称取10g无水碳酸钠，定容至50ml，装入试剂瓶内待用；

③2％高锰酸钾溶液：称取1g高锰酸钾，定容至50ml，就得到2％的溶液，装入试剂瓶待用，且用报纸包住，避免光照；

④0.5％二苯胺基脲：称取0.25g二苯胺基脲，用95％乙醇溶液定容至50ml，然后再在其中加入1：9的硫酸200ml，置于冰箱中保存；

⑤4mol/L氢氧化钠溶液：称取无水氢氧化钠32g，定容至200ml，得到4mol/L的溶液；

⑥1：6的硫酸溶液：在300ml蒸馏水中加入50ml的浓硫酸。

3)富铬菌丝样品的灰化：

①取9个小的瓷坩埚，将其洗静后，于烘箱内烘干，然后放入800℃的马弗炉中进行灼烧，3h后，将其取出放入干燥器内，待其冷却后将其中的灰分倒掉，以免对后来加入的样品造成影响，使数据出现大的误差；

②对应的将菌丝放入到坩埚中去，然后往每个坩埚中加入20％碳酸钠1ml，使其将菌丝充分润湿，然后将其放在电炉上进行炭化，直至坩埚内再没有烟冒出，则表示炭化完成；

③炭化后的菌丝放入马弗炉中，800℃进行灰化，3-4小时后取出；

④在灰化期间，将10个100ml的容量瓶、20个小的锥形瓶、数个漏斗洗静后，再用蒸馏水润洗3次，备用；

⑤将灰分对号的溶于各容量瓶中，将其定容至100ml。

4)铬的测定方法：

精确吸取标准铬工作液0、2、4、6、8、10、12ml，分别加入20％碳酸钠溶液1ml，补水至50ml，加4mol/LNaOH溶液0.4ml，加2％KMnO₄数滴至紫红色，煮沸5min，取下加95％乙醇3ml，摇匀，过滤，用热水洗三角瓶及滤纸3到5次，各加1:6硫酸4ml，0.5％二苯胺基脲2.0ml，摇匀，放置15min于1cm比色皿中在波长540nm处测吸光度，根据测得的吸光度绘制标准曲线。

根据同样的方式，测样品的铬含量。

如图2所示，本发明实施例提供的铬标准溶液曲线示意图。

标准曲线数据：

表3：铬的标准溶液测量数据

铬含量(μg/ml)	0	0.08	0.16	0.24	0.32	0.40	0.48
								吸光度A	0	0.031	0.084	0.111	0.120	0.162	0.177

根据此数据得到直线回归方程A＝0.42C+3.6×10^-3，其中C为铬标准溶液的浓度，由此得到铬标准溶液的曲线如下：

6、还原糖的测定(费林试剂法)：

(1)药品的配制：

费林溶液A：称取五水硫酸铜34.65g，加水定容至500ml；

费林溶液B：称取酒石酸钾钠86.5g，氢氧化钠25g，加水定容至250ml；

葡萄糖标液：3gD-葡萄糖定容至500ml，配成6mg/ml的标液；

指示剂：称取0.125g次甲基蓝溶于25ml水中，配成浓度为5％的溶液。

(2)测定的方法及过程：

①费林试剂的标定：

将费林试剂A和B等体积混合，制成混合费林试剂吸取25ml混合费林试剂于三角瓶中，加入18ml D-葡萄糖标准溶液，振荡后迅速升温，控制在2min(正负15秒)时间范围内沸腾，保持蒸汽充满三角瓶，以防空气进入，沸腾持续2min后，加入1ml次甲基蓝指示剂，用D葡萄糖标液滴定至蓝色消失，记下体积数。调整D-葡萄糖初加量为0.3ml，其余步骤同上，但滴定过程要在1min之内完成，整个沸腾时间不超过3min，记下消耗体积数V1。第三次滴定时，为达到时间上的要求，可调整D-葡萄糖的初加量，其余步骤同上，终体积数应在19～21之间，计算第二次滴定的平均体积数耗用数V1

在整个滴定过程中，加0.3ml D-葡萄糖标液滴定，远远不能满足时间上的要求，经过反复的实验，决定初加量为13ml才能满足时间上的要求，且所耗用的终体积数也在19～21之间。

②样品还原糖的测定：

吸取25ml混合费林试剂于锥形瓶中，滴加10ml配好的样品，加热，使溶液在2min(正负15秒)内沸腾，并保持瓶内充满蒸汽，加1ml次甲基蓝指示剂，再滴定至蓝色消失，如果在样品液未加入任何指示剂时蓝色已消失，那么就要降低样品浓度，但消耗体积不应大于25ml。

样品还原糖的测定一共有10个样品，其中有9个是第一批正交实验获得的上清液，还有1个是未加入菌丝的液体培养基，先测定未加入菌丝的液体培养基的耗用标液体积，由于在样品液未加入任何指示剂时蓝色已消失，则说明样品液浓度太高，需要降低浓度，且耗用体积不应大于25ml，因此，取10ml样品液，定容至100ml(稀释10倍)，取出稀释后的样品液10ml，用于滴定时，标液消耗量超过了25ml，说明样品液中所含还原糖的量不够，所以就加入20ml样品液。

计算还原糖的公式：

还原糖含量(g/ml，以葡萄糖计)＝(V₀—V₂)×0.006×(1/V₁)×n

V₀——费林试剂标定值，ml

V₂——样品糖液测定值，ml

0.006——标准葡萄糖液浓度，g/ml

V₁——样品糖液体积，ml

n——样品稀释倍数。

7、香菇胞外水溶性多糖的提取：

香菇胞外多糖具有一定的功能性，作为富铬菌丝的副产品可以一起添加到牛奶中，使牛奶多一种功能性成分，它是从离心后的液体培养基的上清液中被提取出来的，它的提取可以用两种方式进行，分别是一次性提取和分步提取。提取多糖的具体步骤如下：

①一次性提取：取一定量的发酵液在搅拌下，一次性缓慢加入80％浓度的乙醇，然后置冰箱中沉淀，过夜，3000r/min，离心20min，沉淀即为粗多糖。将得到的沉淀放到准备好的干燥的垫好塑料薄膜的培养皿上，放入烘箱中烘干，共9个。

②分步提取：取一定量的发酵液在搅拌下缓慢加入95％乙醇到30％浓度，在冰箱中沉淀过夜，3000r/min，离心20min得粗多糖沉淀，取上清液，往其中缓慢加乙醇到60％浓度，同法离心后得粗多糖沉淀，最后再往上清液中继续加入乙醇到80％浓度，离心后得粗多糖沉淀。3次沉淀相加即为分步提取所得的粗多糖的总量。

在分步提取的时候，需要计算一下加入乙醇的量，设每次加入的乙醇的体积为x，则：

30％＝x/(150+x) *150为发酵液的体积

60％＝(150×30％+x)/(150+x)

80％＝(150×60％+x)/(150+x)

得到三次加入的乙醇体积分别为65、113、150ml

8、富铬香菇菌丝优化培养：

根据正交实验所得到的结论，用最有利于菌丝生长的方式对菌种进行优化培养，步骤如下：

(1)制备新鲜的培养基：同样是制备玉米液体培养基，制备方法与材料的用量与最初制备时一样，一共做两次，最终得到1500ml左右的培养基，灭好菌后放入无菌室备用；

(2)接种：将制活化好的液体菌种按照无菌操作的方法接种到灭菌后的培养基中，共接种10瓶，由于这次是在同一条件下进行菌种的培养，于摇床100次/min，28℃，培养。

(3)加铬液：待培养1天后，同样按照无菌操作的方式，将6％的铬液分别加入到10个培养基中，每个培养基为1ml，使培养基的铬液浓度达到600μg/ml；

(4)继续培养：将加好铬的三角瓶，继续放入摇床100次/min，28℃，再培养10天，共11天。

9、鲜奶的来源：

在天友奶品专卖店直接购买的天友牌纯牛奶，其中蛋白质≥2.9％、脂肪≥3.1％、非脂乳固体≥8.1％。而奶粉的生产工艺如下：

原料的购入→原料奶验收→原料乳储存→净乳、标准化→冷却暂存→喷雾干燥→筛粉→包装材料的采购验收→装箱入库→检验合格出厂→运输、销售。

10.富铬香菇菌丝和糖在奶粉中的配比：

由于奶粉要具有一定的品尝性和功能性，在其中添加的富铬菌丝及糖都要有一定的配比，因此，加入的菌丝的量应按照每克菌丝所含的铬的量来计算需要加入多少克的菌丝体才能达到奶粉中规定的铬含量，同理，加入的糖的量也要经过对奶的口味进行感官评价之后再计算出来。

11、富铬功能性奶粉的制备：

(1)富铬香菇菌丝的粉碎：

将培养好的富铬香菇菌丝，3000r/min离心，水洗2次后，60℃24h烘干，得到。成品菌丝用搅打干物质的搅拌机打碎(由于样品含量较少，搅拌时要尽量避免菌丝的损失，如黏附在搅拌机内的菌丝也要尽量用小的工具将其取出)。

(2)牛奶中加入富铬香菇菌丝及香菇胞外多糖：

(1)将打碎后的菌丝加入到新鲜的纯牛奶中，由于用搅拌机打碎的菌丝颗粒相对于液体的牛奶来说还是比较大，而且不利于后来的干燥步骤，所以将加了菌丝的牛奶再用搅拌机搅打，其效果明显。

(2)加糖：加糖的主要步骤是看哪个甜度使得牛奶的口感最好，在加入菌丝量不变的前提下，不断变换双歧糖加入量，使糖所占到的百分比分别为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，然后请同学对其进行简单的感官鉴定，如牛奶的口感、颜色是否适合大家的口味，最后大家一致认为0.4％的甜度最好。

(3)加入香菇多糖：将提取的香菇多糖按0.3％加入到牛奶中，使牛奶多一种功能性成分。

(3)对牛奶进行喷雾干燥：

①开机：接通仪器主电流，仪器自检完成，进入待机状态；

②设定流速：打开空气压缩泵，通过空气流速开关设定流速为600I/h；

③设定温度：通过温控按扭设定喷雾温度为130℃，提取温度为87℃；

④加热：打开加热开关进行加热；

⑤预喷：使用蠕动泵进样，用蒸馏水进行预喷，调节喷雾到最佳状态(蠕动泵进样15％)；

⑥进样：按预喷条件进样品喷雾干燥至完成；

⑦停止：样品进完后继续用适量蒸馏水进行喷雾至喷头干净，结束喷雾，依次关掉空气压缩泵、加热开关和主电源，待冷却后收集产物；

⑧清洗。

二、结果与分析：

1、香菇菌丝铬含量及培养基还原糖测定结果：

(1)按照标液的测定方法，将样品液每个取1ml进行测定，最后得到如下数据：

表4样品分光光度

试验号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										坩埚号	13	A	18	49	8	89	42	32	48
分光度	0.060	0.078	0.082	0.209	0.087	0.093	0.245	0.140	0.099

用直线回归方程A＝0.42C可得每个样品的铬的量，表如下：

表5样品中的铬的量

根据此数据，可得到样品铬含量柱形图如下：

如图3所示，试验号7的样品铬含量最高为522.67μg，其次依次分别为实验号7、4、8、3、6、5、9、1。根据此图表可知，铬液浓度越大，香菇菌丝对铬的富集就越多，但铬液浓度过高会抑制菌丝的生长，由于菌丝的多少与铬的含量也密切相关，所以综合菌丝的生长情况考虑，还是600μg/ml的浓度最适合香菇菌丝对铬的富集及生长。

如图3所示，本发明实施例提供的样品铬溶液含量柱形图。

(2)培养基还原糖的测定结果：

表6还原糖的测定结果

葡萄糖初加量V<sub>2</sub>	18ml	13ml	13ml	13ml
					消耗终体积数V<sub>1</sub>	12.28ml	19.95ml	20.55ml	19.40ml

计算得：V₀＝(V₁+V₂) 因此V₀的平均值＝32.29ml

样品液的数据：

这样，再次滴定时得到如下数据：

表7样品还原糖的测定结果

稀释液体积数V<sub>1</sub>	20	20	20
				标液消耗数V<sub>2</sub>	15.92	16.03	15.50

得到最后标液消耗的平均值V2＝15.82

然后按照同样的方法测其他9个培养基中还原糖的含量，得到如下数据：

表8正交样品还原糖

试验号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										标液消耗体积V<sub>2</sub>(ml)	19.68	19.71	21.69	21.70	19.74	20.05	20.75	16.52	19.05
样品液消耗体积V<sub>1</sub>	25	20	15	20	20	16	15	20	20

根据还原糖的计算公式可得：

①加入菌种之前培养基中还原糖的含量设为C₀，则：

C₀＝(32.29-15.82)×0.006×(1/20)×10＝0.0494g/ml

所以，培养基中的还原糖的量：

M₀＝C₀×100＝4.94g

②加入菌种后还原糖的含量得到下列数据：

表9加入菌种后还原糖的含量

试验号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										标液消耗体积V<sub>2</sub>(ml)	19.68	19.71	21.69	21.70	19.74	20.05	20.75	16.52	19.05
样品液消耗体积V<sub>1</sub>	25	20	15	20	20	16	15	20	20

根据此数据表得到如下图表，

如图4所示，还原糖含量消耗量实验号1最高为1.91g，其次依次为4、2、5、9、3、6、7、8。一般来说，培养时间越长，香菇菌丝对培养基的利用率越高，但由于1号培养基的菌丝生长得最好，因此它对培养基的利用率自然就高于其他的培养基，而铬浓度比较高的培养基对还原糖的消耗量较低是因为高浓度的铬液抑制了香菇菌丝的生长，导致其对还原糖的消耗量较少。

如图4所示，本发明实施例提供的还原糖消耗表示意图。

2、正交试验结果：

由一系列的测定数据得到下表，再由此表分析后得到最适合菌丝生长的条件：

表10正交试验结果表

由表10可知：

①菌丝的干重方面：试验号2的培养基菌丝的生长最好，即在600μg/ml的铬浓度、第2天加铬、培养10天的条件下，菌丝生长最好，得到的菌丝也就最多。

②菌丝的铬含量方面：试验号7的菌丝富集的铬是最多的，即在800μg/ml的铬浓度、第1天加铬、培养11天的条件下，菌丝对铬的富集效果最好。

③菌丝对培养基的利用率方面：试验号1的菌丝体对培养基的利用率是最高的，即在600μg/ml的铬浓度、第1天加铬、培养9天的条件下，菌丝对培养基的利用率最高。

综上，对菌丝的生长及其含铬量影响最大的是铬液的浓度，其次为加铬的时间，最后为培养的时间，其中600μg/ml最有利于香菇菌丝对铬的富集；而对菌丝干重影响最大的是加铬的时间，时间第1天最好；在还原糖方面，培养时间10天最有利于菌丝对还原糖的利用，其次为加铬时间和铬液浓度。综上，得出菌丝生长的最佳条件为：A₁B₁C₂(即铬液浓度600μg/ml、加铬时间1天、培养时间10天。)

3、香菇胞外多糖的提取结果：

一次性提取和分步提取得到的数据分别为：

表11香菇胞外多糖一次性提取和分步提取对照表

根据数据得到如下图；

如图5所示，本发明实施例提供的一次性提取和分布提取的对比示意图。

如图5所示，对照一次性提取和分步提取，分步提取的效果要优于一次性提取效果。经分步提取，实验号5的香菇胞外多糖提取最高为0.033g，其他依次为实验号1、9、8、4、2、3、6、7。作为本实验的一种副产品，香菇多糖的功能性却不能忽视，从此图表中可以看出，培养时间越短，香菇胞外多糖的量就越多，相反，培养时间越长，香菇胞外多糖的量就越少，但本发明的最终成品是富铬功能性奶粉，香菇多糖只是作为一种附加的功能性成分加入到牛奶中，所以在不影响富铬菌丝生长的最佳条件下，可以适当考虑香菇多糖的含量。最终在优化培养中得到的香菇多糖的量为0.3g。

4、奶粉数据处理：

按照铬的安全推荐量：成人50—200μg/d，而富铬香菇菌丝含铬为3065.6μg/g，考虑其他食物的含铬量，按每天喝200ml牛奶，使200ml奶中有100μg的铬，计算出加入富铬香菇菌丝粉末33mg。蔗糖含量按4％计，每200ml奶中应加入8g的蔗糖，考虑到蔗糖不利于近视眼的防治、不适宜糖尿病人和中老年人食用，而使用甜味剂—双歧糖代替，双歧糖的甜度为普通蔗糖的10倍，因此最终在200ml奶中应加入0.8g的双歧糖。

加了糖之后再加入香菇多糖，一起溶于奶中，使奶具有香菇多糖的功能。

经喷雾干燥后最终得到富铬奶粉17.14g，按照1份奶粉、7份水的比例，可将其还原为120ml的牛奶。

三、结果

通过正交实验得到富铬香菇菌丝的优化条件为600μg/ml的铬浓度、加铬时间为菌丝培养好后的第1天、培养时间为10天。功能性奶粉的制备为：在100ml牛奶中加入双歧糖0.4g，富铬菌丝体0.016g，最后经喷雾干燥得到。富铬香菇菌丝水溶性胞外多糖采用分步提取的方式可以得到更多的多糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法，其特征在于，所述的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法包括以下步骤：

步骤一：富铬香菇菌丝制备方法： 将经活化、扩大的武香二号香菇菌种，按10%的接种量接种于培养基中，其成分为：纯玉米粉20g，葡萄糖20g，蔗糖20g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠1g，硫酸镁1g，水1000ml，于摇床110次/min、28℃培养一天后，加入三氯化铬溶液至液体培养基的铬浓度达到600μg /ml，在摇床上继续培养9天，即可得到富铬香菇菌丝；将培养好的富铬香菇菌丝，3000r/min离心，水洗2次后，60℃24h烘干，得到富铬香菇菌丝粉末；

步骤二：香菇胞外多糖的提取：取一定量的发酵液在搅拌下缓慢加入95%乙醇到30%的乙醇浓度，在冰箱中沉淀过夜，3000r/min，离心20min得粗多糖沉淀；于上清液中缓慢加95%乙醇到60%的乙醇浓度，同法离心后得粗多糖沉淀； 再往上清液中继续加入95%乙醇到80%的乙醇浓度，离心后得粗多糖沉淀；合并3次沉淀，水洗、离心、烘干后得到香菇胞外多糖；

步骤三：确定奶粉中营养成分之量：每200ml奶中加入富铬香菇菌丝粉末33mg，0.8g的双歧糖，0.6g的香菇胞外多糖；对牛奶进行喷雾干燥得到产品。

2.一种由权利要求1基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉的制备方法制备的基于富铬香菇菌丝的保护视力的富铬功能性奶粉。

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