CN1100870C - 同时富集铁锌微量元素菌体的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时富集铁锌微量元素菌体的制造方法，包括在适当的培养基中培养微生物菌体，并在适当的培养阶段在培养基中添加一定浓度的无机铁和无机锌离子溶液，使铁锌离子在菌体内稳定地积累。本发明的产品可以用于人的铁锌补剂也可以广泛应用于畜禽及水产，提高铁锌的生物利用率。
Description
本发明涉及富集微量元素的微生物菌体的制备方法。
铁锌微量元素缺乏会引起人和动物，特别是儿童及幼畜营养的不良。据我国营养学会发表资料表明，人体必需的微量元素铁、锌、硒、碘等在我国均较缺乏，长期摄入不足。矿物质微量元素预混剂中铁锌是主要成分之一，是国内生产量较大，使用较普遍的饲料添加剂。目前国内使用的铁锌微量元素主要以硫酸亚铁、硫酸锌等无机形态存在，其共同特点是易使载体着色，与食品及饲料中其它成分协同配伍性差。硫酸亚铁难以解决仔猪缺铁性贫血症状，其局限性已被养殖业所证实。有关有机铁锌能提高生物组织吸收利用率、降低饲料中其它成分的损失方面的报道很多(Madson等1989，stuart等1986，Scholmerich等1987)。国内报导奶牛日粮中添加600ppm的蛋白锌，产奶量比添加同样剂量的无机锌盐提高25.4％(赵洪亮等1992)，富锌金针菇中锌的生物利用率是硫酸锌的207％(莫宝庆等1990)。采用微生物富集微量元素以求其有机形态显示出明显的优点。一般用来作微量元素载体的微生物均属对人畜无毒安全的菌种，这种载体不仅能提供人及动物所必需的微量元素，同时菌体本身又含有丰富的营养，菌种一般属食品及饲料工业常用菌种，生产工艺也比较成熟。如日本公开特许公报(特开平5-176758，1993)公开了一种富集铁的酵母的制造方法，是在培养基中加入一定浓度的铁离子，使铁在酵母中积累。铁 富集量达到8000ppm以上。又如林稚兰等(微生物学报，1992)公开了一种制备高锌酵母的方法。但这些方法均是一种微生物富集一种微量元素。当需要向饲料中加入多种微量元素时，就需要进行不同的培养以富集不同的元素。这就不可避免地造成成本过高，操作烦琐，生产周期长。
本发明的目的是提供一种采用一种微生物在同一种培养基和同一发酵条件同时富集两种微量元素的方法以达到在食品及饲料中添加本发明的产品可同时满足人及动物对铁锌的需要。
本发明提供了一种富含铁锌的微生物菌体的制造方法，包括在适当的培养基中培养微生物菌体，并在适当的培养阶段在培养基中添加一定浓度的无机铁和无机锌离子溶液，使铁锌离子在菌体内稳定地积累。
所用的微生物是米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)，香菇(Letinus edode)，金针菇(Flammulinevelutipes)，或酵母菌属(Sacchromyces)、假丝酵母属(Candida)、拟内孢霉属(Endomycopsis)的菌种。
优选的微生物是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
所用的铁盐可以是硫酸亚铁、氯化亚铁、三氯化铁、乳酸亚铁或柠檬酸亚铁，锌盐是硫酸锌、氧化锌、碳酸锌或乙酸锌。优选的铁盐是硫酸亚铁，在培养基中的浓度为60-90ppm，锌盐是硫酸锌，在培养基中的浓度为60-90ppm。
培养基中的碳源可以是选自玉米粉、小米粉、普通面粉、土豆粉及其混合物的物质。
所用的无机铁和无机锌的加入是在发酵培养开始后6-12小时进行的。
通过对本方法富集的铁锌离子的菌体进行透射电镜观察，结果可见富铁锌的微生物菌体细胞壁与对照组有明显的不同。富铁锌的细胞不完整，细胞膜附近有堆积物，细胞内斑点加深等，说明本发明方法制造的铁锌离子不是以游离态存在，而是在代谢中与细胞内某些成分(蛋白质、细胞壁多糖)紧密结合，见附图1照片。该菌种可利用廉价的农副产品来源的培养基富集铁锌微量元素，制取的菌体细胞大利于收取，这无疑会降低饲料的成本。用本发明的方法研制的小试产品用于仔猪代谢试验证明，富铁锌真菌产品的铁锌利用率较之无机铁锌有显著提高(结果见实施例6)。本发明的产品可用于人也可用于畜禽及水产。
实施例
本发明操作程序为：
菌种→斜面活化→三角瓶液体种子培养→三角瓶液体培养基中培养→培养一定阶段加一定浓度的铁锌离子溶液继续培养→收取菌体→水洗三次→干燥
本发明所用培养基为：
(I)钭面培养基：葡萄糖2g，蛋白胨1g，KH2PO4 0.1g，MgSO4·7H2O0.05g，水100ml。
(II)三角瓶种子培养基：玉米粉(过60目筛)2g，NaNO3 0.2g，KH2PO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，水100ml。
(III)三角瓶发酵培养基：
(1)糖度为5％的麦芽汁，或者
(2)同(II)。
实施例11.菌种的筛选：
将钭面上经活化的菌种转接到经121℃灭菌30分钟的三角瓶培养基【培养基(I)、培养基(II)】中，在20-35℃培养10-24小时，按接种量5％转接到灭菌的三角瓶液体培养基中，再加适当浓度的灭菌的铁锌离子溶液(铁锌离子浓度分别为30-150ppm)，培养16-48小时，微生物的生长情况用肉眼根据发酵液混浊度判断++++极好，+++好，++良好，+一般，-不生长，部分结果见表1。
表1：
测定方法：用称重法测定干菌体重，用原子吸收法测定铁锌含量(中华人民共和国国家标准GB/T 13885-92)。2.铁锌的富集：
| 试验菌 | 培养基号别 | 对照 | 铁锌离子浓度分别为50ppm | 铁锌离子浓度分别为90ppm |
| Letinus edodes-M2 | (2) | +++ | + | - |
| Flammuline velutipes-M3 | (1) | ++ | + | - |
| Pleurslus ostreatus | (2) | +++ | + | - |
| Endomycopsis SP | (1) | ++++ | ++ | + |
| Candida tropicalis-Y2 | (1) | ++++ | +++ | + |
| Sacch.Cerevisiae-Y5 | (1) | ++++ | +++ | + |
| Sacch.Cerevisiae-Y17 | (1) | +++ | + | - |
| Asp.Oryzae-F51 | (2) | ++++ | ++++ | + |
| Asp.Oryzae-F107 | (2) | +++ | + | - |
| Asp.Oryzae-F59 | (2) | ++++ | ++++ | ++ |
| Asp.Oryzae-F62 | (2) | ++ | + | - |
| Asp.Oryzae-F510 | (2) | +++ | + | - |
| Asp.Niger-F35 | (1) | ++ | + | - |
| Asp.Niger-F37 | (1) | ++ | + | - |
用上述1中选择出的米曲霉Asp.Oryzae-F 59进行铁锌的富集。
将在钭面上培养4-7天的钭面种子转接入经高压(121℃30分钟)灭菌的三角瓶液体种子培养基中。25-35℃(最适28-32℃)振荡培养16-30小时(最适18-20小时)，按5％接种量转接入经高压灭菌的三角瓶发酵培养基中，培养6-12小时，再添加经过滤灭菌的铁锌离子溶液(30-150ppm)，继续培养10-18小时，过滤收取菌体，用水洗三次，菌体经干燥箱烘至恒重。
实施例2
用不同的原料为培养基质，均可富集到较高含量的铁锌微量元素。本试验培养基起始pH为6.0，所用无机铁锌离子浓度为60PPM，培养时间为24小时，其它条件同实施例1所述，结果见表2。
表2
实施例3
| 培养基主要原料 | 干菌体重(g/100ml) | 铁含量(mg/g) | 锌含量(mg/g) |
| 玉米粉 | 1.25 | 4.67 | 4.55 |
| 普通面粉 | 1.11 | 4.20 | 3.48 |
| 大米粉 | 0.89 | 4.09 | 4.65 |
| 小米粉 | 1.25 | 4.00 | 3.75 |
| 土豆粉 | 0.89 | 5.04 | 4.35 |
用不同的无机铁、锌盐(铁、锌离子浓度均为60PPM)，主要基质用过60目筛的玉米粉，培养条件同上，见表3。
表3：
| 不同的铁、锌盐 | 干菌体重(g/100ml) | 铁含量(mg/g) | 锌含量(mg/g) |
| 氯化亚铁 | 1.278 | 4.30 | |
| 三氯化铁 | 1.102 | 4.01 | |
| 硫酸亚铁 | 1.292 | 5.61 | |
| 柠檬酸亚铁 | 1.020 | 4.01 | |
| 氯化锌 | 1.135 | 2.20 | |
| 硫酸锌 | 1.131 | 5.21 | |
| 碳酸锌 | 1.105 | 5.19 | |
| 乙酸锌 | 1.030 | 4.36 | |
| 氧化锌 | 1.070 | 5.15 | |
| 对照 | 1.256 | 0.218 | 0.125 |
结果证实用不同的无机铁盐和锌盐均可能富集高含量的有机铁锌，但富集含量及干菌体产量不等，以硫酸亚铁和硫酸锌最好。
实施例4
用不同浓度的铁锌离子溶液(硫酸亚铁和硫酸锌，加入培养基中，其它条件同上，结果见表4)。
表4
| 铁离子浓度(ppm) | 锌离子浓度(ppm) | 干菌体重(g/100ml) | 铁含量(mg/g) | 锌含量(mg/g) |
| 30 | 1.308 | 2.25 | ||
| 60 | 1.297 | 5.10 | ||
| 90 | 1.35 | 6.38 | ||
| 120 | 1.226 | 6.00 | ||
| 150 | 1.237 | 5.40 | ||
| 30 | 1.128 | 3.00 | ||
| 60 | 1.132 | 5.25 | ||
| 90 | 1.116 | 5.00 | ||
| 120 | 1.110 | 4.25 | ||
| 30 | 30 | 1.252 | 2.03 | 2.85 |
| 60 | 60 | 1.305 | 5.60 | 5.00 |
| 90 | 90 | 1.272 | 5.80 | 5.00 |
| 120 | 120 | 1.090 | 5.90 | 4.40 |
结果证实，制备富含有机铁锌离子的真菌菌体Asp.Oryzae-F59，培养基中最适的无机铁锌离子浓度范围为60-90ppm，在这个范围内均可制取较高含量铁锌的微生物菌体，同时也能收取较多的干菌体。
实施例5
在不同的培养时间添加无机铁盐锌盐，其它条件同上，结果见附图3，图3表明，在Asp.Oryzae-F59在培养对数生长期(6-12小时)添加铁锌离子，培养24小时后，收获的菌体中铁锌含量较高，12小时后添加，两指标显著下降。
实施例6
将发酵培养基的起始pH用0.1N的NaOH和0.1N的HCL调成不同的pH，灭菌后再进一步调整，结果见附图2。图2表明用该菌种富集铁锌，在pH5.5-7.5范围内，干菌体收获量及菌体内铁锌含量均较高。
实施例7
用本发明的方法制造的富含铁锌离子的菌体用于断奶仔猪作为铁锌源为试验组，用硫酸亚铁及氧化锌为对照组，基础日粮参照1988年美国NRC饲料营养标准，试验两周后，两组仔猪均发育正常。试验组比对照组日增重提高7.14％，饲料利用率提高10％，说明在饲料中添加有机铁、锌微量元素相对于无机铁锌具有促生长并提高饲料利用率的作用。生理生化指标结果：试验前两组基本一致。试验后，试验组的碱性磷酸酶指标(此指标与锌的吸收呈极相关性)与血红蛋白指标(家畜体内的铁有一半以上有存在于血红蛋白中，测此指标可知机体对铁的吸收利用情况)与试验前差异显著(P＜0.05)。试验组碱性磷酸酶指标和血红蛋白指标分别为160.56miu和9.94g/100ml；对照组分别为105.24miu和7.18g/100ml。两组免疫球蛋白指标虽差异不显著，但试验组有上升趋势。
Claims (3)
1.一种富含铁锌的微生物菌体的制造方法，包括在适当的培养基中培养微生物菌体，并在适当的培养阶段在培养基中添加一定浓度的无机铁和无机锌离子溶液，使铁锌离子在菌体内稳定地积累，其特征在于所用的铁盐是硫酸亚铁、氯化亚铁、三氯化铁、或柠檬酸亚铁，在培养基中的浓度为60-90ppm，而所用的锌盐是硫酸锌、氧化锌、碳酸锌或乙酸锌，在培养基中的浓度为60-90ppm，并且无机铁和无机锌的加入是在发酵培养开始后6-12小时进行的。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，该微生物是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、香菇(Letinus edode)、金针菇(Flammuline velutipes)、或酵母菌属(Sacharomyces)、假丝酵母(Candida)和拟内孢霉(Eedomycopsis)的菌种。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，该微生物是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
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