CN110082441A

CN110082441A - 检测禁用香精的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN110082441A
Application number: CN201910294621.8A
Authority: CN
Inventors: 张峰; 刘通; 王秀娟; 王玉娇
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN110082441B

Abstract

本发明公开了检测禁用香精的方法和试剂盒。其中，该检测禁用香精的方法包括：对样品进行提取处理，以便得到提取液；对所述提取液进行纯化处理，以便得到纯化的提取液；以及对所述纯化的提取液进行气相色谱串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述样品中所述禁用香精的定性/定量检测结果。该方法选择性和抗干扰能力更强，适于基质成分复杂样品中禁用香精的检测，并且检测的精确度、灵敏度、回收率和重现性高。

Description

检测禁用香精的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及检测禁用香精的方法和检测禁用香精的试剂盒。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的提高，消费者在追求食品健康与安全的同时，更加注重口味的变化，促进了食品香精的快速发展。香精具有增强商品现有风味和赋予食品风味的特性，广泛应用于饮料、糖果、面包、乳制品、巧克力等。然而，随着越来越多的健康风险证据，使用香精化合物一直是一个有争议的问题。因此，中国食品药品监督管理部门、美国食品药品监督管理局、欧洲食品安全局(EFSA)和国际食品香料工业组织(IOFI)已经对可用于食品的香精化学成分和含量都做出了明确限定。我国食品安全国家标准GB2760-2014《食品添加剂使用标准》对可以添加于食品中的香精香料成分做了明确限定。

现有测试技术中，用于食品中香精成分的定量和定性检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法等。在复杂基质多组分分析时，气相色谱法存在灵敏度低和检测限高的缺点。气相色谱-质谱技术采用选择离子监测模式对化合物进行确认，由于基质复杂的样品基质干扰大，易出现假阳性结果。

由此，香精的检测方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测禁用香精的方法，该方法的灵敏度和精确度高，适于基质成分复杂食品中禁用香精的检测。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测禁用香精的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对样品进行提取处理，以便得到提取液；对所述提取液进行纯化处理，以便得到纯化的提取液；以及对所述纯化的提取液进行气相色谱串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述样品中所述禁用香精的定性/定量检测结果。

根据本发明实施例的检测禁用香精的方法，对提取液进行纯化处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，然后，采用气相色谱串联三重四级杆质谱(GC-MS/MS)，在单四级杆质谱的基础上增加了二级质谱信息，因此选择性和抗干扰能力更强，适于基质成分复杂样品中禁用香精的检测，并且检测的精确度、灵敏度、回收率和重现性高。

另外，根据本发明上述实施例的检测禁用香精的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，利用乙酸乙酯进行所述提取处理。

根据本发明的实施例，所述乙酸乙酯的添加量为每克样品添加15-25mL。

根据本发明的实施例，所述纯化处理包括：利用第一纯化剂和第二纯化剂进行所述纯化处理，其中，所述第一纯化剂为无水硫酸镁，所述第二纯化剂为N-丙基乙二胺。

根据本发明的实施例，基于1g所述样品，所述第一纯化剂的添加量为8-12mg，所述第二纯化剂的添加量为8-12mg。

根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的色谱柱为DB-5MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm。

根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的色谱条件为：进样口温度250℃；进样方式：不分流进样；进样量：1.0μl；载气：氦气(≥99.999％)；流量：1.0mL/min。

根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的气相升温程序为：初始温度：35-45℃，保持5-7min，以8-12℃/min升到110-120℃，然后以4-6℃/min升到130-140℃，最终以25-35℃/min升到210-230℃，保持1-3min。

根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的质谱条件为：离子源为EI源；色谱-质谱接口温度：260-300℃；离子化方式：电子轰击(EI)；电子能量：70ev；检测方式：多反应监测模式(MRM)；溶剂延迟：4-6min。

根据本发明的实施例，所述禁用香精为选自糠基甲基醚、2-乙基噻吩、2,5-二甲基噻吩、苯乙烯、乙基糠基醚、N-甲基-2-吡咯甲醛、2-吡咯甲醛、1-乙基-2-吡咯甲醛、甲基硫代磺酸甲酯、(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇、二乙基三硫醚、3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩、硫代桉中醇、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-醇、二糠基醚、1-甲基萘、丙基磺酰硫丙酯、二糠基硫醚、N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺和(1R,2S,5R)-N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺中的至少一种。

在此基础上，根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测禁用香精的试剂盒。根据本发明的实施例，基于1g样品，该试剂盒包括：提取剂：乙酸乙酯，8-12mL；第一纯化剂：无水硫酸镁，8-12mg；第二纯化剂：N-丙基乙二胺，8-12mg；色谱柱：DB-5MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm。

根据本发明实施例的检测禁用香精的试剂盒，利用第一纯化剂和第二纯化剂对提取液进行纯化处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，然后，以DB-5MS色谱柱对样品进行检测，检测的精确度、灵敏度、回收率和重现性高。在此需要说明的是，本发明实施例的试剂盒具有前述检测禁用香精的方法的全部技术特征，在此不再一一赘述。

根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：稀释剂：正己烷。

根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：标准溶液：禁用香精混合标准品。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的禁用香精成分MRM色谱图的结果示意图，其中，化合物标号：1.糠基甲基醚2.2-乙基噻吩3.2,5-二甲基噻吩4.苯乙烯5.乙基糠基醚6.N-甲基-2-吡咯甲醛7.2-吡咯甲醛8.1-乙基-2-吡咯甲醛9.甲基硫代磺酸甲酯10.(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇11.二乙基三硫醚12.3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩13.硫代桉中醇14.1,8(10)-二烯-9-醇15.二糠基醚16.1-甲基萘17.丙基磺酰硫丙酯18.二糠基硫醚19.N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺20.N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同提取溶剂对20种禁用香精成分提取效果比较示意图，其中，化合物标号：1.糠基甲基醚2.2-乙基噻吩3.2,5-二甲基噻吩4.苯乙烯5.乙基糠基醚6.N-甲基-2-吡咯甲醛7.2-吡咯甲醛8.1-乙基-2-吡咯甲醛9.甲基硫代磺酸甲酯10.(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇11.二乙基三硫醚12.3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩13.硫代桉中醇14.1,8(10)-二烯-9-醇15.二糠基醚16.1-甲基萘17.丙基磺酰硫丙酯18.二糠基硫醚19.N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺20.N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺；

图3显示了根据本发明一个实施例的不同提取溶剂体积对20种禁用香精成分提取回收率结果示意图，其中，化合物标号：1.糠基甲基醚2.2-乙基噻吩3.2,5-二甲基噻吩4.苯乙烯5.乙基糠基醚6.N-甲基-2-吡咯甲醛7.2-吡咯甲醛8.1-乙基-2-吡咯甲醛9.甲基硫代磺酸甲酯10.(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇11.二乙基三硫醚12.3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩13.硫代桉中醇14.1,8(10)-二烯-9-醇15.二糠基醚16.1-甲基萘17.丙基磺酰硫丙酯18.二糠基硫醚19.N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺20.N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺；

图4显示了根据本发明一个实施例的不同吸附剂对目标物吸附效果对比示意图，其中，化合物标号：1.糠基甲基醚2.2-乙基噻吩3.2,5-二甲基噻吩4.苯乙烯5.乙基糠基醚6.N-甲基-2-吡咯甲醛7.2-吡咯甲醛8.1-乙基-2-吡咯甲醛9.甲基硫代磺酸甲酯10.(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇11.二乙基三硫醚12.3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩13.硫代桉中醇14.1,8(10)-二烯-9-醇15.二糠基醚16.1-甲基萘17.丙基磺酰硫丙酯18.二糠基硫醚19.N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺20.N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测禁用香精的方法。根据本发明实施例的检测禁用香精的方法，对提取液进行纯化处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，然后，采用气相色谱串联三重四级杆质谱(GC-MS/MS)，在单四级杆质谱的基础上增加了二级质谱信息，因此选择性和抗干扰能力更强，适于基质成分复杂样品中禁用香精的检测，并且检测的精确度、灵敏度、回收率和重现性高。

为了便于理解该检测禁用香精的方法，在此，对该方法进行解释说明，根据本发明的实施例，该方法包括：

S100提取处理

根据本发明的实施例，对样品进行提取处理，得到提取液。由此，通过提取处理，从样品中提取禁用香精。

发明人对不同提取溶剂进行比较，研究发现，利用乙酸乙酯进行所述提取处理，即以乙酸乙酯为提取溶剂，香精化合物的回收率高，检测结果的精确度更高。进一步地，发明人对提取溶剂的添加量进行了摸索，研究发现，随着提取体积的增大，目标物的提取效率增加，基于1.00g样品，当提取体积达到为15mL时，提取回收率逐渐趋于稳定，综合考虑回收率的稳定性，根据本发明的实施例，所述乙酸乙酯的添加量为每克样品添加15-25mL，其中，优选乙酸乙酯的添加量为20mL。

根据本发明的实施例，该提取方法包括：称取样品1.00g置于离心管中，然后加入提取试剂，涡旋1min，离心(25℃，8000r/min)5min，得到提取液。

根据本发明的实施例，该样品为咖啡。咖啡中常添加禁用香精以提高咖啡的香气，本发明实施例的检测禁用香精的方法尤其适用于咖啡的检测。

S200纯化处理

根据本发明的实施例，对所述提取液进行纯化处理，以便得到纯化的提取液。由此，对提取液进行纯化处理，可以有效去除咖啡样品中的色素和脂类杂质，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，提高灵敏度和检测限。

由于复合香精的样品，例如咖啡，常含有高沸点化合物和深棕色残留物，使样品基质十分复杂，降低了灵敏度和检测限，因此对样品进行纯化处理是定量测定咖啡产品中风味化合物的关键步骤。根据本发明的实施例，所述纯化处理为吸附纯化。根据本发明的实施例，所述纯化处理包括：利用第一纯化剂和第二纯化剂进行所述纯化处理，其中，所述第一纯化剂为无水硫酸镁，去除基质中水的干扰，所述第二纯化剂为N-丙基乙二胺，具有离子交换能力，用于吸附其他杂质，使样品的回收率更高。

进一步地，根据本发明的实施例，基于1g所述样品，所述第一纯化剂的添加量为8-12mg，所述第二纯化剂的添加量为8-12mg。由此，该剂量的第一和第二纯化剂既可以除水完全，又不会吸附目标化合物。

根据本发明的一些实施例，该纯化处理包括：将提取液转移至离心管中，然后加入第一纯化剂和第二纯化剂，涡旋1min，离心(25℃，8000r/min)5min，得到的上清液采用滤膜过滤，得到纯化的提取液。

S300检测处理

根据本发明的实施例，对所述纯化的提取液进行气相色谱串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述样品中所述禁用香精的定性/定量检测结果。由此，采用气相色谱串联三重四级杆质谱(GC-MS/MS)，在单四级杆质谱的基础上增加了二级质谱信息，因此选择性和抗干扰能力更强，适于基质成分复杂样品中禁用香精的检测，并且检测的精确度、灵敏度、回收率和重现性高。

根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的色谱柱为DB-5MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm。DB-5MS色谱柱的固定相为非极性，与待测物分子之间作用主要依靠分子间色散力相互作用，利用目标化合物在固定相与流动相之间吸附解吸附的能力不同，在分离过程中依次分离不同的化合物，尤其适用含有大量香精成分的样品的分离。

根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的色谱条件为：进样口温度250℃；进样方式：不分流进样；进样量：1.0μl；载气：氦气(≥99.999％)；流量：1.0mL/min。由此，该色谱条件适用含有多种禁用香精成分的样品的分离，各化合物分离效果好。

由于禁用香精中的2,5-二甲基噻吩和2-己基噻吩的保留时间相似，为了使这两种化合物完全分离，发明人对气相升温条件进行了摸索，根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的气相升温程序为：初始温度：35-45℃，保持5-7min，以8-12℃/min升到110-120℃，然后以4-6℃/min升到130-140℃，最终以25-35℃/min升到210-230℃，保持1-3min。由此，禁用香精成分2,5-二甲基噻吩和2-己基噻吩具有良好的分离效果，使检测的灵敏度和精确度更高。

采用三重四级杆质谱检测时，优化的质谱参数一般包括母离子、子离子以及碰撞能量等。发明人在优化MRM参数时，先通过全扫描方式找出每一组份的保留时间，选取质荷比较大且相对丰度比较高的特征碎片作为母离子。然后将母离子进一步裂解,选取两个或三个离子作为子离子,同时优化碰撞能量，以最佳的子离子响应值进行定性和定量。根据本发明的实施例，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的质谱条件为：离子源为EI源；色谱-质谱接口温度：260-300℃；离子化方式：电子轰击(EI)；电子能量：70ev；检测方式：多反应监测模式(MRM)；溶剂延迟：4-6min。由此，检测的灵敏度和精确度高。

进一步地，该检测禁用香精的方法还包括一些气相色谱串联三重四级杆质谱检测的常规步骤，例如标准曲线的绘制等，在此不再一一赘述。根据本发明的实施例，标准溶液可以是10μg/mL禁用香精混合标准品。该禁用香精混合标准品的配制方法包括：称取单个禁用香精标准品10.0±0.1mg分别置于10mL容量瓶中，加入少许正己烷混匀，待标准品溶解，再加入正己烷定容至10mL，可得1mg/mL的单个禁用香精标准品储备液。分别精密移取上述单个禁用香精标准品储备液100μL至10mL容量瓶中，用正己烷稀释并定容至10mL，可得10μg/mL的禁用香精混合标准溶液。而配置标准曲线溶液的方法为：分别精密移取1、2、5、10、20、50、100和200μL的10μg/mL混合标准品至10mL容量瓶中，用正己烷稀释并定容至10mL,混匀，可得1、2、5、10、20、50、100和200ng/mL标准曲线溶液，利用气相色谱串联三重四级杆质谱对各标准曲线溶液进行检测，绘制标准曲线。

根据本发明实施例的检测禁用香精的试剂盒，利用第一纯化剂和第二纯化剂对提取液进行纯化处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰然后，以DB-5MS色谱柱对样品进行检测。根据本发明的一些实施例，采用气相色谱串联三重四级杆质谱(GC-MS/MS)，在单四级杆质谱的基础上增加了二级质谱信息，因此选择性和抗干扰能力更强，适于基质成分复杂样品中禁用香精的检测，并且检测的精确度、灵敏度、回收率和重现性高。

根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：稀释剂：正己烷。由于正己烷极性与香精类化合物相似，有利于香精类化合物充分溶解。根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：标准溶液：禁用香精混合标准品。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例以咖啡样品为例进行检测，具体如下：

1、实验方法

(1)样品的提取净化：准确称取咖啡样品1g置于50mL离心管中，加入提取试剂，涡旋1min，混匀，离心(25℃，8000r/min)5min。提取上清液10mL至第二个50mL离心管中，然后将第一纯化剂和第二纯化剂加入第二个离心管中，涡旋1min混匀，离心(25℃，8000r/min)5min。

(2)上机测定：用0.22μm尼龙滤膜过滤后上机检测。

(3)仪器条件

色谱条件：色谱柱:DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，进样口温度250℃；进样方式:不分流进样；进样量:1.0μl；载气:氦气(≥99.999％)，流量:1.0mL/min；程序升温:初始温度40℃，保持6min，以10℃/min升到120℃，5℃/min升到135℃，最终以30℃/min升到220℃，保持2min。

质谱条件：离子源为EI源，色谱-质谱接口温度：280℃；离子化方式：电子轰击(EI)；电子能量：70ev；质谱检测方式:多反应监测模式(MRM)；溶剂延迟：5min。

(4)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限的测定。确称取20种香精香料标准品10.0±0.1mg分别置于10mL容量瓶中，加入少许正己烷混匀，待标准品溶解，再加入正己烷定容至10mL，可得1mg/mL的储备液，并放在-20℃冰箱中保存待用。分别精密移取20种香精香料100μL至10mL容量瓶中，用正己烷稀释并定容至10mL，混匀，可得10μg/mL混合标准溶液，并放置于4℃冰箱中保存待用。

分别精密移取1，2，5，10，20，50，100，200μL的10μg/mL混合标准溶液分别至10mL容量瓶中，用正己烷稀释并定容至10mL,混匀，可得1，2，5，10，20，50，100，200ng/mL标准曲线溶液，分别注入GC-MS/MS分析，得到标准曲线。在空白咖啡样品中添加不同浓度的标准品，经过前处理后进行测定，以峰高为基线噪音3倍时的质量浓度为分析方法的检出限(LOD)，以峰高为基线噪音10倍时的质量浓度为分析方法的定量限(LOQ)。

在空白咖啡中添加混合标准溶液，使添加量为LOQ，2LOQ，4LOQ三个质量浓度的添加水平。每个添加浓度做6个平行样品，按上述方法进行处理分析，计算回收率和日内日间精密度。

2、实验结果：

(1)色谱柱的选择

20种禁用香精分析物属于中等极性或弱极性的化合物，选择Agilent DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，DB-5MS色谱柱的固定相为非极性，与待测物分子之间作用主要依靠分子间色散力相互作用，利用目标化合物在固定相与流动相之间吸附解吸附的能力不同，在分离过程中依次分离不同的化合物。

(2)色谱条件的选择

为了获得目标分析物的最佳分离，GC温度程序得到了优化。2,5-二甲基噻吩和2-己基噻吩的保留时间相似，升温速率为15℃/min至120℃时两种化合物不能完全分离，温度程序为10℃/min至120℃可以具有良好的分离效果。因此，选择10℃/min至120℃的升温程序。

(3)质谱条件的优化

采用三重四级杆质谱检测时，优化的质谱参数一般包括母离子、子离子以及碰撞能量等。在优化MRM参数时，先通过全扫描方式找出每一组份的保留时间，选取质荷比较大且相对丰度比较高的特征碎片作为母离子。然后将母离子进一步裂解,选取两个或三个离子作为子离子,同时优化碰撞能量，以最佳的子离子响应值进行定性和定量。20种禁用香精的MRM色谱图见图1，20种禁用香精化合物质谱参数见表1。

表1 20种禁用香精化合物质谱参数

注：*为定量离子

(4)样品提取溶剂的优化

在该研究中，比较了通过四种不同溶剂(正己烷，乙腈，丙酮和乙酸乙酯甲醇)从咖啡样品中提取的20种香精化合物的回收率。结果如图2所示，当使用正己烷时，吡咯-2-甲醛(73.96％)，2,8-环硫代-薄荷烷(72.59％)，(1R，2S，5R)-N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷(72.67％)回收率低。以丙酮为萃取溶剂，各化合物的回收率在53.01％-117.96％之间；乙腈为萃取溶剂时，各化合物的回收率最低(15％-33.25％)；乙酸乙酯作为萃取溶剂时回收率范围为93.48％-117.85％。因此，选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

(5)样品提取溶剂体积的优化

选择乙酸乙酯为提取溶剂，以加标水平30μg/kg的空白咖啡为基质，以回收率为指标，考察不同提取溶剂体积(5、10、15、20和25mL)对各目标物提取效率的影响。结果见图3所示，随着提取体积的增大，目标物的提取效率增加，当提取体积高于15mL时，提取回收率趋于稳定，为了保障更佳的回收率，选择20mL为提取体积。

(6)样品净化条件的优化

由于咖啡中含有高沸点化合物和深棕色残留物，使咖啡基质十分复杂，降低了灵敏度和检测限，因此对咖啡进行提纯是定量测定咖啡产品中风味化合物的关键步骤。发明人研究了三种不同的样品纯化吸附剂：石墨化碳(GCB，10mg)、N-丙基乙二胺(PSA，10mg)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18，10mg)及其吸附剂组合PSA(5mg)+C18(5mg)。不同吸附剂对目标物吸附效果对比图见图4。将吸附剂GCB或PSA+C18加入到咖啡萃取液中进行提纯时，目标化合物的最高回收率在89％以下。在咖啡萃取液中加入净化材料C18进行提纯时，丙基磺酰硫丙酯的回收率较低(73％)，而用PSA纯化这些化合物时，回收率在86％-106.73％之间，因此用PSA(10mg)作为纯化吸附剂。

(7)检测方法的线性范围、检出限和定量限

在空白样品中分别添加一系列浓度的混合标准溶液，进行前处理和测定，以3倍信噪比确定方法的检出限，以10倍信噪比确定方法的定量限。具体见表2。

表2线性范围及检出限、定量限

(8)检测方法精密度和回收率

准确称取空白咖啡样品，分别添加高、中、低三个浓度标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，进行样品分析。二十种化合物的平均回收率均在83.75％-106.73％之间，精密度良好，相对标准偏差均小于10％，可以满足定量分析的需求，具体计算结果如表3所示。

表3 20种禁用香精化合物回收率和精密度(n＝6)

(9)实际样品的测定

使用本实施例的检测试剂盒和检测方法对11份咖啡样品进行含量测定。样品中各目标组分的含量测定结果见表4，其中n.d表示未检出。其中有5个禁用香精化合物在咖啡样品中检出。由表4可知，本发明可成功用咖啡中20种禁用香精的检测。

表4

综上所述，本发明实施例的方法对咖啡中20种禁用香精方法进行检测，能够简单快速完成样品的前处理和检测。采用MRM模式能有效消除基质效应，具有较高的灵敏度和回收率及重现性，可应用于样品，例如食品中，禁用香精含量的准确测定。并且，20种禁用香精化合物在线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，回收率在可接受范围内，本发明实施例的检测试剂盒及检测方法能够有效检测样品中的禁用香精，为食品，尤其是咖啡的安全检测提供一种灵敏、准确、方便、快捷的手段。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种检测禁用香精的方法，其特征在于，包括：

对样品进行提取处理，以便得到提取液；

对所述提取液进行纯化处理，以便得到纯化的提取液；以及

对所述纯化的提取液进行气相色谱串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述样品中所述禁用香精的定性/定量检测结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用乙酸乙酯进行所述提取处理，

任选地，所述乙酸乙酯的添加量为每克样品添加15-25mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化处理包括：

利用第一纯化剂和第二纯化剂进行所述纯化处理，其中，所述第一纯化剂为无水硫酸镁，所述第二纯化剂为N-丙基乙二胺，

任选地，基于1g所述样品，所述第一纯化剂的添加量为8-12mg，所述第二纯化剂的添加量为8-12mg。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的色谱柱为DB-5MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的色谱条件为：

进样口温度250℃；

进样方式：不分流进样；

进样量：1.0μl；

载气：氦气(≥99.999％)；

流量：1.0mL/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的气相升温程序为：初始温度：35-45℃，保持5-7min，以8-12℃/min升到110-120℃，然后以4-6℃/min升到130-140℃，最终以25-35℃/min升到210-230℃，保持1-3min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱串联三重四级杆质谱的质谱条件为：

离子源为EI源；

色谱-质谱接口温度：260-300℃；

离子化方式：电子轰击(EI)；

电子能量：70ev；

质谱检测方式：多反应监测模式(MRM)；

溶剂延迟：4-6min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禁用香精为选自糠基甲基醚、2-乙基噻吩、2,5-二甲基噻吩、苯乙烯、乙基糠基醚、N-甲基-2-吡咯甲醛、2-吡咯甲醛、1-乙基-2-吡咯甲醛、甲基硫代磺酸甲酯、(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇、二乙基三硫醚、3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩、硫代桉中醇、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-醇、二糠基醚、1-甲基萘、丙基磺酰硫丙酯、二糠基硫醚、N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺和(1R,2S,5R)-N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺中的至少一种。

9.一种检测禁用香精的试剂盒，其特征在于，基于1g样品，包括：

提取剂：乙酸乙酯，8-12mL；

第一纯化剂：无水硫酸镁，8-12mg；

第二纯化剂：N-丙基乙二胺，8-12mg；

色谱柱：DB-5MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：

稀释剂：正己烷，

任选地，进一步包括：

标准溶液：禁用香精混合标准品，

任选地，所述禁用香精为选自糠基甲基醚、2-乙基噻吩、2,5-二甲基噻吩、苯乙烯、乙基糠基醚、N-甲基-2-吡咯甲醛、2-吡咯甲醛、1-乙基-2-吡咯甲醛、甲基硫代磺酸甲酯、(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇、二乙基三硫醚、3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩、硫代桉中醇、p-薄荷-1,8(10)-二烯-9-醇、二糠基醚、1-甲基萘、丙基磺酰硫丙酯、二糠基硫醚、N-乙基-反式-2-顺式-6-壬二烯酰胺和(1R,2S,5R)-N-环丙基-5-甲基-2-异丙基环己烷甲酰胺中的至少一种。