KR101806424B1

KR101806424B1 - 홍삼 제품에서 카라멜 색소를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR101806424B1
Application number: KR1020160043980A
Authority: KR
Inventors: 장혜원; 이장호; 이윤열; 하재호
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2016-04-11
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2017-12-07
Also published as: KR20170116358A

Abstract

본 발명은 시료 내 카라멜 색소의 혼입 여부를 판별하기 위한 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따르면, 시료 내 4-(5)-메틸이미다졸의 함유 여부를 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME) 및 가스크로마토그래피-질량분석법을 이용해 높은 민감도로 검출할 수 있으며, 이로써 시료 내 카라멜 색소의 혼입 여부를 정확하고 편리하게 판별할 수 있다.

Description

홍삼 제품에서 카라멜 색소를 검출하는 방법{Analytical method to detect caramel color in red ginseng products}

본 발명은 시료 내에 카라멜 색소의 혼입 여부를 판별하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 4-(5)-메틸이미다졸을 카라멜 색소의 지표 성분으로 하여 시료 내에 카라멜 색소가 혼입되어 있는지 판별하는 방법에 관한 것이다.

카라멜 색소는 카라멜화 반응에 의해 생성되는 물질로서 암갈 내지 흑색의 분말, 덩어리, 페리스트 또는 액체로, 탄수화물을 가열시키면서 산 또는 알카리 그리고 공정 촉매제로 염 등을 첨가하여 제조되는 것으로 제조방법에 따라 카라멜 색소 Ⅰ, Ⅲ, Ⅲ, Ⅳ, 4 종류로 구분된다. 카라멜 색소는 제품 제조시 원물만으로 충분한 색이 발현되지 않아 제품의 향미 식감을 높여주고자 할 때 착색료로 사용되고 있으나, 카라멜 색소의 제조공정 중 당과 암모니아의 가열에 의해 생성되는 부산물인 4-(5)-메틸이미다졸의 안전성에 의문이 제기되고 있는 상황이다.

이에, 2015년 현재, 한국, 미국, 및 유럽은 4-(5)-메틸이미다졸의 규격을 250mg/kg 이하로 관리하고 있으며, 식품공전의 '식품첨가물 기준 및 규격'에서 인삼 또는 홍삼을 원료로 사용한 건강기능식품, 인삼성분 또는 홍삼성분이 함유된 다류 및 다류(고형차 및 희석하여 음용하는 액상차는 제외)등 몇 가지 식품에는 카라멜 색소를 첨가할 수 없도록 제한하고 있다.

그럼에도 불구하고, 최근 일부 홍삼 제품에서 홍삼 대신 카라멜 색소와 홍삼향을 이용한 부정 제품이 유통되는 등, 카라멜 색소를 혼입한 홍삼 제품이 부정하게 유통되어 문제가 되고 있는바, 홍삼 제품 내 카라멜 색소의 혼입 여부를 정확하고 편리하게 검출할 수 있는 방법을 개발할 필요성이 제기되고 있다.

한편, 극성 물질을 가스크로마토그래피(GC)로 분석하게 되면, 컬럼에 흡착되거나 인젝터에서 분해되어 분석의 재현성을 떨어뜨리는 문제가 있기 때문에, 유도체 변환 과정을 수행하는 것이 필요하다. 그러나 현재까지 공지된 방법에 따르면, 극성 물질의 추출 과정과 유도체 변환 과정이 따로 분리되어 있기 때문에 그 과정이 복잡하고, 시간과 비용이 많이 소요된다. 예를 들어, Ion-pair extraction 추출법은 추출과 역추출의 두 단계로 나뉘어져 있으며, 보다 구체적으로, 시약 및 유기용매를 첨가하여 추출하는 단계, 유기용매층을 분리하는 단계, 수용액을 첨가하여 역추출하는 단계, 수용액층을 분리하는 단계, 유도체 변환 단계, 및 시약 및 유기용매를 첨가하는 단계가 포함되어, 다양한 시약 및 용매가 필요하다(S. C. Cunha, a. I. Barrado, M. a. Faria, and J. O. Fernandes, “Assessment of 4-(5-)methylimidazole in soft drinks and dark beer,” J. Food Compos. Anal., vol. 24, no. 45, pp. 609614, 2011. 등). 이에, 분석 시간보다 전처리 과정(추출 단계 포함)에서 시간이 더 많이 소요되며, 분석하는 시료수가 증가할수록 소요되는 시간은 훨씬 더 증가한다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 시료 내 카라멜 색소의 혼입 여부를 정확하고 편리하게 단시간 내에 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

보다 구체적으로, 시료 내 4-(5)-메틸이미다졸의 함유 여부를 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME) 및 가스크로마토그래피-질량분석법을 이용해 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 4-(5)-메틸이미다졸의 추출과 유도체 변환이 동시에 가능한 방법을 제공하는 것이다.

술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하여 시료 내 카라멜 색소의 혼입을 판별하는 방법을 제공한다:

(S1) 시료에 추출 용매 및 분산 용매와 함께 유도체 변환 시약을 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 실시하는 단계; 및

(S2) 추출 용액에서 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)을 가스크로마토그래피-질량분석기로 분석하는 단계,

상기 추출 용매는 클로로포름, 상기 분산 용매는 아세토니트릴, 그리고 상기 유도체 변환 시약은 이소부틸 클로로포르메이트(isobutyl chloroformate, IBCF)을 사용.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 (S1) 단계에서 추출 용매, 분산 용매, 및 유도체 변환 시약을 동시에 첨가하여 4-(5)-메틸이미다졸의 추출 및 유도체 변환이 동시에 이뤄질 수있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (S1) 단계 전에 내부 표준물질을 시료에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 내부 표준물질은 2-에틸이미다졸(2-ethylimidazole, 2-EI)을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (S1) 단계 전에 유도체 변환 촉매 시약을 시료에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 유도체 변환 촉매 시약은 피리딘을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (S2) 단계에서 4-(5)-메틸이미다졸의 머무름 시간(retention time, min.)은 6 min이고, 이온(ion, m/z)은 182 m/z 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (S2) 단계에서 2-에틸이미다졸의 머무름 시간(retention time, min.)은 8.2 min이고, 이온(ion, m/z)은 196 m/z 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (S1) 단계에서 염을 첨가하지 않을 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 기술한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하여 시료 내 카라멜 색소의 혼입을 판별하는 방법에 관한 것이다:

본 발명자들은 시료, 예컨대 홍삼 제품 내 카라멜 색소의 혼입을 판별하기 위해서, 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME) 및 가스크로마토그래피-질량분석법을 이용하면, 카라멜 색소의 지표 성분인 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)을 정확하고 편리하게 고효율로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 특히, 바람직하게, 추출 용매는 클로로포름, 상기 분산 용매는 아세토니트릴, 그리고 상기 유도체 변환 시약은 이소부틸 클로로포르메이트(isobutyl chloroformate, IBCF) 사용한다. 본 발명에 따르면, 유도체 변환과 동시에 추출이 가능하기 때문에 고효율 및 고정확도로 시료 내 카라멜 색소의 혼입을 판별할 수 있다. 또한, 내부 표준물질을 추출 전에 첨가하였는바, 편의성을 증대시키고 고효율로 검출이 가능한 효과가 있다.

이하, 본 발명에 따른 방법을 단계별로 설명한다:

본 발명은 시료 내 카라멜 색소의 혼입을 판별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, '시료'는 카라멜 색소의 함유 여부가 의심되는 것이면 충분하고, 카라멜 색소가 실제로 포함되었는지는 불문한다. 상기 시료에는 홍삼 제품, 짜장 제품, 간장 제품, 된장 제품 등이 포함된다. 상기 시료는 분산형 액-액 미세추출법에 적용할 수 있도록 사전 처리한 것일 수 있으며, 예를 들어, 액상화한 것을 들 수 있으며, 수용액에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 예를 들어 홍삼 제품을 용해한 뒤에 포스페이트 버퍼를 첨가하여 시료를 준비할 수 있다. 또한, 상기 시료에는 통상의 기술자가 분산형 액-액 미세추출법에 따르기 위해 첨가할 수 있는 다양한 첨가제(예를 들어, 거품방지제)를 첨가할 수 있다.

본 발명에 있어서, '홍삼 제품'은 시료의 주성분이 홍삼인 것으로 인지하고 있는 제품을 의미하는 것으로, 원료명에 홍삼이 기재되어 있으면 본 발명에 따른 제품에 해당하는 것으로 보며, 해당 제품에 카라멜 색소가 포함되었는지 여부는 불문하고, 바람직하게는 홍삼 외 카라멜 색소의 혼입 여부가 의심되는 제품을 의미한다. 홍삼 제품은 분말, 덩어리, 페리스트 또는 액상 등의 특정 제형에 한정하지 않으며, 추출 전에 액화하면 충분하나, 바람직하게 추출 전 시료의 상태는 액상일 수 있다. 상기 제품은 상품화되어 유통되고 있는 것에 한하지 않고, 홍삼을 원료로 하는 물품의 경우에는 모두 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, '홍삼(hongsam, red ginseng)'은 인삼 Panax ginseng C. A. Meyer (두릅나무과 Araliaceae)을 찐 것을 지칭하며, 상기와 동일 학명으로 찌는 공정(steaming)을 거친 인삼은 모두 본 발명에 따른 홍삼에 포함되는 것으로 보고, 인삼의 부위(예를 들어, 껍질의 제거 여부, 줄기, 뿌리 등), 서식지, 재배 혹은 야생, 수확시기 등에 차별을 두지 않는다. 바람직하게, 홍삼은 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)을 함유하지 않는다.

본 발명에 있어서, '카라멜 색소'는 카라멜화 반응에 의해 생성된 색소를 칭하며, 카라멜화 반응은 시료화할 제품을 시료로 하여 추출하기 전 어느 시기에 일어나도 무방하며, 예를 들어, 카라멜화 반응을 이미 종료한 카라멜 색소가 시료화할 제품의 원료 중 하나로 포함될 수도 있고, 시료화할 제품 내에 포함된 원료들 간에 카라멜화 반응이 일어나 시료화할 제품에 생성된 것일 수도 있으며, 제한되지 않는다. 상기 카라멜 색소에는 Ⅰ, Ⅲ, Ⅲ, Ⅳ, 4 종류가 모두 포함될 수 있으며, 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)를 지표 성분으로 포함한다.

(S1) 시료에 추출 용매 및 분산 용매와 함께 유도체 변환 시약을 첨가하고 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 실시하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, '분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)'은 본 발명에서 특별히 기재하지 않는 이상, 본 발명이 속하는 기술분야의 공지된 방법에 따를 수 있으며, 제한하지 않는다.

본 발명에 있어서, '추출 용매'는 물보다 밀도가 크고 추출하고자 하는 물질, 즉 4-MEI의 수용능력이 높아야 하며, 물에 대해 용해도가 낮은 용매가 사용될 수 있으나, 본 발명자들은 다양한 용매를 대상으로 반복적 시험 끝에 클로로포름을 사용하는 것이 가장 고효율 추출이 가능하여 바람직함을 확인하였다(도 1). 더욱 바람직하게, 클로로포름은 시료의 부피 대비 0.02 ~ 0.05 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게 0.02 사용할 수 있다(도 3).

본 발명에 있어서, '분산 용매'는 수용액층과 유기층의 혼합성이 뛰어나고 상기 두 층 사이의 계면장력이 약하며, 추출하고자 하는 물질, 즉 4-MEI를 높은 분산도로 분산시킬 수 있는 용매가 사용될 수 있으나, 본 발명자들은 다양한 용매를 대상으로 반복적 시험 끝에 아세토니트릴을 사용하는 것이 가장 고효율 추출이 가능하여 바람직함을 확인하였다(도 2). 더욱 바람직하게, 아세토니트릴은 시료의 부피 대비 0.04 ~ 0.2 사용할 수 있으며, 더더욱 바람직하게, 0.04, 0.16 ~ 0.2 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게 0.04 사용할 수 있다(도 4).

본 발명에 있어서, '유도체 변환 시약'은 분석하고자 하는 물질이 극성인 경우 가스크로마토그래피 컬럼에 흡착되거나 인젝터에서 분해되어 분석의 재현성을 떨어뜨릴 수 있는바, 이러한 문제를 해결하기 위해, 극성 물질을 유도체 변환을 통해 비극성 물질로 변환시키기 위한 물질을 의미하고, 본 발명에 있어서 4-MEI를 비극성 물질로 변환시키기 위한 물질이 사용될 수 있으나, 가장 바람직하게 이소부틸 클로로포르메이트(isobutyl chloroformate, IBCF)가 사용될 수 있으며, 4-MEI에 IBCF을 주입하면 이소부틸 4-메틸-1H 이미다졸-1-카르복실레이트(Isobutyl 4-methyl-1H imidazole-1-carboxylate)로 전환된다. 바람직하게, 이소부틸 클로로포르메이트는 시료의 부피 대비 0.002 ~ 0.006 사용할 수 있으며, 더더욱 바람직하게, 0.005 ~ 0.006 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게 0.005 사용할 수 있다(도 6).

본 발명에 있어서, 추출 용매(클로로포름) : 분산 용매(아세토니트릴) : 유도체변환시약(이소부틸 클로로포르메이트)의 부피비는 1: 2 ~ 10: 0.22 ~ 0.3인 것이 바람직하고, 더욱 바림직하게 1: 2 ~ 3: 0.22 ~ 0.3이며, 가장 바람직하게 1: 2: 0.25이다.

본 발명에 따르면, 4-MEI의 추출과 동시에 유도체 변환이 하나의 단계에서 가능한바, 추출하는 단계와 유도체 변환하는 단계가 하나의 단계에서 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, '추출 용매' 및 '유도체 변환 시약'은 바람직하게 동시에 주입할 수 있다. 더욱 바람직하게, '추출 용매', '분산 용매' 및 '유도체 변환 시약'은 동시에 주입할 수 있다. 상기 ‘동시에 주입’이라 함은 '추출 용매' 및 '유도체 변환 시약', 추가적으로 '분산 용매'를 한꺼번에 내지 시간 간격을 두지 않고 주입하는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 주입 전 '추출 용매' 및 '유도체 변환 시약', 추가적으로 '분산 용매'를 혼합하여 혼합물 형태로 주입하는 것도 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 분석 단계(S2) 전 (S1) 단계 외에 다른 단계가 추가되지 않을 수 있다. 바람직하게, 역추출(추출 단계 다음에 유기용매인 추출용매에 수용액 첨가하여 역추출하는 과정을 의미함) 단계가 추가되지 않을 수 있다.

바람직하게, 추가로 '유도체 변환 촉매 시약'을 시료에 포함할 수 있으며, 4-MEI와 IBCF의 반응을 촉매하기에 적합한 다양한 시약이 사용될 수 있으나, 바람직하게 피리딘이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 피리딘은 시료의 부피 대비 0.02 ~ 0.04 사용할 수 있으며, 더더욱 바람직하게, 0.02 ~ 0.03 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게 0.02 사용할 수 있다(도 7).

바람직하게, 본 발명에 따른 분산형 액-액 미세추출법을 적용함에 있어서, '내부 표준물질'을 시료에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 내부 표준물질로는 4-MEI와 기능기가 유사하고 가스크로마토그래피-질량분석 결과 피크가 겹치지 않는 화합물이 사용될 수 있으나, 바람직하게 2-에틸이미다졸(2-ethylimidazole, 2-EI)을 내부 표준물질로 사용할 수 있다. 이로써 시료 내 4-MEI 양의 손실을 최소화하고, 4-MEI 을 정량적으로 분석할 수 있다.

본 발명에 있어서, '유도체 변환 촉매 시약'과 '내부 표준물질'은 바람직하게 '추출 용매', '분산 용매', 및 '유도체 변환 시약'을 첨가하기 전에, 시료에 첨가할 수 있으며, '유도체 변환 촉매 시약'과 '내부 표준물질'의 첨가 순서는 무관하며 동시에 첨가할 수도 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 분산형 액-액 미세추출법을 적용함에 있어서, 당업계 공지된 다양한 화합물을 선택적으로 첨가하여 사용할 수 있으나, 바람직하게 염은 첨가하지 않을 수 있다.

본 발명에 있어서, '추출 용매', '분산 용매', 및 '유도체 변환 시약', 그리고 (S1) 단계에서 첨가될 수 있는 그 외의 물질들을 시료에 첨가하고 쉐이킹(shaking) 및 원심분리하는 공정을 거칠 수 있으며, 본 공정은 1회 이상 반복할 수 있다.

(S2) 추출 용액에서 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)을 가스크로마토그래피-질량분석기로 분석하는 단계를 포함한다.

추출 용액 내 4-MEI를 분석하기 위해, 바람직하게 가스크로마토그래피-질량분석을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, 가스크로마토그래피에 장착된 모세분리관의 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 분리된 성분들은 머무름 시간의 차이를 두고 질량분석기로 도입된다. 도입된 시료는 이온화 장치에 의하여 분석물질들이 이온화된다.

본 발명에 따른 4-MEI 및 내부 표준물질인 2-EI의 머무름 시간(retention time, min.) 및 이온(ion, m/z)은 각각 다음과 같다:

4-MEI의 머무름 시간은 6 min이고, 이온(ion, m/z)은 182 m/z

2-EI의 머무름 시간은 8.2 min이고, 이온(ion, m/z)은 196 m/z.

또 다른 양태로, 본 발명에 따른 방법을 적용할 수 있는 키트를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 키트에는 분산형 액-액 미세추출법을 적용할 수 있는 도구 및 시료에서 카라멜 색소의 혼입 여부를 4-MEI를 검출해 판별할 수 있는 방법에 대해 기술하는 지침서가 포함될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 키트는 추출 용매로서 클로로포름, 분산 용매로서 아세토니트릴, 그리고 유도체 변환 시약으로서 이소부틸 클로로포르메이트(isobutyl chloroformate, IBCF)을 포함하고, 시료에서 4-MEI가 검출되면 카라멜 색소가 혼입되어 있는 것으로 판별함을 기술하고 있는 지침서가 포함될 수 있다.

추가적으로, 상기 지침서에는 본 발명에 따른 방법을 통상의 기술자가 적용하기 위해 필요한 사항들(예를 들어, 추출 용매의 양, 분산 용매의 양, 유도체 변환 시약의 양, 4-MEI 머무름 시간, 이온 등)이 기재되어 있을 수 있다.

본 발명에 따르면, 시료 내 4-(5)-메틸이미다졸의 함유 여부를 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME) 및 가스크로마토그래피-질량분석법을 이용해 높은 민감도로 검출할 수 있으며, 이로써 시료 내 카라멜 색소의 혼입 여부를 정확하고 편리하게 판별할 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면, 우수한 직선성(linearity), 정확성, 검출한계 면에서 우수한 효과를 얻을 수 있다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니된다.
도 1은 추출 용매에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건: 추출 용매 100 μL, methanol 200 μL, IBCF 10 μL, pyridine 100 μL, pH 7.6)
도 2는 분산 용매에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건: 분산 용매 200 μL, chloroform 100 μL, IBCF 10 μL, pyridine 100 μL, pH 7.6)
도 3은 추출 용매의 추출 용매의 부피에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건: 추출 용매 = chloroform, acetonitrile 200 μL, IBCF 10 μL, pyridine 100 μL, pH 7.6)
도 4는 분산 용매의 부피에 따른 추출 효율 비교한 그래프이다. (추출 조건: 분산 용매 = acetonitrile, chloroform 100 μL, IBCF 10 μL, pyridine 100 μL, pH 7.6)
도 5는 4-MEI의 유도체 변환 화학식을 나타낸 것이다.
도 6은 유도체 변환 시약 (IBCF)의 부피에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건 : chloroform 100 μL, acetonitrile 200 μL, pyridine 100 μL, pH 7.6)
도 7은 유도체 변환 촉매제 (pyridine)의 부피에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건 : chloroform 100 μL, acetonitrile 200 μL, IBCF 10 μL, pH 7.6)
도 8은 시료의 pH에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건 : chloroform 100 μL, acetonitrile 200 μL, pyridine 100 μL, IBCF 25 μL)
도 9는 시료의 염 농도에 따른 추출 효율을 비교한 그래프이다. (추출 조건 : chloroform 100 μL, acetonitrile 200 μL, pyridine 100 μL, pH 7.6, IBCF 25 μL)
도 10은 4-Methylimidazole(4-MEI) 표준용액 (200 μg L-1)의 GC-MS 크로마토그램과 4-MEI와 2-ethylimidazole (IS, 2-EI)의 질량 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 11은 홍삼농축액 (5% 카라멜 색소 (ES 식품원료))의 GC-MS 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 12는 홍삼음료 (시료 1)의 GC-MS 크로마토그램을 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제조예와 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 제조예와 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 제조예와 실시예들에 한정되는 것으로 해석돼서는 안 된다. 본 발명의 제조예와 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

1. 실험재료

(1) 홍삼 농축액, 홍삼 음료 및 카라멜 색소 시료

홍삼 농축액 및 음료 시료는 시중 마트에서 구입하였다. 카라멜 색소는 Class III (E150c)를 ES 식품원료와 천우식품으로부터 구입하였다. 각각의 시료는 제품에 표기된 보관방법에 따라 상온 또는 냉장 보관하였다.

(2) 시약 및 표준물질

4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole (4-MEI)), 2-에틸이미다졸(2-ethylimidazole (2-EI)), 이소부틸 클로로포르메이트(isobutyl chloroformate (IBCF)), 피리딘(pyridine), 소듐 포스페이트 모노베이직(sodium phosphate monobasic), 소듐 포스페이트 디베이직 및 거품방지제(antifoam) Y-30(sodium phosphate dibasic and antifoam Y-30 emulsion) 은 SigmaAldrich (St. Louis, MO, USA) 로부터 구입하였다. HPLC 등급의 테트라클로로에틸렌(tetrachloroethylene), 클로로벤젠(chlorobenzene) 은 Junsei (Tokyo, Japan) 로부터 구입하였다. HPLC 등급의 아세토니트릴(acetonitrile (ACN)), 메탄올(methanol), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone)은 J.T. Baker (Deventer, Netherlands) 로부터 구입하였다. 2차 증류수는 Milli-Q water purification system (Millipore, Billerica, MA, USA) 으로 획득하였다.

4-MEI (표준 물질)의 stock solution (1 g L^- ¹)과 2-EI (내부 표준 물질)의 working solution (10 mg L^- ¹)은 0.1 M HCl에 준비되었다. 4-MEI의 working standard soluton은 4-MEI의 stock solution을 0.1 M HCl로 희석하여 5개의 농도 (4, 10, 40, 200, 400, 1000 mg L^- ¹)로 준비하였다.

2. 실험방법

(1) 홍삼 농축액과 홍삼 용액의 Dispersive liquid-liquid microextraction ( DLLME ) 방법

홍삼 농축액은 5 g에 10 g L^-1의 거품방지제(antifoam) Y-30 용액 1 mL를 첨가한 뒤, 2차 증류수로 100 mL로 정용하였다. 그 후, 상온에서 5분간 소니케이션(sonication)하여 홍삼 농축액을 완전히 용해시켰다.

10 mL 코니칼 글래스 튜브(conical glass tube)에 홍삼 농축액 용액 2 mL 또는 홍삼 음료 2 mL, 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer) 용액 (0.5 M, pH 7.6) 2 mL, 2차 증류수 1 mL (총 5 mL)를 넣었다. 10 mg L^-1 2-EI 내부 표준물질 100 μL, 피리딘(Pyridine) 100 μL를 첨가한 뒤, 유리 재질의 시린지(Syringe)를 이용하여 200 μL ACN (분산 용매), 100 μL 클로로포름(chloroform) (추출 용매), 그리고 IBCF 25 μL (유도체 변환 시약) 혼합 용액을 빠르게 주입하였다. 그 후, 2초간 흔들었다. 이 용액은 2,500 rpm에서 3분간 원심분리 후, 하층액 (sediment phase)의 클로로포름(chloroform) 추출용액 약 70 ~ 80 μL를 유리 시린지를 이용하여 취하고, 250 μL 인서트 바이알(insert vial)에 옮긴 뒤 GC-MS로 분석하였다. 이 방법은 모두 3반복 되었다.

(2) 4- MEI 분석을 위한 유효성 검증

Relative calibration curve (검량 곡선)은 4-MEI stock solution을 사용하여 샘플과 같은 방법으로 유도체 변환 및 추출하여 얻었다. 회수율 실험은 홍삼 농축액과 홍삼 음료 샘플에 4-MEI (표준 물질) 40, 100, 200 mg L^- ¹을 첨가하여 측정하였다. 4-MEI에 대한 GC-MS 기기분석을 위해서 4-1000 mg L^-1표준용액의 직선성을 확인한다. 그리고 정밀성 검증을 위해서, 추출 후 얻은 4-MEI 표준물질의 시험용액은 Inter-day (1일 1구간, 3일간)와 intra-day (1일, 3 구간)으로 6반복하여 측정되었다.

(3) 가스 크로마토그래피-질량 분석(Gas chromatography-mass spectrometry ( GC -MS)) 기기 분석 조건

기기분석을 위해 Agilent 7890 gas chromatograph와 5975c mass selective detector (Agilent Technoligies, Palo Alto, CA)를 사용하였으며, 추출된 물질들은 DB-WAX column(30 m × 0.25mm i.d., 0.25 μm film thickness, Agilent Technologies)에서 분리되었다. 시료 주입을 위한 인젝터(injector)의 온도는 200℃ 이며, 헬륨 가스의 유속은 1.0 mL min^-1, 그리고 Splitless mode로 분석되었다. Oven programming은 100℃에서 190℃까지 10℃ min^-1의 속도로 상승시킨 후, 15℃ min^-1의 속도로 220℃까지 다시 상승시키고 25분간 유지하였다. MS의 transfer line, MSD source, quadrupole 온도는 각각 225℃, 230℃, 150℃로 설정되었으며, mass spectrum은 SIM (Selected ion monitoring) mode로 기록되었다. 4-MEI는 6분부터 m/z 182, 82, 81로, 2-EI는 8.2분부터 m/z 196, 96, 95의 이온이 모니터링 되었다. m/z 182, 196 은 각각 4-MEI와 2-EI의 정량 분석을 위한 타겟 이온(Target ion)으로 사용되었으며, 각 물질에서 3가지 이온의 비율을 각 표준 물질에서 이온의 비율과 비교하여 정성 분석하였다.

각 데이터는 one-way ANOVA 분석 후, Duncan's multiple range test를 통해 P < 0.05의 범위에서 유의성을 분석하였다. 통계 분석을 위한 프로그램은 SigmaPlot v12.5 (Systat Software, Chicago, IL, USA)를 사용하였다.

3. 실험결과

3-1. DLLME 추출조건 테스트

DLLME 추출법의 추출 효율에 영향을 주는 여러 요소들을 변화시켜 보았다.

최적화된 변수는 추출 용매 (extraction solvent), 분산 용매 (dispersive solvent)의 종류 및 부피, 그리고 시료의 pH 및 NaCl 농도였다. 또한, 유도체 변환 효율을 최대화시키기 위해, 유도체 변환 시약 (derivatizing agent)으로 사용된 IBCF의 부피, 유도체 변환 촉매 시약으로 사용된 피리딘(pyridine)의 부피에 대한 최적화를 수행하였다.

(1) 추출 용매 선택

추출 용매의 선택을 위해, 3가지 추출용매 (chloroform (CHCl₃), chlorobenzene (C₆H₅Cl) , tetrachloroethylene (CH₂Cl₄))를 사용하여, 추출 효율을 비교하였다. 그 결과, 클로로포름(chloroform)을 사용하였을 때, 4-MEI의 peak area가 클로로벤젠(chlorobenzene), 테트라클로로에틸렌(tetrachloroethylene)을 사용하였을 때에 비해 유의적으로 상승하였다 (p < 0.05) (도 1).

(2) 분산 용매 선택

분산 용매의 선택을 위해, 3가지 분산용매 (methanol (CH₃OH), acetonitrile (CH₃CN), acetone (C₃H₆O))를 사용하여, 추출 효율을 비교하였다. 그 결과, 3가지 분산용매에 대한 4-MEI의 추출 효율에 유의적인 차이가 없었다 (p < 0.05). 하지만, 정밀도를 상대 표준편차 (relative standard deviation, RSD (%))를 통해 비교하였을 때, 메탄올(methanol), 아세톤(acetone) (21.0%, 11.5%)에 비해 아세토니트릴(acetonitrile) (8.7%)의 RSD 값이 낮았다. 따라서, 추출의 안정성을 고려하여 아세토니트릴(acetonitrile)을 분산 용매로 선택하였다(도 2).

(3) 추출 용매 부피 조절

추출 용매의 부피를 조절하기 위해, 100, 150, 200, 250 μL의 클로로포름(chloroform)에 대한 추출 효율을 측정하였다. 그 결과, 추출 용매 100 μL에 대한 4-MEI의 peak area가 유의적으로 가장 높았다 (p < 0.05). 따라서, 추출 용매 클로로포름(chloroform)의 부피는 100 μL로 최적화되었다 (도 3)

(4) 분산 용매 부피 조절

분산 용매의 부피를 조절하기 위해, 200, 400, 600, 800, 1000 μL의 아세토니트릴(acetonitrile)에 대한 추출 효율을 측정하였다. 그 결과, 각 부피에서의 peak area 값은 유의적 차이를 나타내지 않았다 (p < 0.05). 따라서, 용매의 사용량을 줄이기 위해, 가장 낮은 부피인 아세토니트릴(acetonitrile) 200 μL로 최적화되었다 (도 4).

(5) 유도체 변환 시약 부피 조절

4-MEI 같은 극성 물질을 가스크로마토그래피(GC)로 분석하게 되면, 컬럼에 흡착되거나 인젝터에서 분해되어 분석의 재현성을 떨어뜨리는 문제가 있었다. 극성 물질을 유도체 변환을 통해 비극성 물질로 변환시킴으로써 해결할 수 있음에 착안해, 4-MEI를 IBCF를 이용하여, 이소부틸 4-메틸-1H 이미다졸-1-카르복실레이트(Isobutyl 4-methyl-1H imidazole-1-carboxylate)로 유도체 변환시킨 후 분석하였다(도 5). 유도체 변환 시약 (IBCF)의 부피 최적화를 위해, 10, 15, 20, 25, 30 μL의 IBCF에 대한 4-MEI와 2-EI (내부 표준 물질)의 유도체 변환 효율을 비교하였다. 그 결과, 각 부피에 대한 4-MEI의 추출 효율은 유의적 차이가 없었지만, 2-EI의 peak area가 25 μL에서 유의적으로 상승하였다 (p < 0.05). 따라서, IBCF의 부피는 25 μL로 최적화되었다 (도 6).

(6) 피리딘 부피 조절

피리딘은 유도체 변환 반응을 촉매하는데 사용하였다. 유도체 변환의 촉매제인 피리딘의 부피 최적화를 위해, 100, 150, 200 μL의 피리딘에 대한 유도체 변환 효율을 비교하였다. 그 결과, 200 μL에서 peak area가 유의적으로 감소하였으며, 100, 150 μL에 대한 peak area는 유의적 차이가 없었다 (p < 0.05). 따라서, 시약의 사용량을 줄이기 위해 100 μL로 최적화되었다 (도 7).

(7) 시료의 pH 및 염의 첨가 조절

pH 최적화를 위해 pH 7.6, 8, 9, 10에 대한 peak area를 비교하였다. 그 결과, 각 pH에서의 peak area는 유의적 차이를 나타내지 않았다 (p < 0.05). 따라서, 기존 추출 조건인 pH 7.6 으로 최적화되었다 (도 8).

염의 첨가는 추출 효율에 대한 중요한 변수이며, 수용액에서의 분석물질의 용해도를 증가 또는 감소시킴으로써, 유기용매로의 추출 효율에 영향을 끼쳤다. 따라서, 0, 3, 6, 9, 12%의 NaCl에 대한 4-MEI의 추출 효율을 측정하였다. 그 결과, NaCl 농도가 증가함에 따라 peak area가 감소하였다 (도 9). 따라서, 추출 효율 최대화를 위해 염을 첨가하지 않았다.

(8) 소결

결론적으로, 추출 용매와 분산 용매의 종류는 각각 클로로포름(chloroform)과 아세토니트릴(acetonitrile)로 선택되었으며, 추출 용매와 분산 용매의 부피는 각각 100 μL, 200 μL로 최적화되었다. 그리고, 유도체 변환 시약으로 사용된 IBCF의 부피는 25 μL, 유도체 변환 촉매제로 사용된 피리딘의 부피는 100 μL, 시료의 pH는 7.6, 그리고 염 농도는 0%로 최적화되었다.

3-2. 4- MEI 분석을 위한 유효성 검증

홍삼 농축액 및 음료 중의 4-MEI를 GC-MS로 분석하는 방법을 확립하였다.

표 1은 홍삼 농축액 및 음료에 4-MEI를 첨가하고 추출하여 얻은 회수율을 기재하였다. 홍삼 농축액에 4-MEI 표준용액 40, 100, 200 ㎍ L^-1를 첨가하여 얻은 회수율은 각각 89.86±8.01%, 97.83±2.59%, 100.58±3.17%로 나타났다. 그리고, 홍삼 음료에 4-MEI 표준용액 40, 100, 200 ㎍ L^-1를 첨가하여 얻은 회수율은 109.09±4.80%, 107.14±2.72%, 101.26±2.45%로 정확도가 매우 높았다.

4-1000 μg L^-1범위에서 R²값이 0.9996으로 좋은 직선성을 보였다 (표 2). RSD (relative standard deviation)에 의한 정밀성 결과는 2.7-6.7 %로 나타났다. 검출 한계 (Limit of detection, LOD), 정량 한계 (limit of quantification, LOQ)는 각각 0.96 ㎍ L^- ¹와 5.79 ㎍ L^-1였다. 이 회수율 결과는 40 μg L^-1, 100 μg L^-1, 1000 μg L^-1농도에 대해 CODEX에서 지정한 범위(80-110%)에 인정되었다. 도 10은 GC-MS를 사용하여 4-MEI 표준용액을 검출한 크로마토그램을 도시한 것이다.

^a미검출(not detected) ; ^b 표준편차(standard deviation).

^a1일간 6회 반복(6 replicates within 1 day); ^b3일간 6회 반복(6 replicates within 3 days, 1일간 2회 반복((2 replicates per day))

4. 홍삼 농축액과 음료에서의 4- MEI 분석

(1) 홍삼 농축액에서의 4- MEI 분석

최적화 및 유효성 검증된 분석법을 통해, 홍삼 농축액의 4-MEI를 정량 분석하였다.

홍삼 농축액 시료에 카라멜 색소 (Type III) ('ES 식품원료')를 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30%의 농도로 첨가한 뒤, 4-MEI의 함량을 분석하였다. (단, 홍삼 농축액 시료에는 4-MEI가 포함되어 있지 않은 것으로 전제한다.)

그 결과, 'ES 식품원료'의 카라멜 색소를 첨가한 경우(하기 표 3의 시료 1), 1% 카라멜 색소를 첨가하였을 때 4-MEI가 미량 검출되었으며, 2 ~ 5% 의 카라멜 색소를 첨가하였을 때 25.5 ~ 66.0 μg kg^-1의 4-MEI가 검출되었다. 또한, 카라멜 색소의 함량이 증가할수록, 4-MEI의 함량이 직선성을 나타내며 증가하였다 (표 3). 도 11은 ES 식품원료의 카라멜 색소를 5% 첨가한 시료의 GC-MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.

^a 'ES 식품 원료의 카라멜 색소 함유 홍삼 농축액'; ^c 정량 불가 (below LOQ and above LOD)

(2) 홍삼 음료에서의 4- MEI 분석

5개의 홍삼 음료 시료에서 4-MEI를 정량 분석한 결과, 성분 표기 레이블에서 카라멜 색소가 표기된 시료 1, 4, 5번의 경우 4-MEI가 42.91 ~ 2863.4 μg L-1 의 범위에서 정량 분석되었다. 또한, 카라멜 색소가 표기되지 않은 시료 2, 3번의 경우 4-MEI가 검출되지 않았다 (표 4). 도 12는 시료 1의 GC-MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.

Claims

하기의 단계를 포함하여 시료 내 카라멜 색소의 혼입을 판별하는 방법:
(S1) 시료에 추출 용매 및 분산 용매와 함께 유도체 변환 시약을 동시에 첨가하여 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)의 추출 및 유도체 변환이 동시에 이뤄지는 것을 특징으로 하는 분산형 액-액 미세추출법(Dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)을 실시하는 단계; 및
(S2) 추출 용액에서 4-(5)-메틸이미다졸(4-(5)-methylimidazole, 4-MEI)을 가스크로마토그래피-질량분석기로 분석하는 단계,
상기 추출 용매는 클로로포름, 상기 분산 용매는 아세토니트릴, 그리고 상기 유도체 변환 시약은 이소부틸 클로로포르메이트(isobutyl chloroformate, IBCF)을 사용.
제1항에 있어서, 상기 시료는 홍삼 제품인 것을 특징으로 하는, 방법.
삭제
제1항에 있어서, (S1) 단계 전에 내부 표준물질을 시료에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 내부 표준물질은 2-에틸이미다졸(2-ethylimidazole, 2-EI)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, (S1) 단계 전에 유도체 변환 촉매 시약을 시료에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 유도체 변환 촉매 시약은 피리딘을 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, (S2) 단계에서 4-(5)-메틸이미다졸의 머무름 시간(retention time, min.)은 6 min이고, 이온(ion, m/z)은 182 m /z 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제4항에 있어서, (S2) 단계에서 2-에틸이미다졸의 머무름 시간(retention time, min.)은 8.2 min이고, 이온(ion, m/z)은 196 m/z 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, (S1) 단계에서 염을 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.