CN105954434B - 一种酚类香料的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酚类香料的检测方法，包括以下步骤：S1)将待测样品用萃取溶剂进行萃取，得到待测样品液；S2)将所述待测样品液经超高效液相色谱‑串联质谱进行检测，得到待测样品的色谱数据与质谱数据，根据酚类香料的标准曲线与质谱数据，得到待测样品中酚类香料的种类及含量；所述超高效液相色谱的流动相为水与甲醇；流动相洗脱为梯度洗脱。与现有技术相比，本发明采用超高效液相色谱‑串联质谱法进行检测，通过梯度洗脱可将待测样品液中不同的酚类香料分离，并从二级质谱层面上也进行了定性和定量分析，有效排除干扰物的影响，提高了分析方法的选择性和准确性。

Description

一种酚类香料的检测方法

技术领域

本发明属于香料添加剂理化检验技术领域，尤其涉及一种酚类香料的检测方法。

背景技术

丁香酚，具有抗菌、降血压的作用，由于其强烈的丁香香气，常用于香水香精以及各种化妆品香精和皂用香精配方中，还可以用于食用香精的调配。作为我国规定允许使用的食用香料，被广泛应用于肉类、胶姆糖、调味品、烘烤食品、糖果、饮品等各种领域，同时丁香酚亦可用作杀虫剂和防腐剂。

麝香草酚具有百里香油似的辛香和草香香气，因此被广泛应用于止咳糖、漱口水和胶姆糖中，同时具有很强的杀菌、杀螨作用，可以用于治疗气管炎、百日咳等，也可以有效控制蜂螨。我国《食品添加剂使用卫生标准》规定，麝香草酚可按生产需要适量用于配制食品香精，同时FEMA中明确规定了麝香草酚在各类食品中的最高限量。

浓馥香兰素可作为香兰素的代用品，有浓烈的奶香气息，香气强度比香兰素可提高1倍，使用中具有用量少的优点，因此被广泛应用于巧克力、坚果、香草兰、奶油司考奇、朗姆、焦糖等调和香料中。但大剂量摄入会导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝、肾等功能。

4-乙基愈创木酚是一种相对安全无毒、用途广、效果好、用量极少的理想食品添加剂，是烟草、食品、饮料、肉制品、海鲜、香精、果酒、日用化妆品等良好的香甜味增效剂，对食品的香味改善和增强具有显著效果，对甜食起着增甜作用，且具有抗菌、防腐性能，能延长食品储存期。但过量食入对人体肝脏产生危害，同时诱发骨骼和关节提前脆变癌变等疾病，对人体有较大的危害。

由于丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚各自特有的香气，均可用于卷烟配方中，以改善卷烟的香气和吸食品质，但同时又都对人体健康具有一定的危害作用，因此FEMA中也规定了其在各个领域中的最高限用量和最大允许残留量。因此，建立简单、快速、灵敏的测定这些酚类物质的分析方法对烟用添加剂的质量控制具有重要意义。

目前，国内外测定这四中物质中的某一种或两种成分的研究报道较为常见，尚未有关于同时快速检测这四种物质的方法报道。报道中提到的主要检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等，但这些方法都有一定的局限性，由于烟用香料的成分较为复杂，气相色谱和高效液相色谱的选择性和特异性差，在实际应用中，容易产生前处理效果不理想，基体干扰大、定性困难等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酚类香料的检测方法，该检测方法可同时检测烟用添加剂中的酚类香料且灵敏度较高。

本发明提供了一种酚类香料的检测方法，包括以下步骤：

S1)将待测样品用萃取溶剂进行萃取，得到待测样品液；

S2)将所述待测样品液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到待测样品的色谱数据与质谱数据，根据酚类香料的标准曲线与质谱数据，得到待测样品中酚类香料的种类及含量；

所述超高效液相色谱的流动相为水与甲醇；流动相洗脱为梯度洗脱。

优选的，所述萃取溶剂为甲醇水溶液。

优选的，所述超高效液相色谱中的色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈。

优选的，所述梯度洗脱的程序为：以水作为A相，以甲醇作为B相，0～1min，35％～45％A；2～5min，65％～75％A；6～10min，35％～45％A。

优选的，所述超高效液相色谱中待测样品液的流速为0.1～0.5ml/min。

优选的，所述超高效液相色谱的柱温为20℃～40℃。

优选的，所述质谱的检测为负离子扫描模式，多重反应监测模式检测。

优选的，所述质谱的检测条件：毛细管电压为3000～5000V；干燥气体流速度为6～10min/L；干燥气体温度为320℃～360℃；雾化器压力为30～50psi。

优选的，所述酚类香料的标准曲线按照以下方法建立：

将酚类香料标准工作溶液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到酚类香料的色谱数据与质谱数据；

按照外标法以酚类香料的色谱数据的色谱峰面积对酚类香料标准工作溶液的浓度进行回归分析，得到酚类香料的标准曲线。

优选的，所述酚类香料为丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素与4-乙基愈创木酚中的一种或多种。

本发明提供了一种酚类香料的检测方法，包括以下步骤：S1)将待测样品用萃取溶剂进行萃取，得到待测样品液；S2)将所述待测样品液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到待测样品的色谱数据与质谱数据，根据酚类香料的标准曲线与质谱数据，得到待测样品中酚类香料的种类及含量；所述超高效液相色谱的流动相为水与甲醇；流动相洗脱为梯度洗脱。与现有技术相比，本发明采用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测，通过梯度洗脱可将待测样品液中不同的酚类香料分离，并从二级质谱层面上也进行了定性和定量分析，有效排除干扰物的影响，提高了分析方法的选择性和准确性。

由实验可知，采用本发明检测方法，丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的检出限分别为6.8ng/mL、7.5ng/mL、8.9ng/mL、6.6ng/mL，在20～1000ng/mL范围内线性良好(相关系数0.9992以上)，回收率在91.2％～106.4％之间，相对标准偏差均小于8％。

附图说明

图1为本发明实施例1中的检测方法的流程示意图；

图2为本发明实施例1中的丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚标准品总离子流(TIC)图谱；

图3为本发明实施例1中的丁香酚的超高效液相色谱-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图；

图4为本发明实施例1中的麝香草酚的超高效液相色-谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图；

图5为本发明实施例1中的浓馥香兰素的超高效液相色-谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图；

图6为4-乙基愈创木酚的超高效液相色-谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种酚类香料的检测方法，包括以下步骤：S1)将待测样品用萃取溶剂进行萃取，得到待测样品液；S2)将所述待测样品液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到待测样品的色谱数据与质谱数据，根据酚类香料的标准曲线与质谱数据，得到待测样品中酚类香料的种类及含量；所述超高效液相色谱的流动相为水与甲醇；流动相洗脱为梯度洗脱。

本发明采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，超高效液相色谱提高了色谱的分离效率，串联质谱提高了检测的准确性和灵敏度，方法选择性和特异性好，适用于低浓度样品的定性定量分析。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

将待测样品用萃取溶剂进行萃取；其中，所述待测样品为本领域技术人员熟知的含有酚类香料的待测样品即可，并无特殊的限制，本发明中优选为烟用添加剂；所述萃取溶剂为本领域技术人员熟知的萃取溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选为(20～40)：(80～60)，更优选为(25～35)：(75～55)，再优选为30：70。所述萃取优选按照以下方法进行：将待测样品与萃取溶剂混合，密封，振荡萃取；所述萃取的时间优选为20～60min，更优选为20～50min，再优选为30～40min，最优选为30min。萃取后优选经滤膜进行纯化，得到待测样品液；所述滤膜的孔径优选为0.22μm或0.45μm。将所述待测样品液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到待测样品的色谱数据与质谱数据。

其中所述超高效液相色谱的色谱柱优选为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈；所述色谱柱的规格优选为2.1×100mm，1.8μm。所述超高效液相色谱的流动相为水与甲醇；所述流动相洗脱为梯度洗脱；以体积百分数计，所述梯度洗脱的程序优选为：以水作为A相，以甲醇作为B相，0～1min，35％～45％A；2～5min，65％～75％A；6～10min，35％～45％A；更优选为：以水作为A相，以甲醇作为B相，0～1min，36％～42％A；2～5min，66％～72％A；6～10min，36％～42％A；再优选为：以水作为A相，以甲醇作为B相，0～1min，38％～42％A；2～5min，68％～72％A；6～10min，38％～42％A；最优选为：以水作为A相，以甲醇作为B相，0～1min，40％A；2～5min，70％A；6～10min，40％A；所述超高效液相色谱中待测样品液的流速优选为0.1～0.5ml/min，更优选为0.2～0.5ml/min，再优选为0.2～0.4ml/min，最优选为0.3ml/min；所述超高效液相色谱的柱温优选为20℃～40℃，更优选为25℃～35℃，再优选为30℃～35℃，最优选为30℃；所述超高效液相色谱检测时待测样品液的进样量优选为5～20μl，更优选为10～15μl，最优选为10μl。

本发明中超高效液相色谱串联质谱进行检测，所述质谱优选为四级杆质谱；所述质谱优选为电喷雾电离源；所述质谱的检测优选为负离子扫描模式，多重反应监测模式(MRM)检测；本发明串联四级杆质谱的多反应检测扫描模式，具有同时监测母离子和子离子的特点，可实现特定离子对的有效监测。所述质谱的检测条件优选为：毛细管电压为3000～4000V；干燥气体流速度为6～10min/L；干燥气体温度为320℃～360℃；雾化器压力为30～50psi。其中，所述质谱的毛细管电压更优选为3500～4000V，再优选为4000V；质谱检测中，干燥气、雾化气和碰撞气均优选为高纯氮气；干燥气体流速度优选为6～10min/L，更优选为7～9min/L，再优选为8min/L；所述干燥气体的温度优选为320℃～360℃，更优选为330℃～360℃，再优选为330℃～350℃，最优选为340℃；所述雾化器压力优选为30～50psi，更优选为35～45psi，再优选为40psi。

将色谱数据与质谱数据，比对酚类香料的标准曲线与质谱数据，得到待测样品中酚类香料的种类及含量。

其中，所述酚类香料的标准曲线优选按照以下方法建立：将酚类香料标准工作溶液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到酚类香料的色谱数据与质谱数据；按照外标法以酚类香料的色谱数据的色谱峰面积对酚类香料标准工作溶液的浓度进行回归分析，得到酚类香料的标准曲线。

将酚类香料标准工作溶液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到酚类香料的色谱数据与质谱数据；其中，本发明中的酚类香料优选为丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素与4-乙基愈创木酚中的一种或多种；所述酚类香料标准工作溶液的浓度优选为20～1500ng/mL；所述经超高效液相色谱-串联质谱的超高效液相色谱条件与质谱条件均同上所述，在此不再赘述。

按照外标法以酚类香料的色谱数据的色谱峰面积对酚类香料标准工作溶液的浓度进行回归分析，得到酚类香料的标准曲线。

将待测样品的色谱数据中的色谱峰面积带入标准曲线，即可得到待测样品中酚类香料的含量，计算公式如下：

X：待测样品中酚类香料的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c：由标准工作曲线得到的酚类香料的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V：试样萃取液体积，单位为毫升(mL)；

m：待测样品的质量，单位为克(g)。

本发明采用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测，通过梯度洗脱可将待测样品液中不同的酚类香料分离，并从二级质谱层面上也进行了定性和定量分析，有效排除干扰物的影响，提高了分析方法的选择性和准确性；另外采用超高效液相色谱-串联质谱法不仅可同时测定烟用添加剂中不同酚类香料的含量，而且速度快，6min内即可完全检出目标峰，相比于现有的技术方法，本发明提供的检测方法在对烟用添加剂中酚类香料的筛查与定量分析上具有明显的优势，更有效，更实用。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种酚类香料的检测方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1标准工作曲线绘制及结果计算。

1.1材料

主要仪器

美国Agilent 6410三重串联四级杆质谱仪，配备电喷雾离子源(ESI)和Masshunter分析软件；美国Agilent 1290infinity超高效液相色谱仪；Milli-Q超纯水仪；Parker氮气发生器；AB204-S型电子分析天平。

试剂与材料

超纯水；甲醇(色谱纯，Fisher Scientific)；丁香酚(色谱纯，J&KCHEMICAL.LTD)；麝香草酚(色谱纯，TCI梯希爱上海化成工业发展有限公司)；浓馥香兰素(色谱纯，TCI梯希爱上海化成工业发展有限公司)；4-乙基愈创木酚(色谱纯，ACROS ORGANICS.LTD)。

1.2待测样品溶液的制备

精密称取0.5g烟用添加剂，置于具塞锥形瓶中，加入50mL萃取溶剂，密塞，振荡萃取30min后，过0.22μm滤膜纯化后，放入色谱进样瓶中。所用的萃取溶剂为甲醇-水溶液(体积比30：70)。

1.3标准工作溶液的配制

分别称取0.020g丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚，用甲醇-水(体积比30：70)溶剂溶解并定溶至100mL，配制成200μg/mL丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的混合储备液，移取0.5mL混合储备液，用甲醇-水(体积比30：70)溶剂溶解并定容至50mL容量瓶，得2000ng/mL混合使用液。准确移取不同体积的混合使用液，稀释成浓度为20～1500ng/mL的标准工作溶液。

1.4液相色谱分离条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C₁₈(2.1mm×100mm，1.8μm)；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；

流动相A：水，流动相B：甲醇；

梯度洗脱程序见表1。

表1梯度洗脱程序

1.5质谱检测条件

电喷雾离子化电离源，负离子模式多反应监测扫描(MRM)，毛细管电压4000V，干燥气、雾化气和碰撞气均为高纯氮气，干燥气体流速度8min/L，干燥气体温度340℃，雾化器压力40psi。丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的MRM参数见表2。

表2丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的MRM参数

1.6标准工作曲线绘制及结果计算

分别取标准工作溶液进行分析，按外标法以丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。取最低浓度工作标准溶液，做10次平行试验，计算标准偏差，3倍标准偏差为检出限，10倍标准偏差为定量限，结果如表3所示。

表3丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的标准曲线及检出限

将相同条件下测得待测样品溶液的丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的色谱峰面积，代入所绘制的标准曲线，得到样品中丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚含量，计算公式如下：

X：试样中香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

c：由标准工作曲线得到的香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V：试样萃取液体积，单位为毫升(mL)；

M：试样的质量，单位为克(g)。

其中，图1为实施例1中的检测方法的流程示意图。

图2为丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚标准品总离子流(TIC)图谱。

图3为丁香酚的超高效液相色谱-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图。

图4为麝香草酚的超高效液相色-谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图。

图5为浓馥香兰素的超高效液相色-谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图。

图6为4-乙基愈创木酚的超高效液相色-谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)色谱图。

由图3～图6可知，丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚的相对保留时间分别为3.90min、5.07min、4.76min、3.73min。

实施例2

测定烟用添加剂中B10、B20和B30中丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚含量。

分别精密称取0.5g烟用添加剂B10、B20和B30，按照实施例1中待测样品溶液制备、色谱分析条件、质谱检测条件以及样品含量计算方式进行检测，检测结果见表4。

表4烟用添加剂B10、B20和B30中4种物质检测结果

实施例3

本实例对本发明方法的准确度性和精密度进行检测。

方法的准确度、精密度分别用回收率和相对标准偏差衡量。对同一样品在相同条件下，取样6次，并根据测定结果的平均值计算丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素和4-乙基愈创木酚物质的相对标准偏差(RSD％)；对样品分别添加高、中、低3个水平的标准溶液，进行加标回收率实验，结果详见表5。

表5 4种物质的回收率与相对标准偏差

Claims (7)

1.一种酚类香料的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1）将待测样品用萃取溶剂进行萃取，得到待测样品液；

S2）将所述待测样品液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到待测样品的色谱数据与质谱数据，根据酚类香料的标准曲线与质谱数据，得到待测样品中酚类香料的种类及含量；

所述超高效液相色谱的流动相为水与甲醇；流动相洗脱为梯度洗脱；

所述超高效液相色谱中的色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈；

所述梯度洗脱的程序为：以水作为A相，以甲醇作为B相，0~1 min，35%~45%A；2~5 min，65%~75%A；6~10 min，35%~45%A；

所述酚类香料为丁香酚、麝香草酚、浓馥香兰素与4-乙基愈创木酚。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述萃取溶剂为甲醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱中待测样品液的流速为0.1~0.5 ml/min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的柱温为20℃~40℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的检测为负离子扫描模式，多重反应监测模式检测。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱的检测条件：毛细管电压为3000~5000 V；干燥气体流速度为6~10 min/L；干燥气体温度为320℃~360℃；雾化器压力为30~50 psi。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酚类香料的标准曲线按照以下方法建立：

将酚类香料标准工作溶液经超高效液相色谱-串联质谱进行检测，得到酚类香料的色谱数据与质谱数据；

按照外标法以酚类香料的色谱数据的色谱峰面积对酚类香料标准工作溶液的浓度进行回归分析，得到酚类香料的标准曲线。