CN103293240B - 一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，本发明提供的方法在萃取过程中，屏蔽掉待测样品中部分干扰物质对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚测定的干扰，而且在进行质谱检测时，采用电喷雾电离负离子模式和多反应监测扫描，通过对二级离子碎片的定量测定，能够更加准确的测定待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。而且，本发明提供的方法能够同时实现对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的检测，可消除类似化合物的干扰，确保所检测成分准确、可靠，检测灵敏度高、重复性好，具有较高的准确性和精密度，适用于烟用添加剂中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的快速定量筛查与评价。

Description

一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法

技术领域

本发明属于添加剂理化检验技术领域，尤其涉及一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法。

背景技术

水杨酸又名邻羟基苯甲酸，是重要的精细化工原料。在医药工业中，水杨酸是一种用途极广泛的消毒、防腐剂，也是皮肤保养品的新宠。但是在我国水杨酸禁止用于食品加工生产，因为水杨酸有腐蚀作用，人们食用了含有水杨酸的食品，能刺激食道、消化道的内膜、黏膜，并能与机体组织中的蛋白质发生反应。大量服食会引起呕吐、腹痛、频促、酸中毒等症状，严重地影响了人们的身体健康。β-萘酚为白色有光泽的碎薄片或白色粉末，具有一定的杀菌，抗氧化能力，因其对眼睛、皮肤、粘膜有强烈刺激作用和对肾脏可引起出血性肾炎，也是明文禁止使用的食品添加剂。虽然水杨酸和β-萘酚为食品添加剂中禁止添加成分，但仍然有很多不法厂家在食品添加剂中添加这些违禁成分。

马兜铃酸来源于天然植物中，具有提高机体抗菌能力，提高细胞免疫功能的作用，但是随着对马兜铃酸和含马兜铃酸中药的进一步研究及其在临床的应用，发现其有较强的致突变、致癌作用及一些不良反应，特别是肾毒性作用。由于目前很多食品添加剂都含有植物提取物，因此很有可能随植物提取物进入食品添加剂中。

甜蜜素化学名称为环己基氨基磺酸钠，作为一种最常用的甜味剂,被广泛应用于食品中。随着近几年甜蜜素在国内及出口食品中屡次被检出超标，及各界对其致癌性、致畸性等安全性问题的诸多争议，甜蜜素一度在消费者对中引起恐慌心理,现已成为全世界关注的热点。许多国家禁止使用甜蜜素或对其使用范围进行限制，我国GB2760-1996对其使用范围及最大使用量均有规定。因此，建立简单、快速、灵敏的测定这些有害物质的分析方法对烟用添加剂的质量控制具有重要意义。

现有技术中，有关以上这4种物质的的测定方法有离子色谱法、气相色谱法、超高效液相色谱法等，但这些方法都有一定的局限性，存在着检测灵敏度不够，机体干扰大出现伪峰、无法同时检测等现象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，本发明提供的方法消除了类似物的干扰，得到的检测结果准确且灵敏度高。

本发明提供了一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，包括以下步骤：

a）将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；

b）将所述步骤a）得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液；

c）将所述步骤b）得到的待测溶液进行超高效液相分离；

d）将所述步骤c）得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测的离子源为电喷雾电离源、负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；

e）根据所述步骤d）得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。

优选的，所述萃取溶剂中氨水与甲醇的体积比为（80～95）:（5～20）；

所述氨水的摩尔浓度为1mmol/L～5mmol/L。

优选的，所述滤膜的孔径为0.1μm～0.5μm。

优选的，所述超高效液相分离流动相A为氨水，流动相B为乙腈；

所述氨水的摩尔浓度为1mmol/L～5mmol/L；

所述超高效液相色谱分离的梯度洗脱程序为：0～2min内，流动相B的体积分数为5%～15%，2min～5min内，流动相B的体积分数由5%～15%变为65～80%，5min～5.5min内，流动相B的体积分数由65～80%变为5%～15%，5.5min～8min内，流动相B的体积分数为5%～15%；

所述超高效液相分离的流速为0.1mL/min～0.75mL/min；

所述超高效液相分离的柱温为25℃～35℃；

所述超高效液相分离的进样量为2μL～8μL。

优选的，所述质谱检测中检测水杨酸的多反应监测扫描参数为：

母离子为136m/z～138m/z，子离子为92m/z～94m/z，碎裂电压为75V～85V，碰撞能量为10V～20V，驻留时间为90ms～110ms。

优选的，所述质谱检测中检测马兜铃酸A的多反应监测扫描参数为：

母离子为339m/z～341m/z，子离子为279m/z～281m/z，碎裂电压为85V～95V，碰撞能量为5V～15V，驻留时间为90ms～110ms。

优选的，所述质谱检测中检测甜蜜素的多反应监测扫描参数为：

母离子为177m/z～179m/z，子离子为79m/z～81m/z，碎裂电压为120V～130V，碰撞能量为25V～35V，驻留时间为90ms～110ms。

优选的，所述质谱检测中检测β-萘酚的多反应监测扫描参数为：

母离子为142m/z～144m/z，子离子为114m/z～116m/z，碎裂电压为125V～135V，碰撞能量为30V～40V，驻留时间为90ms～110ms。

优选的，所述质谱检测中的毛细管电压为3500V～4500V；

所述质谱检测中的干燥气、雾化气和碰撞气为高纯氮气；

所述质谱检测中干燥气的流速为5L/min～12L/min；

所述质谱检测中干燥气的温度为330℃～370℃；

所述质谱检测中雾化气的压力为30psi～40psi。

优选的，所述预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线按照以下方法获得：

提供包含水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚标准品的标准待测溶液；

将所述标准待测溶液进行超高效液相分离；

将所述超高效液相分离的产物进行质谱检测，得到标准待测溶液的质谱图；

根据所述质谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的色谱峰面积与相应的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚在标准待测溶液中的质量浓度，分别得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线。

本发明提供了一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，包括以下步骤：a）将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；b）将所述步骤a）得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液；c）将所述步骤b）得到的待测溶液进行超高效液相分离；d）将所述步骤c）得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测采用电喷雾电离源，负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；e）根据所述步骤d）得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法将待测样品进行萃取，将萃取得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，然后将得到的滤液进行超高效液相分离，再将得到的分离产物进行质谱检测，在质谱检测过程中，采用电喷雾电离源，负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；然后根据得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法在萃取过程中，屏蔽掉待测样品中干扰物质对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚测定的干扰，而且在进行质谱检测时，采用负离子模式和多反应监测扫描，通过对二级离子碎片的定量测定，能够更加准确的测定待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。而且，本发明提供的方法能够同时实现对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的检测，可消除类似化合物的干扰，确保所检测成分准确、可靠，检测灵敏度高、重复性好，具有较高的准确性和精密度，适用于烟用添加剂中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的快速定量筛查与评价。实验结果表明，本发明提供的方法对甜蜜素的检出限为10.0ng/g，对水杨酸的检出限为8.0ng/g，对β-萘酚的检出限为10.0ng/g，对马兜铃酸A的检出限为6.0ng/g。

附图说明

图1为本发明实施例提供方法的流程示意图；

图2为本发明实施例1得到的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚标准品总离子流（TIC）图谱；

图3为本发明实施例1得到的水杨酸的LC-ESI-MS/MS色谱图；

图4为本发明实施例1得到的甜蜜素的LC-ESI-MS/MS色谱图；

图5为本发明实施例1得到的马兜铃酸A的LC-ESI-MS/MS色谱图；

图6为本发明实施例1得到的β-萘酚的LC-ESI-MS/MS色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，包括以下步骤：

a）将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；

b）将所述步骤a）得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液；

c）将所述步骤b）得到的待测溶液进行超高效液相分离；

d）将所述步骤c）得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测的离子源为电喷雾电离源、负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；

e）根据所述步骤d）得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。

本发明提供的方法采用氨水和甲醇的混合溶液为萃取剂对待测样品进行萃取；然后将萃取得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，再将得到的滤液进行液相分离，将得到的分离产物进行质谱检测，在进行质谱检测的过程中，采用电喷雾电离源为离子源，采用负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描，根据得到的质谱图和预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法可用于烟用添加剂中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的同时检测，本发明采用串联质谱的多反应监测（MRM）功能可以实现特定离子对的有效监测，即使水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的保留时间相同，从二级质谱层面上也可进行很好的定性和定量，有效排除干扰物的影响，提高了分析方法的选择性和准确性；而且本发明提供的方法灵敏度高、线性好，检出限低，回收率高，重复性好；本发明提供的方法能够快速测定烟用添加剂中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚含量，实验结果表明，检测过程可在8min内即可完成，相比于现有的技术方法，本发明提出的分析方法在对烟用添加剂中的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚物质的筛查与定量分析上具有明显的优势，更有效，更实用。而且，本发明提供的方法能够快速得到检测结果，提高了检测效率。

本发明将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂。本发明提供的方法以氨水和甲醇的混合溶剂为萃取溶剂，能够排除待测样品中部分干扰物对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚测定的干扰，提高了对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚检测的准确度；

本发明优选向待测样品中加入萃取溶剂，密封后进行振荡萃取。在本发明中，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；所述氨水的摩尔浓度优选为1mmol/L～5mmol/L，更优选为2mmol/L～3.5mmol/L，最优选为2mmol/L；所述氨水和甲醇的体积比优选为（80～95）:（5～20），更优选为（85～92）:（8～15），最优选为90:10；所述待测样品与萃取溶剂的质量比优选为1：（30～70），更优选为1：（35～65），最优选为1：（40～60）。本发明对所述振荡的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的振荡的技术方案即可，如可以采用本领域技术人员熟知的振荡器对待测样品和萃取溶剂的混合溶液进行振荡；在本发明中，所述萃取的时间优选为20min～50min，更优选为25min～40min，最优选为30min。

完成对所述待测样品的萃取后，本发明将得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液。本发明对所述固相萃取的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的固相萃取的技术方案即可，本发明优选将上述技术方案得到的上清液过固相萃取柱；在本发明中，所述固相萃取柱可以采用VARIAN的SPE柱，如可以为聚合物SPE柱。本发明将得到的固相萃取产物进行滤膜纯化，本发明对所述滤膜没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知来源的滤膜即可，在本发明中，所述滤膜的孔径优选为0.1μm～0.5μm，更优选为0.2μm～0.35μm，最优选为0.22μm。

得到待测溶液后，本发明优选将所述待测溶液置于色谱进样瓶中，进行超高效液相分离。本发明对所述超高效液相分离用到的仪器没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的高相色谱仪即可。本发明对所述超高效液相分离采用的色谱柱没有特殊的限制，本发明优选采用Agilent公司生产的、型号为ZORBAX Eclipse Plus的C₁₈柱（2.1×150mm，1.8μm）；在本发明中，所述超高效液相分离中的流动相A为氨水，流动相B为乙腈；所述氨水的摩尔浓度优选为1mmol/L～5mmol/L，更优选为2mmol/L～3.5mmol/L，最优选为2mmol/L；所述超高效液相色谱分离的梯度洗脱程序优选为：0～2min内，流动相B的体积分数为5%～15%，2min～5min内，流动相B的体积分数由5%～15%变为65～80%，5min～5.5min内，流动相B的体积分数由65～80%变为5%～15%，5.5min～8min内，流动相B的体积分数为5%～15%；所述梯度洗脱程序更优选为0～2min内，流动相B的体积分数为10%，2min～5min内，流动相B的体积分数由10%变为75%，5min～5.5min内，流动相B的体积分数为10%，5.5min～8min内，流动相B的体积分数为10%；在本发明中，所述超高效液相分离的流速优选为0.1mL/min～0.75mL/min，更优选为0.2mL/min～0.5mL/min，最优选为0.25mL/min；所述超高效液相分离的柱温优选为25℃～35℃，更优选为28℃～32℃，最优选为30℃；所述超高效液相分离的进样量优选为2μL～8μL，更优选为3μL～6.5μL，最优选为5μL。

完成对待测溶液的色谱分离后，本发明将得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测的离子源为电喷雾离子源、负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描。本发明优选采用多重串联质谱检测方法，更优选为采用三重串联质谱检测方法。本发明对所述质谱检测的仪器没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的质谱仪即可。本发明优选采用三重串联四级杆质谱仪，配备电喷雾离子源（ESI）和Masshunter分析软件。本发明采用串联质谱的多反应监测（MRM）功能可以实现特定离子对的有效监测，即使水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的保留时间相同，从二级质谱层面上也可进行很好的定性和定量，有效排除干扰物的影响，提高了分析方法的选择性和准确性；

在本发明中，所述质谱检测中水杨酸的多反应监测扫描参数优选为：

母离子优选为136m/z～138m/z，更优选为137m/z；子离子优选为92m/z～94m/z，更优选为93m/z；根据母离子和子离子的范围，可以确定水杨酸在进行质谱检测时的离子选择通道；碎裂电压优选为75V～85V，更优选为77V～82V，最优选为80V；碰撞能量优选为10V～20V，更优选为13V～18V，最优选为15V；驻留时间为90ms～110ms，更优选为95ms～105ms，最优选为100ms；

所述质谱检测中马兜铃酸A的多反应监测扫描参数优选为：

母离子优选为339m/z～341m/z，更优选为340m/z；子离子优选为279m/z～281m/z，更优选为280m/z；根据母离子和子离子的范围，可以确定马兜铃酸A在进行质谱检测时的离子选择通道；碎裂电压优选为85V～95V，更优选为88V～92V，最优选为90V；碰撞能量优选为5V～15V，更优选为8V～12V，最优选为10V；驻留时间为90ms～110ms，更优选为95ms～105ms，最优选为100ms；

所述质谱检测中甜蜜素的多反应监测扫描参数优选为：

母离子优选为177m/z～179m/z，更优选为178m/z；子离子优选为79m/z～81m/z，更优选为80m/z；根据母离子和子离子的范围，可以确定甜蜜素在进行质谱检测时的离子选择通道；碎裂电压优选为120V～130V，更优选为123V～128V，最优选为125V；碰撞能量优选为25V～35V，更优选为27V～32V，最优选为30V；驻留时间为90ms～110ms，更优选为95ms～105ms，最优选为100ms；

所述质谱检测中β-萘酚的多反应监测扫描参数优选为：

母离子优选为142m/z～144m/z，更优选为143m/z；子离子优选为114m/z～116m/z，更优选为115m/z；根据母离子和子离子的范围，可以确定β-萘酚在进行质谱检测时的离子选择通道；碎裂电压优选为125V～135V，更优选为127V～133V，最优选为130V；碰撞能量优选为30V～40V，更优选为32V～38V，最优选为35V；驻留时间为90ms～110ms，更优选为95ms～105ms，最优选为100ms；

在本发明中，所述质谱检测中毛细管电压优选为3500V～4500V，更优选为3600V～4400V，最优选为3800V～4200V，最最优选为4000V；所述质谱检测中的干燥气、雾化气和碰撞气优选为高纯氮气，本发明对所述高纯氮气的纯度没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的用于质谱检测中的高纯氮气即可；所述干燥气的流速优选为5L/min～12L/min，更优选为8L/min～10L/min，最优选为9L/min；所述干燥气的温度优选为330℃～370℃，更优选为340℃～360℃，最优选为345℃～355℃，最优选为350℃；所述雾化气的压力优选为30psi～40psi，更优选为33psi～38psi，最优选为35psi。

得到的待测样品的质谱图后，本发明根据所述质谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的峰面积与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明也可以按照得到的色谱图中各色谱峰的保留时间对待测样品中是否含有水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚进行定性测定。在本发明中，所述水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线优选按照以下方法获得：

提供包含水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚标准品的系列浓度的标准待测溶液；

将所述标准待测溶液进行超高效液相分离；

将所述超高效液相分离的产物进行质谱检测，得到标准待测溶液的质谱图；

根据所述质谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的色谱峰面积与相应的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚在标准待测溶液中的质量浓度，分别得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线。

本发明首先配制系列浓度的包含有水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚标准品的标准待测溶液，本发明优选将水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚的标准品混合溶解在萃取溶剂中，得到标准待测溶液，所述萃取溶剂优选为上述技术方案所述的萃取溶剂，在此不再赘述。本发明对所述水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚的标准品的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚的市售商品即可，在本发明中，所述水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚标准品的级别优选为色谱纯。本发明优选先配制包括水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚标准品的储备液，然后根据需要稀释成不同浓度的标准待测溶液；在本发明中，在所述标准待测溶液中，所述水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚的质量浓度优选相同，所述标准待测溶液中水杨酸、马兜铃酸A甜蜜素和β-萘酚的质量浓度优选均为20ng/mL～1500ng/mL，本领域技术人员可以根据需要在20ng/mL～1500ng/mL范围内选择合适数量的标准待测溶液。

得到系列浓度的标准待测溶液后，本发明优选采用上述技术方案对得到的标准待测溶液进行超高效液相分离和质谱检测，得到标准溶液的质谱图；

得到标准溶液的质谱图后，本发明根据所述质谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的保留时间，可以对待测样品中的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚进行定性测定，在本发明中，水杨酸的相对保留时间为1.07min、马兜铃酸A的相对保留时间为4.15min、甜蜜素的相对保留时间为1.06min、β-萘酚的相对保留时间为4.75min；

本发明根据所述质谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的色谱峰面积与相应的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚在标准待测溶液中的质量浓度进行线性拟合，分别得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线。在本发明中，甜蜜素的标准曲线为y=51.5504x+4935.5416，其中x为峰面积，y为甜蜜素的质量浓度，单位为ng/mL；该标准曲线的线性相关系数R²为0.9992；水杨酸的标准曲线为y=144.6109x+5113.7916，其中x为峰面积，y为水杨酸的质量浓度，单位为ng/mL，该标准曲线的线性相关系数R²为0.9992；β-萘酚的标准曲线为y=15.9209x+228.8699，其中x为峰面积，y为β-萘酚的质量浓度，单位为ng/mL，该标准曲线的线性相关系数R²为0.9992；马兜铃酸A的标准曲线为y=0.4805x-0.8316，其中x为峰面积，y为马兜铃酸A的质量浓度，单位为ng/mL，该标准曲线的线性相关系数R²为0.9994；

得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线后，本发明根据上述技术方案检测得到的待测样品色谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的峰面积，计算得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明优选按照式（I）所示公式计算得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量：

$X=\frac{c\×V}{m}$

X为待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素或β-萘酚的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c为由标准工作曲线得到的待测溶液中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素或β-萘酚质量浓度，单位为微克每升（μg/mL）；

V为待测溶液的体积，单位为毫升（mL）；

M为待测样品的质量，单位为克（g）。

本发明提供的方法具有较高的灵敏度，实验结果表明，本发明提供的方法对甜蜜素的检出限为10.0ng/g，对水杨酸的检出限为8.0ng/g，对β-萘酚的检出限为10.0ng/g，对马兜铃酸A的检出限为6.0ng/g。

本发明提供了一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，包括以下步骤：a）将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；b）将所述步骤a）得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液；c）将所述步骤b）得到的待测溶液进行超高效液相分离；d）将所述步骤c）得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测采用电喷雾电离源，负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；e）根据所述步骤d）得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法将待测样品进行萃取，将萃取得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，然后将得到的滤液进行超高效液相分离，再将得到的分离产物进行质谱检测，在质谱检测过程中，采用电喷雾电离源负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；然后根据得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法在萃取过程中，屏蔽掉待测样品中干扰物质对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚测定的干扰，而且在进行质谱检测时，采用负离子监测模式和多反应监测扫描，通过对二级离子碎片的定量测定，能够更加准确的测定待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。而且，本发明提供的方法能够同时实现对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的检测，可消除类似化合物的干扰，确保所检测成分准确、可靠，检测灵敏度高、重复性好，具有较高的准确性和精密度，适用于烟用添加剂中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的快速定量筛查与评价。实验结果表明，本发明提供的方法对甜蜜素的检出限为10.0ng/g，对水杨酸的检出限为8.0ng/g，对β-萘酚的检出限为10.0ng/g，对马兜铃酸A的检出限为6.0ng/g。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在下述实施例中，质谱仪为美国Agilent6410三重串联四级杆质谱仪，配备电喷雾离子源（ESI）和Masshunter分析软件；液相色谱仪为美国Agilent1290infinity超超高效液相色谱仪；制备超纯水使用Milli-Q超纯水仪；氮气由Parker氮气发生器制得；样品称量采用AB204-S型电子分析天平；采用HY-5型回旋式振荡器对样品进行振荡；

甲醇和乙腈为色谱纯，购自Fisher Scientific公司；氨水为色谱纯，购自Merck KGaA；马兜铃酸A为色谱纯，购自ACROS ORCANICS.LTD；β-萘酚为色谱纯，购自ACROS ORCANICS.LTD；甜蜜素为色谱纯，购自ACROSORCANICS.LTD；水杨酸为色谱纯，购自J&K CHEMICAL.LTD；液氮购自长春巨洋气体有限公司。

实施例1

分别称取0.0020g水杨酸、0.0020g马兜铃酸A、0.0020g甜蜜素和0.0020gβ-萘酚，用体积比为10:90的氨水溶液-甲醇溶解并定溶至100mL，氨水的摩尔浓度为2mmol/L，得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的摩尔浓度均为20μg/mL的混合储备液；

准确移取不同体积的混合储备液，稀释成摩尔浓度为20ng/mL～1500ng/mL的标准工作溶液。

将得到的标准工作溶液进行超高效液相色谱分离：

色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C₁₈（2.1mm×150mm，1.8μm）；

流速为0.25mL/min；

柱温为30℃；

进样量为5μL；

流动相A为摩尔浓度为2mmol/L的氨水溶液，流动相B为乙腈；

梯度洗脱程序：0min～2min内，流动相B的体积分数为10%，2min～5min内，流动相B的体积分数由10%变为75%，5min～5.5min内，流动相B的体积分数由75%变为10%，5.5min～8min内，流动相B的体积分数为10%；

将得到的液相色谱分离产物进行质谱检测：

电喷雾电离源，负离子模式多反应监测扫描（MRM）；

毛细管电压4000V；

干燥气、雾化气和碰撞气均为高纯氮气；

干燥气体流速度为9L/min，干燥气体温度为350℃；

雾化器压力为35psi，水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的MRM参数见表1，表1为水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的MRM参数：

表1水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的MRM参数

根据表1的MRM参数，及上述条件，完成对标准工作溶液的超高效液相-质谱检测，得到色谱图，结果如图2～6所示，图2为本发明实施例1得到的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚标准品总离子流（TIC）图谱，由图2可以看出，本发明提供的方法能够同时对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的测定；

图3～6分别为本发明实施例1得到的水杨酸的、甜蜜素、马兜铃酸和β-萘酚的LC-ESI-MS/MS色谱图，根据得到的色谱图得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的相对保留时间分别为1.07min、4.15min、1.06min、4.75min，可以根据上述相对保留时间对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚进行定性测试；

将得到的标准工作溶液的检测结果进行分析，按外标法以水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的色谱峰面积对其相应的浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；取最低浓度工作标准溶液，做10次平行试验，计算标准偏差，3倍标准偏差为检出限，10倍标准偏差为定量限，结果如表2所示，表2为本发明实施例1得到的马兜铃酸A、甜蜜素、水杨酸和β-萘酚的标准曲线及检测限。

表2本发明实施例1得到的马兜铃酸A、甜蜜素、水杨酸和β-萘酚的标准曲线及检测限

注：表2中回归方程中的y分别对应待测溶液中甜蜜素、水杨酸、β-萘酚和马兜铃酸A的质量浓度，单位为ng/mL，x分别对应得到的色谱图中甜蜜素、水杨酸、β-萘酚和马兜铃酸A色谱峰的峰面积。

实施例2

按照图1所示的流程，对烟用添加剂进行检测，图1为本发明实施例提供的方法的流程示意图：

精密称取1g购于延边某香精香料厂的烟用添加剂C10，按照实例1中样品溶液制备、色谱分析条件、质谱检测条件对两种烟用添加剂中的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚进行检测，根据得到的水杨酸、甜蜜素、马兜铃酸A和β-萘酚色谱峰的峰面积，以及实施例1得到的水杨酸、甜蜜素、马兜铃酸A和β-萘酚的回归方程，计算得到待测溶液中水杨酸、甜蜜素、马兜铃酸A和β-萘酚的质量浓度；根据得到的待测溶液中水杨酸、甜蜜素、马兜铃酸A和β-萘酚的质量浓度，以及式（I）所示的计算公式，计算得到烟用添加剂C10样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚含量，计算公式如下：

$X=\frac{c\×V}{m}---\left(I\right)$

式（I）中，X为试样中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素或β-萘酚含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c为由标准工作曲线得到的待测溶液中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚浓度，单位为微克每升（μg/mL）；

V为待测溶液的体积，单位为毫升（mL）；

m为待测烟用添加剂的质量，单位为克（g）。

计算结果如表3所示，表3为本发明实施例2和实施例3得到的检测结果。

实施例3

精密称取1g购于延边某香精香料厂的烟用添加剂C20，采用实施例2的技术方案，检测得到其中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素或β-萘酚的含量，结果如表3所示，表3为本发明实施例2和实施例3得到的检测结果。

表3本发明实施例2和实施例3得到的检测结果。

本发明提供的方法对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的检测限分别为8.0ng/g、6.0ng/g、10.0ng/g、10.0ng/g，在20ng/mL～1000ng/mL范围内线性良好，相关系数R²为0.9991以上。这说明，本发明提供的方法灵敏度高，得到的检测结果准确。

实施例4

本发明以回收率和相对标准偏差来衡量本发明提供方法的准确度和精密度，具体过程如下：

在相同条件下，对同一样品取样6次，采用实施例2所述的检测方法对其中的马兜铃酸A、甜蜜素、水杨酸和β-萘酚物质含量进行检测，并根据测定结果的平均值计算马兜铃酸A、甜蜜素、水杨酸和β-萘酚物质的相对标准偏差（RSD%）；

对样品分别添加高、中、低3个水平的标准溶液，进行加标回收率实验，结果如表4所示，表4为本发明实施例4得到的回收率和相对标准偏差。

表4本发明实施例4得到的回收率和相对标准偏差

由表4可以看出，本发明提供的方法得到的回收率在95.1%～106.5%之间，相对标准偏差均小于5%，这说明，本发明提供的方法对于马兜铃酸A、甜蜜素、水杨酸和β-萘酚的检测具有较高的准确度和精密度。

由以上实施例可知，本发明提供了一种同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，包括以下步骤：a）将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；b）将所述步骤a）得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液；c）将所述步骤b）得到的待测溶液进行超高效液相分离；d）将所述步骤c）得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测采用电喷雾电离源，负离子监测，扫描方式为多反应监测扫描；e）根据所述步骤d）得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法将待测溶液进行萃取，将萃取得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，然后将得到的滤液进行超高效液相分离，再将得到的分离产物进行质谱检测，在质谱检测过程中，采用电喷雾电离源负离子监测模式，扫描方式为多反应监测扫描；然后根据得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。本发明提供的方法在萃取过程中，屏蔽掉待测样品中干扰物质对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚测定的干扰，而且在进行质谱检测时，采用负离子监测模式和多反应监测扫描，通过对二级离子碎片的定量测定，能够更加准确的测定待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。而且，本发明提供的方法能够同时实现对水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的检测，可消除类似化合物的干扰，确保所检测成分准确、可靠，检测灵敏度高、重复性好，具有较高的准确性和精密度，适用于烟用添加剂中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的快速定量筛查与评价。实验结果表明，本发明提供的方法对甜蜜素的检出限为10.0ng/g，对水杨酸的检出限为8.0ng/g，对β-萘酚的检出限为10.0ng/g，对马兜铃酸A的检出限为6.0ng/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于烟用添加剂中同时检测水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的方法，包括以下步骤：

a)将待测样品与萃取溶剂混合进行萃取，所述萃取溶剂为氨水和甲醇的混合溶剂；

b)将所述步骤a)得到的上清液进行固相萃取和滤膜纯化，得到待测溶液；

c)将所述步骤b)得到的待测溶液进行超高效液相分离；

所述超高效液相分离中的流动相A为氨水，流动相B为乙腈；所述氨水的摩尔浓度为1mmol/L～5mmol/L；所述超高效液相色谱分离的梯度洗脱程序为：0～2min内，流动相B的体积分数为5％～15％，2min～5min内，流动相B的体积分数由5％～15％变为65～80％，5min～5.5min内，流动相B的体积分数由65～80％变为5％～15％，5.5min～8min内，流动相B的体积分数为5％～15％；所述超高效液相分离的流速为0.1mL/min～0.75mL/min；

d)将所述步骤c)得到的分离产物进行质谱检测，得到待测样品的质谱图，所述质谱检测的离子源为电喷雾电离源、负离子模式，扫描方式为多反应监测扫描；

所述质谱检测中的毛细管电压为3500V～4500V；所述质谱检测中干燥气的流速为5L/min～12L/min；所述质谱检测中干燥气的温度为330℃～370℃；所述质谱检测中雾化气的压力为30psi～40psi；

所述质谱检测中水杨酸子离子为92m/z～94m/z，碎裂电压为75V～85V，碰撞能量为10V～20V，驻留时间为90ms～110ms；

所述质谱检测中马兜铃酸A子离子为279m/z～281m/z，碎裂电压为85V～95V，碰撞能量为5V～15V，驻留时间为90ms～110ms；

所述质谱检测中甜蜜素子离子为79m/z～81m/z，碎裂电压为120V～130V，碰撞能量为25V～35V，驻留时间为90ms～110ms；

所述质谱检测中β-萘酚的子离子为114m/z～116m/z，碎裂电压为125V～135V，碰撞能量为30V～40V，驻留时间为90ms～110ms；

e)根据所述步骤d)得到的质谱图与预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线，得到待测样品中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取溶剂中氨水与甲醇的体积比为(80～95):(5～20)；

所述氨水的摩尔浓度为1mmol/L～5mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.1μm～0.5μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相分离的柱温为25℃～35℃；

所述超高效液相分离的进样量为2μL～8μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测中的干燥气、雾化气和碰撞气为高纯氮气。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述预定的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线按照以下方法获得：

提供包含水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚标准品的系列浓度的标准待测溶液；

将所述标准待测溶液进行超高效液相分离；

将所述超高效液相分离的产物进行质谱检测，得到标准待测溶液的质谱图；

根据所述质谱图中水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的色谱峰面积与相应的水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚在标准待测溶液中的质量浓度，分别得到水杨酸、马兜铃酸A、甜蜜素和β-萘酚的标准曲线。