CN112432990B - 马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,其是针对植物来源的样品,使用探针电喷雾电离质谱法,分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法,所述方法具备以下步骤:稀释步骤,在所述样品中添加缓冲液进行稀释;以及,质谱分析步骤,将稀释后的所述样品进行探针电喷雾电离,并导入到质谱分析装置,所述缓冲液含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学、质谱分析、中草药分析等领域,尤其涉及一种马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法。
背景技术
马兜铃酸是一大类硝基菲类化合物,主要有马兜铃酸A、B、C、D(也有时被称为马兜铃酸I、II、III、IV)等。许多马兜铃属及细辛属等马兜铃科植物中都含有马兜铃酸,并常与马兜铃内酰胺共存。这些植物广泛地用作中药材,例如天仙藤、马兜铃、寻骨风、朱砂莲、细辛等。2017年10月27日,世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中,马兜铃酸、含马兜铃酸的植物在一类致癌物清单中。此外,马兜铃酸可以引发肾小管坏死,进而出现不可逆转的肾间质纤维化,这种肾毒性与用药剂量相关。因此,马兜铃酸在中草药和食物中的含量检测分析具有重大意义。
最近,在鱼腥草等植物中也发现了几种马兜铃内酰胺,这些植物在亚洲国家广泛作为蔬菜食用。鱼腥草中所含的马兜铃内酯的危害尚不明确,但非常有必要监测中草药和食物中的这些化合物。
近年来,作为检测马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法,开发了基于近红外光谱技术来测定中药材中的马兜铃酸I的方法(专利文献1)、基于液相色谱法检测药材和消肿止痛酊中的马兜铃酸A的方法(专利文献2)。此外,迄今例如报道了,通过LC-MS、LC-MSMS、以及LC和高分辨率质谱联用的方法(非专利文献1~3)。其中,LC-MS和LC-MSMS都需要液相色谱分离然后用质谱进行检测。由于马兜铃科植物的强基质效应,通常通过稀释、色谱分离和/或固相萃取来减少LC系统中的干扰物和污染物,操作烦杂,分析耗时。例如,非专利文献1和2中记载的方法的分析时间分别为30分钟、3.5分钟。对于LC和高分辨率质谱联用,主要应用于马兜铃酸类物质的定性分析,难以进行准确的定量。
如上可见,现有技术中,在通过质谱分析法进行马兜铃酸类物质的定量分析必须预先进行LC分离步骤,分析时间非常长,另一方面,基于高分辨率质谱技术,虽然能够实现快速的定性分析,但无法实现可靠的定量分析。因此,迫切需要开发快速筛选和定量分析中药和/或食物中的马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法。
引证文件列表
专利文献
专利文献1:CN 108918460A
专利文献2:CN 101455695 A
非专利文献
非专利文献1:A simple and selective detection method for aristolochicacid in crude drugs using solid-phase extraction.J Nat Med,2013,67:838-843
非专利文献2:超高效液相色谱-串联质谱测定保健食品中马兜铃酸A.中国现代应用药学,2013,30:186-189
非专利文献3:Characterization and quantitation of aristolochic acidanalogs in different parts of Aristolochiae Fructus,using UHPLC-Q/TOF-MS andUHPLC-QqQ-MS.Chin J Nat Med,2017,15:392-400
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术中存在的难以快速且准确地对马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺进行定性/定量分析的问题,本发明提供一种马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,该方法基于探针电喷雾电离技术使利用特定缓冲液稀释后的样品进行电离,并通过质谱法分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺,从而在供于质谱分析之前无需进行色谱分离,能够实现快速且准确的定性和定量分析。
此外,本发明还提供一种探针电喷雾电离法中使用的探针的前处理方法,其通过以特定步骤对探针施加电压,从而提高探针的使用寿命、分析的灵敏度和稳定性。
用于解决问题的方案
本发明中,使用如下方案解决了快速且准确地定性和定量分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的技术问题。
1.一种马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,其特征在于,其是针对植物来源的样品,使用探针电喷雾电离质谱法,分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法,
所述方法具备以下步骤:
稀释步骤,在所述样品中添加缓冲液进行稀释;以及,
质谱分析步骤,将稀释后的所述样品进行探针电喷雾电离,并导入到质谱分析装置,
所述缓冲液含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。
2.根据前述1所述的分析方法,其特征在于,所述样品为选自由蔬菜、中药材、中药提取物、以及中药制剂组成的组中的任一种。
3.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述样品为固体样品,在所述稀释步骤之前,还包括以下步骤:
粉碎步骤,将所述固体样品粉碎;以及,
提取步骤,在粉碎后的所述固体样品中加入提取溶剂进行提取,得到样品提取液,
将所述样品提取液供于所述稀释步骤。
4.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述缓冲液含有水和有机溶剂。
5.根据前述4所述的分析方法,其特征在于,所述有机溶剂与水的体积比为70/30~20/80。
6.根据前述4所述的分析方法,其特征在于,所述有机溶剂为选自由二甲亚砜、甲酰胺和碳数为2~4的醇组成的组中的任一种或两种以上。
7.根据前述4所述的分析方法,其特征在于,所述有机溶剂为异丙醇和/或乙醇。
8.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述铵盐为甲酸铵,所述pKa为4.8以下的羧酸为甲酸。
9.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺为选自由马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D和马兜铃内酰胺I组成的组中的任一种或两种以上。
10.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析装置为三重四极杆质谱仪。
11.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析步骤中,在多反应监测模式下分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺。
12.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析步骤中的所述探针电喷雾电离所使用的探针的表面具有硅涂层。
13.根据前述1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析步骤中的所述探针电喷雾电离所使用的探针实施了前处理,
所述前处理包括:
浸渍步骤,将所述探针的前端浸渍于酸性的前处理液;以及,
电压施加步骤,以在施加负电压后施加正电压、或者在施加正电压后施加负电压、或者交替施加正电压和负电压的方式,对浸渍后的所述探针施加电压。
14.根据前述13所述的分析方法,其特征在于,所述正电压处于+2k~+5kV的范围内,所述负电压处于-5kV~-2kV的范围内。
15.根据前述13所述的分析方法,其特征在于,所述电压施加步骤中,最初施加的电压为正电压,最后施加的电压为负电压。
16.根据前述13所述的分析方法,其特征在于,所述负电压的绝对值中的最小值大于或等于所述正电压的绝对值中的最大值。
17.根据前述13所述的分析方法,其特征在于,施加负电压的总时间小于施加正电压的总时间。
18.根据前述13所述的分析方法,其特征在于,所述前处理液含有酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。
19.根据前述18所述的分析方法,其特征在于,相对于所述前处理液,所述酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的含有量为0.08~0.45重量%。
此外,本发明中,还使用如下的技术方案解决了提高探针的使用寿命、分析的灵敏度和稳定性的技术问题。
1.一种探针电喷雾电离法中使用的探针的前处理方法,其特征在于,包括:
浸渍步骤,将所述探针的前端浸渍于酸性的前处理液;以及,
电压施加步骤,以在施加负电压后施加正电压、或者在施加正电压后施加负电压、或者交替施加正电压和负电压的方式,对浸渍后的所述探针施加电压。
2.根据前述1所述的前处理方法,其特征在于,所述正电压处于+2k~+5kV的范围内,所述负电压处于-5kV~-2kV的范围内。
3.根据前述1或2所述的前处理方法,其特征在于,所述电压施加步骤中,最初施加的电压为正电压,最后施加的电压为负电压。
4.根据前述1或2所述的前处理方法,其特征在于,所述负电压的绝对值中的最小值大于或等于所述正电压的绝对值中的最大值。
5.根据前述1或2所述的前处理方法,其特征在于,施加负电压的总时间小于施加正电压的总时间。
6.根据前述1或2所述的前处理方法,其特征在于,所述前处理液含有酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。
7.根据前述6所述的前处理方法,其特征在于,相对于所述前处理液,所述酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的含有量为0.08~0.45重量%。
8.根据前述6所述的前处理方法,其特征在于,所述pKa为4.5以下的羧酸为甲酸和/或乙酸。
9.根据前述1或2所述的前处理方法,其特征在于,所述前处理液含有水和有机溶剂。
10.根据前述9所述的前处理方法,其特征在于,有机溶剂与水的体积比为70/30~20/80。
11.根据前述9所述的前处理方法,其特征在于,所述有机溶剂的粘度高于水。
12.根据前述11所述的前处理方法,其特征在于,所述有机溶剂为选自由二甲亚砜和碳数为2~4的醇组成的组中的任一种或两种以上。
13.根据前述12所述的前处理方法,其特征在于,所述有机溶剂为异丙醇和/或乙醇。
14.根据前述1或2所述的前处理方法,其特征在于,所述探针的表面具有硅涂层。
发明的效果
通过本发明上述技术方案的实施,能够取得如下的有益效果:
依据本发明所提供的马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,采用探针电喷雾电离技术,可以最大限度地减少样品的各种预处理过程,能够通过简单的方法制备待测样品。而且,在供于质谱分析之前无需进行色谱分离,能够实现快速的定性和定量分析,且不需要消耗流动相。进而,与大气压化学电离(APCI)和电喷雾电离(ESI)相比,本发明由于使用探针电喷雾电离,因此不需要消耗脱溶剂气体和雾化气。此外,本发明的分析方法对每个样品或每个化合物的分析时间通常小于20秒。因此,极大的提高了分析效率、降低了时间/劳力、以及成本。
依据本发明所提供的马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,通过使用含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的缓冲液,从而马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的检测结果具有高灵敏度、良好的线性相关系数,并且重现性好以及回收率高。因此,实现了稳定且准确的定性和定量分析。
此外,依据本发明所提供的探针电喷雾电离法中使用的探针的前处理方法,能够提高探针的使用寿命、分析的灵敏度和稳定性,还能够降低探针的批间差异,从而能够实现稳定且准确的定性和定量分析。
附图说明
图1为示出探针在前处理前后的信号强度的变化的图。
图2为马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃内酰胺I的标准样品的MRM色谱图。
图3为马兜铃酸A的标准曲线。
图4为马兜铃酸B的标准曲线。
图5为马兜铃酸C的标准曲线。
图6为马兜铃酸D的标准曲线。
图7为马兜铃内酰胺I的标准曲线。
具体实施方式
以下,针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方式、具体例子而进行,但本发明不限定于这些实施方式、具体例子。需要说明的是,本说明书中,“数值A~数值B”所表示的数值范围是指包含端数值A和B的范围。
在本发明中,提供了一种马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,其特征在于,其是针对植物来源的样品,使用探针电喷雾电离质谱法,分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法,
所述方法具备以下步骤:
稀释步骤,在所述样品中添加缓冲液进行稀释;以及,
质谱分析步骤,将稀释后的所述样品进行探针电喷雾电离,并导入到质谱分析装置,
所述缓冲液含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。
作为检测对象的样品只要源自植物及植物制品,就没有特别限定,例如可以源自植物的根、茎、叶、花、果实、种子等任意部位。在一些实施方案中,所述样品可以为选自由蔬菜、中药材、中药提取物、以及中药制剂组成的组中的任一种。其中,蔬菜可以为新鲜蔬菜,也可以为冷冻蔬菜、干燥蔬菜或冻干蔬菜,还可以为烹调后的蔬菜。作为具体例,可列举出:鱼腥草等蔬菜。需要说明的是,药食同源的植物可以根据其形态、用途等适宜地归类为蔬菜或中药材。例如,可以将新鲜鱼腥草归类为蔬菜,将干鱼腥草归类为中药材。
上述中药材只要是源自植物的中药材即可,对其形态、等级、加工、炮制方法没有特别限定。作为具体例,可列举出:大叶青木香、大百解、朱砂莲、九月生(朱砂莲)、天仙藤(马兜铃藤)、马兜铃、防己、汉防己、淮通、木防己(水城木防己)、木香马兜铃、大青木香、冕宁防己、寻骨风、苕叶细辛、乌金七、杜衡、湘细辛、细辛、甘肃细辛、南坪细辛、毛细辛、金耳环、山慈菇等。需要说明的是,作为中药材的原料的植物本身包含在本发明中的中药材的范畴中。
本发明中,中药提取物是指,是以植物等为原料,在中医药理论的指导下,按照对提取的最终产品的用途的需要,经过物理化学提取分离过程,定向获取和浓集植物动物中的某一种或多种有效成分,而不改变其有效成分结构而形成的产品。本发明中,作为中药提取物的具体例,可列举出:上述列举的中药材中的任一种或两种以上的提取物。中药提取物的形态没有特别限定,可以为干提取物、液体提取物、软提取物等。
中药制剂是指,根据药典、制剂规范和其他规定的处方,将中药的原料药物加工制成具有一定规格,可以直接用于防病、治病的药品。本发明中,作为中药制剂的具体例,可列举出:原料中包含上述列举的中药材的中药制剂。所述中药制剂的剂型没有特别限定,可以为片剂、注射剂、气雾剂、丸剂、散剂、膏剂等。需要说明的是,本发明中,中药制剂只要包含植物来源的中药材作为主原料即可,即,以植物来源的中药材为主原料且含有动物来源和/或矿物来源的中药材的中药制剂也包含在本发明中的中药材的范畴中。所述“包含植物来源的中药材作为主原料”是指,在全部中药材原料中含量最高的原料为植物来源的中药材,优选的是,植物来源的中药材在全部中药材原料中占50重量%以上。
从分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的实际需求的观点出发,样品优选为源自三白草科植物、马兜铃科植物的样品,更优选为鱼腥草、天仙藤、细辛,从获取和处理的容易度出发,进一步优选以干品形态作为中药材市售的鱼腥草、天仙藤、细辛。
在一些实施方式中,本发明的方法所分析的马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺为选自由马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D和马兜铃内酰胺I组成的组中的任一种或两种以上。
本发明中,分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法具备:稀释步骤,在样品中添加缓冲液进行稀释;以及,质谱分析步骤,将稀释后的所述样品进行探针电喷雾电离,并导入到质谱分析装置。
在一些实施方案中,所述样品为固体样品、代表性地为中药材的天仙藤和细辛的情况下,可以在稀释步骤之前还包括:粉碎步骤,将所述固体样品粉碎的步骤;以及,提取步骤,在粉碎后的所述固体样品中加入提取溶剂进行提取,得到样品提取液。
上述粉碎步骤中所使用的粉碎设备可以适宜使用公知的设备,例如杵臼、乳钵、研磨机、粉碎机等。上述提取溶剂可以根据样品的种类、成分而适宜使用公知的提取溶剂,例如可列举出水、有机溶剂、水与有机溶剂的混合溶剂等。作为提取溶剂,从马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的提取效率的观点出发,优选使用水、碳数1~8的醇、以及它们的混合溶剂,更优选使用水与碳数1~4的醇的混合溶剂,进一步优选使用水与甲醇的混合溶剂、水与乙醇的混合溶剂,最优选使用水与甲醇的混合溶剂。在使用水与甲醇的混合溶剂的情况下,水与甲醇的比例可以适宜地使用通常的比例,例如可以为10/90~50/50、优选为20/80~40/60。
在一些实施方案中,上述提取步骤如下进行:在根据需要粉碎后的固体样品中加入水与甲醇的混合溶剂等提取溶剂,通过例如搅拌、振荡、超声波处理使固体样品中的成分溶解到提取溶剂中,根据需要通过静置、过滤、离心等处理进行固液分离,将如此得到的液体部分作为样品提取液。
在所述提取步骤后,将所述样品提取液供于后续的稀释步骤。需要说明的是,根据样品自身的性质、状态、成分,也可以将样品直接供于稀释步骤,或者,也可以将样品用常规的溶剂溶解后供于稀释步骤。
本发明中,稀释步骤中使用的缓冲液含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。所述缓冲液可以含有水、有机溶剂、或它们的混合物作为溶剂。从马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的溶解性以及质谱分析的灵敏度和准确性的观点出发,所述缓冲液优选含有水和有机溶剂,进一步优选所述有机溶剂为选自由二甲亚砜、甲酰胺和碳数为2~4的醇组成的组中的任一种或两种以上,更进一步优选所述有机溶剂为选自由二甲亚砜、甲酰胺和碳数为2~4的一元醇组成的组中的任一种或两种以上,尤其优选使用异丙醇与水的混合物、乙醇与水的混合物作为溶剂。
在一些优选的实施方式中,从80/20~20/80的范围中选择有机溶剂与水的体积比,更优选为70/30~20/80。通过采取这样的体积比,稀释后的样品由于具有适宜的粘度而能够更高效地粘附到探针上,从而提高质谱分析的准确性。在使用乙醇与水的混合物的情况下,从适宜调整稀释后的样品的粘度、提高质谱分析的准确性的观点出发,优选乙醇/水的体积比为70/30~30/70、更优选为68/32~35/65、进一步优选为65/35~45/55、特别优选为62/38~50/50,最优选为60/40。作为另一个例子,在使用异丙醇与水的混合物的情况下,从适宜调整稀释后的样品的粘度、提高质谱分析的准确性的观点出发,优选异丙醇/水的体积比为65/35~25/75、更优选为60/40~30/70、进一步优选为55/45~45/55、特别优选为50/50。
作为上述缓冲液所含有的铵盐,没有特别限定,使用在质谱分析中观测M+NH4 +的加合离子时通常使用的挥发性的铵盐即可。作为具体例,可列举出甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵等。从质谱分析的灵敏度和准确性的观点出发,优选使用甲酸铵。所述铵盐的浓度可以采取质谱分析中通常采用的浓度,例如可以为0.2~10mM、优选为0.5~5mM、更优选为1~3mM、进一步优选为1.5~2.5mM。
本发明通过使用pKa为4.8以下的羧酸,从而在正离子模式下促进加合离子的生成,能够提高质谱分析的灵敏度和准确性。作为上述pKa为4.8以下的羧酸,可列举出乙酸、甲酸、乙二酸、一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等通常在缓冲液中使用的羧酸。从进一步提高质谱分析的灵敏度和准确性的观点出发,优选pKa为4.75以下的羧酸,更优选pKa为4.75以下的一元羧酸,进一步优选优选乙酸、甲酸,最优选甲酸。所述pKa为4.8以下的羧酸的浓度可以采取质谱分析中通常采用的浓度,例如可以为0.02~0.8wt%、优选为0.04~0.5wt%、更优选为0.06~0.3wt%、进一步优选为0.08~0.2wt%。
本发明通过使用含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的缓冲液,从而与现有技术中通常使用的其他类型的缓冲液(例如含NH3的溶液)相比,能够提高质谱分析灵敏度。下述的表1中示出,含有10mM甲酸铵+0.05%甲酸的缓冲液、与含有0.1%NH3的缓冲液中的信号强度的对比。
表1
由表1可见,使用10mM甲酸铵+0.05%甲酸的缓冲液的情况下,马兜铃酸A、马兜铃酸、马兜铃酸C的信号强度显著高于使用0.1%NH3的缓冲液的情况。另一方面,与使用0.1%NH3的缓冲液的情况相比,使用10mM甲酸铵+0.05%甲酸的缓冲液时马兜铃酸D的信号强度有所降低,但是由于在天仙藤、细辛等中药材中,马兜铃酸D的含量远远高于马兜铃酸A、马兜铃酸、马兜铃酸C,因此这种灵敏度的降低并不会对马兜铃酸D的分析造成困难。如此可见,本发明的使用上述特定缓冲液的方法在以中药材及其制品为对象的马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析中是特别有用的。
所述缓冲液中,从进一步提高质谱分析的灵敏度、准确性、稳定性的观点出发,优选使用甲酸铵和甲酸的组合。在一些优选的实施方式中,作为缓冲液,可以使用1.5~2.5mM甲酸铵和0.05~0.2wt%甲酸的乙醇/水(体积比为60/40~50/50)、或者异丙醇/水(体积比为60/40~50/50)溶液。通过使用这样的缓冲液,能够更进一步提高质谱法分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的灵敏度。如下的表2示出4钟马兜铃酸甲酸铵和甲酸浓度不同的缓冲液中信号强度(峰面积)。
表2
本发明中,质谱分析步骤中,作为分析设备,例如可以使用具备探针电喷雾离子源(PESI)的质谱仪。从分析灵敏度的观点出发,所述质谱仪优选为三重四极杆质谱仪。作为分析设备的具体例,可列举出株式会社岛津制作所制造的DPiMS-2020原位探针离子化质谱仪、在三重四极杆质谱仪(例如株式会社岛津制作所制造的LCMS-8060、LCMS-8045或LCMS-8050)上安装株式会社岛津制作所制造的探针电喷雾电离装置而成的设备。
质谱分析步骤中,探针电喷雾电离可以采用正离子模式或负离子模式中的任一种,从灵敏度的观点出发,优选采用正离子模式。在一些优选的实施方式中,质谱分析步骤中,可以在多反应监测模式下进行马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的定性/定量分析。多反应监测模式中所使用的检测条件可以使用现有公知的条件。
上述探针电喷雾离子源中使用的探针没有特别限定,可以使用现有公知的用于探针电喷雾电离质谱法的探针,例如可以使用株式会社岛津制作所制造的17928A1探针。从适宜用于分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的观点出发,优选使用表面具有硅涂层的探针。从提高延长探针的使用寿命、提高分析的灵敏度和稳定性的方面出发,探针优选预先实施前处理。
所述前处理包括:浸渍步骤,将所述探针的前端浸渍于酸性的前处理液;以及,电压施加步骤,以在施加负电压后施加正电压、或者在施加正电压后施加负电压、或者交替施加正电压和负电压的方式,对浸渍后的所述探针施加电压。通过电压施加步骤,使探针的表面活化,从而不仅增加探针的使用次数,而且表现出稳定且较高的样品信号强度。
通过如上那样的浸渍步骤和电压施加步骤而提高探针的使用寿命、提高分析的灵敏度和稳定性的机理尚不明确,推测与探针表面在电压下的氧化还原行为有关,但不限定于此。
上述前处理液只要为酸性即可,其组成可以根据所要分析的目标物质、质谱分析的条件而适宜设定。在一些实施方式中,所述前处理液含有酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。作为上述pKa为4.8以下的羧酸,可列举出乙酸、甲酸、乙二酸、一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等通常在缓冲液中使用的羧酸。从进一步提高质谱分析的灵敏度和准确性的观点出发,优选pKa为4.75以下的羧酸,更优选pKa为4.75以下的一元羧酸,进一步优选优选乙酸、甲酸,最优选甲酸。在一些优选的实施方式中,相对于所述前处理液,所述酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的含有量为0.06~0.48重量%、优选为0.08~0.40重量%、更优选为0.09~0.30重量%、进一步优选为0.1~0.2重量%。
在一些的方式中,前处理液为在水、有机溶剂、或水与有机溶剂的混合溶剂中溶解有酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的溶液。作为有机溶剂,可以适宜地采用公知的有机溶剂。作为具体例,可列举出乙腈、四氢呋喃、丙酮、氯仿、二氯甲烷、二甲亚砜、甲酰胺、碳数为1~4的醇。从保护探针不被高电压破坏的观点出发,优选的是,组合使用水与粘度高于水的有机溶剂作为前处理液的溶剂,例如列举出二甲亚砜、碳数为2~4的醇作为优选的例子,更优选为二甲亚砜、以及乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇等碳数为2~4的一元醇。在一些优选的实施方式中,可以使用异丙醇与水的混合物、乙醇与水的混合物作为溶剂。
在一些优选的实施方式中,从90/10~10/90的范围中选择有机溶剂与水的体积比,更优选为80/20~20/80,进一步优选为70/30~20/80。通过采取这样的体积比,前处理液由于具有适宜的粘度而能够更高效地粘附到探针上,从而提高前处理的效率并且防止探针破坏。有机溶剂与水的体积比可以根据有机溶剂的种类和粘度而适宜调整。例如,在使用乙醇与水的混合物的情况下,从进一步提高前处理的效率并且防止探针破坏的观点出发,优选乙醇/水的体积比为70/30~30/70、更优选为68/32~35/65、进一步优选为65/35~45/55、特别优选为62/38~50/50,最优选为60/40。作为另一个例子,在使用异丙醇与水的混合物的情况下,从进一步提高前处理的效率并且防止探针破坏的观点出发,优选异丙醇/水的体积比为65/35~15/85、更优选为60/40~30/70、进一步优选为55/45~45/55、特别优选为50/50。
前处理液中无需含有铵盐,但在一些的实施方式中,从操作性和方便性出发,前处理液也可以使用用于溶解待测样品的溶液或缓冲液。例如,在通过本发明的分析方法分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的情况下,可以采用前文中说明的稀释步骤中使用的缓冲液。
上述电压施加步骤中,只要包含施加正电压的过程和施加负电压的过程即可,对于正电压与负电压的施加顺序没有限定。在一些优选的实施方式中,最初施加的电压为正电压,最后施加的电压为负电压。
对于施加的电压,可以为恒定值,也可以为线性变化值、梯度变化值等变化值。从操作性的观点出发,优选以恒电压模式施加正电压、负电压。施加的电压通常可以选择电喷雾电离通常使用的电压,例如可以正电压为+1kV~+7kV、优选+2kV~+5kV,所述负电压为-7kV~-1kV、优选低于-5kV~-2kV。若电压过大,则担心探针发生破坏。另一方面,若电压过小,则有时难以发挥放电的作用。
上述电压施加步骤中,正电压与负电压的相对大小没有限定。在一些优选的实施方式中,正电压的绝对值小于负电压的绝对值。需要说明的是,在正电压或负电压为变化值的情况下,“正电压的绝对值小于负电压的绝对值”中的“正电压”和“负电压”分别是指“正电压”和“负电压”的时间加权平均值。在一些优选的实施方式中,负电压(以时间加权平均值计)设为-4.0kV~-2.0kV、更优选设为-3.5kV~-2.5kV、进一步优选设为-3.2kV~-2.8kV,正电压设为1.5kV以上且不足3.0kV、更优选设为2.0kV~2.5kV、进一步优选设为2.2kV~2.4kV。在一些优选的实施方式中,负电压的绝对值中的最小值大于或等于所述正电压的绝对值中的最大值。
施加负电压的时间与施加正电压的时间可以根据所使用的探针和离子源设备适当设定。施加正电压的总时间和施加负电压的总时间分别可以为5秒以上且5分钟以下。若时间过短则有时难以期待效果,若时间过长则有时耗费过多的时间和成本。从性能价格比的观点出发,施加正电压的总时间和施加负电压的总时间分别优选为8秒以上且4分钟以下、更优选为8秒以上且3分钟以下、进一步优选为10秒以上且2分钟以下、特别优选15秒以上且1分钟以下。
在一些实施方式中,施加负电压的总时间小于施加正电压的总时间。在一些优选的实施方式中,可以将施加正电压的总时间设为1.5分钟以上且3.5分钟以下,将施加负电压的总时间设为10秒以上且1.2分钟以下,优选的是,将施加正电压的总时间设为2分钟以上且3分钟以下,将施加负电压的总时间设为15秒以上且30秒以下。
通过如上所述,使施加负电压的时间短于施加正电压的时间,从而有利于保持探针的高稳定性,故而优选。推测这是因为适宜地控制了探针表面的氧化层(表面具有硅涂层的情况下为氧化硅层)生成的程度,但不限定于此。在探针表面具有硅涂层的情况下,尤其能够发挥本申请的前处理的效果,故而优选。
在一些实施方式中,在电压施加步骤的过程中,也可以将电压暂停,并将探针的前端浸渍于前处理液,然后对浸渍后的探针继续施加电压。在一些优选的实施方式中,在电压施加步骤的过程中,可以在施加正电压的过程与施加负电压的过程之间,将探针的前端浸渍于前处理液。通过这样在施加电压的间隔中浸渍探针前端,从而能够降低探针破坏的可能性,故而优选。
上述前处理方法可以进行一次,也可以根据需要进行多次。在一些实施方式中,可以逐次进行前处理,并且在每一次前处理后观测探针信号,直至获得高且稳定的探针信号。
图1为示出探针在前处理前后的信号强度的变化的图。从图1可见,使用未经前处理的探针进行马兜铃酸A标准样品分析时,在前3次进样过程中,样品的信号强度缓慢升高,第4次进行时信号强度陡然升高,第5次到第10次进样时,信号强度又显著下降。由此可见,未经前处理的探针的信号强度十分不稳定。图1中,在第10次进样后对探针进行前处理。从图1可见,使用前处理后的探针,进行马兜铃酸A标准样品分析时,第11次和第12次进样信号强度显著增大,而后信号强度开始稳定,并且连续进样20次后,信号强度仍十分稳定,且信号强度较大。由此可见,通过探针的前处理,能够有效地提高探针的使用次数,并且能够实现更稳定性、更高灵敏度的分析。
需要说明的是,上述探针的前处理方法不仅限于马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析中的应用,只要是探针电喷雾电离质谱法中使用的探针,无论检测对象和目标物质如何,均可以通过上述探针的前处理方法来改善探针的寿命,提高分析的灵敏度和稳定性。例如,上述探针的前处理方法可以用于通过探针电喷雾电离质谱法检测农残、兽残等的场景。
另外,本发明中,质谱分析步骤中,可以使用归一化法、内标法、外标法及标准加入法等任意的分析方法。本发明中,若采用外标法,则标准曲线的线性相关系数通常为0.9~0.99。另一方面,若采用内标法,则马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃内酰胺I均可获得线性相关系数高的标准曲线,例如R2高于0.99、在一些情况下高于0.999,此外,灵敏度和检测限也有时优于外标法。因此,从减少基质效应、提高分析的灵敏度、准确性的观点出发,优选采用内标法进行马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析。对于和/或马兜铃内酰胺的分析,现有技术中常用的内标物质包括氘代马兜铃酸A、吲哚美辛、金合欢素、萘普生等。萘普生作为一种常见药物,结构与马兜铃酸相似,从易购性出发优选用作内标物质。
实施例
以下说明本发明的实施例,但本发明不限定于下述的实施例。
本实施例采用探针电喷雾离子源串联三重四极杆质谱仪分析中药材天仙藤、细辛中的马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃内酰胺I。
以下具体说明装置构成以及检测的条件、步骤和结果。
本实施例中,按照如下的步骤将作为样品的天仙藤、细辛分别破碎后,用甲醇水提取,经过稀释后供于探针电喷雾离子源串联三重四极杆质谱仪,通过内标法进行分析。
(1)取100g样品,用粉碎机破碎,过0.35mm样品筛;
(2)准确称取0.2g样品于50mL离心管;
(3)加入20mL提取用溶剂(甲醇/水,体积比70/30);
(4)超声提取40min,用甲醇/水溶液定容至25mL;
(5)配置乙醇/水(60/40)溶液,其含2mM甲酸铵,0.1%甲酸,10ppb萘普生(内标);
(6)取20μL上清液用上述乙醇/水溶液稀释至1mL;
(7)取10μL稀释液进样分析。
装置及其工作条件
本实施例中,在株式会社岛津制作所制造的三重四极杆质谱仪LCMS-8060上安装株式会社岛津制作所制造的探针电喷雾电离装置,构成探针电喷雾离子源串联三重四极杆质谱仪,作为质谱分析装置。
探针电喷雾离子源设定为如下的工作条件。
取样时间:50秒 放电电压:2.3kV(+)/3.0kV(-)
取样位置:46.0mm 探针清洗:0.05min(+)/0.05min(-)
离子化时间:220msec 探针频率:2.78Hz
探针型号:表面具有硅涂层的17928A1(株式会社岛津制作所制造)
探针的前处理条件:在含2mM甲酸铵、0.1%甲酸的乙醇/水(60/40)溶液中浸渍后,在+2.3kV电压下放电处理2.55min,在-2.3kV电压下处理0.15min,在-3.7kV电压下处理0.2min。
三重四极杆质谱仪设定为如下的工作条件。
离子源:PESI(+) DL管温度:250℃
接口电压:2.5kV 加热模块温度:30℃
扫描模式:多反应监测(MRM)MRM参数:见表3
表3
*为定量离子
图2示出马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃内酰胺I的标准样品的MRM色谱图。制作马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃内酰胺I的内标标准曲线,将它们分别示于图3~图7。将各马兜铃酸和马兜铃内酰胺的内标标准曲线回归方程、线性相关系数、线性范围、检出限、定量限示于如下的表4。
表4
由表4可见,线性相关系数高于0.999、检出限处于0.04~0.66μg/g、定量限为0.13~1.99μg/g,表现出高灵敏度。
使用上述标准曲线,分别在0.20μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L的浓度下测定各马兜铃酸和马兜铃内酰胺的标准样品精密度(n=6),将结果示于表5。
表5
使用上述标准曲线,分别以1μg/L、20μg/L的加标浓度,对作为样品的天仙藤、细辛中的各马兜铃酸和马兜铃内酰胺进行分析,将各马兜铃酸和马兜铃内酰胺在天仙藤、细辛中的加标回收率(n=4),将结果示于表6,将天仙藤、细辛中的各马兜铃酸和马兜铃内酰胺的含量示于表7。
表6
*表示未在1μg/L或20μg/L的加标浓度下测定。
表7
由表7可见,本实施例中,对于天仙藤、细辛,通过简单的提取、以及使用特定缓冲液的稀释处理后,使用本发明的基于探针电喷雾电离质谱法的分析方法测定了马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D、马兜铃内酰胺I,其结果,天仙藤、细辛中的各马兜铃酸和马兜铃内酰胺的RSD(标准偏差)处于2.0~10.3%(n=4,平行样品)之间,得到了良好的重现性。
产业上的可利用性
依据本发明的分析方法,能够简化样品前处理的工艺,实现高灵敏度、高准确性且更快捷的检测,在分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的用途中有用。依据本发明的分析方法,能够提高探针电喷雾电离用探针的寿命和稳定性,在基于探针电喷雾电离质谱法的分析中有用。
上述已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (18)
1.一种马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的分析方法,其特征在于,其是针对植物来源的样品,使用探针电喷雾电离质谱法,分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺的方法,
所述方法具备以下步骤:
稀释步骤,在所述样品中添加缓冲液进行稀释;以及,
质谱分析步骤,将稀释后的所述样品进行探针电喷雾电离,并导入到质谱分析装置,
所述缓冲液含有铵盐以及酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸,
所述质谱分析步骤中的所述探针电喷雾电离所使用的探针实施了前处理,
所述前处理包括:
浸渍步骤,将所述探针的前端浸渍于酸性的前处理液;以及,
电压施加步骤,以在施加负电压后施加正电压、或者在施加正电压后施加负电压、或者交替施加正电压和负电压的方式,对浸渍后的所述探针施加电压。
2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述样品为选自由蔬菜、中药材、中药提取物、以及中药制剂组成的组中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述样品为固体样品,在所述稀释步骤之前,还包括以下步骤:
粉碎步骤,将所述固体样品粉碎;以及,
提取步骤,在粉碎后的所述固体样品中加入提取溶剂进行提取,得到样品提取液,
将所述样品提取液供于所述稀释步骤。
4.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述缓冲液含有水和有机溶剂。
5.根据权利要求4所述的分析方法,其特征在于,所述有机溶剂与水的体积比为70/30~20/80。
6.根据权利要求4所述的分析方法,其特征在于,所述有机溶剂为选自由二甲亚砜、甲酰胺和碳数为2~4的醇组成的组中的任一种或两种以上。
7.根据权利要求4所述的分析方法,其特征在于,所述有机溶剂为异丙醇和/或乙醇。
8.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述铵盐为甲酸铵,所述pKa为4.8以下的羧酸为甲酸。
9.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺为选自由马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D和马兜铃内酰胺I组成的组中的任一种或两种以上。
10.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析装置为三重四极杆质谱仪。
11.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析步骤中,在多反应监测模式下分析马兜铃酸和/或马兜铃内酰胺。
12.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述质谱分析步骤中的所述探针电喷雾电离所使用的探针的表面具有硅涂层。
13.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述正电压处于+2k~+5kV的范围内,所述负电压处于-5kV~-2kV的范围内。
14.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述电压施加步骤中,最初施加的电压为正电压,最后施加的电压为负电压。
15.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述负电压的绝对值中的最小值大于或等于所述正电压的绝对值中的最大值。
16.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,施加负电压的总时间小于施加正电压的总时间。
17.根据权利要求1或2所述的分析方法,其特征在于,所述前处理液含有酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸。
18.根据权利要求17所述的分析方法,其特征在于,相对于所述前处理液,所述酸解离常数pKa为4.8以下的羧酸的含有量为0.08~0.45重量%。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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