CN106814155B

CN106814155B - 一种西红柿中烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法

Info

Publication number: CN106814155B
Application number: CN201710141461.4A
Authority: CN
Inventors: 张洪非; 费婷; 罗彦波; 陈欢; 李翔宇; 姜兴益; 庞永强; 吴达; 戚大伟; 朱风鹏; 胡少东; 付亚宁; 韩书磊
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2037-03-10
Also published as: CN106814155A

Abstract

本发明公开了一种西红柿中烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法。其特征在于：将西红柿样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用两根手性柱串联‑合相色谱串联质谱法分析，采用峰面积归一化法定量检测西红柿中S‑(‑)‑烟碱和R‑(+)‑烟碱的比例。本方法提供的检测方法，样品萃取净化方法简单高效，可降低样品液对色谱柱的污染，合相色谱串联质谱法检测方法灵敏度高，特异性好，可排除假阳性，分析时间短，能够满足大批量西红柿样品中烟碱的手性分析。

Description

一种西红柿中烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法

技术领域

本发明涉及西红柿化学成分测定方法，具体涉及一种西红柿中烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法。

背景技术

烟碱，也叫尼古丁，是一种存在于茄科植物中的生物碱，也是烟草的重要成分。烟碱分子含有一个手性中心，即四氢吡咯环上的2位碳原子，所以烟碱有两个对映体：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱。烟碱的两个对映体具有完全不同含量、代谢机理和生理特性。因此需进行西红柿中烟碱的手性分析。

目前关于烟碱的手性分析，主要是采用气相色谱法进行研究，例如申请号为201610663534.1的专利《一种卷烟烟丝中烟碱的手性分析方法》，该方法前处理步骤复杂，并且检测时间达到140min，不能满足大量样品的检测，目前尚未有关于西红柿中烟碱的手性分析的方法。因此有必要开发一种灵敏度高、精密度好、适合大批量准确定量西红柿中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的方法。手性柱-合相色谱串联质谱在异构体分离方面有着明显的优势，因此通过大量实验建立了西红柿中烟碱手性的手性柱-合相色谱串联质谱分析方法，该方法更适合用于大量样品中烟碱的手性分析。

发明内容

本发明的目的正是以烟碱为研究对象，对西红柿样品进行了前处理方法研究，建立了串联手性柱-合相色谱串联质谱法检测西红柿中烟碱旋光异构体的分析方法，实现了对西红柿中烟碱旋光对映体S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的准确测定。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：将西红柿样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用串联手性柱-合相色谱串联质谱法分析，采用峰面积归一化法定量检测西红柿中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的比例。具体步骤如下：

1. 标准溶液的配制：称取约100.0 mg的S-(-)-烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-烟碱标准储备液；称取约50.0mg的R-(+)-烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为1.0mg/mL的R-(+)-烟碱标准储备液；利用S-(-)-烟碱标准储备液和R-(+)-烟碱标准储备液稀释配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为100 μg/mL和80 μg/mL的混合标准溶液。

2.西红柿样品的混匀：将西红柿样品置于40 ℃烘箱中，1小时后将西红柿取出，使用冷冻干燥机粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。

3. 西红柿样品的萃取：称取2 g已粉碎的样品于15 mL具塞离心管中，加入2.0 mL5% 的氢氧化钠溶液，涡旋1 min混匀后静置10 min浸润样品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min，过滤上清液并氮吹浓缩至2 mL。

4. 萃取液的净化：取1.5 mL浓缩液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA吸附剂，7.5 mg GCB吸附剂，统称基质分散固相萃取材料），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1 min。取上清液氮吹浓缩至0.3 mL后过0.22 μm有机相滤膜后进合相色谱串联质谱分析。

5. 串联手性柱-合相色谱串联质谱法条件：分析柱1为Trefoil CEL1柱（柱长 150mm ，内径3.0 mm ，固定相粒径2.5 µm），分析柱2为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm)；流动相A为：CO₂，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.1 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A。柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min。分析时间总计12 min。质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300℃，电喷雾电压为5000 V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测（MRM）；MRM参数见下表。通过对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。

本发明提供了一种西红柿中烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法，具有以下优良效果：可降低样品液对色谱柱的污染，合相色谱串联质谱法检测方法灵敏度高，特异性好，可避免假阳性，分析时间短，能实现对S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的基线分离，R-(+)-烟碱的检出限（LOD）为0.04%，能够满足大批量西红柿样品中烟碱的手性分析。

附图说明

图1为混合标准溶液的色谱图，

图2为西红柿样品的色谱图。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。

1. 仪器和试剂

ACQUITY UPC2超高效合相色谱仪（美国Waters公司），6410B三重串联四级杆质谱仪（美国Agilent公司），AE163电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），高速粉碎机（武汉银彩科技有限公司），美国ColeparmerVotex-Genie漩涡振荡器，德国SIGMA 3-30K-高速台式冷冻型离心机。甲基叔丁基醚（色谱纯），氢氧化钠（分析纯），甲酸（色谱纯），甲醇（色谱纯），S-(-)-烟碱标准品（CAS：54-11-5），R-(+)-烟碱标准品（CAS：25162-00-9）。

2. 标准溶液的配制

称取约100.0 mg的S-(-)-烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-烟碱标准储备液；称取约50.0 mg的R-(+)-烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为1.0 mg/mL的R-(+)-烟碱标准储备液；利用S-(-)-烟碱标准储备液和R-(+)-烟碱标准储备液稀释配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为100 μg/mL和80 μg/mL的混合标准溶液。

3.西红柿样品的混匀：将西红柿样品置于40 ℃烘箱中，1小时后将西红柿取出，使用冷冻干燥机粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。

4. 西红柿样品的萃取：称取2 g已粉碎的样品于15 mL具塞离心管中，加入2.0 mL5% 的氢氧化钠溶液，涡旋1 min混匀后静置10 min浸润样品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min，过滤上清液并氮吹浓缩至2 mL。

5. 萃取液的净化：取1.5 mL浓缩液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA吸附剂，7.5 mg GCB吸附剂），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1 min。取上清液氮吹浓缩至0.3 mL后过0.22 μm有机相滤膜后进合相色谱串联质谱分析。

6. 串联手性柱-合相色谱串联质谱法条件：分析柱1为Trefoil CEL1柱（柱长 150mm ，内径3.0 mm ，固定相粒径2.5 µm），分析柱2为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm)；流动相A为：CO₂，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.1 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A。柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min。分析时间总计12 min。质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300℃，电喷雾电压为5000 V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测（MRM）；MRM参数见下表。通过对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。

7. R-(+)-烟碱的检出限

烟碱的手性组成通常以R-(+)-烟碱占总烟碱的百分比来表示。为评估R-(+)-烟碱的检出限，本发明方法在S-(-)-烟碱的标准溶液中加入R-(+)-烟碱的标准溶液。结果表明，S-(-)-烟碱的标准溶液中即可观察到R-(+)-烟碱的响应信号，对定量离子峰面积进行归一化后，S-(-)-烟碱的标准溶液中R-(+)-烟碱的比例为0.04%（峰面积相对于总烟碱峰面积），以此作为本方法R-(+)-烟碱的检出限。

8. 西红柿样品中烟碱的手性分析实例

将按照上述步骤处理的西红柿样品进行合相色谱串联质谱分析；采用西红柿中烟碱MRM离子进行定性分析，对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。

采用该方法对2个西红柿样品进行了分析，结果见表1。

9. 分析方法的精密度

取同一西红柿样品进行5次日内和日间平行测定，考察了本发明方法的精密度，结果见表2和表3。结果表明，西红柿样品中R-(+)-烟碱的日内和日间测定结果的变异系数分别为2.52%和2.28%，精密度较好。

采用具体实施方式中的方法对上述2个西红柿样品进行了检测。检测得到的色谱图如图1和图2所示。

Claims

1.一种西红柿中烟碱的手性分析合相色谱串联质谱法，其特征在于：将西红柿样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用手性柱-合相色谱串联质谱分析，采用峰面积归一化法定量检测西红柿中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的比例，具体步骤如下：

1). 标准溶液的配制：称取约100.0 mg的S-(-)-烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-烟碱标准储备液；称取约50.0 mg的R-(+)-烟碱标准品，用甲醇溶液稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为1.0mg/mL的R-(+)-烟碱标准储备液；利用S-(-)-烟碱标准储备液和R-(+)-烟碱标准储备液稀释配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为100 μg/mL和80 μg/mL的混合标准溶液；

2).西红柿样品的混匀：将西红柿样品置于40 ^oC烘箱中，1小时后将西红柿取出，使用冷冻干燥机粉碎后过0.45毫米孔径标准筛；

3). 西红柿样品的萃取：称取2 g已粉碎的样品于15 mL具塞离心管中，加入2.0 mL 5%的氢氧化钠溶液，涡旋1 min混匀后静置10 min浸润样品，取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇溶液到上述具塞离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min，过滤上清液并氮吹浓缩至2 mL；甲基叔丁基醚和甲醇的体积比90:10；

4). 萃取液的净化：取1.5 mL萃取上清液于2 mL内含有基质分散固相萃取材料的净化离心管中，于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1 min，取上清液氮吹浓缩至0.3 mL后过0.22 μm有机相滤膜后进合相色谱串联质谱分析；所述的基质分散固相萃取材料含：150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA吸附剂，7.5 mg GCB吸附剂；

5).串联手性柱-合相色谱串联质谱法条件：分析柱1为Trefoil CEL1柱，柱长 150 mm，内径3.0 mm ，固定相粒径2.5 µm，分析柱2为Chiralcel OD-H液相色谱柱，柱长 250 mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm；流动相A为：CO₂，流动相B：含0.05%异丙胺的甲醇；流速为1.1 mL/min；梯度洗脱条件为：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0 min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A；柱温40 ℃；进样室温度：10 ℃；进样体积2 μL；背压：1600 psi；ISM补偿流路流动相为含0.1%甲酸的甲醇，流速为0.3 mL/min，分析时间总计12 min；质谱条件：离子源：电喷雾源，扫描方式为正离子扫描，离子源温度为300 ℃，电喷雾电压为5000 V，雾化气压力为40 psi；检测方式：多反应监测；通过对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。