CN110066740A - 一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法。所述杜仲内生真菌的命名为：Aspergillus sp.GZWMJZ‑055，于2018年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2018808。该方法是将采用上述菌株制备种子液，然后在添加杜仲叶的真菌液体培养基或者添加杜仲叶的固体培养基中进行发酵。通过该方法，所述菌株添加杜仲叶调控后沉默基因显著激活，代谢产物的丰富程度以及发酵效价显著提高，发酵提取物抑制α‑葡萄糖苷酶的活性明显提高。

Description

一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法
技术领域
本发明涉及一株内生真菌，具体的是一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法。
背景技术
植物内生真菌与其宿主植物在长期协同进化过程中，形成了互惠共生关系，内生真菌的代谢途径受宿主植物的影响，其合成次生代谢产物的编码基因非常丰富。但是大部分编码基因在常规培养条件下处于沉默状态。因此，通过代谢调控使内生真菌代谢产物多样性和新颖性充分表达出来，是有效利用植物内生真菌资源的迫切需要。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术存在的不足之处，提供一种可有效激活内生真菌沉默基因表达的方法，并获得沉默基因显著激活的杜仲内生真菌，菌株GZWMJZ-055，鉴定为曲霉菌（Aspergillus sp.），保藏号为CCTCC NO：M 2018808，保藏日期为2018年11月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，该方法的具体步骤为：
A.种子液制备，将上述的菌株按培养基的重量份数的1-3%接种在培养基中扩大培养制备种子液；
B.在真菌液体培养基或者固体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵。
其中步骤A中所述的种子液培养基的重量份数为：甘露醇15-25份、麦芽糖15-25份、葡萄糖5-10份、谷氨酸钠5-10份、酵母浸膏1-3份、玉米粉0.5-1份、磷酸二氢钾0.5-1份、硫酸镁0.3-1份，加入到800-1000份纯净水中，调节pH值 6.5~7.5。
步骤B中所述真菌液体培养基的组成按重量份数计为：可溶性淀粉10-15份、蛋白胨1-2份、纯净水1000份、调节pH值 6.5~7.5；所述的真菌固体培养基的组成按重量份数计为：大米100-150份、纯净水100-150份。
步骤B中种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵温度为28-35℃，发酵时间为20—30天。
步骤B中真菌液体培养基或者固体培养基添加杜仲叶的量为：杜仲干叶按培养基的重量的1%-2%添加，新鲜杜仲叶按培养基的重量的5%-10%添加，或添加后杜仲叶与培养基一起灭菌后备用。
发酵结束后，真菌液体培养基和固体培养基均用少量的乙酸抑制将菌株灭活，然后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，浓缩得到发酵提取物。在菌株发酵培养基中添加杜仲叶进行调控后，菌株的发酵效价明显提高。
具体实施方式
实施例1
一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，该方法的具体步骤为：
选择菌株的名称为：Aspergillus sp. GZWMJZ-055，于2018年11月21日保藏单位于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2018808。
A.种子液制备，将上述的菌株按培养基的重量份数的1%接种在培养基中扩大培养制备种子液；
B.在真菌液体培养基或者固体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵。
其中步骤A中所述的种子液培养基的重量份数为：甘露醇15份、麦芽糖25份、葡萄糖5份、谷氨酸钠10份、酵母浸膏1份、玉米粉1份、磷酸二氢钾0.5份、硫酸镁1份，加入到1000份纯水中，调节pH值 6.5。
步骤B中所述真菌液体培养基的组成按重量份数计为：可溶性淀粉10份、蛋白胨2份、纯净水1000份、调节pH值 6.5；所述的真菌固体培养基的组成按重量份数计为：大米120份、纯净水100份。
步骤B中种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵温度为30℃，发酵时间为35天。
步骤B中真菌液体培养基或者固体培养基添加杜仲叶的量为：杜仲干叶按培养基的重量的2%添加，添加后杜仲叶与培养基一起灭菌后备用。设置不添加杜仲叶的真菌液体培养基或者固体培养基为对照组。
发酵结束后，真菌液体培养基和固体培养基均用少量的乙酸抑制将菌株灭活，然后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，浓缩得到发酵提取物。
实施例2
一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，该方法的具体步骤为：
选择菌株的名称为：Aspergillus sp.GZWMJZ-055，于2018年11月21日保藏单位于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2018808。
A.种子液制备，将上述的菌株按培养基的重量份数的2%接种在培养基中扩大培养制备种子液；
B.在真菌液体培养基或者固体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵。
其中步骤A中所述的种子液培养基的重量份数为：甘露醇20份、麦芽糖20份、葡萄糖10份、谷氨酸钠10份、酵母浸膏3份、玉米粉1份、磷酸二氢钾1份、硫酸镁0.5份，加入到900份纯水中，调节pH值 7.0。
步骤B中所述真菌液体培养基的组成按重量份数计为：可溶性淀粉10份、蛋白胨1份、纯净水1000份、调节pH值7.0；所述的真菌固体培养基的组成按重量份数计为：大米100份、纯净水120份。
步骤B中种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵温度为28℃，发酵时间为30天。
步骤B中真菌液体培养基或者固体培养基添加杜仲叶的量为：杜仲干叶按培养基的重量的1%添加，添加后杜仲叶与培养基一起灭菌后备用。设置不添加杜仲叶的真菌液体培养基或者固体培养基为对照组。
发酵结束后，真菌液体培养基和固体培养基均用少量的乙酸抑制将菌株灭活，然后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，浓缩得到发酵提取物。
实施例3
一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，该方法的具体步骤为：
选择菌株的名称为：Aspergillus sp.GZWMJZ-055，于2018年11月21日保藏单位于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2018808。
A.种子液制备，将上述的菌株按培养基的重量份数的3%接种在培养基中扩大培养制备种子液；
B.在真菌液体培养基或者固体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵。
其中步骤A中所述的种子液培养基的重量份数为：甘露醇25份、麦芽糖15份、葡萄糖10份、谷氨酸钠5份、酵母浸膏3份、玉米粉0.5份、磷酸二氢钾1份、硫酸镁0.3份，加入到800份纯水中，调节pH值7.5。
步骤B中所述真菌液体培养基的组成按重量份数计为：可溶性淀粉15份、蛋白胨1份、纯净水1000份、调节pH值7.5；所述的真菌固体培养基的组成按重量份数计为：大米150份、纯净水150份。
步骤B中种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵温度为35℃，发酵时间为20天。
步骤B中真菌液体培养基或者固体培养基添加杜仲叶的量为：新鲜杜仲叶按培养基的重量的5%添加，添加后杜仲叶与培养基一起灭菌后备用。设置不添加杜仲叶的真菌液体培养基或者固体培养基为对照组。
发酵结束后，真菌液体培养基和固体培养基均用少量的乙酸抑制将菌株灭活，然后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，浓缩得到发酵提取物。
实施例4
对实施例1-3获得的发酵提取物进行了发酵效价的分析和α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试，实验结果表明(表1)，在菌株发酵培养基中添加杜仲叶进行调控后，菌株的发酵效价明显提高，发酵提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性明显增加。
表 1. 菌株在不同培养条件下的发酵效价和发酵提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性（阳性对照阿卡波糖的IC50值为170.9 μg/mL。
植物内生真菌由于与宿主植物长期互利共生，其代谢基因可能需要宿主植物的化学成分进行刺激才能表达，本发明提出了一种在发酵培养基中添加杜仲叶来激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，本发明的其它实施例可以在上述公开的实施例基础上，通过数值和特征的简单替换，可以获得多个实施例，且本领域技术人员在了解本发明内容的基础上，可以方便地实施本发明，并不需要做出任何创造性劳动。

Claims (7)

1.一株杜仲内生真菌，其特征在于，所述菌株的命名为：Aspergillus sp. GZWMJZ-055，于2018年11月21日保藏单位于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2018808。
2.一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：
A.种子液制备，将权利要求1所述的菌株按培养基的重量份数的1-3%接种在培养基中扩大培养制备种子液；
B.在真菌液体培养基或者固体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵。
3.根据权利要求2所述的一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，其特征在于：步骤A中所述的种子液培养基的重量份数为：甘露醇15-25份、麦芽糖15-25份、葡萄糖5-10份、谷氨酸钠5-10份、酵母浸膏1-3份、玉米粉0.5-1份、磷酸二氢钾0.5-1份、硫酸镁0.3-1份，加入到800-1000份的纯净水中，调节pH值 6.5~7.5。
4. 根据权利要求2所述的一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，其特征在于：步骤B中所述真菌液体培养基的组成按重量份数计为：可溶性淀粉10-15份、蛋白胨1-2份、纯净水1000份、调节pH值 6.5~7.5；所述的真菌固体培养基的组成按重量份数计为：大米100-150份、纯净水100-150份。
5.根据权利要求2所述的一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，其特征在于：步骤B中种子液接种到配置好的真菌液体培养基或者固体培养基中进行发酵温度为28-35℃，发酵时间为20—30天。
6.根据权利要求2所述的一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，其特征在于：步骤B中真菌液体培养基或者固体培养基添加杜仲叶的量为：杜仲干叶按培养基的重量的1%-2%添加，或新鲜杜仲叶按培养基的重量的5%-10%添加，添加后杜仲叶与培养基一起灭菌后备用。
7.根据权利要求2-6任意一项所述的一种经代谢调控激活杜仲内生真菌沉默基因的方法，其特征在于：该方法能使权利要求1所述的杜仲内生真菌代谢产物的丰富增加，发酵效价提高，发酵提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性提高。
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