CN109706083B - 一种经代谢调控后抗菌活性显著增加的杜仲内生真菌 - Google Patents
一种经代谢调控后抗菌活性显著增加的杜仲内生真菌 Download PDFInfo
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Abstract
一株经代谢调控后抑菌活性显著增加的杜仲内生曲霉菌（Aspergillus sp.），菌株GZWMJZ‑047，保藏号为CCTCC M 2018807。代谢调控增加杜仲内生菌抗菌活性的方法是在发酵培养基中添加杜仲叶并按照如下步骤实施：（a）种子液制备，将菌株接种在培养基中扩大培养制备种子液；（b）菌株的代谢调控的方法是在真菌液体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基中进行发酵；真菌液体培养基的成分及重量为：可溶性淀粉（10‑15克）、蛋白胨（1‑2克）、自来水1L、pH 6.5~7.5；真菌液体培养基添加杜仲叶的量为：杜仲干叶（1%‑2%）或者新鲜杜仲叶（5%‑10%），所添加的杜仲叶与发酵培养基一起灭菌使用。杜仲内生真菌GZWMJZ‑047通过在其发酵培养基中添加杜仲叶调控后，其发酵提取物的抗菌活性明显增加。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种代谢调控抗菌活性显著增加的杜仲内生真菌。
背景技术
目前，随着抗生素的滥用，病菌的耐药性急剧增加，已成为威胁人类生存的最严重的问题之一。抗生素的滥用不仅包括人类疾病的不合理使用，在养殖业中的滥用更是触目惊心，在养殖过程中使用了大量的人用抗生素，使得病原微生物与抗生素接触增加，大大提高了病原微生物产生耐药的几率。因此，开发养殖业专用的抑菌剂对抗生素的滥用能起到缓解作用。我们从杜仲内生菌中筛选得到一株曲霉菌（Aspergillus sp.），菌株编号为GZWMJZ-047，保藏号为CCTCC M 2018807。在发酵培养基中添加杜仲叶后，其发酵提取物对多种水产致病菌的抑制活性显著增加。
发明内容
本发明目的在于提供一种代谢调控后抗菌活性显著增加的杜仲内生菌，菌株GZWMJZ-047，菌株鉴定为曲霉菌（Aspergillus sp.），保藏号为CCTCC M 2018807，保藏日期为2018年11月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种经代谢调控后抗菌活性显著增加的杜仲内生菌，所述的代谢调控的方法包括如下步骤：
（a）种子液制备，将菌株接种在培养基中扩大培养制备种子液；
（b）菌株的代谢调控的方法是在真菌液体培养基中添加杜仲叶，将种子液接种到配置好的真菌液体培养基中进行发酵。
作为优选：所述的种子液培养基成分及重量为：甘露醇（15-25克）、麦芽糖（15-25克）、葡萄糖（5-10克）、谷氨酸钠（5-10克）、酵母浸膏（1-3克）、玉米粉（0.5-1克）、磷酸二氢钾（0.5-1克）、硫酸镁（0.3-1克）、自来水1L、pH 6.5~7.5。
作为优选，真菌液体培养基的成分及重量：可溶性淀粉（10-15克）、蛋白胨（1-2克）、自来水1L、pH 6.5~7.5。
作为优选，真菌液体培养基添加杜仲叶的量为：杜仲干叶（1%-2%）或者新鲜杜仲叶（5%-10%），所添加的杜仲叶与发酵培养基一起灭菌使用。
作为优选，真菌液体培养基进行培养和发酵温度均为28-35℃，培养和发酵时间均为20—30天。
具体实施方式：
将保藏于4℃的菌株GZWMJZ-047接到PDA固体培养基（葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，马铃薯浸提液1000 mL）平板上，在恒温培养箱，28摄氏度下培养3天。然后从平板上挑取单菌落接种到装有150 mL 的种子液培养基【甘露醇（15-25克）、麦芽糖（15-25克）、葡萄糖（5-10克）、谷氨酸钠（5-10克）、酵母浸膏（1-3克）、玉米粉（0.5-1克）、磷酸二氢钾（0.5-1克）、硫酸镁（0.3-1克）、自来水1L、pH 6.5~7.5】的500 mL锥形瓶中，在28摄氏度的恒温震荡培养器中（180 rpm）培养4天，制备种子液。
将种子液超声破碎，使得菌体在溶液中均匀分散，作为种子液使用。后将种子液分别接种到真菌液体培养基【可溶性淀粉（10-15克）、蛋白胨（1-2克）、自来水1L、pH 6.5~7.5】。设置对照组及实验组，对照组为不添加杜仲叶的真菌液体培养基，实验组为添加杜仲叶的真菌液体培养基，添加量为杜仲干叶（1%-2%）或者新鲜杜仲叶（5%-10%），所添加的杜仲叶与发酵培养基一起灭菌使用。
将接种后真菌液体培养基和固体培养基进行发酵培养，发酵温度均为28-35℃，发酵时间均为20—30天。
发酵结束后，真菌液体培养基用少量的乙酸抑制将菌株灭活，然后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，浓缩得到发酵提取物。
提取物的抗菌活性测试采用二倍稀释法。菌液准备：病原菌培养物用海水校正浓度至0.5麦氏浓度，菌量约为1~2×108 CFU/mL。取100 μL 菌悬液稀释到10 mL液体培养基（2216E液体培养基）中备用。不同浓度提取物的配制及菌液接种：取无菌试管12支，除第1管加入1.6 mL 液体培养基外，其余每管均加入1 mL 液体培养基，在第1管加入640 μg/mL提取物（用液体培养基稀释）0.4 mL混匀，然后吸取1 mL加至第2管，混匀后再吸取1 mL加至第3管，如此连续稀释至第11管，并从第11管中吸取1 mL弃去，第12管为不含药物的空白对照。最后在每管内加入上述制备好的菌液各1 mL，每管菌液浓度大约为5×105 CFU/mL，每个浓度设置三个平行。以环丙沙星作为抑制细菌的阳性对照。将接种好的试管置35℃，200 rpm培养24h。观察菌液状态，无细菌生长管中化合物的最低浓度，即为受试菌的MIC。
实验结果表明(表1)，在菌株发酵培养基中添加杜仲叶进行调控后(实验组)，菌株发酵提取物的抑菌活性显著提高。
表 1. 菌株发酵提取物的抑菌活性
结论
本发明通过代谢调控增加了一株杜仲内生菌的抗菌活性，其发酵提取物对五种水产致病菌具有较强的抑制作用，可用于水产养殖过程中相关病害的防控。
Claims (5)
1.一株杜仲内生曲霉菌（Aspergillus sp.），菌株GZWMJZ-047，保藏号为CCTCC M2018807。
2.一种增加杜仲内生菌发酵提取物抗菌活性的方法，其特征在于，该方法的步骤为：
A制备种子液：将权利要求1所述的菌株接种在种子液培养基中，接种量为1-3%，调节pH值6.5~7.5，进行扩大培养制备种子液；
B液态培养发酵：将步骤A制备的种子液接种到配置好的真菌液体培养基中，添加杜仲叶，调节pH值 6.5~7.5进行液态培养发酵，培养发酵温度为28-35℃，培养发酵时间为20-30天。
3.根据权利要求2所述的一种增加杜仲内生菌发酵提取物抗菌活性的方法，其特征在于，步骤A中所述的种子液培养基的组成按重量份数计：甘露醇15-25g，麦芽糖15-25 g，葡萄糖5-10 g，谷氨酸钠5-10 g，酵母浸膏1-3 g，玉米粉0.5-1 g，磷酸二氢钾0.5-1 g，硫酸镁0.3-1 g，自来水1L。
4.根据权利要求2所述的一种增加杜仲内生菌发酵提取物抗菌活性的方法，其特征在于，步骤B中所述的真菌液体培养基的组成按重量份数计：可溶性淀粉10-15g，蛋白胨1-2g，自来水1L。
5.根据权利要求2所述的一种增加杜仲内生菌发酵提取物抗菌活性的方法，其特征在于，步骤B中杜仲叶的添加量为：杜仲干叶1%-2%或新鲜杜仲叶5%-10%，添加的杜仲叶与发酵培养基一起灭菌使用。
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