CN110042156B - 一种判断子宫内膜容受性的方法及其应用 - Google Patents

一种判断子宫内膜容受性的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种判断子宫内膜容受性的方法及其应用。具体地，本发明提供了一种判断子宫内膜容受性的方法以及判断子宫内膜容受性状态的标志物。本发明的标志物可显著降低子宫内膜容受性判断的错误率。

Description

一种判断子宫内膜容受性的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种判断子宫内膜容受性的方法及其应用。
背景技术
人类生殖过程中，受精卵在母体子宫内定位、黏附、着床，最终发育成一个成熟的胎儿，着床过程对成功妊娠具有重要影响，成功的临床妊娠除需要优质的胚胎之外还需要良好的子宫内膜容受性(endometrial receptivity，ER)、子宫内膜与胚胎的同步发育。子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，只有在短暂的特定时期内子宫内膜才允许胚胎着床，这一时期称为“着床窗口期”，就成年女性而言，相当于月经周期第20-24日或排卵后6-8日。
在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)领域中，反复移植失败的奴性，或者罹患其他继发性不孕症的女性，着床窗口期的时间节点并不准确，如果按月经周期或者排卵日推算着床窗口期，会有很大移植失败的风险。虽然子宫内膜容受性的具体机制目前尚不清楚，但可以明确的是，子宫内膜容受性差是导致体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中胚胎着床失败的重要原因之一。
因此，本领域迫切需要找到一种稳定的、无创的，且准确的子宫内膜容受性评估标志物和评估方法，就可以帮助医疗人员明确子宫内膜容受性状态，准确地帮助患者找到着床窗口期，对于提升体外受精-胚胎移植的成功率意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定的、无创的，且准确的子宫内膜容受性评估标志物和评估方法，就可以帮助医疗人员明确子宫内膜容受性状态，准确地帮助患者找到着床窗口期，对于提升体外受精-胚胎移植的成功率意义重大。
在本发明的第一方面，提供了一种判断子宫内膜容受性的方法，包括步骤：
(a)提供一样本；
(b)测定所述样本中的子宫内膜容受性相关基因的表达量；
(c)将步骤(b)获得的子宫内膜容受性相关基因的表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜容受性。
在另一优选例中，所述样本选自下组：子宫内膜组织、宫腔液、宫腔灌洗液、阴道脱落细胞、阴道分泌物、子宫内膜的活检产物、血清、血浆、或其组合。
在另一优选例中，步骤(b)获得的子宫内膜容受性相关基因的表达量高于预定值时，则表明存在子宫内膜容受性。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因的表达量包括子宫内膜容受性相关基因cDNA的表达量。
在另一优选例中，所述样本为以下时期的样本：LH+n，LH+n+2，LH+n+4，其中，n为3-7，较佳地，n为4-6。
在另一优选例中，所述样本为以下时期的样本：排卵后的第n天，其中，n为3-7，较佳地，n为4-6。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因包括选自表A的至少70％、较佳地，至少80％，更佳地，至少90％，更佳地，至少95％的基因：
表A
Figure BDA0002035910100000021
Figure BDA0002035910100000031
Figure BDA0002035910100000041
Figure BDA0002035910100000051
Figure BDA0002035910100000061
Figure BDA0002035910100000071
Figure BDA0002035910100000081
Figure BDA0002035910100000091
Figure BDA0002035910100000101
Figure BDA0002035910100000111
Figure BDA0002035910100000121
Figure BDA0002035910100000131
Figure BDA0002035910100000141
Figure BDA0002035910100000151
Figure BDA0002035910100000161
Figure BDA0002035910100000171
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因至少包括选自表A的40个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因至少包括选自表A的147个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因至少包括选自表A的259个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因还包括额外的5-200个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因还包括选自表B的一个或多个基因：
表B
Figure BDA0002035910100000172
Figure BDA0002035910100000181
Figure BDA0002035910100000191
Figure BDA0002035910100000201
Figure BDA0002035910100000211
Figure BDA0002035910100000221
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因还包括额外的基因，使得总基因数量达到10000个。
本发明第二方面提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括选自表A的至少70％、较佳地，至少80％，更佳地，至少90％，更佳地，至少95％的基因。
在另一优选例中，所述生物标志物集合至少包括选自表A的40个基因。
在另一优选例中，所述生物标志物集合至少包括选自表A的147个基因。
在另一优选例中，所述生物标志物集合至少包括选自表A的259个基因。
在另一优选例中，所述生物标志物集合还包括额外的5-200个基因。
在另一优选例中，所述生物标志物集合还包括额外的基因，使得总基因数量达到10000个。
在另一优选例中，所述生物标志物集合用于判断子宫内膜容受性，或用于制备一试剂盒或试剂，所述的试剂盒或试剂用于评估待测对象的的子宫内膜容受性状态或诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)待测对象的子宫内膜容受性的状态。
在另一优选例中，所述的生物标志物或生物标志物集合来源子宫内膜组织、宫腔液、宫腔灌洗液、阴道脱落细胞、阴道分泌物、子宫内膜的活检产物、血清、血浆样本。
在另一优选例中，与预定值进行比较，一个或多个选自表A的生物标志物增加，表明待测对象存在子宫内膜容受性。
在另一优选例中，通过选自下组的方法对各个生物标志物进行鉴定：RT-qPCR，RT-qPCR芯片，二代测序，表达谱芯片，甲基化芯片，三代测序、或其组合。
在另一优选例中，所述的集合用于评估待测对象的子宫内膜容受性的状态。
本发明第三方面提供了一种用于子宫内膜容受性状态判断的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测本发明第二方面所述的集合中各个生物标志物的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂包括用选自下组的方法检测本发明第二方面所述的集合中各个生物标志物的物质：RT-qPCR，RT-qPCR芯片，二代测序，表达谱芯片，甲基化芯片，三代测序、或其组合。
本发明第四方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第二方面所述的集合和/或本发明第三方面所述的试剂组合。
本发明第五方面提供了一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于评估待测对象的子宫内膜容受性的状态，其中，所述生物标志物集合包括选自表A的至少70％、较佳地，至少80％，更佳地，至少90％，更佳地，至少95％的基因。
在另一优选例中，所述的评估或诊断包括步骤：
(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；
(2)将步骤(1)测得的水平与一预定值进行比较。
在另一优选例中，所述的样品选自下组：子宫内膜组织、宫腔液、宫腔灌洗液、阴道脱落细胞、阴道分泌物、子宫内膜的活检产物、血清、血浆、或其组合。
在另一优选例中，与预定值进行比较，一个或多个选自表A的生物标志物增加，表明待测对象存在子宫内膜容受性。
在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。
本发明第六方面提供了一种评估待测对象的子宫内膜容受性状态的方法，包括步骤：
(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中集合中各个生物标记物的水平进行检测，所述集合包括选自表A的至少70％、较佳地，至少80％，更佳地，至少90％，更佳地，至少95％的基因；
(2)将步骤(1)测得的水平与一预定值进行比较。
本发明第七方面提供了一种评估待测对象的子宫内膜容受性状态的系统，所述系统包括：
(a)子宫内膜容受性状态的特征输入模块，所述输入模块用于输入待测对象的子宫内膜容受性状态的特征；
其中所述的子宫内膜容受性状态的特征包括选自表A的至少70％、较佳地，至少80％，更佳地，至少90％，更佳地，至少95％的基因；
(b)子宫内膜容受性状态的判别处理模块，所述处理模块对于输入的子宫内膜容受性状态的特征，按预定的判断标准进行评分处理，从而获得子宫内膜容受性状态评分；并且将所述子宫内膜容受性状态评分与预定值进行比较，从而得出辅助诊断结果，其中，当所述子宫内膜容受性状态评分高于所述预定值时，则提示该对象具有子宫内膜容受性；和
(c)辅助诊断结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的辅助诊断结果。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因至少包括选自表A的40个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因至少包括选自表A的147个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因至少包括选自表A的259个基因。
在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因还包括额外的5-200个基因。在另一优选例中，所述子宫内膜容受性相关基因还包括额外的基因，使得总基因数量达到10000个。
在另一优选例中，所述的对象是人。
在另一优选例中，所述的评分包括(a)单个特征的评分；和/或(b)多个特征的评分之和。
在另一优选例中，所述的特征输入模块选自下组：样本采集器、样本保存管、细胞裂解与核酸样本提取试剂盒、RNA核酸逆转录与扩增试剂盒、二代测序文库构建试剂盒、文库定量试剂盒、测序反应试剂盒、或其组合。
在另一优选例中，所述的子宫内膜容受性状态的判别处理模块包括一处理器，以及一储存器，其中所述的储存器中存储有基于子宫内膜容受性状态特征的子宫内膜容受性状态的评分数据。
在另一优选例中，所述的输出模块包括报告系统。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明实施例4中样本cDNA扩增产物分布图；
图2为本发明实施例7所用监督学习方法的流程概述；
图3为本发明实施例7数据处理的流程图；
图4为本发明实施例7中患者检测后的结果示意图；
图5为本发明实施例7受试者检测模式图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了判断子宫内膜容受性的生物标志物及其组合。具体地，本发明发现了一种生物标志物集合，所述的集合包括可以用于评估待测对象的的子宫内膜容受性状态或诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)待测对象的子宫内膜容受性的状态，可极大减少错误率，具有重要的应用价值。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：
根据本发明，术语“子宫内膜容受性”，是指子宫内膜对胚胎的接受能力,只有在短暂的特定时期内子宫内膜才允许胚胎着床。
根据本发明，术语“生物标志物集合”是指一种生物标志物、或两种及两种以上生物标志物的组合。
根据本发明，生物标志物质的水平通过RT-qPCR，RT-qPCR芯片，二代测序，表达谱芯片，甲基化芯片，三代测序等方法进行鉴定。
根据本发明，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG标记)等。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。
根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。
根据本发明，术语“血浆”指的是全血的液体成分。根据所使用的分离方法，血浆可能完全不含细胞成分，也可能含有不同量的血小板和/或少量其它细胞成分。
根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。
检测方法
在本发明中，通过选自下组的方法检测本发明的集合中各个生物标志物的物质：RT-qPCR，RT-qPCR芯片，二代测序，表达谱芯片，甲基化芯片，三代测序、或其组合。
试剂盒
在本发明中，本发明的试剂盒包括本发明第二方面所述的集合和/或本发明第三方面所述的试剂组合。
预定值
在本发明中，预定值是指通过人工智能或决策树C4.5算法(Decision Tree)、隐马尔可夫模型(HMM)、神经网络反向传播(BP)、支持向量机(SVM)、和各种聚类分析算法(包括简单聚类、层次聚类、K平均聚类、自组织映射神经网络、模糊聚类、贝叶斯分类法、K最邻近法、神经网络法、决策树法、投票分类法、主成分分析法等)对子宫内膜容受期(即临床上已经证明该内膜允许胚胎定位、黏附、着床于其上的时期)进行评分所获得的评分分值。
评估方法
在另一优选例中，本发明方法可通过公式S＝W1S1+W2S2+WiSi+……WnSn计算加权综合评分；
其中，W1、W2……Wn为权重；
S1、S2……Sn为每个标志物的评分。
优选地，所述权重可以基于表9中的分析价值。例如对于子宫内膜容受性的评估而言，任一权重(如W1)可以为表9中相应标志物的分析价值。
在一优选实施方式中，
待测人群的Ssubject＝W1S1+W2S2+WiS3+……WnSn。
当待测人群的Ssubject＞预定值时，则表明该对象存在子宫内膜容受性状态。
本发明的实验结果表明，本发明的标志物可极大降低错误率，显著提高子宫内膜容受性状态判断或诊断的准确性。
判断子宫内膜容受性的分析模型的构建方法
在本发明中，判断子宫内膜容受性的分析模型的构建方法包括如下步骤：
经过高灵敏性RNA逆转录和从cDNA扩增，而后将cDNA进行二代测序前建库，上机测序，通过下机数据构建样本的表达谱信息，通过与生物信息学的分析和归类，确定子宫内膜容受性状态，准确的判断子宫内膜着床的窗口期，实现个体化精准判断。
在一优选实施方式中，本发明提供一种判断子宫内膜容受性的分析模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取健康女性不同月经周期的样本，提取RNA、逆转录RNA并扩增cDNA；
(2)构建cDNA文库进行高通量测序；
(3)通过强化学习方法、无监督学习方法或监督学习方法，在不同类标的多个样本中比较不同基因的表达量，得到差异表达的基因，构建分析模型。
本发明以高灵敏的RNA逆转录与cDNA扩增流程为依托，以RNA-seq测序方法为基础，获得了大量患者的子宫内膜、宫腔液或其他生殖内分泌相关体液或脱落物的表达谱信息。并针对这些样本，以取样时期、取样方式、表达谱特征的不同，以生物信息学、统计学以及机器学习的方式进行超高维度的分类和分型。依据分型的不同，判断子宫内膜的容受性状态。
监督学习的任务是学习一个模型，使模型对给定的任意的一个输入，对其都可以映射出一个预测结果，可以实现高维度预测分析。
本发明步骤(3)所述“学习”的“多个样本”指的是同一样本来源、不同个体的样本，比如102例容受期子宫内膜组织，205例容受前期子宫内膜组织，300例容受后期子宫内膜组织等。
优选地，步骤(1)所述不同月经周期为三个时期。
优选地，所述三个时期的中间时期为LH+7，或排卵后的第5天。
本发明使用的检验样本为处于自然月经周期的女性受试者，在促黄体生成素(LH)峰值出现后的第七天(LH+7)进行子宫内膜活检，或者，处于激素替代(HRT)周期的女性受试者，在排卵后第5天(P+5)进行子宫内膜活检。不适用于有子宫内膜病变者(包括宫腔粘连内膜息肉内膜结核等)、有输卵管积水且未行输卵管近端结扎者、有粘膜下子宫肌瘤或突向宫腔的肌壁间子宫肌瘤或腺肌瘤患者以及子宫内膜异位症(III–IV期)患者。
优选地，所述三个时期还包括中间时期前后各1-3天的时期，优选为2天的时期。
优选地，所述中间时期为容受期，中间时期前1-3天为容受前期，中间时期后1-3天为容受后期。
本发明中，模型所用“训练数据”或称“训练集”的入组标准为：自然周期中不同的健康中国女性，没有既往病史，没有原发性不孕证，体重指数在19-25kg/m2之间。随着大量样本的入组、测试和入组病例临床结局的积累，发明人掌握了这些病例的子宫内膜组织、宫腔液或其他生殖内分泌相关体液或脱落物“容受期”表达谱，(经过对临床结局的追踪，如该时期进行胚胎植入，均能有效着床并发育，那么就将该时期定义为“容受期”)，同时我们也对这些病例的“容受窗口期”前两天、“容受窗口期”后两天进行取样，获得相应的RNA-seq数据，将其类标分别定义为“容受前期”、“容受后期”。
本发明中，通过分别获取相同个体的不同月经周期的样本，并测序比较不同周期样本基因表达谱特征，可以更好地指导差异表达基因，降低假阳性概率。
优选地，步骤(1)所述样本包括宫底子宫内膜组织、宫腔液或阴道脱落物中的任一种或至少两种的组合。
本发明中，样本可以是子宫内膜的活检产物，也可以是通过无创手段取得的患者宫腔液，甚至是宫腔灌洗液、阴道脱落细胞和阴道分泌物，样本来源广泛，取样方便快捷，增加女性的依从度，同时验证同一个体的不同来源样本可提高基因表达谱特征的准确性；宫腔灌洗液、阴道脱落物或阴道分泌物样本量小，常规检测方法中需要大量的样本，因此只能选择子宫内膜的活检产物，而本申请通过微量的样本即可满足测试需要，因此扩大了样本种类，降低受试者的痛苦与不适。
优选地，所述宫底子宫内膜组织的取样量大于5mg，优选为5-10mg，例如可以是5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg。
优选地，所述宫腔液的取样量大于10μL，优选为10-15μL，例如可以是10μL、11μL、12μL、13μL、14μL或15μL。
优选地，所述阴道脱落物的取样量大于5mg，优选为5-10mg，例如可以是5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg。
本发明中，样本取样量小，准确率高，无需大量样本即可准确预测样本的容受性状态。
优选地，步骤(2)所述文库中cDNA的浓度为不小于5ng/μL。
优选地，步骤(2)所述测序包括RNA-Seq测序和/或qPCR测序。
本发明中，RNA-Seq测序方法较芯片测序更具优势，所能检测到的差异表达基因数量是芯片测序的2-8倍，针对低丰度基因检测的准确性，RNA-Seq的qPCR验证率是芯片的5倍，差异表达倍数准确性方面，RNA-Seq与qRCR相关性比芯片高14％，本发明所用RNA-Seq或qPCR测序方法为本领域技术人员常用技术手段。
优选地，步骤(2)所述测序的读长大于45nt。
优选地，步骤(2)所述测序的reads数不少于2.5兆reads。
本发明中，测序的读长大于45个碱基，测序的读段数不少于2.5兆以满足测序需要。
本发明中，特异性选择上机测序的读长与reads数，在保证准确性的同时降低实验周期和成本。
优选地，步骤(3)之前还包括数据预处理步骤。
优选地，所述数据预处理步骤为对基因长度和测序深度进行标准化。
优选地，所述标准化的方法包括RPKM、TPM或FPKM中的任一种或至少两种的组合，优选为FPKM。
本发明中，在获取不同类标的RNA-Seq数据后，使用FPKM(Fragments PerKilobase Million)对基因长度和测序深度进行标准化，以排除测序深度的影响，同类的标准化方法还有RPKM(Reads Per Kilobase Million)和TPM(Trans Per Million)，本发明优选FPKM进行标准化。
FPKM适用于双端测序文库或单端测序文库，因而比较灵活，易于产品化；而RPKM只适用于单端测序文库；TPM数值能体现出比对上某个基因的reads的比例，使得该数值可以直接进行样本间的比较，但过程比较繁琐，运算缓慢，批量分析的效率不高。
在本发明的监督学习中，通过使用带有容受前期、容受窗口期、容受后期类标的训练数据构建模型，可以通过训练得到的模型对未知的数据(指新样本)的容受性状态进行预测。比如，新输入一例样本的宫腔液表达谱，使用该机器学习模型的判断其容受性状态。
优选地，所述类标为子宫内膜组织、宫腔液或阴道脱落物在不同容受状态下的表达谱特征。
本发明中，针对同一个体获取不同来源的样本，包括子宫内膜组织、宫腔液或阴道脱落物中的任一种或至少两种的组合在不同容受状态下的表达特征谱，显著提高预测结果可信度。
优选地，所述差异表达基因的分析方法为：找到每个样本FPKM>0的所有基因，再筛选容受前期与容受期、容受前期与容受后期、容受期与容受后期的差异表达基因的交集，满足p_value<0.05，且满足Fold_change>2或Fold_change<0.5。
本发明中，通过对样本的筛选，排除在不同类标中始终高表达或始终低表达的基因对分析模型的影响，为了后续分析模型取得良好的拟合效果同时确保排除过拟合的情况。
优选地，步骤(3)所述监督学习方法包括朴素贝叶斯、决策树、逻辑回归、KNN或支持向量机中的任一种或至少两种的组合，优选为支持向量机。
支持向量机对原始数据的分布没有很多限制，不需要先验信息，而RNA-Seq测序获得的数据量极大，不同基因有着不同的表达量，支持向量机可以保持一个超多维(超高维度)的分析，使模型更加精准。
优选地，所述支持向量机的脚本为：
library(e1071)
svm.model<-svm(data.class～.,data4,kernel＝'linear')
summary(svm.model)
table(data$class,predict(svm.model,data4,type＝"data.class"))
mydata＝read.table(file.choose(),header＝T,row.names＝1)
mydata2＝log2(mydata+1)
predict(svm.model,mydata2)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type＝"shdata.class"))
##
table(testdata$data.class,predict(svm.model,testdata,type＝"data.class"))
shdata＝read.table(file.choose(),header＝T,row.names＝1)
shdata2＝log2(shdata[,-length(shdata[1,])]+1)
shdata3＝data.frame(shdata2,shdata$class)
predict(svm.model,shdata3)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type＝"shdata.class")).
优选地，所述判断子宫内膜容受性的分析模型的构建方法具体包括如下步骤：
(1)获取健康女性容受前期、容受期和容受后期的样本，分别提取RNA、逆转录RNA并扩增cDNA；
(2)构建cDNA文库，富集并纯化文库，文库浓度不低于5ng/μL，进行高通量上机测序，读长大于45nt，不少于2.5兆reads；
(3)由步骤(2)得到的子宫内膜组织、宫腔液或阴道脱落物在不同容受状态下的表达谱特征作为类标，采用监督学习的方法，使用带类标的数据进行模型训练，在不同类标的多个样本中比较不同基因的表达量，在获取不同类标的RNA-Seq测序数据后，使用FPKM法对基因长度和测序深度进行标准化，通过标准化过程，在不同类标的多个样本中比较不同基因的表达量，排除在不同类标中始终高表达或低表达基因对模型的影响，分析得到差异表达的基因；
(4)采用支持向量机的学习模型，通过使用带有容受前期、容受期和容受后期类标的训练数据构建得到分析模型，对未知的数据容受性状态进行预测，为了提高判断准确率可在多个周期内反复调整取样时间，然后进行容受性测试。
本发明中，通过RNAseq得到下机数据，FPKM进行表达量标准化。比较同一个体不同时期基因表达量差异，差异显著的标记为表达差异基因。找到同一样本容受前期，容受期，容受后期的表达差异最显著的基因。然后用多个个体的不同时期来优化“表达差异基因”，通过机器学习构建三个时期的特征库，对于新来某个待测样本，进行表达量标准化后，根据机器对特征的判别，进行自动归类。本发明的模型构建方法所用的训练集庞大，通过特异性显著的表达差异基因配合支持向量机，充分训练机器，并通过长期跟踪临床结局调整模型，提高模型的准确度。
本发明中，为获得不同个体的个体性容受期可在多个周期内反复调整取样时间，如第一次检测为LH+5，则下一周期测试需推迟2日以获得LH+7；若第一次检测为LH+9，则下一周期测试需提前2日以获得LH+7。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的生物标志物可准确判断子宫内膜容受性的状态，极大降低了错误率，具有重要的应用价值。
(b)本发明以高灵敏的RNA逆转录与cDNA扩增流程为依托，以RNA-seq测序方法为基础，获得了大量患者的子宫内膜、宫腔液或其他生殖内分泌相关体液或脱落物的表达谱信息。并针对这些样本，以取样时期、取样方式、表达谱特征的不同，以生物信息学、统计学以及机器学习的方式进行超高维度的分类和分型。依据分型的不同，判断子宫内膜的容受性状态。
(c)本发明提供了一种稳定地将基因表达谱特征用于判断子宫内膜容受性的模型构建方法，整体优化并调整RNA提取、逆转录、cDNA纯化建库、上机测序并进行相应的数据处理分析建模，显著提高判断子宫内膜容受性的准确度。
(d)本发明的方法具有无创宫腔液活检带来的低伤害性，以及流程快周期短的带来的简便性等特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂和材料均为市售产品。
材料
Qiagen生产的Qiagen RNeasy Micro Kit进行，货号74004；
亿康基因生产的MALBAC白金微量RNA扩增试剂盒进行，货号KT110700724；
Zymo生产的DNA Clean&Concentrator-5，货号D4014；
亿康基因生产的基因测序文库试剂盒(Illumina转座酶法)货号：KT100801924；
Agilent 2100生物分析仪；
高灵敏度DNA芯片；
以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。
实施例1样本的预处理及RNA提取
妇产科医生或有活检样本获取资质的专业人员取样，样本包括大于5mg的宫底子宫内膜组织、大于10ul的宫腔液或大于10ul其他生殖内分泌相关体液、大于5mg阴道脱落物。活检完成后，尽快将组织、脱落物或液体完全浸润于RNA保存液(约20uL RNA Later)中。样品运输之前，样品保存于-20℃或-80℃冰箱。
使用Qiagen生产的Qiagen RNeasy Micro Kit提取子宫内膜组织的RNA，具体方法如下：
1.实验准备：使用RNA酶清除剂和核酸去污剂擦拭双手、移液器以及实验台面(请注意，所有的提取步骤都应于无RNA酶污染区进行)。
2.用去离子水和无水乙醇配制70％乙醇溶液(每样品350uL)以及80％乙醇溶液(每样品500uL)备用。
3.向Buffer RPE(随试剂盒提供)中加入4倍体积无水乙醇，混匀后备用。
4.在通风橱中，取10uLβ-巯基乙醇加入到990uLbufferRLT中(每样品将会使用350uL混合液)，混匀备用(请注意，每次抽提需现配现用)。
5.向DNase I冻干粉(随试剂盒提供)中加入550uLRNasefree水，上下颠倒5次混匀，室温静置2min。将所得液体分装(标记为DNase I solution)，并储存于-20℃冰箱备用，反复冻融不宜超过3次。
6.取10uL DNase I solution(步骤5获得)于无RNA酶的EP管中，再加入70uLbufferRDD，吹打混匀，置于冰上备用(标记为DNase I混合液)。每次抽提需现配现用。
7.从-80℃冰箱取出样品，置于冰上解冻后，将样本连同保存液转移至无RNA酶的1.5mL EP管中。
8.向EP管中加入350uL含有β-巯基乙醇的Buffer RLT(步骤4获得)，涡旋振荡30s，并短暂离心。
9.向EP管内继续加入350uL 70％乙醇，涡旋振荡30s，并短暂离心。
10.小心吸取上清650uL(注意不要吸取到未裂解的组织碎片)，转移至吸附柱中(随试剂盒提供)。
11.14000xg离心30s，倒掉收集套管中的废液。
12.向吸附柱中加入350uL Buffer RW1(随试剂盒提供)，14000xg离心30s，倒掉收集套管中的废液。
13.小心向吸附柱的中心处加入80uL DNase I混合液，室温孵育20min。
14.向吸附柱中加入350uL Buffer RW1(随试剂盒提供)，14000xg离心30s，倒掉收集套管中的废液。
15.向吸附柱中加入500uL含有无水乙醇的Buffer RPE(步骤3获得)，14000xg离心30s，倒掉收集套管中的废液。
16.向吸附柱中加入500uL80％乙醇(步骤2获得)，14000xg离心30s，倒掉收集套管中的废液。
17.将空吸附柱插入收集套管14000xg离心2min。丢弃收集套管。
18.将吸附柱插入新的1.5mL无RNA酶的EP管中，开盖晾干1min。
19.小心向吸附柱中心处加入21uL RNase Free水，室温孵育1min，17000xg离心2min，收集到的液体既为RNA。
20.取1uLRNA使用Qubit RNA HS kit进行定量，定量后的RNA存储于-80℃冰箱备用。
实施例2RNA逆转录与cDNA扩增反应
1.实验准备：使用RNA酶清除剂和核酸去污剂擦拭双手、移液器以及超净台台面。在超净中准备无RNA酶及核酸污染的枪头、1.5mL EP管以及0.2mL PCR管，打开超净台紫外照射30min(请注意，步骤2至11都应于无RNA酶及核酸污染的超净台中进行)。
2.RNA样品及Lysis Buffer(随试剂盒提供)置于冰上解冻，解冻后涡旋振荡，短暂离心后置于冰上备用。
3.每个样品取2uL RNA置于1.5mL EP管中。根据样品已测定的RNA浓度，用RNaseFree水将RNA样品稀释至约5ng/uL。
4.向0.2mL PCR管中依次加入1.5uL Lysis Buffer、3.5uL稀释后的RNA样品。
5.设置逆转录阴性对照(RT-NC)：用3.5uL RNase Free水代替步骤4中的RNA样品。
6.取13.3uL*(反应份数+移液损耗)RT buffer于新的0.2mL PCR中。(每个PCR管中的体积不宜超过50uL)。
7.预热PCR仪后，将步骤4-6中的PCR管置入PCR仪72℃孵育3min。
8.立即将PCR管置于冰上孵育至少2min后，短暂离心。
9.从-20℃冰箱中取出RT Enzyme Mix(随试剂盒提供)，短暂离心，切勿震荡，置于冰上备用。
10.向72℃孵育后的RT Buffer(步骤6)中加入1.7uL*(反应份数+移液损耗)RTEnzyme Mix。轻轻吹打混匀后置于冰上备用。混合物标记为“RT mix”。
11.吸取15uL RT mix(步骤10)加入含有RNA样品或RT-NC的PCR管(步骤4-5)中，轻轻吹打混匀并短暂离心后置于冰上。
12.在预热的PCR仪上孵育样本，条件见表1。
表1 PCR条件设置
Figure BDA0002035910100000341
13.从-20℃冰箱中取出PCR Mix(随试剂盒提供)。置于冰上解冻，上下颠倒混匀后，短暂离心，置于冰上备用。
14.向每个逆转录反应产物中加入30uL PCR Mix，轻轻吹打混匀并短暂离心后置于冰上备用。
15.设置PCR阴性对照(PCR-NC)：用20uL RNase Free水代替步骤3中的逆转录反应产物。
16.在预热的PCR仪上孵育样本，条件见表2。
表2 PCR反应条件
Figure BDA0002035910100000351
备注：可根据样品酌情增减扩增循环数，适应性调整建议如表3所示。
表3不同样本量对应的参考循环数
总RNA 参考循环数
10-20ng 7-8
1ng 11-12
100pg 14-15
10pg 17-18
实施例3扩增产物的纯化
1.实验准备：必须与步骤逆转录和扩增步骤使用不同的试验区。使用核酸去污剂擦拭双手、移液器以及实验台面。
2.向Wash Buffer加入4倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀后备用。
3.PCR产物于冰上静置2min后，短暂离心备用。
4.向1.5mL EP管中依次加入250uL DNA Binding Buffer以及50uL PCR产物。涡旋振荡混匀后，短暂离心。
5.将吸附柱插入收集套管中，并将步骤4中的300uL混合液移入吸附柱中。
6.14000xg离心30s。
7.向吸附柱中加入200uL含有乙醇的Wash buffe，14000xg离心30s。
8.重复步骤7，并倒掉收集套管中的废液。
9.将吸附柱插回收集套管，14000xg离心2min。丢弃收集套管。
10.将吸附柱插入新的1.5mL EP管中，开盖晾干1min。
11.小心向吸附柱中心处加入30uL Elution buffer(DNA Clean&Concentrator-5提供)，室温孵育1min，17000xg离心2min，收集到的液体既为cDNA扩增产物。
12.取1uL RNA使用Qubit DNA HS kit进行定量。逆转录过程中设置的阴性对照RT-NC，扩增后浓度应小于2ng/uL，PCR过程中设置的阴性对照PCR-NC，扩增后浓度应小于0.4ng/uL。样品的cDNA扩增产物浓度应大于40ng/uL。RT-NC和PCR-NC无需进行后续测序步骤。
实施例4 cDNA产物的质检
取1μl纯化后的cDNA扩增产物合理稀释后进行检测，操作说明见HighSensitivity DNA Chip操作手册结果见图1。
一般情况下，样品cDNA扩增产物分布于400-10000bp，主峰位于2000bp左右，由图1可知，本申请所用cDNA复合质量要求。
实施例5转座建库
1.DNA片段化
(1)从-20℃拿出片段化缓冲液，室温解冻，震荡混匀，瞬时离心，备用。根据样本的数目(N)，反应体系见表4.
表4 PCR反应体系配制
组分 体积
片段化缓冲液 8.5uL×(N+1)
片段化酶 1uL×(N+1)
总体积 9.5uL×(N+1)
(2)将上述配制的片断化混合液各取9.5uL分装至0.2mL PCR管内，瞬时离心。取0.5uL(约10ng)MALBAC扩增产物，分别加入上步装有9.5uL片断化混合液的PCR管中。涡旋震荡，充分混匀，瞬时离心。
(3)将配制好的反应体系放置于PCR仪中，“热盖”选择“On,105℃”，拧紧热盖，反应程序见表5。
表5 PCR反应程序
Figure BDA0002035910100000371
2.文库富集
(1)从-20℃拿出扩增缓冲液，室温解冻，震荡混匀，瞬时离心，备用。根据样本的数目(N)，反应体系见表6.
表6 PCR反应体系
组分 体积
扩增缓冲液 11.5uL×(N+1)
扩增酶 0.5uL×(N+1)
总体积 12uL×(N+1)
(2)涡旋震荡，充分混匀，瞬时离心。
(3)将上述配制的扩增反应混合液各取12uL加入“步骤1.1”的片断化产物中。向上述反应体系中各加入3uL标签引物，涡旋震荡，充分混匀，瞬时离心。
(4)记录每个样本对应的标签引物编号(注意：此处标签引物共24种，每个反应加入一种即可，同一批上机的样品标签引物不可重复)。
(5)将配制好的反应体系放置于PCR仪中，“热盖”选择“On,105℃”，拧紧热盖，反应程序如表7所示。
表7 PCR反应程序
Figure BDA0002035910100000372
Figure BDA0002035910100000381
3.文库纯化
(1)从4℃取出磁珠，室温放置，平衡至室温。涡旋振荡磁珠20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
(2)取构建的文库各20uL置于新的1.5mL离心管中，分别加入0.6×重悬的磁珠(例如：初始文库体积为20uL，加入12uL磁珠)，涡旋震荡混匀，瞬时离心，室温静置5分钟。
(3)瞬时离心，将离心管放于磁力架上使磁珠与上清液分离，约5分钟后，溶液澄清，保持离心管在磁力架上，小心打开管盖，防止液体溅出，小心将上清液转移至一新的1.5mL离心管中(注意：不要吸到磁珠)，并弃去磁珠(注意：不要弃上清)。
(4)向上清中加入起始文库体积0.15×的重悬磁珠(例如：初始文库体积为20uL，加入3uL磁珠)，涡旋振荡，混合均匀，瞬时离心，室温孵育5分钟。
(5)将离心管置于磁力架上使磁珠与上清液分离，约5分钟后，液体变得澄清，小心吸取上清并弃除(注意：不要弃磁珠，不要吹打磁珠)。
(6)继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入200uL左右新鲜配制的80％乙醇(注意：小心沿着管壁加入乙醇，不要将磁珠冲散，保证乙醇能够淹没磁珠)，室温放置30秒，小心弃除上清。
(7)重复上一步。
(8)保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟左右，使乙醇完全挥发。
(9)将离心管从磁力架上取下，加入17.5uL洗脱液，涡旋振荡，使磁珠完全重悬，瞬时离心，室温放置5分钟，将离心管置于磁力架中使磁珠和液体分离，约5分钟后，溶液澄清，小心吸取15uL上清至新的离心管中(注意：不要吸到磁珠)，于-20℃保存。
4.文库质控
纯化后的文库可使用Qubit dsDNA HS Assay Kit分别进行定量，浓度一般在5ng/ul以上(为了得到高质量的测序结果，可采用实时荧光定量PCR方法进行定量)。
实施例6上机测序
实验步骤参考Illumina测试试剂盒说明书。上机策略：单端或双端均可，读长大于45nt，需保证2.5兆reads。
实施例7数据处理步骤
利用有明确临床结局的志愿者样本的表达谱当作训练数据，利用机器学习建立分析模型，而后输入位置数据，利用分析模型进行预判，具体的为：
1.采用监督学习的方法(如图2)，利用“训练数据”是带类标的，该类标为子宫内膜组织、宫腔液或其他生殖内分泌相关体液或脱落物在不同容受状态下的表达谱特征；
2.判断模型中“训练数据”或称“训练集”的入组标准为：自然周期中不同的健康中国女性，没有既往病史，没有原发性不孕证，体重指数在19-25kg/m2之间，在获取三个类标的RNA-seq数据后，使用FPKM对基因长度和测序深度进行标准化，以排除测序深度的影响，通过标准化过程，在不同类标的(多个)样本中比较不同基因的表达量，进行基因差异表达的分析，具体的为：找到每个样本FPKM>0的所有基因，然后在所有进入训练集样本的FPKM>0的所有基因中寻找“容受前期”vs.“容受期”，“容受前期”vs.“容受后期”，“容受期”vs.“容受后期”差异基因的交集(满足p_value<0.05,Fold_change>2或<0.5的均满足选择的标准)，得到12734个差异表达基因，其中包括ENSG00000000003、ENSG00000104881、ENSG00000128928、ENSG00000151116、ENSG00000171222、ENSG00000198961、ENSG00000261732、ENSG00000000419、ENSG00000104883、ENSG00000128944、ENSG00000151117、ENSG00000171223、ENSG00000198963、ENSG00000261740、ENSG00000000457、ENSG00000104886、ENSG00000128951、ENSG00000151131、ENSG00000171224、ENSG00000198964、ENSG00000261760等，上述基因编号均唯一确定地与NCBI网站数据库中的基因相对应(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，因所得差异表达基因数量众多，限于篇幅因素不再赘述；
3.在本发明的监督学习中，通过使用带有容受前期、容受窗口期、容受后期类标的训练数据构建模型，我们可以通过训练得到的模型对未知的数据(指新病例)的容受性状态进行预测。比如，新输入一例病例的宫腔液表达谱，使用该机器学习模型的判断其容受性状态(如图3所述)；
4.采用支持向量机，将3中类标对应的样本作为输入变量，进行训练集构建，脚本入下：
library(e1071)
svm.model<-svm(data.class～.,data4,kernel＝'linear')
summary(svm.model)
table(data$class,predict(svm.model,data4,type＝"data.class"))
mydata＝read.table(file.choose(),header＝T,row.names＝1)
mydata2＝log2(mydata+1)
predict(svm.model,mydata2)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type＝"shdata.class"))
##
table(testdata$data.class,predict(svm.model,testdata,type＝"data.class"))
shdata＝read.table(file.choose(),header＝T,row.names＝1)
shdata2＝log2(shdata[,-length(shdata[1,])]+1)
shdata3＝data.frame(shdata2,shdata$class)
predict(svm.model,shdata3)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type＝"shdata.class"))；
5.根据支持向量机的结果，为未知样品容受状态做定义，判断该样品的子宫内膜容受性，根据容受性状态指导胚胎植入(如图4)；为获得良好的妊娠结局，可在多个周期内反复调整取样时间，然后进行容受性测试(如图5)。
实施例8临床验证
选择23-39岁不同不孕个体做对象，采用本发明构建的分析模型做预测，依据支持向量机的结果，为未知样品容受状态做定义，判断该样品的子宫内膜容受性，根据容受性状态指导胚胎植入，记录妊娠结局，结果见表8-1、8-2和8-3.
表8-1模型预测及妊娠结果
Figure BDA0002035910100000411
表8-2模型预测及妊娠结果
Figure BDA0002035910100000421
表8-3模型预测及妊娠结果
Figure BDA0002035910100000422
样本时期、样本类型、既往病史、不孕症类型为样本的临床信息，RNA浓度、cDNA浓度、测序数据量、Unique Mapping Ratio、外显子占比为测序质控信息，支持向量机分类为机器学习判定的容受状态，植入方法为根据机器学习分析结果进行的植入时期调整。由表8-1、8-2和8-3可知，经过临床验证，19例不孕症妇女经本发明所述模型指导胚胎植入时机，均成功妊娠，说明本发明所述模型准确率极高有助于推动医学进步。
本发明的标志物的判断结果如表9所示。
表9
Figure BDA0002035910100000431
Figure BDA0002035910100000441
Figure BDA0002035910100000451
Figure BDA0002035910100000461
Figure BDA0002035910100000471
Figure BDA0002035910100000481
Figure BDA0002035910100000491
Figure BDA0002035910100000501
Figure BDA0002035910100000511
Figure BDA0002035910100000521
Figure BDA0002035910100000531
Figure BDA0002035910100000541
Figure BDA0002035910100000551
Figure BDA0002035910100000561
Figure BDA0002035910100000571
Figure BDA0002035910100000581
Figure BDA0002035910100000591
Figure BDA0002035910100000601
Figure BDA0002035910100000611
Figure BDA0002035910100000621
Figure BDA0002035910100000631
Figure BDA0002035910100000641
Figure BDA0002035910100000651
Figure BDA0002035910100000661
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Figure BDA0002035910100001241
如表9所示，在本发明中，即使仅用单个标志物，只要高于预定值，这些标志物可子宫内膜容受性的有用的辅助判断或诊断信息，从而尤其用于早期和/或辅助诊断。
此外，当采用表9所述的多个标志物进行综合评判时，可以进一步地显著降低错误率(错误率仅为17.5％)，提高评判的准确性。
当采用多个标志物(含有额外的5-200个基因)时，错误率可低至16.5％。
当采用的标志物数量达到10000时，错误率仅为6.7％。
其中，错误率的计算方式为：以临床结局为金标准，进行胚胎植入成功的日期为容受期。准确率＝本方法判断为容受期的案例数/胚胎植入成功的总案例数；错误率＝本方法判断为非容受期的案例数/胚胎植入成功的案例数。
因此，从上述可知，本发明的标志物具有很高的预测价值，尤其是组合使用，可进一步降低子宫内膜容受性状态判断的错误率，提高评判的准确性。
此外，根据表11，本发明对表9的标志物进行进一步筛选，并获得了具有非常低错误率、高准确性效果的40个标志物、147个标志物、259个标志物，其中，空白指分析价值＜4。
表11
Figure BDA0002035910100001242
此外，从表10可以看出，本发明的表9中的基因是核心基因，在此基础上，新增加的基因会提高正确率，但是新增加的基因的权重很低。
表10
Figure BDA0002035910100001243
综上所述，本发明以高灵敏的RNA逆转录与cDNA扩增流程为依托，以RNA-seq测序方法为基础，获得了大量患者的子宫内膜、宫腔液或其他生殖内分泌相关体液或脱落物的表达谱信息。并针对这些样本，特异性地选择取样时期、取样方式获得不同的表达谱特征，以生物信息学、统计学以及机器学习的方式进行超高维度的分类和分型。依据分型的不同，判断子宫内膜的容受性状态；本发明将表达谱特征用于判断胚胎植入前子宫内膜容受性的模型，准确地判断子宫内膜着床的窗口期。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种用于非疾病诊断目的的判断子宫内膜容受性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a) 提供一样本；
(b) 测定所述样本中的子宫内膜容受性相关基因的表达量；
(c) 将步骤(b)获得的子宫内膜容受性相关基因的表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜容受性，
其中，所述子宫内膜容受性相关基因由来自表A中的全部基因组成：
表A
编号 名称 1 KRIT1 2 RBM5 3 PAF1 4 RFC1 5 TPR 6 ACAA1 7 SFSWAP 8 SPEN 9 CPSF1 10 XRCC1 11 KDM5A 12 SART3 13 PIK3C3 14 YTHDC1 15 PPIE 16 NFX1 17 CDC5L 18 SF3A1 19 TXN2 20 EIF3D 21 EP300 22 CHD8 23 PNN 24 CSTF1 25 PRPF6 26 PQBP1 27 CIAO3 28 HMOX2 29 PIH1D1 30 AKAP8 31 BUD31 32 EIF3A 33 CASC3 34 CDK5RAP3 35 SUPT6H 36 CNOT2 37 SUDS3 38 TBCCD1 39 EIF2B4 40 ORC2 41 SRSF4 42 SFPQ 43 SRSF11 44 PRRC2C 45 FBXW2 46 SNX19 47 EPC1 48 TBCC 49 CNOT1 50 GTF2F1 51 KDM5C 52 NSRP1 53 UXT 54 ATG14 55 AKAP9 56 PRKRIP1 57 CCNT1 58 LSM4 59 RLIM 60 ERAL1 61 PTPRA 62 NASP 63 SRRM1 64 PRPF38A 65 CDK5RAP2 66 PRPF4 67 PPIG 68 SMARCC2 69 TCF25 70 CSNK1D 71 ENSA 72 TEX261 73 FIP1L1 74 CENPC 75 ZMAT2 76 CELF1 77 CPSF7 78 UPF2 79 MMS19 80 SON 81 ADAR 82 MAGOH 83 ELP6 84 NIPBL 85 SLU7 86 PCF11 87 NSD1 88 YWHAB 89 DDB1 90 SF1 91 ATG4B 92 FEM1B 93 SIN3A 94 LUZP1 95 GPS1 96 SF3B5 97 HNRNPA3 98 PYM1 99 RBM4 100 PRPF8 101 ZBTB4 102 CKAP5 103 SMAD2 104 POLR2A 105 RNF135 106 RNF41 107 MRPS11 108 CEP63 109 EIF3C 110 SF3B3 111 SIAH1 112 SND1 113 UBL5 114 NELFE 115 EIF3CL 116 FIS1 117 TRIM26 118 MRPL20 119 KMT2E 120 AFF4 121 GTF3C1 122 ANAPC5 123 MAEA 124 TOX4 125 GID8 126 ARFGAP1 127 ARHGEF7 128 H2AFV 129 ZNHIT1 130 COA1 131 GBF1 132 GOSR1 133 IFT20 134 ANAPC15 135 IK 136 KANSL3 137 GTF3C2 138 CHMP3 139 FAM20B 140 CHCHD5 141 RPAIN 142 UBE4B 143 C19orf12 144 ANKRD17 145 MED6 146 TMEM258 147 ERCC5 148 ATP5MC2 149 SMPD4 150 ECPAS 151 DMAC1 152 SEC24B 153 NCOR1 154 PI4KB 155 C1orf43 156 ASXL2 157 VTI1A 158 PPP1R15B 159 SNF8 160 GATD3A 161 MED11 162 RAD21 163 SPIDR 164 ANAPC16 165 VPS39 166 ATP5PD 167 FIBP 168 CORO1B 169 RAB1B 170 RMDN1 171 BET1L 172 ASB8 173 EXOC7 174 UQCR10 175 top1 176 SPOUT1 177 ARMCX6 178 PPP1R10 179 LIN52 180 SMIM7 181 TOMM6 182 PDCD6 183 GGNBP2 184 GATD3B 185 KIAA0100 186 ELOA 187 AQR 188 FBXO42 189 LSG1 190 FAM120A 191 THRAP3 192 ARID4B 193 POLR3E 194 GPBP1 195 RFXANK 196 TAF11 197 BUD23 198 PDCD2 199 BCS1L 200 ZNF638 201 ZNF37A 202 EXOSC7 203 top2B 204 DELE1 205 GCN1 206 DDX24 207 DHPS 208 WAC 209 HPS4 210 PPP6R2 211 PACSIN2 212 HMGXB4 213 POLR3H 214 RBM23 215 ZC3H14 216 DCAF11 217 NDRG3 218 GYS1 219 CCDC130 220 DNAJC2 221 CHCHD2 222 TMEM248 223 NUFIP2 224 UBTF 225 MTMR4 226 RSRC2 227 KRR1 228 CHD4 229 ZNF451 230 SENP6 231 PRPF4B 232 PRKAR2A 233 FXR1 234 HDLBP 235 PPP1R7 236 ASH1L 237 GON4L 238 TSNAX 239 HMGCL 240 MED28 241 NEK9 242 PANK3 243 SPOP 244 MTIF3 245 ZC3H13 246 SMUG1 247 RAB22A 248 STAU1 249 DDX27 250 SERPINB6 251 MEA1 252 COX6B1 253 TIMM17B 254 XPO7 255 SAFB2 256 EIF2S3 257 UBA1 258 RBM39 259 ACLY 260 DHX30 261 SCO1 262 LARS 263 PPHLN1 264 LPIN1 265 TIMM10 266 ARGLU1 267 TFCP2 268 C2orf49 269 SLTM 270 CIR1 271 TMOD3 272 SBNO1 273 DCAF5 274 ANP32A 275 COMMD4 276 ARHGAP17 277 RHOT2 278 SERBP1 279 STRIP1 280 UFC1 281 MRPL9 282 UBAP2L 283 SDE2 284 SNRNP200 285 C7orf50 286 MDH2 287 NDUFB11 288 TAF1 289 EIF4EBP2 290 MTG1 291 NUDT22 292 VIPAS39 293 KIN 294 ATP5F1A 295 PELO 296 SAR1B 297 HNRNPDL 298 CCDC174 299 LARP1 300 SCAF4 301 APPL1 302 GPBP1L1 303 PSKH1 304 SSU72 305 CCDC12 306 ZYG11B 307 PMVK 308 KIAA1143 309 UBXN7 310 GAPVD1 311 NEMF 312 HIF1AN 313 MARF1 314 NDUFV1 315 HARS 316 ATF7 317 AKAP13 318 QARS 319 ZNF24 320 FAM192A 321 MRPL57 322 CHD2 323 TOMM20 324 MGA 325 IP6K1 326 DNAJC30 327 IMP3 328 NDUFAF3 329 SPTY2D1 330 CLK3 331 MRPS23 332 TTC3 333 GPATCH8 334 USP7 335 LAMTOR4 336 TBC1D9B 337 GSTK1 338 QRICH1 339 DDX39B 340 GIGYF2 341 BRD2 342 GPANK1 343 PRRC2A 344 DHX16 345 NAP1L4 346 SELENOH 347 RBMXL1 348 ACBD6 349 FAM133B 350 CDKN2AIPNL 351 CDK11B 352 PRKDC 353 MYO19 354 LAS1L 355 PPP1R12A 356 CCAR1 357 SMC1A 358 ARAF 359 HSP90AA1 360 CHERP 361 SRRT 362 SF3B2 363 HNRNPC 364 HNRNPM 365 RBX1 366 TELO2 367 UBE2I 368 TIMM50 369 PRPF31 370 TCERG1 371 TUSC2 372 EIF4G1 373 NCL 374 PRPF3 375 SNRPB 376 PRKCSH 377 TUBGCP2 378 EIF3G 379 SYNCRIP 380 HUS1 381 ACTR1A 382 MBD1 383 HDGF 384 PARP1 385 RPL7L1 386 RPUSD3 387 ACOX1 388 U2SURP 389 CPSF2 390 TSR1 391 RFWD3 392 CD2BP2 393 PCBP1 394 PA2G4 395 PPID 396 HCFC1 397 FKBP2 398 BRMS1 399 EIF3K 400 PUF60 401 NOC2L 402 PRPF40A 403 RNPS1 404 DCP1A 405 CWC25 406 MED24 407 PHF20 408 EIPR1 409 KAT6A 410 PSMD8 411 NOP56 412 COPE 413 SSR3 414 COPA 415 THOC6 416 WDR74 417 PSMB7 418 HAX1 419 SURF6 420 VPS28 421 VKORC1 422 PSMD13 423 TMEM222 424 C6orf106 425 MRPL38 426 CSNK2B 427 PSMB3 428 CCDC124 429 RANBP3 430 NOP58 431 ZFR 432 IDH3G 433 HSD17B10 434 MRPL28 435 PSMC5 436 HSP90AB1 437 L3MBTL2 438 CINP 439 NAA10 440 SGTA 441 EDF1 442 NDUFS8 443 TPI1 444 MFN2 445 DNPEP 446 CLPP 447 RBM42 448 PNKD 449 ILF3 450 COX4I1 451 RBSN 452 ILKAP 453 NIP7 454 THUMPD3 455 CCT7 456 TBRG4 457 DDX56 458 DCAF7 459 YME1L1 460 MAN2C1 461 SCYL1 462 GPN2 463 GMPPA 464 DDX46 465 SRFBP1 466 CXXC1 467 EIF5B 468 GPATCH4 469 EIF4A1 470 UBXN1 471 IWS1 472 PSMC3 473 CIAO2B 474 ZNF592 475 DNAJC7 476 DTYMK 477 RNF181 478 SLC25A6 479 TRMT112 480 EIF1AD 481 AURKAIP1 482 ACSF3 483 TALDO1 484 COX5A 485 TUFM 486 FARSA 487 MRPL14 488 ARL6IP4 489 EWSR1 490 DDX41 491 CDK10 492 FAAP100 493 RPS19BP1 494 PTMA 495 MRPL21 496 MRPS18B 497 ABCF1 498 MCRIP1 499 CNPY2 500 MRPL12 501 BAZ2A 502 USP4 503 SMG7 504 ARPP19 505 NR1H2 506 NPEPPS 507 BIN3 508 UBE3B 509 WASF2 510 TAGLN2 511 IRF2 512 RELA 513 DCTN2 514 CIB1 515 SPTAN1 516 WWP2 517 MSRB1 518 DCTN1 519 EIF6 520 CUX1 521 WDR1 522 PDRG1 523 SH3GLB1 524 SNAP29 525 KLHDC3 526 CHMP1A 527 LGALS3 528 GLYR1 529 NOSIP 530 HERC4 531 UBE2J2 532 CHtop 533 PEF1 534 ZDHHC3 535 ATP5MD 536 SETD3 537 MCRS1 538 AP1G2 539 CHMP1B 540 ARF5 541 RNF10 542 SNX1 543 HAGH 544 FAM50A 545 MYL6 546 NANS 547 LPIN2 548 UBL4A 549 TBCB 550 PRKD2 551 DMAC2 552 RNF7 553 WRAP73 554 PEX16 555 ANXA11 556 CYREN 557 DYNLRB1 558 HECTD3 559 PGLS 560 COX5B 561 CDK9 562 ARPC5L 563 RTCA 564 UNC45A 565 NARF 566 GUK1 567 CAST 568 NIT1 569 EFCAB14 570 PRMT2 571 FLAD1 572 SLMAP 573 TKT 574 SLFN5 575 CSNK1G1 576 EXOSC10 577 NADSYN1 578 KDM2A 579 KPNA4 580 TMEM120A 581 COX19 582 ARPIN 583 SYNRG 584 LYPLA2 585 TOLLIP 586 CDC37 587 H2AFY 588 RBCK1 589 RAF1 590 GPS2 591 NMT1 592 FLOT1 593 FBXW5 594 SQSTM1 595 DTX3L 596 PPIA 597 SMG5 598 EGLN2 599 ROCK1 600 PXN 601 RANGAP1 602 PSMA7 603 MBD4 604 ADRM1 605 ARF3 606 SMIM12 607 PPP1CA 608 SMIM29 609 WDR5 610 GRIPAP1 611 CWF19L1 612 MED15 613 TSPO 614 MYH9 615 ITPK1 616 TPD52L2 617 GSDMD 618 PSMD9 619 ADPRHL2 620 CCDC32 621 NSUN5 622 EIF4E2 623 MGST3 624 PCYT1A 625 SAP30BP 626 RNASEK-C17orf49 627 SHISA5 628 BLCAP 629 DDX23 630 FLII 631 GAK 632 PAK2 633 HGS 634 AATF
。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本是子宫内膜组织。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本选自下组：宫腔液、宫腔灌洗液、阴道脱落细胞、阴道分泌物、子宫内膜的活检产物、血清、血浆、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)获得的子宫内膜容受性相关基因的表达量高于预定值时，则表明存在子宫内膜容受性。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为以下时期的样本：促黄体生成素峰值出现后的第n天、第n+2天、第n+4天，其中，n为3-7。
6.如权利要求5所述的方法，其中n为4-6。
7.一种用于子宫内膜容受性状态判断的生物标志物集合，其特征在于，所述生物标志物集合由来自表A中的全部基因组成。
8.一种用于子宫内膜容受性状态判断的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括特异性地用于检测权利要求7所述的生物标志物集合中各个生物标志物表达量的试剂。
9.权利要求8的试剂组合用于制备试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于评估待测对象的子宫内膜容受性的状态。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求8所述的试剂组合。
11.一种用于非疾病诊断目的的评估待测对象的子宫内膜容受性状态的方法，其特征在于，包括步骤：
(1) 提供一来源于待测对象的样品，对样品中各个生物标志物的水平进行检测，所述生物标志物为表A中的全部基因；
(2) 将步骤(1)测得的水平与一预定值进行比较；
从而，判断待测对象的子宫内膜容受性状态。
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