CN115537462B - 一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的测序方法及在细菌性脑膜炎诊断和预后中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的测序方法及在细菌性脑膜炎诊断和预后中的应用，涉及生物测序技术领域。本发明提供了一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的测序方法，可以同时检测脑脊液中病原菌序列及宿主基因表达量，不仅能够用于检测病原体诊断细菌性脑膜炎，并得到了新的与细菌性脑膜炎预后相关的宿主基因标志物CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L基因，同时基于宿主表达量建立了细菌性脑膜炎不良预后预测模型，经试验证实，本发明所述模型有助于临床诊断细菌性脑膜炎患者并尽早识别具有不良预后风险的细菌性脑膜炎患者，从而及时采取干预措施，改善患者预后。

Description

一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的测序方法及在细菌 性脑膜炎诊断和预后中的应用
技术领域
本发明涉及生物测序技术领域，具体涉及一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的测序方法及在细菌性脑膜炎诊断和预后中的应用。
背景技术
细菌性脑膜炎是细菌引起的严重中枢神经系统感染性疾病，发病率高，疾病进展快，治疗不及时致残致死率高，严重影响儿童的生命健康。细菌性脑膜炎在婴幼儿尤其多见，在发展中国家其病死率可达10％～15％，致残率为25％～50％。细菌性脑膜炎经常出现脑膜强化、硬膜下积液、脑梗死、脑室积水等严重并发症，高达20％-50％的新生儿幸存者可能会出现听力减退、失明、脑积水、智力和/或运动障碍等后遗症。早期明确诊断并识别危重患儿，及时进行针对性干预，是治愈脑膜炎和减少并发症及后遗症的关键。
脑脊液(CSF)检查是诊断感染性脑膜炎的主要手段。由于抗生素的普遍应用等导致脑脊液培养阳性率低，约为20％～30％，且耗时长，不利于疾病的早期、快速诊断。PCR方法能够提高病原检出率，但检测病原体种类有限，非常依赖临床医生的经验。已有研究发现了一些与脑膜炎不良预后相关的生物标志物，比如郑州大学研究发现脑脊液糖<1mmol/L、脑脊液蛋白>2g/L是新生儿细菌性脑膜炎预后不良的独立危险因素。英国研究人员基于5个实验室和临床指标(脑脊液培养阳性、脑脊液白细胞计数、血红蛋白、格拉斯哥昏迷量表和脉搏率)构建模型用于成人细菌性脑膜炎的不良预后评估，特异性仅为63％。综合看来，这些方法大多数集中于现有的生化常规指标，而且准确性欠佳，尚缺乏预测效果更准确的宿主基因标志物和模型。
宏基因组测序(mNGS)可以获得样品中存在所有微生物基因组序列信息，有助于无偏好的所有检测病原体。测序技术的发展和成本的降低给宏基因组应用到临床诊断提供了基础。宏基因组学诊断儿童细菌性脑膜炎的成功病例或临床研究取得重大进展，已成为了近年来的热点。细菌性脑膜炎临床诊断现阶段通常构建DNA文库进行宏基因组测序，主要用于检测细菌等病原体，无法用于预测细菌性脑膜炎患者的预后。
由于宿主免疫反应的复杂性和宿主遗传变异多样性，单一指标很难获得很好的临床效果。基于宿主全基因组表达谱构建预后分层模型是现阶段感染预后评估的研究热点，已在败血症预后评估中有良好表现，但在儿童细菌性脑膜炎尚未见相关报道。而且现有常规宏基因组测序一般只构建DNA测序文库用于检测病原菌基因序列，无法检测宿主基因表达量。检测宿主基因表达量则需要单独构建RNA文库，使工作量和测序成本成倍增加。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的测序方法，基于该方法建立的预后预测模型有助于临床中尽早识别具有不良预后风险的细菌性脑膜炎患者。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的宏基因组测序方法，所述方法包括如下步骤：
收集细菌性脑膜炎患者的脑脊液样本，对所述脑脊液样本中的总核酸进行测序获得reads；所述reads经比对即可获得所述脑脊液样本中的病原菌和宿主基因表达量；所述总核酸包括DNA和RNA；所述RNA反转录成cDNA，利用所述cDNA和DNA共同构建文库后进行测序。
优选的，所述比对包括序列比对和转录组比对；所述序列比对分析后获得所述脑脊液样本中的病原菌；所述转录组比对分析后得到所述宿主基因表达量。
优选的，所述序列比对分析包括如下步骤：
将测序所得reads比对到人类参考基因组，去除属于人的序列得到可能的病原微生物序列，然后将可能的病原微生物序列与病原微生物参考数据库进行序列比对和物种分类即可获得所述脑脊液样本中的病原菌。
优选的，所述转录组比对分析包括如下步骤：
将测序所得reads比对到人类参考基因组，统计比对到基因外显子区域的reads数目，即得所述宿主基因表达量。
优选的，所述人类参考基因组序列为UCUC数据库中人类hg19参考基因组或人类hg38参考基因组。
本发明提供了一种细菌性脑膜炎预后相关的基因标志物，所述基因标志物根据上述的宏基因组测序方法获得；所述基因标志物包括CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L基因。
优选的，根据所述基因标志物的表达量对细菌性脑膜炎进行预测。
本发明还提供了一种细菌性脑膜炎不良预后预测模型的构建方法，所述细菌性脑膜炎不良预后预测模型是以上述基因标志物的表达量为输入数据构建得到；所述构建得到的预测模型公式为：
其中Z＝(1.290×CXXC4表达量)+(-0.857×XPNPEP2表达量)+(-1.277×IGSF1表达量)+(-0.003×ND4L表达量)+5.305。
本发明还提供了一种识别细菌性脑膜炎患者不良预后的方法，所述方法包括如下步骤：
利用上述的构建方法构建得到的预测模型计算不良预后风险值，根据所述不良预后风险值的阈值识别细菌性脑膜炎患者不良预后；所述不良预后风险值的阈值为0.5。
优选的，所述不良预后风险值的阈值＜0.5时，患者预后良好；所述不良预后风险值的阈值≥0.5时，患者预后不良。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种细菌性脑膜炎不良预后预测模型的构建方法，可以同时检测脑脊液中病原菌序列及宿主基因表达量，不仅能够用于检测病原体诊断细菌性脑膜炎，并得到了新的与细菌性脑膜炎预后相关的基因标志物CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L基因，同时基于宿主表达量建立了细菌性脑膜炎不良预后预测模型，经试验证实，本发明所述模型有助于临床中诊断细菌性脑膜炎患者并尽早识别具有不良预后风险的细菌性脑膜炎患者，从而及时采取干预措施，改善患者预后。
附图说明
图1为常规DNA建库和本发明方法(DNA+RNA建库)在病原菌检出效果的比较。
图2为样本中部分基因的表达量图谱。
图3为预后不良患者与预后良好患者间的差异表达基因。
图4为CXXC4，XPNPEP2，IGSF1和ND4L基因在预后良好和预后不良患者间的表达差异。
图5为实施例2中细菌性脑膜炎不良预后预测模型的表现评估。
图6为实施例3中细菌性脑膜炎不良预后预测模型的在测试集样本中的表现评估。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测病原菌和宿主基因表达量的宏基因组测序方法，所述方法包括如下步骤：
收集细菌性脑膜炎患者的脑脊液样本，对所述脑脊液样本中的总核酸进行测序获得reads；所述reads经比对即可获得所述脑脊液样本中的病原菌和宿主基因表达量；所述总核酸包括DNA和RNA；所述RNA反转录成cDNA，利用所述cDNA和DNA共同构建文库后进行测序。
本发明中，所述测序平台优选为Illumina测序平台。本发明中，所述测序前，优选的利用超声波对文库进行打断成短片段，然后进行末端修补，添加测序接头，连接产物纯化，PCR扩增，文库质检。本发明中，所述测序产出原始测序读段(reads)优选的利用FastQC等软件进行质控，利用Trimmomatic、fastp等软件过滤掉低质量的reads。
本发明中，所述比对优选的包括序列比对和转录组比对；所述序列比对分析后获得所述脑脊液样本中的病原菌；所述转录组比对分析后得到所述宿主基因表达量。
本发明中，所述序列比对分析包括如下步骤：将测序所得reads比对到人类参考基因组，去除属于人的序列得到可能的病原微生物序列，然后将可能的病原微生物序列与病原微生物参考数据库进行序列比对和物种分类即可获得所述脑脊液样本中的病原菌。本发明中，将测序所得reads比对到人类参考基因组使用的比对软件优选为bowtie2、BWA等软件；所述将可能的病原微生物序列与病原微生物参考数据库进行序列比对和物种分类的软件优选为kraken2、MetaPhlAn等软件。
本发明中，所述转录组比对分析包括如下步骤：将测序所得reads比对到人类参考基因组，统计比对到基因外显子区域的reads数目，即得所述宿主基因表达量。本发明中，所述转录组比对软件优选为STAR等软件；所述统计比对的软件优选为featureCounts等软件。本发明中，所述人类参考基因组序列优选为UCUC数据库中人类hg19参考基因组或人类hg38参考基因组。
本发明提供了一种细菌性脑膜炎预后相关的基因标志物，所述基因标志物根据上述的宏基因组测序方法获得；所述基因标志物包括CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L基因。本发明根据所述基因标志物的表达量对细菌性脑膜炎进行预测。
本发明还提供了一种细菌性脑膜炎不良预后预测模型的构建方法，所述细菌性脑膜炎不良预后预测模型是以上述基因标志物的表达量为输入数据构建得到；所述构建得到的预测模型公式为：
其中Z＝(1.290×CXXC4表达量)+(-0.857×XPNPEP2表达量)+(-1.277×IGSF1表达量)+(-0.003×ND4L表达量)+5.305。
本发明还提供了一种识别细菌性脑膜炎患者不良预后的方法，所述方法包括如下步骤：
利用上述的构建方法构建得到的预测模型计算不良预后风险值，根据所述不良预后风险值的阈值识别细菌性脑膜炎患者不良预后；所述不良预后风险值的阈值为0.5。本发明中，所述不良预后风险值的阈值＜0.5时，患者预后良好；所述不良预后风险值的阈值≥0.5时，患者预后不良。
本发明建立了可以同时检测病原体DNA和宿主基因表达量的宏基因组方法，拓展了传统宏基因组测序的应用场景，在检测细菌性脑膜炎病原菌的同时也可以预测细菌性脑膜炎的预后，而且相比于现有的预后预测方法具有更高的灵敏性和特异性。本发明拓展常规宏基因组测序在细菌性脑膜炎诊疗中的使用场景，除了检测病原菌，还可以识别不良预后的细菌性脑膜炎患者，能更好地指导临床对预后不良的细菌性脑膜炎患者设计更有针对性的治疗方案，实现精准医疗，改善患者的预后。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
构建同时检测脑脊液中病原菌序列及宿主基因表达量的宏基因组测序方法
(1)构建细菌性脑膜炎的模拟脑脊液样本
体外培养2种代表性的细菌性脑膜炎病原菌，肺炎链球菌和大肠杆菌，分别制成菌悬液并计算浓度(菌落形成单位，CFU)。收集无感染症状白血病儿童的脑脊液，混合后分别加入低浓度和高浓度的大肠杆菌和肺炎链球菌，制成1-4号的感染性脑炎模拟脑脊液样本(图1)。
(2)DNA和RNA同时提取、文库构建及测序
1)对照组：按照常规宏基因组测序流程，使用DNA提取试剂盒提取步骤(1)模拟脑脊液样本中的DNA，构建DNA文库并测序，作为对照组。
2)本发明实验组：使用EasyPure RNA试剂盒(Transgene公司，北京)提取步骤(1)模拟脑脊液样本的总核酸(混合液中含有DNA和RNA)，DNA无需特殊处理，使用逆转录试剂盒(罗氏公司，瑞士)将混合液中RNA逆转录成单链cDNA，并利用二链合成试剂盒(NEB公司，美国)合成二链cDNA。把混合液中的DNA和cDNA一起用于构建测序文库；
运用超声波将上述核酸打断成短片段；末端修补，添加测序接头；连接产物纯化，PCR扩增，文库质检。利用Illumina测序平台对文库进行宏基因组测序，产出原始测序读段(reads)。利用FastQC等软件进行质控，利用Trimmomatic等软件过滤掉低质量的reads。
(3)利用宏基因组测序检测病原体种类和丰度
利用bowtie2或BWA软件将对照组和本发明实验组的测序数据分别比对到人参考基因组去除可以比对到人基因组的序列(reads)。利用kraken2或MetaPhlAn等软件将剩余序列(reads)与病原微生物参考数据库进行序列比对和物种分类，检测样本中是否含有已知的病原菌，结果如图1。
根据图1比较分析发现，本发明在检出病原菌的种类和丰度上与常规基于DNA建库的宏基因组方法相当。
(4)利用宏基因组测序检测宿主基因表达量
利用转录组比对软件STAR等将测序序列(reads)比对到人类参考基因组(hg19或hg38版本)，利用featureCounts等软件统计比对到基因外显子区域的reads数目，1-4样本中中部分宿主基因的表达量结果如图2。
综上可知，本发明建立的宏基因组方法同时提取了DNA和RNA并建立测序文库并测序，可以检测宿主基因表达量。本发明建立了单次同时提取DNA和RNA，单次核酸建库的宏基因组测序方法，大大减少了建库及测序的时间和成本，可以同时检测病原菌DNA和宿主基因表达量，解决了目前检测细菌性脑膜炎患者病原菌的宏基因组方法不能同时检测宿主基因表达量的问题。
实施例2
建立细菌性脑膜炎诊断及不良预后预测的方法
(1)收集细菌性脑膜炎患者的脑脊液样本
采集2019年03月至2021年01月于深圳市儿童医院就诊的细菌性脑膜炎患儿的脑脊液标本共33余例。患者入院后由临床医师进行无菌技术腰椎穿刺获得脑脊液标本，标本用干冰或液氮冷冻运送到实验室后保存在深圳市儿童医院样本库。样本信息完整，包括患者基本信息、病原学检测结果、临床诊断信息、治疗方案及预后情况。
依据出院转归情况，将细菌性脑膜炎患儿分为预后不良组(n＝15)与预后良好组(n＝18)。预后不良指出现了细菌性脑膜炎并发症(脑积水、硬膜下积液、脑室管膜炎、脑软化、脑脓肿等)或后遗症、放弃治疗或死亡，其他样本为预后良好组。
(2)同时检测病原体DNA和宿主RNA的宏基因组测序
1)核酸提取
利用磁珠法分别提取脑脊液样本的总核酸(包括DNA和RNA)，其中RNA经罗氏cDNA第一链合成试剂盒和NEB的cDNA第二链合成试剂盒逆转录成双链cDNA，把DNA和cDNA一起用于构建测序文库。
2)测序文库构建和上机测序
核酸片段化：运用超声波将长链DNA分子打断成500bp的短片段；
添加接头：末端修补，添加A碱基，添加测序接头；
连接产物纯化：采用磁珠纯化的方法对连接产物进行纯化，选出完整的连接产物；
PCR扩增：利用通用引物，对连接产物进行PCR，增加文库量；
测序文库质检：琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物长度、杂带、引物二聚体残留等；利用Agilent 2100Bioanalyzer测定文库的片段长度及分布；使用Qubit测定文库浓度；
上机测序：利用Illumina测序平台对文库进行双端150bp的宏基因组测序，产出FASTQ格式原始测序数据。
3)测序数据的处理
利用FastQC等软件进行质控，分析测序数据是否符合要求；利用fastp、Trimmomatic等软件过滤低质量序列(reads)，得到高质量序列。
(3)检测脑脊液中的病原菌
利用bowtie2软件将测序reads比对到人参考基因组以去除人源序列，得到候选的病原微生物序列。利用kraken2软件将候选的病原微生物序列比对到病原微生物参考数据库(包括细菌、病毒、真菌、支原体等)进行物种分类，检测样本中含有的病原体。33例样本皆检出了病原菌，且病原菌种类与脑脊液培养结果相符，能够用于后续预后分析，表明本方法可以检出病原体序列。
(4)计算脑脊液的宿主基因表达量
利用转录组比对软件STAR宏基因组测序数据中的转录组数据比对到人参考基因组(版本为hg19)；利用featureCounts软件统计比对到基因外显子区域的reads数目，得到细菌性脑膜炎患者脑脊液样本中基因的表达量。
(5)筛选与患者不良预后相关的宿主基因
利用DaMiRseq软件，去除年龄、性别和批次等混杂因素的影响，分析预后不良患者与预后良好患者之间的基因差异表达情况，共得到10个差异表达基因，包括CLCN4、IGSF1、CXXC4、XPNPEP2、MED12、ARHGEF6、DDX3X、AMER1、TSIX、IGSF1和ND4L(图3)，同时进一步表明本发明提出的宏基因组测序方法可以检测宿主基因表达量(图3)。
(6)构建不良预后预测模型
把不良预后组样本与预后良好组样本间的上述10个差异表达基因的表达量作为自变量；以预后状态分类(预后良好、预后不良)作为因变量。
利用R语言glmnet包中的LASSO回归函数建立细菌性脑膜炎不良预后预测模型：利用交叉验证(cv.glmnet函数)的方法测试不同lambda参数对于模型分类效果的影响；
使用推荐的lambda.1se数值作为超参数，获得了分类效果最好的最小基因集(CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L)并用于构建不良预后预测模型。
其中，CXXC4在预后不良组患者中表达上调，XPNPEP2，IGSF1和ND4L基因在预后不良组患者中表达下调(图4)。
计算获得预测模型中4个基因的权重系数，构建了不良预后预测模型公式：
其中Z＝(1.290×CXXC4表达量)+(-0.857×XPNPEP2表达量)+(-1.277×IGSF1表达量)+(-0.003×ND4L表达量)+5.305。
(7)评估预后预测模型的表现
根据建立的细菌性脑膜炎不良预后预测模型，计算患者的不良预后风险得分如表1所示。以0.5作为阈值，风险数值得分<0.5则将患者划分为预后良好组，风险数值得分≥0.5则将患者划分为预后不良组。
表1细菌性脑膜炎样本的预后信息、模型所用宿主基因的表达量及不良预后预测模型结果
以患者实际的预后信息作为金标准，运用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析评估模型的表现，结果如图5。
由图5可以看出，本发明建立的不良预后预测模型表现良好，曲线下面积(AUC)为0.88，灵敏度(sensitivity)为0.867，特异度(specificity)为0.889。
实施例3
验证细菌性脑膜炎诊断方法及预后预测模型
(1)收集细菌性脑膜炎患者的脑脊液样本作为测试集
采集在深圳市儿童医院就诊的细菌性脑膜炎患者的脑脊液标本共18例作为测试集。样本信息完整，包括患者基本信息、病原学检测结果、临床诊断信息、治疗方案及预后情况。其中8例患者预后不良(n＝8)，另10例患者预后良好(n＝10)，具体信息见表2。
预后不良指出现了细菌性脑膜炎并发症(脑积水、硬膜下积液、脑室管膜炎、脑软化、脑脓肿等)或后遗症、放弃治疗或死亡，其他样本为预后良好组。
(2)宏基因组测序及病原体检测
采用实施例2的方法进行宏基因组测序及病原体检测。样本中检出了大肠杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、鲍曼不动杆菌、无乳链球菌等病原菌，与脑脊液培养结果相一致。
(3)检测脑脊液的宿主基因表达量
采用实施例2的方法检测宿主基因表达量。即利用STAR软件将宏基因组测序数据中的转录组数据比对到人参考基因组(版本为hg19)，利用featureCounts软件统计比对到基因外显子区域的reads数目，得到测试集脑脊液样本中CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L基因的表达量，见表2。
(4)计算测试集样本的不良预后风险值
根据实施例2建立的不良预后风险得分公式计算不良预后风险值，公式为：
其中，Z＝(1.290×CXXC4表达量)+(-0.857×XPNPEP2表达量)+(-1.277×IGSF1表达量)+(-0.003×ND4L表达量)+5.305。
根据公式计算出的测试集样本的不良预后风险值见表2，其中风险值<0.5的患者有10例，被预测为预后良好(n＝10)；风险值≥0.5的患者有8例，被预测为预后不良。
表2细菌性脑膜炎样本的预后信息、模型所用宿主基因的表达量及不良预后预测模型结果
(6)脑膜炎不良预后预测模型在测试集中表现良好
以患者实际的预后信息作为金标准，其中14例样本的预测结果与金标准一致，4例患者(VCSF.03、VCSF.04、VCSF.12和VCSF.18)的预测结果与金标准不一致。运用受试者工作特征曲线(ROC)分析评估模型的准确性。由图6可以看出，本发明所述模型同样在测试集样本中表现良好，曲线下面积(AUC)为0.78，灵敏度(sensitivity)为0.75，特异度(specificity)为0.80，进一步验证了预后模型的预测能力。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种细菌性脑膜炎不良预后预测模型的构建方法，其特征在于，所述细菌性脑膜炎不良预后预测模型是以细菌性脑膜炎预后相关的基因标志物的表达量为输入数据构建得到；所述构建得到的预测模型公式为：
不良预后风险值=，其中Z=（1.290×CXXC4表达量）+（-0.857×XPNPEP2表达量）+（-1.277×IGSF1表达量）+（-0.003×ND4L表达量）+5.305；所述基因标志物包括CXXC4、XPNPEP2、IGSF1和ND4L基因。
2.一种识别细菌性脑膜炎患者不良预后的系统，其特征在于，所述系统包括利用权利要求1所述构建方法构建得到的预测模型；所述系统的使用方法如下：
利用所述预测模型计算不良预后风险值，根据所述不良预后风险值的阈值识别细菌性脑膜炎患者不良预后；所述不良预后风险值的阈值为0.5。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述不良预后风险值的阈值＜0.5时，患者预后良好；所述不良预后风险值的阈值≥0.5时，患者预后不良。
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