CN113470752A - 一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，属于基因检测分析领域，鉴定方法包括：构建用于Nanopore测序数据比对的细菌序列参考库；将待测样品测序，用minimap2和blast两种比对软件进行数据库比对；注释结果，筛选比对结果，以barcode为单位进行汇总；对每一个barcode的比对结果进行分析，确定每一个细节比对结果的准确性；采用本发明的鉴定方法能够提高序列质量和分析速度，降低错误率。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测分析领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法。
背景技术
被感染后进行治疗的首要条件就是要快速准确的对病因进行鉴定。尽可能的进行早期诊断和早期药物干预能够尽可能的提高生存率。而对病原细菌的快速、准确的检测能够再第一时间进行诊断并给出相应的治疗药物。
目前的病原细菌检测技术分为基于分离培养和镜检的检测技术、定量PCR检测技术和基于高通量宏基因组测序的检测技术。
基于分离培养和镜检的检测技术有诸多的不足，如厌氧菌离体后容易死亡；ICU分离菌株抗生素暴露后，低活性状态难以生长；部分菌落生长极其缓慢或快速难以分离；复合感染等问题，基于定量PCR的检测技术检测范围有限，同时特异性和通量低。基于高通量宏基因组测序的检测技术可实现对所有病原细菌无选择性、无偏倚、快速、全面的检测，但同样存在许多的限制。检测样本中的微生物DNA和宿主DNA极易受到干扰。测序结果需要样本完全测序完成后才可进行生信分析进行。
新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。但是新型纳米孔测序法产生的序列质量低，错误率较高而导致无法进行准确的细菌分析鉴定的问题；市场需要一种基于新型纳米孔测序法能够快速、准确鉴定病原细菌的鉴定方法，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，本发明能够解决Nanopore纳米孔测序法产生的序列质量低，错误率较高而导致无法进行准确的细菌分析鉴定的问题。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一，建立细菌序列参考库：通过下载多个数据库的微生物rRNA序列，再对序列做过滤后，构建数据库；
步骤二，鉴定病原细菌包括：测序数据样品拆分，数据质控处理，比对分析，物种分类，和汇总结果；
对待测样品测序后的reads采用minimap2和blast比对到细菌序列参考库，筛选出一致性大于90%且覆盖度大于85%作为比对质量高的序列，输出分析结果；
测序数据样品拆分的具体内容为：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，fastq文件中每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段barcode序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，并正确分辨每一条barcode序列对应的样品；
数据质控处理的具体内容为：采用NanoFilt软件并根据序列的平均测序数据质量值Q进行质控，若Q值小于7的序列为不合格序列，则被去除；
比对分析的具体内容为：将质控处理后的序列采用minimap2和blast进行快速比对，计算reads 的identity和coverage，筛选identity 大于90%且coverage大于85%作为比对质量高的结果；
物种分类的具体内容包括如下步骤：
步骤a：将序列与微生物序列参考库进行比对，选择比对分数最高、identity大于90%且coverage大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录ID；
步骤b：将最佳比对记录ID与物种谱系数据库进行匹配，获取物种分类结果；
汇总结果的具体内容包括：将每一个barcode的所有序列的物种分类结果按照种分类水平进行计数汇总，然后获得每种细菌在此barcode中检出的条数和占比汇总，最终将多个barcode的汇总合并到同一张表并输出到一个汇总文件；
步骤三，比对准确性分析的内容包括：
在获得汇总文件后，针对每条序列minimap2和blast两个软件的所有比对结果进行重分析，先筛选出identity大于90%且coverage大于85%的高质量比对结果，再对每条序列的多个比对结果进行物种分类，若存在如下两种情况，则认为此比对结果是由Nanopore测序仪自身缺陷导致错误比对，将此结果删除，最终生成新的汇总文件；
情况一：同一软件的多个比对结果中获得了不同科的细菌分类结果；
情况二：同一软件的非最高比对结果中获得了其他种的细菌分类结果，在此barcode的汇总结果中，其他种的结果计数为最高比对结果获得物种的两倍及以上。
进一步的，步骤一中多个数据库包括：NCBI 16S rRNA数据库和SILVA数据库。
进一步的，步骤一中对序列做过滤的具体步骤为：
步骤a：将来源不同的序列合并成一个综合数据库，并剔除重复序列；
步骤b：筛选有文献支持的序列作为高可信度参考序列。
进一步的，步骤二中，计算identity和coverage的方法为：minimap2比对结果中第13列含有前缀de:f:，该列值加上identity等于1；minimap2比对结果第2列代表序列长度，第3列代表比对其实位置，第4列代表比对终止位置，将第4列与第3列的差值除以第2列等于coverage。
进一步的，步骤二中的微生物序列参考库为NCBI taxonomy。
进一步的，汇总文件为excel文件。
采用上述技术方案后，本发明的有益之处在于：
本发明通过设定软件的特定参数有效去除了质量低的序列，同时使用多种比对软件，进行阈值筛选和汇总后重分析有效避免了测序错误率高带来的影响，提高准确率；
本发明基于纳米孔测序平台的病原细菌测序数据鉴定方法拥有KB级的测序长度，可有效提升病原细菌物种分辨率从而保证鉴定结果的准确性；分析流程采用实时分析可更加快速的出具分析结果。
附图说明
图1为本发明的一种实施例的流程图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一，建立细菌序列参考库：通过下载多个数据库的微生物rRNA序列，再对序列做过滤后，构建数据库；作为一种优选，多个数据库包括：NCBI 16S rRNA数据库和SILVA数据库；这些数据库是目前公开发表的较为全面的数据库，需要说明的是：数据库的选取不受限制，在未来若出现更加全面的数据库也可以进行替换。
对序列做过滤的具体步骤为：
步骤a：将来源不同的序列合并成一个综合数据库，并剔除重复序列；
步骤b：筛选有文献支持的序列作为高可信度参考序列。
步骤二，鉴定病原细菌包括：测序数据样品拆分，数据质控处理，比对分析，物种分类，和汇总结果；
对待测样品测序后的reads采用minimap2和blast比对到细菌序列参考库，筛选出一致性大于90%且覆盖度大于85%作为比对质量高的序列，输出分析结果；
测序数据样品拆分的具体内容为：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，fastq文件中每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段barcode序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，并正确分辨每一条barcode序列对应的样品；
数据质控处理用于去除测序质量低序列、接头或引物污染序列；具体内容为：采用NanoFilt软件并根据序列的平均测序数据质量值Q进行质控，若Q值小于7的序列为不合格序列，则被去除；
比对分析的具体内容为：将质控处理后的序列采用minimap2和blast进行快速比对，计算reads 的identity和coverage，筛选identity 大于90%且coverage大于85%作为比对质量高的结果；作为一种实施例，计算identity和coverage的方法为：minimap2比对结果中第13列含有前缀de:f:，该列值加上identity等于1；minimap2比对结果第2列代表序列长度，第3列代表比对其实位置，第4列代表比对终止位置，将第4列与第3列的差值除以第2列等于coverage。需要说明的是：这只是一种优选实施例，只要能计算reads 的identity和coverage的方法都适用于本发明。
物种分类的具体内容包括如下步骤：
步骤a：将序列与微生物序列参考库进行比对，选择比对分数最高、identity大于90%且coverage大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录ID；作为一种优选，微生物序列参考库为NCBI taxonomy；
步骤b：将最佳比对记录ID与物种谱系数据库进行匹配，获取物种分类结果；
汇总结果的具体内容包括：将每一个barcode的所有序列的物种分类结果按照种分类水平进行计数汇总，然后获得每种细菌在此barcode中检出的条数和占比汇总，最终将多个barcode的汇总合并到同一张表并输出到一个汇总文件；作为一种优选，汇总文件为excel文件。
步骤三，比对准确性分析的内容包括：
在获得汇总文件后，针对每条序列minimap2和blast两个软件的所有比对结果进行重分析，先筛选出identity大于90%且coverage大于85%的高质量比对结果，再对每条序列的多个比对结果进行物种分类，若存在如下两种情况，则认为此比对结果是由Nanopore测序仪自身缺陷导致错误比对，将此结果删除，最终生成新的汇总文件；
情况一：同一软件的多个比对结果中获得了不同科的细菌分类结果；
情况二：同一软件的非最高比对结果中获得了其他种的细菌分类结果，在此barcode的汇总结果中，其他种的结果计数为最高比对结果获得物种的两倍及以上。
为了验证本发明的有益效果，做如下验证实验：
申请人收集了五十三株不同的标准菌和三百八十七个临床鉴定的样本，采用富集培养鉴定，一代测序结合人工比对和三代测序结果本发明鉴定三种不同的方法验证准确性；富集培养鉴定和一代人工比对是目前公认的标准，准确率为100%。
结果发现，三种不同的检测方法都可以准确鉴定五十三株标准菌。富集培养鉴定和一代测序结果人工比对可以准确鉴定所有的三百八十七个临床样本，而三代测序结合本发明鉴定可以准确鉴定三百七十四个样本；通过此验证，可以说明本发明的鉴定准确率达到了97%以上，是可以用来进行临床应用的。
三代测序结合本发明病原细菌鉴定的水平结果统计总览如表1所示：
从准确率来看，采用三代测序结合本发明鉴定方法准确率高于97%。从时效性来看，采用富集培养鉴定和一代测序结合人工比对的方法鉴定时间历时近两周，而采用三代测序结合本发明鉴定方法仅需要24小时，具有广大的应用前景。
除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。
Claims (6)
1.一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，建立细菌序列参考库：通过下载多个数据库的微生物rRNA序列，再对序列做过滤后，构建数据库；
步骤二，鉴定病原细菌包括：测序数据样品拆分，数据质控处理，比对分析，物种分类，和汇总结果；
对待测样品测序后的reads采用minimap2和blast比对到细菌序列参考库，筛选出一致性大于90%且覆盖度大于85%作为比对质量高的序列，输出分析结果；
所述测序数据样品拆分的具体内容为：通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，fastq文件中每条序列的前一段序列就是barcode序列，将这段barcode序列与测序仪提供的barcode序列库进行比对，并正确分辨每一条barcode序列对应的样品；
所述数据质控处理的具体内容为：采用NanoFilt软件并根据序列的平均测序数据质量值Q进行质控，若Q值小于7的序列为不合格序列，则被去除；
所述比对分析的具体内容为：将质控处理后的序列采用minimap2和blast进行快速比对，计算reads 的identity和coverage，筛选identity 大于90%且coverage大于85%作为比对质量高的结果；
所述物种分类的具体内容包括如下步骤：
步骤a:将序列与微生物序列参考库进行比对，选择比对分数最高、identity大于90%且coverage大于85%的记录作为该序列的最佳比对记录ID；
步骤b:将最佳比对记录ID与物种谱系数据库进行匹配，获取物种分类结果；
所述汇总结果的具体内容包括：将每一个barcode的所有序列的物种分类结果按照种分类水平进行计数汇总，然后获得每种细菌在此barcode中检出的条数和占比汇总，最终将多个barcode的汇总合并到同一张表并输出到一个汇总文件；
步骤三，比对准确性分析的内容包括：
在获得汇总文件后，针对每条序列minimap2和blast两个软件的所有比对结果进行重分析，先筛选出identity大于90%且coverage大于85%的高质量比对结果，再对每条序列的多个比对结果进行物种分类，若存在如下两种情况，则认为此比对结果是由Nanopore测序仪自身缺陷导致错误比对，将此结果删除，最终生成新的汇总文件；
情况一：同一软件的多个比对结果中获得了不同科的细菌分类结果；
情况二：同一软件的非最高比对结果中获得了其他种的细菌分类结果，在此barcode的汇总结果中，其他种的结果计数为最高比对结果获得物种的两倍及以上。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，其特征在于，步骤一中所述多个数据库包括：NCBI 16S rRNA数据库和SILVA数据库。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中对序列做过滤的具体步骤为：
步骤a：将来源不同的序列合并成一个综合数据库，并剔除重复序列；
步骤b：筛选有文献支持的序列作为高可信度参考序列。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中，计算identity和coverage的方法为：minimap2比对结果中第13列含有前缀de:f:，该列值加上identity等于1；minimap2比对结果第2列代表序列长度，第3列代表比对其实位置，第4列代表比对终止位置，将第4列与第3列的差值除以第2列等于coverage。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中的微生物序列参考库为NCBI taxonomy。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的细菌测序数据鉴定方法，其特征在于，所述汇总文件为excel文件。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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