CN111575368A - 一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，包括gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂、cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物、逆转录引物混合物、实时荧光定量聚合酶链式反应液、探针、阳性对照标准品和无酶水。探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来，针对逆转录产物的特定序列所结合探针信号的检测从而检测特定基因的表达量，从而能够推测子宫内膜容受性，采用该种方式操作简单、灵敏性高、特异性强，且检测结果准确、客观、快捷。从而帮助临床医生明确子宫内膜容受性的状态，以期为不孕患者早期诊断、靶向干预以及指导胚胎移植时机提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物学检测领域，具体涉及一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前，中国不孕症的发生率约在15-20％，而且不孕不育患者的数量每年以数十万的速度递增。婚育年龄的推迟、工作压力的堆积以及生活方式的改变等因素直接或间接地减低了人们的生育能力。随着世界上首例试管婴儿的降生，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)已成为不孕女性尽快获得妊娠的有效途径。但在实际临床实践过程中，低胚胎种植率仍然是长期困扰辅助生殖技术医护人员的难题之一。子宫内膜容受性作为胚胎植入过程中的关键因素，其改变是低胚胎种植率的重要原因之一。
子宫内膜容受性是指子宫内膜对于胚胎的接受能力，指子宫内膜处于一种允许胚胎定位、黏附和侵入的状态。这段子宫内膜接受胚胎的时间，也被称为种植窗期，一般出现在排卵或者hCG扳机后的第7-9天。目前研究表明，子宫内膜的容受性受到时间和病理因素的双重调节。早于或者晚于这段时间，子宫内膜的着床期尚未开放或已经闭合，均不利于胚胎的种植。同时，病理性的因素，包括内膜基质细胞、免疫细胞、细胞因子的异常，都会影响子宫内膜的容受性，从而导致流产或不孕等不良妊娠结局的发生。
传统临床上对于子宫内膜容受性的诊断，主要是参考形态学的评估。其评估指标主要包括三大类：(1)子宫内膜厚度、回声和血流等超声形态；(2)腺体大小、间质疏密和血管丰度等组织活检形态；(3)子宫内膜胞饮突。然而，形态学评估无法准确反映子宫内膜细胞和细胞因素的表达情况，因此其评估的有效性在临床实践中受到一定的争议。
鉴于形态学评估的局限性，目前基础科研和临床实践中，已逐渐采用基于免疫组织化学染色技术和基因转录组分析技术的方法进行子宫内膜容受性评估。相较于免疫组织化学染色技术的分析，采用基因转录组分析技术所需要的患者组织样本较少，因此能够减少患者因组织样本取样时痛苦。同时，基于转录组分析技术的方法能够检测多种生物分子标记物，确保子宫内膜容受性评估的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种评估子宫内膜容受性的试剂盒及其使用方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，包括gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂、cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物、逆转录引物混合物、实时荧光定量聚合酶链式反应液、探针、阳性对照标准品和无酶水。
本发明的有益效果是：探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来，针对逆转录产物的特定序列所结合探针信号的检测从而检测特定基因的表达量，从而能够推测子宫内膜容受性，采用该种方式操作简单、灵敏性高、特异性强，且检测结果准确、客观、快捷。从而帮助临床医生明确子宫内膜容受性的状态，以期为不孕患者早期诊断、靶向干预以及指导胚胎移植时机提供依据。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，所述gDNA清除剂缓冲液为TaKaRa PrimeScriptTM5×gDNAEraser Buffer，所述gDNA清除剂为TaKaRa PrimeScriptTMgDNA Eraser；所述cDNA逆转录酶混合物为TaKaRaPrimeScriptTMRT Enzyme Mix I；所述逆转录引物混合物为TaKaRa PrimeScriptTMRTPrimer Mix；所述实时荧光定量聚合酶链式反应液为TaqManTMUniversal Master Mix II,with UNG。
采用上述进一步方案的有益效果是上述试剂能够辅助实现基因组DNA的清除、逆转录以及实时荧光定量聚合酶链式反应。
进一步，所述探针包括7种，所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述阳性对照标准品为含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒以及含有B2M基因的质粒的混合质粒，所述无酶水包括第一无酶水和第二无酶水。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测糖酵解通路相关基因的表达水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化生产。
进一步，还包括单独质粒，所述单独质粒包括7种，分别为含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒以及含有B2M基因的质粒。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测含有相关基因和内参基因的质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线，以便得到基因的表达量。对检测结果进行进一步验证。
进一步，所述试剂盒包括盒体以及设置于所述盒体内的第一抽屉式隔层、第二抽屉式隔层和第三抽屉式隔层，
所述第一抽屉式隔层内设有第一泡沫垫，所述第二抽屉式隔层内设有第二泡沫垫，
所述第一泡沫垫开设6个分别放有gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂、cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物、逆转录引物混合物和第一无酶水的凹槽，所述第一泡沫垫开设一个放置逆转录反应使用96孔板的腔体，
所述第二泡沫垫上开设7个放置探针的凹槽、1个放置阳性标准品的凹槽、放置实时荧光定量聚合酶链式反应液的凹槽和放置第二无酶水的凹槽，所述第二泡沫垫开设放置定量聚合酶链式反应使用的96孔板的腔体，
所述第三隔层内放置第一冰盒和第二冰盒，所述第一冰盒用来放置96孔板，所述第二冰盒用来放置离心管。
采用上述进一步方案的有益效果是(1)实验稳定性好：逆转录试剂和实时荧光定量聚合酶链式反应的反应试剂平常保存在-20℃的环境下，呈现冰冻的状态。使用时需要缓慢解冻以减少试剂因为温度骤变而失效，本试剂盒提供的放置离心管的冰盒，能够让上述试剂均匀恢复到液体状态。本试剂盒提供的放置96孔板冰盒，则可以让反应混合液在进行反应前，保持较低的温度，减少非特异性反应。(2)试剂盒分区明确：用到哪层试剂就取出哪个隔层，避免了提前解冻试剂。同时，也减少了检测人员拿错试剂的可能性。
进一步，所述第二泡沫垫上还开设7个放置单独质粒的凹槽，7个放置所述单独质粒的凹槽分别放置含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质粒；7个放置所述探针的凹槽分别放置SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基因探针、ACTB基因探针和B2M基因探针。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测糖酵解通路相关基因的表达水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化生产；通过检测含有相关基因和内参基因的质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线，以便得到样本基因的表达量。
进一步，所述第一抽屉式隔层、所述第二抽屉式隔层和所述第三抽屉式隔层从上至下层叠设置且其后端均设置第一磁性锁扣，所述盒体分别对应所述第一磁性锁扣设置第二磁性锁扣，所述第一磁性锁扣和所述第二磁性锁扣通过磁性连接；所述第一抽屉式隔层、所述第二抽屉式隔层和所述第三抽屉式隔层前端均设置把手；所述试剂盒还包括一份使用说明书。
采用上述进一步方案的有益效果是密封性好：本发明的试剂盒，在盒体和抽屉式隔层相应的设置了磁性锁合装置，试剂盒密封性好，便于移动和运输。
本发明还涉及一种所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：步骤1，RNA提取：获取子宫内膜组织样本，之后提取所述子宫内膜组织样本的RNA；步骤2，清除gDNA：在所述步骤1得到的RNA中加入gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂和无酶水混合后放入PCR仪中进行反应,之后冷却得到第一混合物；步骤3,逆转录反应：在所述第一混合物中加入cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物和逆转录引物混合物混合后放入PCR仪中进行逆转录反应，得到cDNA；步骤4，获取模板：将所述cDNA稀释得到检测样品的模板，将能够同时检测7种待测基因的阳性对照标准品稀释得到阳性对照标准品的上样模板；步骤5，实时荧光定量聚合酶链式反应：将所述步骤4中所述检测样品的模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；将所述步骤4中所述阳性对照标准品的上样模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；根据实验结果得到检测基因表达量；步骤6，判断容受性：将所述步骤5得到的基因表达量与阳性对照标准品的上样模板值进行比较，得到待测样品相较于阳性对照标准品的变化比例，从而判断子宫内膜的容受性。
采用上述进一步方案的有益效果是上述方法能够实现检测相关基因的表达水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化生产。
进一步，所述步骤1中，提取所述子宫内膜组织样本的RNA的方法为Qiagen RNeasyPlus Mini Kit或者ThermoFisher Dynabeads mRNA DIRECTPurification Kit；所述步骤2中，PCR仪设置为42℃反应2min；所述步骤3中，PCR仪设置为37℃反应15min，85℃反应5sec；所述步骤4中，稀释倍数为10；所述步骤5中所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针和SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述步骤5中基因表达量包括相关基因表达量和内参基因表达量；所述步骤6中通过相关基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性；所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法还包括通过内参基因表达量对样本上样量进行校正的步骤。
采用上述进一步方案的有益效果是上述PCR参数的设置能够分别实现去除基因组DNA和逆转录反应。与“阳性标准对照品”进行比较，得到样本相关基因和内参基因的相对表达量。通过内参基因的表达量能够校正基因的表达量，从而得到准确的效果，使得检测更为精准。
进一步，还包括验证步骤，所述验证步骤包括，步骤a，RNA提取：获取子宫内膜组织样本，之后提取所述子宫内膜组织样本的RNA；步骤b，清除gDNA：在所述步骤a得到的RNA中加入gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂和无酶水混合后放入PCR仪中进行反应,之后冷却得到第一混合物；步骤c,逆转录反应：在所述第一混合物中加入cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物和逆转录引物混合物混合后放入PCR仪中进行逆转录反应，得到cDNA；步骤d，获取模板：将所述cDNA稀释得到检测样品的模板，将含有检测基因的每种质粒分别稀释不同倍数作为标曲模板检测荧光量制作标准曲线；步骤e，实时荧光定量聚合酶链式反应：将所述步骤d中所述检测样品的模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；将所述步骤d中所述标曲模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；根据实验结果得到检测基因表达量；步骤f，判断容受性：将所述步骤e得到的基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测糖酵解通路相关基因的表达水平，能够简单、高效地评估子宫内膜容受性，易于制造和使用，市场需求量大，适合规模化生产。通过检测含有相关基因和内参基因的质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线，以便得到样本相关基因和内参基因的表达量。通过内参基因的表达量能够校正相关基因的表达量，从而得到准确的结果，使得检测更为精准。
进一步，所述步骤a中，提取所述子宫内膜组织样本的RNA的方法为Qiagen RNeasyPlus Mini Kit或者ThermoFisher Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit；所述步骤b中，PCR仪设置为42℃反应2min；所述步骤c中，PCR仪设置为37℃反应15min，85℃反应5sec；所述步骤d中，稀释倍数为10；所述步骤e中所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针和SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述含有检测基因的质粒包括含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质粒；所述步骤d中将含有检测基因的每种质粒分别稀释100倍，1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍作为标曲模板检测荧光量制作标准曲线；所述步骤e中基因表达量包括相关基因表达量和内参基因表达量；所述步骤f中通过相关基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性；所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法还包括通过内参基因表达量对样本上样量进行校正的步骤。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明通过检测含有相关基因和内参基因的质粒的反应荧光量和含量的值来做标准曲线，以便得到样本相关基因和内参基因的表达量。通过内参基因的表达量能够校正相关基因的表达量，从而得到准确的结果，使得检测更为精准。利用质粒对实验结果做进一步检测，保证实验结果的准确性。
附图说明
图1为本发明实施例1试剂盒结构示意图；
图2为本发明实施例2试剂盒结构示意图。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1、盒体，2、第一抽屉式隔层，3、第二抽屉式隔层，4、第三抽屉式隔层，5、第一磁性锁扣，6、第二磁性锁扣，7、把手，8、泡沫垫，801、第一泡沫垫，802、第二泡沫垫，9、gDNA清除剂缓冲液，10、gDNA清除剂，11、cDNA逆转录缓冲液，12、cDNA逆转录酶混合物，13、逆转录引物混合物，14、第一无酶水，15、逆转录使用96孔板，16、探针，17、阳性标准品，18、单独质粒，19、实时荧光定量聚合酶链式反应液，20、第二无酶水，21、定量聚合酶链式反应使用的96孔板，22、第一冰盒，23、第二冰盒。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
糖酵解通路相关基因在子宫内膜基质细胞蜕膜化和免疫细胞的活化中发挥重要的作用。基础研究结果表明，采用在体外人为降低基质细胞葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达水平或者通过一些抑制剂抑制糖酵解途径上的酶，都会抑制子宫内膜蜕膜化标志分子PRL和IGFBP1的表达，提示糖酵解对于子宫内膜蜕膜化十分重要。此外，活化的免疫细胞，包括T细胞、巨噬细胞(Macrophage)、树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(Natural Killer Cell)和B细胞，糖酵解作用均有增强。受孕酮受体、细胞因子和抗原受体激活的免疫细胞能够通过糖酵解快速产生足够的能量以满足其功能需求，如吞噬作用，细胞因子产生以及抗原提呈等。因此，糖酵解途径相关蛋白和基因能够通过影响免疫细胞的分化和功能以及基质细胞的蜕膜化，构建了适宜胚胎植入和妊娠维持的子宫内膜微环境。对糖酵解途径的评估能够从病理角度反映子宫内膜的容受性状态。糖酵解途径中，葡萄糖转运蛋白-1(glucosetransporter 1,SLC2A1)能够将细胞外的葡萄糖(glucose)转移到胞质中，随后在己糖激酶2(hexokinase-2,HK2)、丙酮酸激酶同工酶(pyruvate kinase,PKM)等作用下转化为丙酮酸(pyruvate)，生成的丙酮酸可以进行三羧酸循环或生成乳酸。单羧酸转运蛋白4(Monocarboxylate transporter 4,SLC16A3)能够将多余的乳酸排出细胞外，减少乳酸对细胞毒性的作用。低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1A)则是糖酵解作用重要的调节因子。
在临床的人体组织样本中，发明人通过检测糖酵解通路相关基因的转录水平，包括Solute carrier family 2,facilitated glucose transporter member 1(SLC2A1)、Hexokinase-2(HK2)、Pyruvate kinase PKM 2(PKM2)、Hypoxia-inducible factor 1-alpha(HIF1A)、Monocarboxylate transporter 4(SLC16A3)。与妊娠成功组相比，妊娠失败组的上述基因发生下调。
【本发明检测步骤流程】
提取子宫内膜组织RNA
将子宫内膜组织RNA逆转录生成cDNA
进行“实时荧光定量聚合酶链式反应”，将cDNA、“实时荧光定量聚合酶链式反应液”和“探针”共同加入反应体系。通过“实时荧光定量聚合酶链式反应仪器”，对cDNA进行PCR扩增并进行荧光检测。最终会得到某个样本cDNA的荧光数值，并通过跟标准品/质粒进行比较，推算出某个样本cDNA的相对值变化情况，并由此推算出某个样本RNA的目标基因相对值变化情况。最后通过与ACTB/B2M这些内参基因进行上样量校正，得到某个样品在单位质量内，转录组RNA的变化情况。
实施例1
如图1，本实施例评估子宫内膜容受性的试剂盒，所述试剂盒包括盒体1以及设置于所述盒体1内的第一抽屉式隔层2、第二抽屉式隔层3和第三抽屉式隔层4，所述第一抽屉式隔层1内设有第一泡沫垫801，所述第二抽屉式隔层3内设有第二泡沫垫802，所述第一泡沫垫801开设6个分别放有gDNA清除剂缓冲液9、gDNA清除剂10、cDNA逆转录缓冲液11、cDNA逆转录酶混合物12、逆转录引物混合物13和第一无酶水14的凹槽，所述第一泡沫垫801开设一个放置逆转录使用96孔板15的腔体，所述第二泡沫垫802上开设7个放置探针16的凹槽、1个阳性对照标准品的凹槽、放置实时荧光定量聚合酶链式反应液19的凹槽和放置第二无酶水20的凹槽，所述第二泡沫垫802开设放置定量聚合酶链式反应使用的96孔板21的腔体，所述第三隔层内放置第一冰盒22和第二冰盒23，所述第一冰盒22用来放置96孔板，所述第二冰盒23用来放置离心管。
作为本实施例进一步的方案，7个放置所述探针16的凹槽分别放置SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基因探针、ACTB基因探针和B2M基因探针；1个放置所述阳性对照标准品的凹槽放置1个阳性对照标准品。
作为本实施例进一步的方案，所述第一抽屉式隔层2、所述第二抽屉式隔层3和所述第三抽屉式隔层4后端设置第一磁性锁扣5，所述盒体1对应所述第一磁性锁扣5设置第二磁性锁扣6，所述第一磁性锁扣5和所述第二磁性锁扣6通过磁性连接；所述第一抽屉式隔层2、所述第二抽屉式隔层3和所述第三抽屉式隔层4前端均设置把手7；所述试剂盒还包括一份使用说明书。
具体的，说明书可以在盒体1内也可以贴在盒体1上。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1)采用超声活检导管经阴道插入子宫腔内注入生理盐水进行宫腔声学造影，并在超声介导下获取子宫内膜活检组织标本。将获取的子宫内膜组织标本在体外采用生理盐水洗去淤血，立刻进行RNA提取或暂时冻存于液氮中暂存。将新鲜的内膜组织标本或液氮组织标本采用Qiagen RNeasy Plus Mini Kit、ThermoFisher Dynabeads mRNA DIRECTPurification Kit或其他方式提取RNA，采用超微量分光光度计测定内膜标本的RNA浓度。
2)逆转录生成cDNA：
将清除gDNA、逆转录反应、荧光定量聚合酶链式反应所需的试剂至于第二冰盒(23)中进行缓慢解冻。
清除gDNA(基因组DNA)：将逆转录使用的96孔板置于第一冰盒(22)上，根据测定的标本浓度取1ug RNA加入96孔板的其中一孔中，加入2ul gDNA清除剂缓冲液(9)和1ul gDNA清除剂(10)，用第一无酶水(14)将每个孔中反应液的总体积补充到10ul(表1)。将96孔板放入聚合酶链式反应(PCR)仪中，42℃反应2min。反应后，将96孔板放入第一冰盒(22)中冷却。
表1清除基因组DNA反应体系
| gDNA清除剂缓冲液 | 2ul |
| gDNA清除剂 | 1ul |
| 样本RNA | 1ug |
| 无酶水 | 至10ul |
逆转录反应：将上述反应液中，加入1ul cDNA逆转录酶混合物(12)，1ul逆转录引物混合物(13)，4ul cDNA逆转录缓冲液(11)和4ul第一无酶水(14)(表2)。将96孔板放入聚合酶链式反应(PCR)仪中，37℃反应15min，85℃反应5sec。
表2逆转录反应体系
逆转录中的引物是混合引物。含有TaKaRa PrimeScriptTMPrimerOligo dT Primer和TaKaRa PrimeScriptTMRandom 6mers。
逆转录的步骤分成两步，第一步去除gDNA(基因组DNA，避免后续实施“实时荧光定量聚合酶链式反应”测定时，探针有可能通过和gDNA上的目标片段结合，造成假阳性或者检测数值偏高的情况)
3)cDNA分装与保存：将逆转录生成cDNA分装，暂时不需要检测的样本保存在-20℃或-80℃待用。
4)实时荧光定量聚合酶链式反应测定相关基因表达量：将步骤3)获得cDNA稀释10倍作为检测样品的模板。将阳性对照标准品(17)稀释10倍作为阳性对照标准品的上样模板。
5)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR)反应液(19)、7瓶探针(检测SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M基因的表达)(18)、第二无酶水(20)，分别配置反应混合液(表3)，检测子宫内膜容受性相关基因的表达量(包括SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3)，并通过内参基因(ACTB和B2M)对样本上样量进行校正；
表3实时荧光定量聚合酶链式反应体系
6)判断容受性：计算步骤5)中获得样本的子宫内膜容受性相关基因的表达量与阳性对照标准品的表达量比值，最终比照预定值，从而判断子宫内膜的容受性，低于截断值的判断为子宫容受性较差。
SLC2A1截断值：0.5534；HK2截断值：0.6443；PKM2截断值：0.6903；HIF1A截断值：0.7111；SLC16A3截断值：0.6235。
实例：通过实施荧光定量聚合酶链式反应，得到阳性对照标准品和待测样本的Ct值。
通过△△CT法计算目标的基因的相对表达量(相对表达量＝2-△△Ct)：
通过ActB和B2M对特定进行的表达量进行校正，并取两者的均值：
即患者1子宫内膜的SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3的数据经过校正后，相对表达量分别为0.9709、1.5306、1.3419、0.7378、1.1465。患者2子宫内膜的SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3的数据经过校正后，相对表达量分别为0.2630、0.1914、0.4690、0.4729、0.3942。
通过与SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3截断值(0.5534；0.6443；0.6903；0.7111；0.6235)进行比较，患者1的相对表达量均高于截断值，说明患者的子宫内膜容受性较好。患者2的相对表达量均低于截断值，说明患者的子宫内膜容受性较差。
实施例2
如图2，试剂盒包括盒体(1)以及设置于所述盒体(1)内的第一抽屉式隔层(2)、第二抽屉式隔层(3)和第三抽屉式隔层(4)，
所述第一抽屉式隔层(1)内设有第一泡沫垫(801)，所述第二抽屉式隔层(3)内设有第二泡沫垫(802)，
所述第一泡沫垫(801)开设6个分别放有gDNA清除剂缓冲液(9)、gDNA清除剂(10)、cDNA逆转录缓冲液(11)、cDNA逆转录酶混合物(12)、逆转录引物混合物(13)和第一无酶水(14)的凹槽，所述第一泡沫垫(801)开设一个放置逆转录反应使用96孔板(15)的腔体，
所述第二泡沫垫(802)上开设7个放置探针(16)的凹槽、1个放置阳性标准品(17)的凹槽、放置实时荧光定量聚合酶链式反应液(19)的凹槽和放置第二无酶水(20)的凹槽，所述第二泡沫垫(802)开设放置定量聚合酶链式反应使用的96孔板(21)的腔体，
所述第三隔层内放置第一冰盒(22)和第二冰盒(23)，所述第一冰盒(22)用来放置96孔板，所述第二冰盒(23)用来放置离心管，
所述第二泡沫垫(802)上还开设7个放置质粒(18)的凹槽，7个放置所述质粒(18)的凹槽分别放置含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质粒；7个放置所述探针(16)的凹槽分别放置SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基因探针、ACTB基因探针和B2M基因探针。
作为本实施例进一步的方案，所述第一抽屉式隔层(2)、所述第二抽屉式隔层(3)和所述第三抽屉式隔层(4)从上至下依次层叠设置且其后端均设置第一磁性锁扣(5)，所述盒体(1)分别对应所述第一磁性锁扣(5)设置第二磁性锁扣(6)，所述第一磁性锁扣(5)和所述第二磁性锁扣(6)通过磁性连接；所述第一抽屉式隔层(2)、所述第二抽屉式隔层(3)和所述第三抽屉式隔层(4)前端均设置把手(7)；所述试剂盒还包括一份使用说明书。
前期检测同实施例1，在此基础上增加验证步骤，
内膜组织样本获取后，采用Qiagen RNeasy Plus Mini Kit、ThermoFisherDynabeads mRNA DIRECT Purification Kit或其他方式提取RNA，测定RNA浓度。
逆转录生成cDNA：
清除gDNA(基因组DNA)：将逆转录使用的96孔板置于第二冰盒上，取1ug RNA加入96孔板的其中一孔中，加入2ul gDNA清除剂缓冲液(genomic DNA Eraser Buffer)和1ulgDNA清除剂(genomic DNA Eraser)，用无酶水将每个孔中反应液的总体积补充到10ul。将96孔板放入聚合酶链式反应(PCR)仪中，42℃反应2min。反应后，将96孔板放入冰盒中冷却。
逆转录反应：将上述反应液中，加入1ul cDNA逆转录酶混合物，1ul逆转录引物混合物，4ul cDNA逆转录缓冲液和4ul无酶水。将96孔板放入聚合酶链式反应(PCR)仪中，37℃反应15min，85℃反应5sec。
cDNA分装与保存：将逆转录生成cDNA分装，暂时不需要检测的样本保存在-20℃或-80℃待用。
实时荧光定量聚合酶链式反应测定相关基因表达量：将获得的cDNA稀释10倍作为检测样品的上样模板。将阳性对照标准品稀释10倍作为阳性对照标准品的上样模板。将7瓶含有不同检测基因序列的单独质粒分别稀释100倍，1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍作为标准曲线的模板。
采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR)反应液和7瓶探针(检测SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M基因的表达)，分别配置反应混合液，检测子宫内膜容受性相关基因的表达量(包括SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3)，并通过内参基因(ACTB和B2M)对样本上样量进行校正；
将获得的子宫内膜容受性相关基因的表达量与预定值进行比较，从而判断样本的子宫内膜的容受性和对阳性对照标准品的检测结果进行进一步的验证。
所述7个对照标准品为1mg/μl含SLC2A1基因序列的质粒、1mg/μl含HK2基因序列的质粒、1mg/μl含PKM2基因序列的质粒、1mg/μl含HIF1A基因序列的质粒、1mg/μl含SLC16A3基因序列的质粒、1mg/μl含ACTB基因序列的质粒、1mg/μl含B2M基因序列的质粒。
本申请的验证步骤还可以是
实时荧光定量聚合酶链式反应测定相关基因表达量：将阳性对照标准品稀释10倍作为阳性对照标准品的上样模板。将7瓶含有不同检测基因序列的单独质粒分别稀释100倍，1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍作为标准曲线的模板。
采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR)反应液和7瓶探针(检测SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M基因的表达)，分别配置反应混合液，检测阳性对照标准品中各基因的含量(包括SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M)。
效果：通过质粒构建的标准曲线，计算阳性对照标准品中目标基因的浓度，判断阳性对照标准品的稳定性。
本发明的试剂盒，包括盒体和三层抽屉式的隔层，设置在所述盒体侧面开口的盒盖，在盒体、各隔层衔接处分别设有磁性锁扣，所述抽屉式隔层内部设有深色泡沫垫8和1份使用说明书，所述泡沫垫上设有7种质粒、阳性标准对照品，15瓶试剂、2个冰盒和8个96孔板。实时荧光定量聚合酶链式反应的检测试剂多为光敏感性试剂，采用深色泡沫垫(如黑色和棕色等)进行日常保存，能够减少日常保存中因为过度暴露于外界光线中而导致检测试剂的效价降低。
具体来说，所述泡沫垫包括位于抽屉式隔层1的第一泡沫垫、位于抽屉式隔层2的第二泡沫垫，所述第一泡沫垫801上开设有6个分别放置gDNA清除剂缓冲液(genomic DNAEraser Buffer)、gDNA清除剂(genomic DNAEraser)、cDNA逆转录缓冲液(ReverseTranscription Buffer)、cDNA逆转录酶混合物(Reverse Transcription Enzyme Mix)、逆转录引物混合物(Reverse Transcription Primer Mix)和无酶水(Nuclease-Free Water)的凹槽，以及一个放置1个放置96孔板的腔体。所述第二泡沫垫802上开设有17个分别放置实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR)反应液，1瓶阳性标准品(检测SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M基因的表达)、7瓶探针(检测SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M基因的表达)、7瓶含有不同检测基因序列的质粒(SLC2A1、HK2、PKM2、HIF1A、SLC16A3、ACTB、B2M)和无酶水(Nuclease-Free Water)的圆形的凹槽，以及1个一个放置6个放置96孔板的腔体(6个96孔板堆叠在一起)。第三隔层(最靠下底面的隔层)放置所述2个冰盒，第一个冰盒可放置1块96孔板，第二个带盖冰盒可放置数个1.5mL离心管。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，包括gDNA清除剂缓冲液(9)、gDNA清除剂(10)、cDNA逆转录缓冲液(11)、cDNA逆转录酶混合物(12)、逆转录引物混合物(13)、实时荧光定量聚合酶链式反应液(19)、探针(16)、阳性对照标准品(17)和无酶水。
2.根据权利要求1所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述gDNA清除剂缓冲液(9)为5×gDNA Eraser Buffer，所述gDNA清除剂(10)为gDNA Eraser；所述cDNA逆转录缓冲液(11)为Reverse Transcription Buffer；所述cDNA逆转录酶混合物(12)为RTEnzyme Mix I；所述逆转录引物混合物(13)为RT Primer Mix；所述实时荧光定量聚合酶链式反应液(19)为Universal Master Mix II。
3.根据权利要求1所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述探针(16)包括7种，所述探针(16)包括相关基因探针和内参基因探针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述阳性对照标准品(17)为含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒以及含有B2M基因的质粒的混合质粒，7种质粒的比例为0.5-1.5：0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:0.5-1.5:1:1；所述无酶水包括第一无酶水(14)和第二无酶水(20)。
4.根据权利要求1所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，还包括单独质粒(18)，所述单独质粒(18)包括7种，分别为含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒以及含有B2M基因的质粒。
5.根据权利要求3所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体(1)以及设置于所述盒体(1)内的第一抽屉式隔层(2)、第二抽屉式隔层(3)和第三抽屉式隔层(4)，
所述第一抽屉式隔层(1)内设有第一泡沫垫(801)，所述第二抽屉式隔层(3)内设有第二泡沫垫(802)，
所述第一泡沫垫(801)开设6个分别放有gDNA清除剂缓冲液(9)、gDNA清除剂(10)、cDNA逆转录缓冲液(11)、cDNA逆转录酶混合物(12)、逆转录引物混合物(13)和第一无酶水(14)的凹槽，所述第一泡沫垫(801)开设一个放置逆转录反应使用96孔板(15)的腔体，
所述第二泡沫垫(802)上开设7个放置探针(16)的凹槽、1个放置阳性标准品(17)的凹槽、放置实时荧光定量聚合酶链式反应液(19)的凹槽和放置第二无酶水(20)的凹槽，所述第二泡沫垫(802)开设放置定量聚合酶链式反应使用的96孔板(21)的腔体，
所述第三隔层内放置第一冰盒(22)和第二冰盒(23)，所述第一冰盒(22)用来放置96孔板，所述第二冰盒(23)用来放置离心管。
6.根据权利要求4所述一种评估子宫内膜容受性的试剂盒，其特征在于，所述第二泡沫垫(802)上还开设7个放置单独质粒(18)的凹槽，7个放置所述单独质粒(18)的凹槽分别放置含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质粒；7个放置所述探针(16)的凹槽分别放置SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针、SLC16A3基因探针、ACTB基因探针和B2M基因探针；所述第一抽屉式隔层(2)、所述第二抽屉式隔层(3)和所述第三抽屉式隔层(4)从上至下依次层叠设置且其后端均设置第一磁性锁扣(5)，所述盒体(1)分别对应所述第一磁性锁扣(5)设置第二磁性锁扣(6)，所述第一磁性锁扣(5)和所述第二磁性锁扣(6)通过磁性连接；所述第一抽屉式隔层(2)、所述第二抽屉式隔层(3)和所述第三抽屉式隔层(4)前端均设置把手(7)；所述试剂盒还包括一份使用说明书。
7.一种如权利要求1-6任一项所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，RNA提取：获取子宫内膜组织样本，之后提取所述子宫内膜组织样本的RNA；
步骤2，清除gDNA：在所述步骤1得到的RNA中加入gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂和无酶水混合后放入PCR仪中进行反应,之后冷却得到第一混合物；
步骤3,逆转录反应：在所述第一混合物中加入cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物和逆转录引物混合物混合后放入PCR仪中进行逆转录反应，得到cDNA；
步骤4，获取模板：将所述cDNA稀释得到检测样品的模板，将阳性标准品稀释得到阳性标准品的上样模板；
步骤5，实时荧光定量聚合酶链式反应：将所述步骤4中所述检测样品的模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；将所述步骤4中所述阳性标准品的上样模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；将检测各基因的实验结果与ACTB和B2M进行校正，得到容受性相关检测基因表达量；
步骤6，判断容受性：将所述步骤5得到的基因表达量与阳性对照标准品的上样模板值进行比较，得到待测样品相较于阳性对照标准品的变化比例，从而判断子宫内膜的容受性。
8.根据权利要求7所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤1中，提取所述子宫内膜组织样本的RNA的方法为Qiagen RNeasy Plus Mini Kit或者ThermoFisher Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit；所述步骤2中，PCR仪设置为42℃反应2min；所述步骤3中，PCR仪设置为37℃反应15min，85℃反应5sec；所述步骤4中，稀释倍数为10倍；所述步骤5中所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针和SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述步骤5中基因表达量包括相关基因表达量和内参基因表达量；所述步骤6中通过相关基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性；所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法还包括通过内参基因表达量对样本上样量进行校正的步骤。
9.根据权利要求7所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括验证步骤，所述验证步骤包括，
步骤a，RNA提取：获取子宫内膜组织样本，之后提取所述子宫内膜组织样本的RNA；
步骤b，清除gDNA：在所述步骤a得到的RNA中加入gDNA清除剂缓冲液、gDNA清除剂和无酶水混合后放入PCR仪中进行反应,之后冷却得到第一混合物；
步骤c,逆转录反应：在所述第一混合物中加入cDNA逆转录缓冲液、cDNA逆转录酶混合物和逆转录引物混合物混合后放入PCR仪中进行逆转录反应，得到cDNA；
步骤d，获取模板：将所述cDNA稀释得到检测样品的模板，将含有检测基因的每种单独质粒分别稀释不同倍数作为标曲模板检测荧光量制作标准曲线；
步骤e，实时荧光定量聚合酶链式反应：将所述步骤d中所述检测样品的模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；将所述步骤d中所述标曲模板、实时荧光定量聚合酶链式反应反应液和探针混合后放入实时荧光定量PCR仪器中进行实时荧光定量聚合酶链式反应；根据实验结果得到检测基因表达量；
步骤f，判断容受性：将所述步骤e得到的基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性。
10.根据权利要求9所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤a中，提取所述子宫内膜组织样本的RNA的方法为Qiagen RNeasy Plus Mini Kit或者ThermoFisher Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit；所述步骤b中，PCR仪设置为42℃反应2min；所述步骤c中，PCR仪设置为37℃反应15min，85℃反应5sec；所述步骤d中，稀释倍数为10；
所述步骤e中所述探针包括相关基因探针和内参基因探针，所述相关基因探针包括SLC2A1基因探针、HK2基因探针、PKM2基因探针、HIF1A基因探针和SLC16A3基因探针，所述内参基因探针包括ACTB基因探针和B2M基因探针；所述含有检测基因的质粒包括含有SLC2A1基因的质粒、含有HK2基因的质粒、含有PKM2基因的质粒、含有HIF1A基因的质粒、含有SLC16A3基因的质粒、含有ACTB基因的质粒和含有B2M基因的质粒；
所述步骤d中将含有检测基因的每种质粒分别稀释100倍，1000倍，10000倍，100000倍，1000000倍作为标曲模板检测荧光量制作标准曲线；所述步骤e中基因表达量包括相关基因表达量和内参基因表达量；所述步骤f中通过相关基因表达量与预定值进行比较，从而判断子宫内膜的容受性；所述评估子宫内膜容受性的试剂盒的使用方法还包括通过内参基因表达量对样本上样量进行校正的步骤。
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- 2020-05-29 CN CN202010472264.2A patent/CN111575368A/zh active Pending
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