CN115976200B

CN115976200B - 一种评估子宫内膜容受性相关复发流产风险的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115976200B
Application number: CN202310273639.6A
Authority: CN
Inventors: 李蓉; 严杰; 尹婧雯; 秦训思
Original assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Priority date: 2023-03-21
Filing date: 2023-03-21
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2043-03-21
Also published as: CN115976200A

Abstract

本发明提供了一种用于检测子宫内膜容受性相关复发流产风险的生物标志物的筛选方法、生物标志物的组合，以及检测试剂盒。本发明首次利用分离子宫内膜淋巴细胞检测内膜容受性相关标志物，通过开展大样本子宫病理异常基因数据分析，结合检测经典子宫内膜容受性相关复发流产风险相关基因，评估子宫内膜容受性相关复发流产风险，可显著降低子宫内膜容受性相关复发流产风险判断错误率。

Description

一种评估子宫内膜容受性相关复发流产风险的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物标志物的筛选方法，更为具体的，本发明涉及一种子宫内膜容受性相关复发流产风险的生物标志物的筛选方法、所述生物标志物的组合及其应用。

背景技术

胚胎着床是一个复杂的过程，受精卵在母体子宫内定位、黏附、着床，最终发育成一个成熟的胎儿，成功的临床妊娠除需要优质的胚胎之外还需要良好的子宫内膜容受性相关复发流产风险(endometrial receptivity，ER)以及子宫内膜与胚胎的同步发育。子宫内膜容受性相关复发流产风险是指子宫内膜对胚胎的接受能力，是获得临床妊娠的基础条件。只有在短暂的特定时期内子宫内膜才允许胚胎着床，在此期间胚胎滋养层细胞附着于子宫内膜上皮细胞，随后侵入子宫内膜基质和脉管系统，这一时期称为“着床窗口期”，就成年女性而言，相当于月经周期第20-24日或排卵后6-8日。

大多数女性在雌激素和孕激素的顺序作用驱动下在黄体中期获得正常的子宫内膜容受性相关复发流产风险，然而不同程度或不同类型的内膜容受性异常会导致一系列生殖问题，从完全性植入失败（不孕）到严重植入缺陷（流产）和轻度异常植入（例如子痫前期等），多种妊娠相关不良事件均与内膜容受性异常具有一定相关性。目前已知干扰子宫内膜容受性相关复发流产风险的因素包括内分泌异常、炎症、薄型子宫内膜、内膜息肉、子宫肌瘤及免疫功能紊乱等，但其具体调控机制尚未完全阐明。

随着辅助生殖技术飞速发展，通过形态学和遗传学分析等多种方法筛选优质胚胎，移植后着床率可从25%提高到50%，但目前其成功率仍维持在较低水平，其活产率仅为30%-35%，其主要原因是胚胎着床失败或异常，但难以进一步得到改善，这与子宫内膜容受性相关复发流产风险调控机制不清有关。关于子宫内膜容受性相关复发流产风险调控因素及其机制的探究对于帮助建立临床妊娠，避免内膜容受性异常相关妊娠不良事件发生以及在辅助生殖治疗中提高临床妊娠率与活产率寻求新的有效的治疗手段具有重要意义。然而，目前内膜容受性的调控机制仍在探索阶段，对于内膜容受性的评估手段和方法也刚刚起步。

近年来，不同研究基于不同的研究对象，例如子宫内膜组织、宫腔液、宫腔灌洗液、阴道脱落细胞、阴道分泌物、子宫内膜的活检产物、血清、血浆、或其组合，在子宫内膜容受性相关复发流产风险评估标志物的探索上有了初步成果。检测手段以RT-qPCR，RT-qPCR芯片，二代测序，表达谱芯片，甲基化芯片，三代测序、或其组合，检测子宫内膜容受性相关复发流产风险标志基因为主。

目前针对内膜容受性评估的基因检测试剂盒具有如下弊端：① 缺乏子宫病理异常基因数据分析，数据分析来源多基于正常女性不同时期内膜的表达谱，未充分开展子宫内膜容受性相关复发流产风险受损模型基因检测分析；② 试剂盒检测分析性和准确性较低，仅依靠少数个体样本获得数据进行分析比较，由于个体差异的普遍存在，该类基因检测试剂盒缺乏准确性；③ 尚未纳入免疫相关标识物，对于子宫内膜容受性相关复发流产风险评估尚缺乏全面性与准确性；④ 检测分析深度不够，仅能初步判断内膜是否处于容受期或内膜容受性是否存在异常，尚不能检测容受性异常的类型，且不能预测子宫内膜容受性相关复发流产风险异常所对应妊娠结局。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的弊端，本发明提供一组子宫内膜容受性相关复发流产风险的生物标志物，其中，所述生物标志物包括由FCGR3A/CD16、RNASET2、CCL、KLF5、RXFP1、CXCL8、GLTSCR2、IER2、TYMP组成的组合。

本发明的第二方面，提供一种用于检测子宫内膜容受性相关复发流产风险的试剂盒，其中，所述试剂盒包括用于检测上述生物标志物表达量的试剂。

在一种实施方式中，所述试剂盒为针对的检测样品来自受试者的子宫内膜。

本发明的第三个方面，提供一种生物标志物在制备用于检测子宫内膜容受性相关复发流产风险的试剂盒中的应用，其中，所述试剂盒包含检测上述生物标志物水平的试剂。

在一种实施方式中，所述试剂盒包含检测上述的生物标志物水平的试剂。

相对于现有技术，本发明具有如下显著的进步：

1. 本发明利用临床中复发流产、反复移植失败、子宫内膜腺肌症等子宫内膜容受性相关复发流产风险受损模型基因检测结果，结合已经过多个数据库验证子宫内膜容受性相关复发流产风险评估基因，提供一种更为准确和可靠的评估内膜容受性的方法；

2. 本发明在临床研究的基础上，所筛选目的基因获得大量临床数据的验证和支持，在子宫内膜容受性相关复发流产风险评估上具有更高效力；

3. 本发明更为全面的纳入免疫相关标识基因，对免疫源性子宫内膜容受性相关复发流产风险受损患者的识别具有更高的敏感度；

4. 本发明所筛选的检测基因，可提示内膜容受性异常类型及其所对应妊娠结局，对辅助生殖治疗方案的制定具有一定指导意义。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为子宫内膜容受性相关复发流产风险评估ROC曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

实施例1样本采集以及子宫内膜容受性相关复发流产风险相关基因的筛选

选择50名不孕患者（来自北京大学第三医院生殖医学中心，已签署知情同意书），根据临床疾病采纳标准，以是否具有复发流产史为区分标准，分别纳入复发流产组（25例）及非复发流产组（即对照组，25例），对两组患者黄体中期的子宫内膜进行子宫内搔刮取样，将取出的内膜组织放入已装有生理盐水的皿中。

将取出的内膜组织样本制备为单个核细胞悬液：利用单核细胞在37℃和

存在时具有的贴壁粘附特性，通过装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶吸附柱过滤法将其从细胞悬液中除去单核细胞，分离获得样本中淋巴细胞。

分别对两组样本中获得的淋巴细胞进行基因表达量的测定及分析，具体步骤如下：

1.RNA提取与检测：对两组淋巴细胞样本进行总RNA (total RNA)提取，并对提取后的total RNA进行RNA完整性及纯度分析，包括琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA 完整性及是否存在DNA污染。其中，采用Nano Photometer spectrophometer检测RNA纯度；采用Quit2.0 Fluorometer对RNA浓度进行精确定量；采用Agilent 2100bioanalyzer 精确检测RNA完整性。

2.文库构建与质检：建库起始RNA为total RNA，总量≥1μg。建库中使用的建库试剂盒为Illumina的 UltraTM RNA Library Prep Kit。通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，随后在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模板，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA 第一条链，随后用RNase降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以 dNTPs为原料合成 cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复，经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200bp左右的 cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。文库构建完成后，先使用Qubit2 .0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测， insert size符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。

3.上机测序：库检合格后，进行PCR扩增体系和程序，检测扩增后的特异基因RNA的含量，得到特异基因RNA的含量数据，通过对比复发流产组（25例）与非复发流产组（25例）基因表达文库的数据，获得如表1所示的差异表达标志物，即为复发性流产子宫内膜容受性相关复发流产风险相关基因。

表1.复发性流产子宫内膜容受性相关复发流产风险基因及其检测引物

注：复发性流产组/非复发性流产组基因表达差异倍数为利用Q-PCR技术检测各样本基因表达水平两组比较获得基因表达差异倍数，该差异倍数数值越高，表示复发性流产组基因表达水平越高，数值越低则非复发性流产组基因表达水平越高。加粗的基因为优选基因，以基因表达差异>3倍为筛选条件。

实施例2 子宫内膜特异性基因表达预测复发性流产模型的构建及验证

以表1中的优选基因作为变量，通过 Logistic 回归分析构建临床预测模型“子宫内膜特异性基因表达预测复发性流产模型”，具体方法如下：统计学分析：应用 SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料呈正态分布时以均数 ± 标准差（x±s）描述，采用独立样本t 检验；非正态分布时以中位数（四分位数）〔M（QL，QU）〕描述，采用 Mann-Whitney U 检验。采用 Kaplan-Meier 生存分析比较终点事件的发生率；采用单因素及多因素 Logistic 回归分析来评估复发性流产的独立预测因子，并构建临床预测模型。预测模型评分系统的分值根据Logistic 回归模型系数计算得出。绘制受试者工作特征曲线（receiver operatingcharacteristic curve，ROC曲线），计算 ROC 曲线下面积（area under ROC curve，AUC），评估预测模型的准确性。双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

基于 Logistic 回归分析构建的9种标志物（FCGR3A/CD16、RNASET2、CCL、KLF5、RXFP1、CXCL8、GLTSCR2、IER2、TYMP）的组合的ROC曲线，产生的最大曲线下面积（AUC）为0.804，〔95%可信区间（95%CI）为0,621~0.987，P＜0.001〕，临床预测模型的预测价值如图1所示。ROC 曲线分析显示，提示该模型具有良好的预测价值；敏感度为 81.33%，特异度为83.54%。

该预测模型的风险指数计算公式如下：

风险指数=0.2141×(FCGR3A/CD16)的CT值 + 0 .0911×(RNASET2) 的CT值+0.2229×(CCL) 的CT值 +0.0803×(KLF5) 的CT值 + 0.0849×(RXFP1) 的CT值 + 0.0704×(CXCL8) 的CT值 +0.0847×(GLTSCR2) 的CT值 + 0.0776×(IER2) 的CT值+ 0 .0840×(TYMP) 的CT值。风险指数＜20.668提示所检测样本个体具有较高复发性流产风险。

为了进一步验证该模型的准确性，随机选取另外30个不孕病人样品（来自北京大学第三医院生殖医学中心，已签署知情同意书），按照实施例1中的步骤，取患者黄体期子宫内膜样本进行检测，并与该患者实际临床确诊数据（已确诊是否为复发性流产）对比，结果显示该模型准确率可达到83%（表2）。

。

Claims

1.一种子宫内膜容受性相关复发流产风险生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括由FCGR3A/CD16、RNASET2、CCL、KLF5、RXFP1、CXCL8、GLTSCR2、IER2、TYMP组成的组合。

2.一种用于检测子宫内膜容受性相关复发流产风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测权利要求1所述的生物标志物表达量的试剂。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为针对的检测样品来自受试者的子宫内膜。

4.一种生物标志物在制备用于检测子宫内膜容受性相关复发流产风险的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含检测如权利要求1所述的生物标志物水平的试剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含检测如权利要求1所述的生物标志物水平的试剂。