JP2022530135A - 子宮内膜着床を決定する定法及びその応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、子宮内膜着床を決定する方法及びその適用を提供する。具体的には、本発明は、子宮内膜着床を決定するための方法及び子宮内膜着床状態を決定するためのマーカーを提供する。本発明のマーカーは、子宮内膜着床の決定中のエラー率を大幅に減少させることができる。
Description
本発明は、生物医学の分野に関するものであり、特に、子宮内膜着床を決定する方法及びその適用に関する。
ヒトの生殖過程では、受精卵が母親の子宮に位置し、接着し、着床し、最終的に成熟した胎児になるが、着床過程は妊娠の成功に大きな影響を与え、臨床妊娠の成功には、良好な子宮内膜着床（ＥＲ）と、高品質の胚に加えて子宮内膜と胚の同時発生が必要である。ＥＲとは、子宮内膜が胚を受け取る能力を指す。胚の着床は、子宮内膜により、短期間の特定期間に限り認められ、その期間を「着床ウィンドウ窓期間」と呼ぶ。これは、成熟雌の場合、月経周期の２０～２４日目、又は排卵後６～８日目に相当する。
体外受精胚移植（ＩＶＦ－ＥＴ）の分野では、移植失敗を繰り返す女性、又は他の二次性不妊症を患う女性は、移植ウィンドウ期間の時間節が不正確である。月経周期又は排卵日に従って着床ウィンドウ期間を計算すると、移植失敗のリスクが非常に高くなる。ＥＲの特異的機序は不明であるが、不十分なＥＲがＩＶＦ－ＥＴにおける胚移植の失敗を引き起こす重要な理由の一つであることは明らかである。
したがって、子宮内膜着床を評価するための安定した、非侵襲的で正確なマーカー及び方法を見いだすことが急務であり、それによって医療従事者がＥＲ状態を明確に判断し、患者が移植ウィンドウ期間を正確に見つけるのを助けることができ、ＩＶＦ－ＥＴの成功率を促進する上で非常に重要である。
発明の内容
本発明の目的は、子宮内膜着床を評価するための安定した、非侵襲的で正確なマーカー及び方法を提供することであり、それにより、医療従事者がＥＲ状態を明確に決定し、患者が埋め込みウィンドウ期間を正確に見つけるのを助けるのを助け、ＩＶＦ－ＥＴの成功率を促進するのに非常に重要である。
本発明の目的は、子宮内膜着床を評価するための安定した、非侵襲的で正確なマーカー及び方法を提供することであり、それにより、医療従事者がＥＲ状態を明確に決定し、患者が埋め込みウィンドウ期間を正確に見つけるのを助けるのを助け、ＩＶＦ－ＥＴの成功率を促進するのに非常に重要である。
本発明の第１の態様は、子宮内膜着床を決定する方法を提供することであり、以下のステップを含む：
（ａ）試料を提供するステップ；
（ｂ）試料中の子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルを所定の値と比較し、それによって子宮内膜着床を決定するステップ。
（ａ）試料を提供するステップ；
（ｂ）試料中の子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルを所定の値と比較し、それによって子宮内膜着床を決定するステップ。
別の好ましい実施形態において、試料は、子宮内膜組織、子宮液、子宮洗浄液、膣剥脱細胞、膣分泌物、子宮内膜の生検産物、血清、血漿、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）で得られた子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルは、所定の値よりも高く、子宮内膜着床が存在することを示す。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルは、子宮内膜着床関連遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを含む。
別の好ましい実施形態において、試料は、ＬＨ＋ｎ、ＬＨ＋ｎ＋２、ＬＨ＋ｎ＋４の期間から誘導され、ここで、ｎは３～７であり、好ましくはｎは４～６である。
別の好ましい実施形態において、試料は、次の期間から誘導される：排卵後のｎ日目、ここで、ｎは３～７であり、好ましくはｎは４～６である。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される少なくとも４０個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される少なくとも１４７個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される少なくとも２５９個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、さらに５～２００個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ｂから選択される１つ以上の遺伝子をさらに含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、さらに、遺伝子の数が合計１００００に達するように、追加の遺伝子を含む。
本発明の第２の態様において、一組のバイオマーカーを提供し、この組は、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む。
別の好ましい実施形態において、一組のバイオマーカーは、表Ａから選択される少なくとも４０個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、一組のバイオマーカーは、表Ａから選択される少なくとも１４７子の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、一組のバイオマーカーは、表Ａから選択される少なくとも２５９個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、一組のバイオマーカーは、さらに５～２００の遺伝子を含む。
別の好ましい態様において、一組のバイオマーカーは、遺伝子の数が合計１００００に達するように、さらなる遺伝子をさらに含む。
別の好ましい実施形態において、一組のバイオマーカーは、子宮内膜着床を決定するために使用されるか、又はキットもしくは試薬の製造のために使用され、ここで、該キット又は試薬は、試験対象物の子宮内膜着床状態を評価又は診断する（早期診断及び／又は補助診断を含む）ために使用される。
別の好ましい実施形態において、バイオマーカー又は一組のバイオマーカーは、子宮内膜組織、子宮液、子宮洗浄液、膣剥離細胞、膣分泌物、子宮内膜の生検産物、血清、又は血漿試料から得られる。
別の好ましい実施形態において、所定の値と比較して、表Ａから選択される１つ以上のバイオマーカーは増加し、試験対象物の子宮内膜着床を示す。
別の好ましい実施形態において、各バイオマーカーは、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲチップ、次世代シークエンシング、発現プロファイルチップ、メチル化チップ、第３世代配列決定、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される方法によって同定される。
別の好ましい実施形態において、セットは、試験対象物の子宮内膜着床状態を評価するために使用される。
本発明の第３の態様は、子宮内膜着床状態を決定するための試薬の組み合わせを提供し、ここで、試薬の組み合わせは、本発明の第２の態様のセットにおける各バイオマーカーを検出するための試薬を含む。
別の好ましい実施形態において、試薬は、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲチップ、次世代配シークエンシング、発現プロファイルチップ、メチル化チップ、第３世代シークエンシング、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を使用して、本発明の第２の態様のセットにおける各バイオマーカーを検出するための物質を含む。
本発明の第４の態様は、キットを提供し、キットは、本発明の第２の態様のセット及び／又は本発明の第３の態様の試薬組み合わせを含む。
本発明の第５の態様は、キットの製造のための一組のバイオマーカーの使用を提供し、キットは、試験対象物の子宮内膜着床状態を評価するために使用され、一組のバイオマーカーは、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む。
別の好ましい実施形態において、評価及び診断は、以下のステップを含む：
（１）検出対象物から得られた試料を提供し、試料中のセット中の各バイオマーカーのレベルを検出するステップ；及び
（２）（１）で検出したレベルと所定の値を比較するステップ。
（１）検出対象物から得られた試料を提供し、試料中のセット中の各バイオマーカーのレベルを検出するステップ；及び
（２）（１）で検出したレベルと所定の値を比較するステップ。
別の好ましい実施形態において、試料は、子宮内膜組織、子宮液、子宮洗浄液、膣剥脱細胞、膣分泌物、子宮内膜の生検産物、血清、血漿、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、所定の値と比較して、表Ａから選択される１つ以上のバイオマーカーは増加し、試験中の対象物の子宮内膜着床を示す。
別の好ましい実施形態において、本方法は、ステップ（１）の前に試料を処理するステップをさらに含む。
本発明の第６の態様は、検出されるべき対象の子宮内膜着床を決定する方法を提供し、以下のステップを含む：
（１）検出される対象に由来する試料を提供し、試料中のセット中の各バイオマーカーのレベルを検出するステップであって、該セットが、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含むステップ；
（２）（１）で検出したレベルと所定の値を比較するステップ。
（１）検出される対象に由来する試料を提供し、試料中のセット中の各バイオマーカーのレベルを検出するステップであって、該セットが、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含むステップ；
（２）（１）で検出したレベルと所定の値を比較するステップ。
本発明の第７の態様は、検出される対象物の子宮内膜着床状態を評価するためのシステムを提供し、以下を含む：
（ａ）子宮内膜着床状態の特徴の入力モジュールであって、入力モジュールは、被検物の子宮内膜着床状態の特徴を入力するために使用され、ここで、子宮内膜着床状態の特徴は、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む、入力モジュール；
（ｂ）子宮内膜着床状態判定のための処理モジュールであって、処理モジュールは、予め設定された基準により子宮内膜着床状態の特徴を入力し、それにより子宮内膜着床状態のスコアを得るための評価プロセスを実行し；さらに、モジュールは、子宮内膜着床状態のスコアを予め定められた値と比較し、従って、補助診断結果を得、ここで、子宮内膜着床状態のスコアが予め定められた値よりも高い場合、対象が子宮内膜着床を有することが示唆される、処理モジュール；
（ｃ）補助診断結果の出力モジュールであって、前記出力モジュールは、補助診断結果を出力するために使用される、出力モジュール。
（ａ）子宮内膜着床状態の特徴の入力モジュールであって、入力モジュールは、被検物の子宮内膜着床状態の特徴を入力するために使用され、ここで、子宮内膜着床状態の特徴は、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む、入力モジュール；
（ｂ）子宮内膜着床状態判定のための処理モジュールであって、処理モジュールは、予め設定された基準により子宮内膜着床状態の特徴を入力し、それにより子宮内膜着床状態のスコアを得るための評価プロセスを実行し；さらに、モジュールは、子宮内膜着床状態のスコアを予め定められた値と比較し、従って、補助診断結果を得、ここで、子宮内膜着床状態のスコアが予め定められた値よりも高い場合、対象が子宮内膜着床を有することが示唆される、処理モジュール；
（ｃ）補助診断結果の出力モジュールであって、前記出力モジュールは、補助診断結果を出力するために使用される、出力モジュール。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される少なくとも４０個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される少なくとも１４７個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、表Ａから選択される少なくとも２５９個の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、さらに５～２００子の遺伝子を含む。別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床関連遺伝子は、さらに、遺伝子の数が合計１００００に達するように、追加の遺伝子を含む。
別の好ましい実施形態において、対象はヒトである。
別の好ましい実施形態において、スコアは、（ａ）単一の特徴のスコア；及び（ｂ）複数の特徴のスコアの合計を含む。
別の好ましい実施形態において、特徴入力モジュールは、試料コレクター、試料保存チューブ、細胞溶解及び核酸試料抽出キット、ＲＮＡ核酸逆転写増幅キット、ＮＧＳライブラリー構築キット、ライブラリー定量キット、配列決定キット、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、子宮内膜着床状態判定のための処理モジュールは、プロセッサと、メモリとを含み、メモリは、子宮内膜着床状態の特徴に基づいてＥＲステータスのスコアリングデータを格納する。
別の好ましい実施形態において、出力モジュールは報告システムを含む。
本発明の上述の技術的特徴の各々又は以下に具体的に説明する各技術的特徴（例えば、実施例）は、互いに組み合わせてもよく、それによって、スペースの制約のために、本明細書では１つずつ説明しないであろう新規の又は好ましい技術的解決策を構成し得ることが理解されるべきである。
実施形態の詳細な説明
本発明者らは、広範かつ詳細な研究を通して、子宮内膜着床及びその組み合わせを決定するためのバイオマーカーを予期せず発見した。具体的には、本発明は、一組のバイオマーカーを開示しており、この組（セット）は、試験対象物の子宮内膜着床状態を評価又は診断するために使用されてもよく（早期診断及び／又は補助診断を含む）、これは、エラー率を大幅に低下させる可能性がある。したがって、本発明は重要な応用価値を有する。以上に基づいて、本発明者らは本発明を完成した。
本発明者らは、広範かつ詳細な研究を通して、子宮内膜着床及びその組み合わせを決定するためのバイオマーカーを予期せず発見した。具体的には、本発明は、一組のバイオマーカーを開示しており、この組（セット）は、試験対象物の子宮内膜着床状態を評価又は診断するために使用されてもよく（早期診断及び／又は補助診断を含む）、これは、エラー率を大幅に低下させる可能性がある。したがって、本発明は重要な応用価値を有する。以上に基づいて、本発明者らは本発明を完成した。
用語
本明細書で使用される用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。しかしながら、本発明をより良く理解するために、いくつかの定義及び関連用語を以下に説明する。
本明細書で使用される用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。しかしながら、本発明をより良く理解するために、いくつかの定義及び関連用語を以下に説明する。
本発明によれば、用語「ＥＲ」は、子宮内膜が胚を受け入れる能力を指し、胚の移植は、特定の短期間にのみ子宮内膜によって許容される。
本発明によれば、用語「バイオマーカーの組（セット）」は、１つのバイオマーカー、又は２つ以上のバイオマーカーの組み合わせを指す。
本発明によれば、バイオマーカーのレベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲチップ、次世代シークエンシング、発現プロファイルチップ、メチル化チップ、第３世代シークエンシング、又は他の方法によって同定される。
本発明によれば、用語「バイオマーカー」は、「生物学的マーカー」とも呼ばれ、個体の生物学的状態の測定可能な指標を指す。そのようなバイオマーカーは、それが個体の特定の生物学的状態（例えば、疾患）に関連する限り、個体中の任意の物質であり得、例えば、核酸マーカー（例えば、ＤＮＡ）、タンパク質マーカー、サイトカインマーカー、ケモカインマーカー、炭水化物マーカー、抗原マーカー、抗体マーカー、種マーカー（種／属標識）、機能マーカー（ＫＯ／ＯＧ標識）などである。測定及び評価の後、バイオマーカーは、通常、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療介入に対する薬理学的応答を調べるために使用され、多くの科学分野において有用である。
本発明によれば、用語「個体」とは、動物、具体的には哺乳類、例えば霊長類、好ましくはヒトを指す。
本発明によれば、用語「血漿」とは、全血の液体成分を指す。使用される分離方法に依存して、血漿は、細胞成分が全く存在せず、種々の量の血小板及び／又は少量の他の細胞成分を含有し得る。
本発明によれば、「１つの（ａ／ａｎ）」、「１つの（ｏｎｅ）」及び「このような」のような用語は、単数個の個体／ユニットを指すだけでなく、特定の実施形態を特定することができる通常のカテゴリも含む。
本明細書に提供される用語は、本発明をより良く理解するために当業者に説明されるに過ぎないが、本発明を限定するものと解釈されないことを示す必要がある。
検出方法
本発明では、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲチップ、次世代配列決定、発現プロファイルチップ、メチル化チップ、第３世代配列決定、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって、本発明の組における各バイオマーカーを検出するための物質。
本発明では、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲチップ、次世代配列決定、発現プロファイルチップ、メチル化チップ、第３世代配列決定、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって、本発明の組における各バイオマーカーを検出するための物質。
キット
本発明では、キットは、本発明の第２の態様のセット及び／又は本発明の第３の態様の試薬組み合わせを含む。
本発明では、キットは、本発明の第２の態様のセット及び／又は本発明の第３の態様の試薬組み合わせを含む。
所定値
本発明では、所定の値は、ＥＲ期間（すなわち、子宮内膜が人工知能又はデシジョンツリーＣ４．５アルゴリズム、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、ニューラルネットワークバックプロパゲーション（ＢＰ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、及び種々のクラスタ分析アルゴリズム（簡単なクラスタリング、階層的クラスタリング、Ｋ－平均クラスタリング、自己組織化特徴マップ、ファジークラスタリング、ベイズ分類器、ｋ－近傍、ニューラルネットワーク法、デシジョンツリー法、投票分類法、主成分分析（ＰＣＡ）などをスコアリングすることによって得られるスコアリング値を指す。
本発明では、所定の値は、ＥＲ期間（すなわち、子宮内膜が人工知能又はデシジョンツリーＣ４．５アルゴリズム、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、ニューラルネットワークバックプロパゲーション（ＢＰ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、及び種々のクラスタ分析アルゴリズム（簡単なクラスタリング、階層的クラスタリング、Ｋ－平均クラスタリング、自己組織化特徴マップ、ファジークラスタリング、ベイズ分類器、ｋ－近傍、ニューラルネットワーク法、デシジョンツリー法、投票分類法、主成分分析（ＰＣＡ）などをスコアリングすることによって得られるスコアリング値を指す。
評価方法
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、式Ｓ＝Ｗ１Ｓ１＋Ｗ２Ｓ２＋ＷｉＳｉ＋・・・・・・ＷｎＳｎによって加重包括スコアを計算することができる。Ｗ１、Ｗ２・・・・・・Ｗｎは、重みである。Ｓ１、Ｓ２・・・・・・Ｓｎは、各マーカーのスコアである。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、式Ｓ＝Ｗ１Ｓ１＋Ｗ２Ｓ２＋ＷｉＳｉ＋・・・・・・ＷｎＳｎによって加重包括スコアを計算することができる。Ｗ１、Ｗ２・・・・・・Ｗｎは、重みである。Ｓ１、Ｓ２・・・・・・Ｓｎは、各マーカーのスコアである。
好ましくは、重みは、表９の分析値に基づいてもよい。例えば、子宮内膜着床の評価に関しては、任意の重量（例えば、Ｗ１）が表９の対応するマーカーの分析値であり得る。
好ましい実施形態において、
検出される集団のＳ対象＝Ｗ１Ｓ１＋Ｗ２Ｓ２＋ＷｉＳ３＋・・・・・・ＷｎＳｎ
検出される集団のＳ対象＝Ｗ１Ｓ１＋Ｗ２Ｓ２＋ＷｉＳ３＋・・・・・・ＷｎＳｎ
検出される集団の対象が所定値よりも大きい場合、それは、目的物がＥＲ状態を有することを示す。
本発明の実験結果は、本発明のマーカーがエラー率を大幅に減少させ、ＥＲ状態－の決定又は診断の精度を著しく改善し得ることを示す。
子宮内膜着床を決定するための解析モデルの構築法
本発明において、子宮内膜着床を決定するための分析モデルの構築方法は、以下のステップを含む。
本発明において、子宮内膜着床を決定するための分析モデルの構築方法は、以下のステップを含む。
高感度ＲＮＡ逆転写及びｃＤＮＡからの増幅を行い、次にｃＤＮＡをＮＧＳのためのライブラリー構築に供した。配列決定の実行後、試料の発現プロファイル情報は、配列決定の実行出力データによって構築される。バイオインフォマティクスを用いた分析・分類により、ＥＲの状態を同定し、子宮内膜への胚移植のウィンドウ期間を正確に決定し，個別化された正確な決定を実現した。
好ましい実施形態において、本発明は、子宮内膜着床を決定するための分析モデルの構築方法を提供し、以下のステップを含む：
（１）月経周期の異なる健常女性から試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ逆転写を行い、ｃＤＮＡを増幅する；
（２）ハイスループットシークエンシングのためのｃＤＮＡライブラリーを構築する；
（３）強化学習法、非指導学習法、あるいは指導学習法により、複数の試料中の各種遺伝子の発現レベルを異なる標識で比較し、差次発現遺伝子を得ることにより、
解析モデルを構築する。
（１）月経周期の異なる健常女性から試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ逆転写を行い、ｃＤＮＡを増幅する；
（２）ハイスループットシークエンシングのためのｃＤＮＡライブラリーを構築する；
（３）強化学習法、非指導学習法、あるいは指導学習法により、複数の試料中の各種遺伝子の発現レベルを異なる標識で比較し、差次発現遺伝子を得ることにより、
解析モデルを構築する。
本発明は、高感度ＲＮＡ逆転写及びｃＤＮＡ増幅プロセスに依存し、ＲＮＡ－ｓｅｑ配列決定方法に基づいており、それにより、子宮内膜、子宮液、又は他の生殖内分泌学関連体液又は患者からの剥離の多数の発現プロファイル情報を得る。これらの試料は、異なるサンプリング期間、サンプリングマナー、及び発現プロファイル特徴に基づく、バイオインフォマティクス、統計及び機械学習方法による超高次元分類及びタイピングに供される。ＥＲの状態は、異なるタイプに応じて決定される。
教師付き学習のタスクは、モデルが任意の与えられた入力から予測結果をマッピングできるように、モデルから学習することであり、従って、高次元予測分析が達成される。
ステップ（３）における「学習」の「複数の試料」は、同一の試料起源であるが異なる個体からの試料を指し、例えば、着床期間における子宮内膜組織の１０２例、着床前期間における子宮内膜組織の２０５例、着床後期間における子宮内膜組織の３００例などである。
好ましくは、ステップ（１）における異なる月経周期は、３つの周期である。
好ましくは、３つの期間の中間期間は、ＬＨ＋７、又は排卵後５日目である。
本発明で使用される試験試料は、自然月経周期の女性対象の子宮内膜生検から得られ、黄体形成ホルモン（ＬＨ）ピークの発生後７日目（ＬＨ＋７）に実施され、又はホルモン補充療法（ＨＲＴ）サイクルの女性対象の子宮内膜生検から得られ、排卵後５日目（Ｐ＋５）に実施される。子宮内膜病変（子宮内膜癒着、子宮内膜ポリープ、気管支結核等を含む）、卵管水腫、近位卵管結紮術を受けていない対象、子宮粘膜下筋腫、子宮腔や腺筋腫に向かって膨隆する子宮筋腫を有する患者、子宮内膜症（第ＩＩＩ～ＩＶ相）を有する患者は、適用に適さない。
好ましくは、３つの期間は、さらに、それぞれ、中間期間の前後１～３日の期間、好ましくは２日の期間を含む。
好ましくは、中間期間は着床期間であり、中間期間の１～３日前は着床前期間であり、中間期間の１～３日後は着床後期間である。
本発明では、モデルで使用される「トレーニングデータ」又は「トレーニングセット」として知られる「トレーニングセット」のグループ分け基準は、過去の病歴又は一次不妊症のない自然サイクルにおける様々な健康な中国人女性、及び１９～２５ｋｇ／ｍ２内のボディマスインデックスを有する。多数の試料のグループ化及び試験、ならびに症例の臨床転帰の蓄積に加えて、本発明者は、「着床期間」における子宮内膜組織、子宮体液又は他の生殖内分泌学に関連する体液の発現プロファイル又は剥脱（この期間中に胚移植が行われ、胚が効果的に着床及び発達する可能性がある場合、臨床転帰を追跡することにより、期間を「着床期間」と定義する）をマスターする。一方、我々は、対応するＲＮＡ－ｓｅｑデータを得るために、「着床ウィンドウ期間」の前後２日のケースについてもサンプリングを行い、標識をそれぞれ「着床期間」及び「着床後期間」と定義した。
本発明では、異なる月経周期にある同一個体の試料をそれぞれ獲得し、配列を決定して、異なる期間の試料からの遺伝子発現プロファイルの特徴を比較する。このことは、差次的に発現される遺伝子がより良好であることを示し、したがって、偽陽性の発生を減少させることができる。
好ましくは、ステップ（１）の試料は、少なくとも２つの子宮底子宮内膜組織、子宮液、又は膣剥離のいずれか１つ又は組み合わせを含む。
本発明では、試料は、子宮内膜生検製品であってもよく、また、子宮洗浄液、膣剥離細胞及び膣分泌物でさえも、非侵襲的手段によって得られる患者の子宮液であってもよい。試料の起源は広範で、試料採取は簡便かつ迅速であり、雌のコンプライアンスの程度は、同じ個体からの試料の異なる起源を検証することにより、遺伝子発現プロファイル特徴の精度の改善と共に促進される。子宮洗浄液、膣剥離又は膣分泌物は、試料サイズが小さく、従来の検出方法では多数の試料が必要であるため、子宮内膜生検製品を選択する必要があるが、本発明は、微量の試料で試験要件を満たすことができるため、試料のタイプが拡大され、対象の疼痛及び不快感が軽減される。
好ましくは、子宮底の子宮内膜組織の試料体積は、５ｍｇ、好ましくは５～１０ｍｇ、例えば５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ又は１０ｍｇより大きい。
好ましくは、子宮液の試料体積は、１０μＬ、好ましくは１０～１５μＬ、例えば１０μＬ、１１μＬ、１２μＬ、１３μＬ、１４μＬ又は１５μＬより大きい。
好ましくは、膣剥離の試料体積は、５ｍｇ、好ましくは５～１０ｍｇ、例えば５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ又は１０ｍｇより大きい。
本発明では、試料の試料体積はより小さく、精度速度はより高く、試料の着床状態は、多数の試料なしで正確に予測することができる。
好ましくは、ステップ（２）のライブラリー中のｃＤＮＡは、５ｎｇ／μＬ以上の濃度を有する。
好ましくは、ステップ（２）における配列決定は、ＲＮＡ－Ｓｅｑ配列決定及び／又はｑＰＣＲ配列決定を含む。
本発明において、ＲＮＡ－Ｓｅｑ配列決定方法は、チップ配列決定よりも優れており、チップ配列決定の２～８倍の検出可能な差次的発現遺伝子を多数有する。低存在量遺伝子の検出精度に関しては、ＲＮＡ－ＳｅｑのｑＰＣＲ検証率はチップの５倍であり、差次発現倍数変化の精度に関しては、ＲＮＡ－ＳｅｑのｑＲＣＲ相関はチップのそれよりも１４％高い。本発明で使用されるＲＮＡ－Ｓｅｑ又はｑＰＣＲ配列決定方法は、当業者にとって一般的な技術的手段である。
好ましくは、ステップ（２）における配列決定は、４５ｎｔより大きい読み取り長さを有する。
好ましくは、ステップ（２）における配列決定は、２５０万以上の読み取りの数を有する。
本発明では、４５塩基以上の読み取り長及び２５０万以上の読み取り数を有する配列決定は、配列決定要件を満たすことである。
本発明では、配列決定の読み取り長さ及び読み取り数が具体的に選択され、これは、正確性を確保しつつ、実験期間及びコストを低減する。
好ましくは、本発明は、ステップ（３）の前のデータ前処理ステップをさらに含む。
好ましくは、データ前処理ステップは、遺伝子長及び配列決定深度によって正規化を行う。
好ましくは、正規化方法は、少なくとも２つのＲＰＫＭ、ＴＰＭ又はＦＰＫＭ、好ましくはＦＰＫＭのいずれか１つ又は組み合わせを含む。
本発明では、キロベースミリオンあたりの断片（ＦＰＫＭ）を、ＲＮＡ－Ｓｅｑデータの異なるラベルを取得した後の配列決定深度の影響を除外するために、遺伝子長及び配列決定深度のための正規化に使用する。キロベースミリオン（ＲＰＫＭ）及びトランス・パー・ミリオン（ＴＰＭ）あたりの読み取りは、同様の正規化方法であるが、ＦＰＫＭは、本発明において好ましくは使用される。
ＦＰＫＭは、より柔軟性があり、商業化が容易であるように、ペア末端配列決定ライブラリー又はシングルリード配列決定ライブラリーに適している。ＲＰＫＭは、シングルリードライブラリにのみ適している。ＴＰＭ値は、比較された特定の遺伝子の読み取りの比率を反映している可能性があり、そのため、その値は、試料間の比較に直接従うことができるが、それは、プロセスにおいてより面倒であり、操作が遅く、バッチ分析において低い効率を有する。
本発明の教師付き学習では、事前着床期間、着床ウィンドウ期間及び事後着床期間をラベル付けした訓練データを使用してモデルを構築し、訓練によって得られたモデルを使用して未知データの着床状態を予測することができる（新しい試料を参照する）。例えば、１つの試料からの子宮液発現プロファイルが新たに入力され、機械学習モデルが、試料の着床状態を決定するために使用される。
好ましくは、標識は、異なる着床状態下での子宮内膜組織、子宮液又は膣剥離の発現プロファイル特徴である。
本発明において、異なる起源からの試料の発現プロフィールは、異なる着床状態下での子宮内膜組織、子宮液又は膣剥離物の少なくとも２つのいずれか１つ又は組み合わせを含み、同一個体について得られ、したがって、結果を予測する信頼性を有意に改善する。
好ましくは、差次的に発現される遺伝子の分析方法は、各試料のＦＰＫＭ＞０を有する全ての遺伝子が見出され、そして、ｐ値＜０．０５、及び倍数変化Ｆ＞２又は倍数変化＜０．５を満たすように、着床前期間と着床期間、着床前期間と着床後期間との間の差次的に発現される遺伝子の交差部分がスクリーニングされる。
本発明では、試料スクリーニングは、常に異なる標識で高度又は低レベルに発現される遺伝子が分析モデルに及ぼす影響を排除し、したがって、次の分析モデルにおいて良好な適合効果を達成しつつ、適合過剰状態の排除を保証する。
好ましくは、ステップ（３）における教師付き学習方法は、Ｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓ、Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｒｅｅ、Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ、ＫＮＮ又はサポート・ベクトル・マシン（ＳＶＭ）、好ましくはＳＶＭのうちの少なくとも２つのいずれか１つ又は組み合わせを含む。
ＳＶＭは元のデータに多くの制約を持たず、事前情報を必要としない。ＲＮＡ－Ｓｅｑ配列決定によって得られる膨大な量のデータがあり、異なる遺伝子は異なる発現を示すが、ＳＶＭは超多次元（超高次元）分析を維持する可能性があり、その結果、モデルをより正確にすることができる。
好ましくは、前記ＳＶＭは、以下のスクリプトを有する。
library(e1071)
svm.model<-svm(data.class~.,data4,kernel='linear')
summary(svm.model)
table(data$class,predict(svm.model,data4,type="data.class"))
mydata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
mydata2=log2(mydata+1)
predict(svm.model,mydata2)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
## table(testdata$data.class,predict(svm.model,testdata,type="data.class"))
shdata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
shdata2=log2(shdata[,-length(shdata[1,])]+1)
shdata3=data.frame(shdata2,shdata$class)
predict(svm.model,shdata3)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
library(e1071)
svm.model<-svm(data.class~.,data4,kernel='linear')
summary(svm.model)
table(data$class,predict(svm.model,data4,type="data.class"))
mydata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
mydata2=log2(mydata+1)
predict(svm.model,mydata2)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
## table(testdata$data.class,predict(svm.model,testdata,type="data.class"))
shdata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
shdata2=log2(shdata[,-length(shdata[1,])]+1)
shdata3=data.frame(shdata2,shdata$class)
predict(svm.model,shdata3)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
好ましくは、子宮内膜着床を決定するための分析モデルの構築方法は、具体的には、以下のステップを含む：
（１）着床前、着床期間、及び着床後の期間に健常女性から検体を採取し、それぞれＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、及びｃＤＮＡ増幅を行う；
（２）ｃＤＮＡライブラリーを構築し、ライブラリーを濃縮及び精製し、次に、濃度を５ｎｇ／μＬ以上とする；読み取り長さが４５ｎｔより大きく、読み取り数が２５０万回以上である、ハイスループットシークエンシングが実施される；
（３）子宮内膜組織、子宮液、膣剥離の発現プロファイルの特徴を用いて、ステップ（２）で得られた異なる着床状態の下で標識として用い、標識データを教師付き学習法を用いたモデルトレーニングに用い、異なる標識を有する異なる遺伝子の発現を比較した。異なる標識のＲＮＡ－Ｓｅｑ配列データを取得した後、ＦＰＫＭ法を用いて遺伝子長と配列決定深度による正規化を行い、それにより異なる標識の複数試料における異なる遺伝子の発現を、モデル上の異なる標識で常に高度又は低レベルに発現される遺伝子の影響を除外して比較した；差次的に発現する遺伝子を得るために分析する；
（４）ＳＶＭ学習モデルを用い、着床前期間、着床期間、及び着床後期間をラベル付けした訓練データを用いて、未知試料の着床状態を予測するための解析モデルを構築し、複数の期間内にサンプリング時間を繰り返し調整して、決定の精度を向上させた後、着床試験を行う。
（１）着床前、着床期間、及び着床後の期間に健常女性から検体を採取し、それぞれＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、及びｃＤＮＡ増幅を行う；
（２）ｃＤＮＡライブラリーを構築し、ライブラリーを濃縮及び精製し、次に、濃度を５ｎｇ／μＬ以上とする；読み取り長さが４５ｎｔより大きく、読み取り数が２５０万回以上である、ハイスループットシークエンシングが実施される；
（３）子宮内膜組織、子宮液、膣剥離の発現プロファイルの特徴を用いて、ステップ（２）で得られた異なる着床状態の下で標識として用い、標識データを教師付き学習法を用いたモデルトレーニングに用い、異なる標識を有する異なる遺伝子の発現を比較した。異なる標識のＲＮＡ－Ｓｅｑ配列データを取得した後、ＦＰＫＭ法を用いて遺伝子長と配列決定深度による正規化を行い、それにより異なる標識の複数試料における異なる遺伝子の発現を、モデル上の異なる標識で常に高度又は低レベルに発現される遺伝子の影響を除外して比較した；差次的に発現する遺伝子を得るために分析する；
（４）ＳＶＭ学習モデルを用い、着床前期間、着床期間、及び着床後期間をラベル付けした訓練データを用いて、未知試料の着床状態を予測するための解析モデルを構築し、複数の期間内にサンプリング時間を繰り返し調整して、決定の精度を向上させた後、着床試験を行う。
本発明では、ＲＮＡｓｅｑを用いて配列決定ラン出力データを得、ＦＰＫＭを用いて発現レベルを正規化する。同じ個体の異なる時期の間の遺伝子発現量の差を比較し、有意差のある遺伝子を差次的に発現する遺伝子としてマークする。着床前期間、着床期間及び着床後期間において、同じ試料から最も顕著な発現差を有する遺伝子を同定する。その後、「差次的に発現される遺伝子」は、複数の個体の異なる期間によって最適化される。３期間の特徴ライブラリーを機械学習により構築した。発現レベルの正規化後、試験されるべき新しい試料は、機械による特徴判定に従って自動的に分類される。本発明のモデル構築方法は、膨大な数のトレーニングセットを利用し、ＳＶＭと一致する顕著な特異性を有する差次的に発現された遺伝子により機械を完全にトレーニングし、長期間にわたって臨床転帰を追跡することによりモデルに調整することによりモデル精度を改善する。
本発明では、異なる個体からの個体差着床期間を得るために、サンプリング時間を複数の期間内に繰り返し調整することができ、例えば、第１の検出がＬＨ＋５上にある場合、次の期間の試験は２日間延期され、ＬＨ＋７上に得られ、第１の検出がＬＨ＋９上にある場合、次の期間の試験は２日前に実施され、ＬＨ＋７上に得られる。
本発明は、以下の主な利点を有する：
（ａ）本発明のバイオマーカーは、ＥＲ状態を正確に決定するために使用することができ、エラー率を大幅に減少させ、従って、大きな応用価値を有する。
（ｂ）本発明は、高感度ＲＮＡ逆転写及びｃＤＮＡ増幅プロセスに依存し、患者から子宮内膜、子宮液又は他の生殖内分泌学関連体液又は剥離の多数の発現プロファイル情報を得るＲＮＡ－ｓｅｑ配列決定法に基づく。これらの試料は、異なるサンプリング期間、サンプリングマナー、及び発現プロファイル特徴に基づく、バイオインフォマティクス、統計及び機械学習方法による超高次元分類及びタイピングに供される。ＥＲの状態は、異なるタイプに応じて決定される。
（ｃ）本発明は、ＲＮＡ抽出、逆転写、ｃＤＮＡ精製及びライブラリー構築を統合的に最適化及び調整する遺伝子発現プロファイル特徴を用いて子宮内膜着床を決定するために使用されるモデルの構築方法を提供し、対応するデータの処理、分析及びモデル構築を行い、それによって子宮内膜着床を決定する精度を有意に改善する。
（ｄ）本発明の方法は、非侵襲的子宮体液生検によってもたらされる有害性が低く、迅速なプロセス及び短い期間によってもたらされる簡便性及び利便性によって特徴づけられる。
（ａ）本発明のバイオマーカーは、ＥＲ状態を正確に決定するために使用することができ、エラー率を大幅に減少させ、従って、大きな応用価値を有する。
（ｂ）本発明は、高感度ＲＮＡ逆転写及びｃＤＮＡ増幅プロセスに依存し、患者から子宮内膜、子宮液又は他の生殖内分泌学関連体液又は剥離の多数の発現プロファイル情報を得るＲＮＡ－ｓｅｑ配列決定法に基づく。これらの試料は、異なるサンプリング期間、サンプリングマナー、及び発現プロファイル特徴に基づく、バイオインフォマティクス、統計及び機械学習方法による超高次元分類及びタイピングに供される。ＥＲの状態は、異なるタイプに応じて決定される。
（ｃ）本発明は、ＲＮＡ抽出、逆転写、ｃＤＮＡ精製及びライブラリー構築を統合的に最適化及び調整する遺伝子発現プロファイル特徴を用いて子宮内膜着床を決定するために使用されるモデルの構築方法を提供し、対応するデータの処理、分析及びモデル構築を行い、それによって子宮内膜着床を決定する精度を有意に改善する。
（ｄ）本発明の方法は、非侵襲的子宮体液生検によってもたらされる有害性が低く、迅速なプロセス及び短い期間によってもたらされる簡便性及び利便性によって特徴づけられる。
本発明は、特定の実施形態と組み合わせてさらに説明される。これらの実施形態は、本発明を例示するためにのみ使用されるが、本発明の範囲を限定又は制限するためには使用されないことを理解されたい。以下の実施例の詳細な条件で規定されていないいずれもの実験方法は、通常、従来の条件、又は製造者が推奨する条件に従わなければならない。別に規定するもののほか、百分率及び部は、質量により算出する。
特に指定のない限り、本発明の実施例で使用される試薬及び材料は、市販されている製品である。
材料
Ｑｉａｇｅｎにより製造番号７４００４で作製されたＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット；
Ｙｉｋｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃによって製造された製造番号がＫＴ１１０７００７２４であるＭＡＬＢＡＣプラチナマイクロスケールＲＮＡ増幅キット；
Ｚｙｍｏによって製造された製造番号がＯｆＤ４０１４であるＤＮＡクリーン＆コンセントレータ－５；
Ｙｉｋｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって製造された製造番号がＫＴ１００８０１９２４である遺伝子配列決定ライブラリーキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ法）；
アジレント２１００バイオアナライザー；
高感度ＤＮＡチップ；
以下の実施例で使用される材料は、上記の列挙に限定されるものではなく、他の類似の材料で置き換えることができ、規定された条件でない器具は、製造者によって推奨される従来の条件又は条件にさらされる。当業者は、従来の材料及び器具の関連知識を習得し、使用しなければならない。
Ｑｉａｇｅｎにより製造番号７４００４で作製されたＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット；
Ｙｉｋｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃによって製造された製造番号がＫＴ１１０７００７２４であるＭＡＬＢＡＣプラチナマイクロスケールＲＮＡ増幅キット；
Ｚｙｍｏによって製造された製造番号がＯｆＤ４０１４であるＤＮＡクリーン＆コンセントレータ－５；
Ｙｉｋｏｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって製造された製造番号がＫＴ１００８０１９２４である遺伝子配列決定ライブラリーキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ法）；
アジレント２１００バイオアナライザー；
高感度ＤＮＡチップ；
以下の実施例で使用される材料は、上記の列挙に限定されるものではなく、他の類似の材料で置き換えることができ、規定された条件でない器具は、製造者によって推奨される従来の条件又は条件にさらされる。当業者は、従来の材料及び器具の関連知識を習得し、使用しなければならない。
実施例１ 試料前処理及びＲＮＡ抽出
サンプリングは、婦人科医又は検体生検に適格な専門家によって実施され、試料には、子宮底の子宮内膜組織（５ｍｇを超える）、子宮液（１０μｌを超える）又は他の生殖内分泌学的関連液（１０μｌを超える）、及び膣剥脱（５ｍｇを超える）が含まれた。生検後、組織、剥離又は液体をＲＮＡ保存液（約２０μＬ ＲＮＡ後）にできるだけ早く完全に浸漬した。試料は輸送前に－２０℃又は－８０℃の冷蔵庫に保存した。
サンプリングは、婦人科医又は検体生検に適格な専門家によって実施され、試料には、子宮底の子宮内膜組織（５ｍｇを超える）、子宮液（１０μｌを超える）又は他の生殖内分泌学的関連液（１０μｌを超える）、及び膣剥脱（５ｍｇを超える）が含まれた。生検後、組織、剥離又は液体をＲＮＡ保存液（約２０μＬ ＲＮＡ後）にできるだけ早く完全に浸漬した。試料は輸送前に－２０℃又は－８０℃の冷蔵庫に保存した。
Ｑｉａｇｅｎ社が製造したＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔを用いて子宮内膜組織のＲＮＡを抽出し、特異的方法は以下の通りであった。
1. 実験準備: 両手、ピペッター及び実験台をRNA酵素スカベンジャー及び核酸除去剤で洗浄した(注: すべての抽出ステップはRNA酵素が混入していないエリアで実施すべきである)。
２．７０％エタノール溶液（各試料３５０μＬ）及び８０％エタノール溶液（各試料５００μＬ）を脱イオン水及び無水エタノールで調製した。
３．４倍容量の無水エタノールをＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ（キットに付属）に添加し、さらに使用するために均一に混合した。
４．１０μＬのβ－メルカプトエタノールを採取し、９９０μＬの緩衝液ＲＬＴに発煙戸棚（各試料に３５０μＬの混合溶液を用いる）で添加し、さらに使用するために均等に混合した（注：抽出のたびに使用する直前に調製する）。
５．５５０μＬのＮａｓｅフリー水をＤＮａｓｅ Ｉ凍結乾燥粉末（キットに付属）に添加し、５回逆さまにして均一に混合し、室温で２分間放置した。得られた液体を（ＤＮａｓｅ Ｉ溶液としてマークされた）サブパッケージ化し、さらに使用するために－２０℃の冷蔵庫に保存し、凍結－解凍サイクルは３回を超えないようにした。
６．１０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ溶液（ステップ５から得られた）を、ＲＮＡ酵素を含まないＥＰチューブに取り、次に、７０μＬの緩衝液ＲＤＤを添加し、ピペットで均一に混合し、次に、氷上に置いて、さらに使用した（ＤＮａｓｅ Ｉ混合溶液としてマークされた）。溶液は抽出のたびに使用する直前に調製する。
７．試料を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置き、解凍し、次に、試料を、保存流体と共に、１．５ｍＬ ＲＮａｓｅフリーＥＰチューブに移した。
８．３５０μＬのβ－メルカプトエタノール含有緩衝液ＲＬＴ（ステップ４で得られた）をＥＰチューブに添加し、３０秒間ボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した。
９．３５０μＬの７０％エタノールをＥＰチューブに連続的に添加し、３０秒間ボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した。
１０．６５０μＬの上清を注意深く吸収し（溶解していない組織断片は吸収しないでほしい）、吸着カラム（キットに付属）に移した。
１１．１４０００×ｇ遠心分離を３０秒間行い、回収カニューレの廃液を廃棄した。
１２．３５０μＬ緩衝液ＲＷ１（キット付属）を吸着カラムに添加し、１４０００×ｇを３０秒間遠心分離し、回収カニューレ内の廃液を廃棄した。
１３．８０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ混合溶液を吸着カラムの中心に注意深く添加し、室温で２０分間インキュベートした。
１４．３５０μＬ緩衝液ＲＷ１（キット付属）を吸着カラムに添加し、１４０００ｘｇを３０秒間遠心分離し、回収カニューレ内の廃液を廃棄した。
１５．５００μＬの無水エタノール含有緩衝液ＲＰＥ（ステップ３で得られた）を吸着カラムに添加し、１４０００×ｇを３０秒間遠心分離し、収集カニューレ内の廃液を廃棄した。
１６．吸着カラムに５００μＬの８０％エタノール（ステップ２で得られた）を添加し、１４０００×ｇを３０秒間遠心分離し、回収カニューレの廃液を捨てた。
１７．空の吸着カラムを１４０００×ｇ遠心分離のために回収カニューレに２分間挿入した。その後、採取カニューレを廃棄した。
１８．吸着カラムを新しいＲＮａｓｅ不含ＥＰチューブ１．５ｍＬに挿入し、チューブを開き、空気中で１分間乾燥させた。
１９．２１μＬのＲＮａｓｅ遊離水を吸着カラムの中心に注意深く添加し、室温で１分間インキュベートし、１７０００×ｇを２分間遠心分離し、液体、すなわちＲＮＡを回収した。
２０．１μＬのＲＮＡを採取し、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳキットにより定量した。定量したＲＮＡをさらに使用するために－８０℃の冷蔵庫に保管した。
1. 実験準備: 両手、ピペッター及び実験台をRNA酵素スカベンジャー及び核酸除去剤で洗浄した(注: すべての抽出ステップはRNA酵素が混入していないエリアで実施すべきである)。
２．７０％エタノール溶液（各試料３５０μＬ）及び８０％エタノール溶液（各試料５００μＬ）を脱イオン水及び無水エタノールで調製した。
３．４倍容量の無水エタノールをＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥ（キットに付属）に添加し、さらに使用するために均一に混合した。
４．１０μＬのβ－メルカプトエタノールを採取し、９９０μＬの緩衝液ＲＬＴに発煙戸棚（各試料に３５０μＬの混合溶液を用いる）で添加し、さらに使用するために均等に混合した（注：抽出のたびに使用する直前に調製する）。
５．５５０μＬのＮａｓｅフリー水をＤＮａｓｅ Ｉ凍結乾燥粉末（キットに付属）に添加し、５回逆さまにして均一に混合し、室温で２分間放置した。得られた液体を（ＤＮａｓｅ Ｉ溶液としてマークされた）サブパッケージ化し、さらに使用するために－２０℃の冷蔵庫に保存し、凍結－解凍サイクルは３回を超えないようにした。
６．１０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ溶液（ステップ５から得られた）を、ＲＮＡ酵素を含まないＥＰチューブに取り、次に、７０μＬの緩衝液ＲＤＤを添加し、ピペットで均一に混合し、次に、氷上に置いて、さらに使用した（ＤＮａｓｅ Ｉ混合溶液としてマークされた）。溶液は抽出のたびに使用する直前に調製する。
７．試料を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、氷上に置き、解凍し、次に、試料を、保存流体と共に、１．５ｍＬ ＲＮａｓｅフリーＥＰチューブに移した。
８．３５０μＬのβ－メルカプトエタノール含有緩衝液ＲＬＴ（ステップ４で得られた）をＥＰチューブに添加し、３０秒間ボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した。
９．３５０μＬの７０％エタノールをＥＰチューブに連続的に添加し、３０秒間ボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した。
１０．６５０μＬの上清を注意深く吸収し（溶解していない組織断片は吸収しないでほしい）、吸着カラム（キットに付属）に移した。
１１．１４０００×ｇ遠心分離を３０秒間行い、回収カニューレの廃液を廃棄した。
１２．３５０μＬ緩衝液ＲＷ１（キット付属）を吸着カラムに添加し、１４０００×ｇを３０秒間遠心分離し、回収カニューレ内の廃液を廃棄した。
１３．８０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ混合溶液を吸着カラムの中心に注意深く添加し、室温で２０分間インキュベートした。
１４．３５０μＬ緩衝液ＲＷ１（キット付属）を吸着カラムに添加し、１４０００ｘｇを３０秒間遠心分離し、回収カニューレ内の廃液を廃棄した。
１５．５００μＬの無水エタノール含有緩衝液ＲＰＥ（ステップ３で得られた）を吸着カラムに添加し、１４０００×ｇを３０秒間遠心分離し、収集カニューレ内の廃液を廃棄した。
１６．吸着カラムに５００μＬの８０％エタノール（ステップ２で得られた）を添加し、１４０００×ｇを３０秒間遠心分離し、回収カニューレの廃液を捨てた。
１７．空の吸着カラムを１４０００×ｇ遠心分離のために回収カニューレに２分間挿入した。その後、採取カニューレを廃棄した。
１８．吸着カラムを新しいＲＮａｓｅ不含ＥＰチューブ１．５ｍＬに挿入し、チューブを開き、空気中で１分間乾燥させた。
１９．２１μＬのＲＮａｓｅ遊離水を吸着カラムの中心に注意深く添加し、室温で１分間インキュベートし、１７０００×ｇを２分間遠心分離し、液体、すなわちＲＮＡを回収した。
２０．１μＬのＲＮＡを採取し、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳキットにより定量した。定量したＲＮＡをさらに使用するために－８０℃の冷蔵庫に保管した。
実施例２ ＲＮＡ逆転写及びｃＤＮＡ増幅
１．実験準備：両手、ピペッター及びスーパークリーンベンチ卓上をＲＮＡ酵素スカベンジャー及び核酸除去剤で洗浄した。スーパークリーンベンチでは、ＲＮａｓｅ、核酸混入のないチップ、１．５ｍＬ ＥＰチューブ、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブを用意し、スーパークリーンベンチ内の紫外線を３０分間照射した（手順２～１１はＲＮａｓｅ、核酸混入のないスーパークリーンベンチ内で実施する）。
２．ＲＮＡ試料及び溶解緩衝液（キットに付属）を氷上に置き、解凍し、ボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した後、氷上に置き、さらに使用した。
３．２μＬのＲＮＡを採取し、各試料について１．５ｍＬ ＥＰチューブに入れた。ＲＮＡ試料を、試料の測定ＲＮＡ濃度に従って、ＲＮａｓｅフリー水で約５ｎｇ／μＬに希釈した。
４．１．５μ溶解緩衝液及び３．５μＬ希釈ＲＮＡ試料を、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに連続的に添加した。
５．逆転写陰性対照（ＲＴ－ＮＣ）を、ステップ４のＲＮＡ試料を３．５μＬ ＲＮａｓｅ不含水に置き換えた。
６．１３．３μＬ＊（反応部＋ピペッティングロス）ＲＴ緩衝液を採取し、新しい０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに入れた。（各ＰＣＲチューブの容積は５０μＬ以下であった）。
７．ＰＣＲ増幅器を予熱した後、ステップ４～６のＰＣＲチューブをＰＣＲ増幅器に入れ、７２℃で３分間インキュベートした。
８．ＰＣＲチューブを直ちに氷上に置き、少なくとも２分間インキュベートし、フラッシュで遠心分離した。
９．ＲＴ酵素混合物（キット付属）を－２０℃の冷蔵庫から取り出し、フラッシュで遠心分離し、振動を避け、さらに使用するために氷上に置いた。
１０．１．７μＬ＊（反応部＋ピペッティングロス） ＲＴ酵素混合物を、７２℃でインキュベート後、ＲＴ緩衝液（ステップ６）に加え、混合溶液をわずかにピペッティングして均一に混合し、氷上に置いて使用した。混合物を「ＲＴミックス」でマークした。
１１．１５μＬのＲＴ混合物（ステップ１０）を吸収し、ＲＮＡ試料又はＲＴ－ＮＣを含有するＰＣＲチューブ（ステップ４～５）に加え、次にわずかにピペッティングし、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、氷上に置いた。
１２．試料を予熱ＰＣＲ増幅器上でインキュベートし、条件を表１に示した。
１．実験準備：両手、ピペッター及びスーパークリーンベンチ卓上をＲＮＡ酵素スカベンジャー及び核酸除去剤で洗浄した。スーパークリーンベンチでは、ＲＮａｓｅ、核酸混入のないチップ、１．５ｍＬ ＥＰチューブ、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブを用意し、スーパークリーンベンチ内の紫外線を３０分間照射した（手順２～１１はＲＮａｓｅ、核酸混入のないスーパークリーンベンチ内で実施する）。
２．ＲＮＡ試料及び溶解緩衝液（キットに付属）を氷上に置き、解凍し、ボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した後、氷上に置き、さらに使用した。
３．２μＬのＲＮＡを採取し、各試料について１．５ｍＬ ＥＰチューブに入れた。ＲＮＡ試料を、試料の測定ＲＮＡ濃度に従って、ＲＮａｓｅフリー水で約５ｎｇ／μＬに希釈した。
４．１．５μ溶解緩衝液及び３．５μＬ希釈ＲＮＡ試料を、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに連続的に添加した。
５．逆転写陰性対照（ＲＴ－ＮＣ）を、ステップ４のＲＮＡ試料を３．５μＬ ＲＮａｓｅ不含水に置き換えた。
６．１３．３μＬ＊（反応部＋ピペッティングロス）ＲＴ緩衝液を採取し、新しい０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに入れた。（各ＰＣＲチューブの容積は５０μＬ以下であった）。
７．ＰＣＲ増幅器を予熱した後、ステップ４～６のＰＣＲチューブをＰＣＲ増幅器に入れ、７２℃で３分間インキュベートした。
８．ＰＣＲチューブを直ちに氷上に置き、少なくとも２分間インキュベートし、フラッシュで遠心分離した。
９．ＲＴ酵素混合物（キット付属）を－２０℃の冷蔵庫から取り出し、フラッシュで遠心分離し、振動を避け、さらに使用するために氷上に置いた。
１０．１．７μＬ＊（反応部＋ピペッティングロス） ＲＴ酵素混合物を、７２℃でインキュベート後、ＲＴ緩衝液（ステップ６）に加え、混合溶液をわずかにピペッティングして均一に混合し、氷上に置いて使用した。混合物を「ＲＴミックス」でマークした。
１１．１５μＬのＲＴ混合物（ステップ１０）を吸収し、ＲＮＡ試料又はＲＴ－ＮＣを含有するＰＣＲチューブ（ステップ４～５）に加え、次にわずかにピペッティングし、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、氷上に置いた。
１２．試料を予熱ＰＣＲ増幅器上でインキュベートし、条件を表１に示した。
１３．－２０℃の冷蔵庫からＰＣＲ混合物（キット付属）を取り出した。ＰＣＲ Ｍｉｘを氷上に置き、解凍し、裏返し、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、氷上に置き、さらに使用した。
１４．３０μＬのＰＣＲ混合物を各逆転写反応生成物に添加し、わずかにピペットで混合し、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、次に氷上に置き、さらに使用した。
１５．逆転写陰性対照（ＲＴ－ＮＣ）を、ステップ３の逆転写反応生成物を２０μＬのＲＮａｓｅ不含水に置き換えた。
１６．試料を予熱ＰＣＲ増幅器上でインキュベートし、条件を表２に示した。
１４．３０μＬのＰＣＲ混合物を各逆転写反応生成物に添加し、わずかにピペットで混合し、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、次に氷上に置き、さらに使用した。
１５．逆転写陰性対照（ＲＴ－ＮＣ）を、ステップ３の逆転写反応生成物を２０μＬのＲＮａｓｅ不含水に置き換えた。
１６．試料を予熱ＰＣＲ増幅器上でインキュベートし、条件を表２に示した。
備考：試料に応じて増幅のサイクル数を適切に増減させることができ、適応調整のアドバイスを表３に示した。
実施例３ 増幅産物の精製
１．実験準備：実験領域が逆転写の段階と増幅の段階で異なることを確認する。両手、ピペッター及び実験台頭を核酸除去剤で洗浄した。
２．４倍容量の無水エタノールを緩衝液ＲＰＥに添加し、上下逆さまにし、さらなる使用のために均等に混合した。
３．ＰＣＲ産物を氷上に２分間置き、次に、さらなる使用のためにフラッシュ中で遠心分離した。
４．２５０μＬのＤＮＡ結合緩衝液及び５０μＬのＰＣＲ産物を１．５ｍＬ ＥＰチューブに連続的に添加した。次に、混合溶液を均一にボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した。
５．捕集カニューレに吸着カラムを挿入し、ステップ４の混合溶液３００μＬを吸着カラムに移した。
６．１４０００×ｇ遠心分離を３０秒間行った。
７．２００μＬのエタノール含有洗浄緩衝液を吸着カラムに添加し、１４０００×ｇで３０秒間遠心分離した。
８．ステップ７を１回繰り返し、回収カニューレの廃液を廃棄した。
９．吸着カラムを収集カニューレに挿入し、１４０００×ｇ遠心分離を２分間行った。その後、採取カニューレを廃棄した。
１０．吸着カラムを新しい１．５ｍＬ ＥＰチューブに挿入し、開封し、空気中で１分間乾燥させた。
１１．３０μＬの溶出緩衝液（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５より提供）を吸着カラムの中心に注意深く添加し、室温で１分間インキュベートし、１７０００×ｇを２分間遠心分離し、液体、すなわち、ＲＮＡ増幅生成物を回収した。
１２．１μＬのＲＮＡを採取し、Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ ＨＳキットで定量した。逆転写中に設定した陰性対照ＲＴ－ＮＣは、増幅後の濃度が２ｎｇ／ｕＬ未満でなければならず、ＰＣＲ中に設定した陰性対照のＰＣＲ－ＮＣは増幅後の濃度が０．４ｎｇ／ｕＬ未満でなければならない。試料のｃＤＮＡ増幅産物の濃度は、４０ｎｇ／ｕＬを超えるべきである。その後の配列決定ステップは、ＲＴ－ＮＣ及びＰＣＲ－ＮＣについては行われない。
１．実験準備：実験領域が逆転写の段階と増幅の段階で異なることを確認する。両手、ピペッター及び実験台頭を核酸除去剤で洗浄した。
２．４倍容量の無水エタノールを緩衝液ＲＰＥに添加し、上下逆さまにし、さらなる使用のために均等に混合した。
３．ＰＣＲ産物を氷上に２分間置き、次に、さらなる使用のためにフラッシュ中で遠心分離した。
４．２５０μＬのＤＮＡ結合緩衝液及び５０μＬのＰＣＲ産物を１．５ｍＬ ＥＰチューブに連続的に添加した。次に、混合溶液を均一にボルテックスし、フラッシュ中で遠心分離した。
５．捕集カニューレに吸着カラムを挿入し、ステップ４の混合溶液３００μＬを吸着カラムに移した。
６．１４０００×ｇ遠心分離を３０秒間行った。
７．２００μＬのエタノール含有洗浄緩衝液を吸着カラムに添加し、１４０００×ｇで３０秒間遠心分離した。
８．ステップ７を１回繰り返し、回収カニューレの廃液を廃棄した。
９．吸着カラムを収集カニューレに挿入し、１４０００×ｇ遠心分離を２分間行った。その後、採取カニューレを廃棄した。
１０．吸着カラムを新しい１．５ｍＬ ＥＰチューブに挿入し、開封し、空気中で１分間乾燥させた。
１１．３０μＬの溶出緩衝液（ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５より提供）を吸着カラムの中心に注意深く添加し、室温で１分間インキュベートし、１７０００×ｇを２分間遠心分離し、液体、すなわち、ＲＮＡ増幅生成物を回収した。
１２．１μＬのＲＮＡを採取し、Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ ＨＳキットで定量した。逆転写中に設定した陰性対照ＲＴ－ＮＣは、増幅後の濃度が２ｎｇ／ｕＬ未満でなければならず、ＰＣＲ中に設定した陰性対照のＰＣＲ－ＮＣは増幅後の濃度が０．４ｎｇ／ｕＬ未満でなければならない。試料のｃＤＮＡ増幅産物の濃度は、４０ｎｇ／ｕＬを超えるべきである。その後の配列決定ステップは、ＲＴ－ＮＣ及びＰＣＲ－ＮＣについては行われない。
実施例４ 増幅産物の品質管理
１μｌの精製ｃＤＮＡ増幅産物を採取し、検出のために適度に希釈した。取扱説明書は高感度ＤＮＡチップ取扱説明書に示し、その結果を図１に示す。
１μｌの精製ｃＤＮＡ増幅産物を採取し、検出のために適度に希釈した。取扱説明書は高感度ＤＮＡチップ取扱説明書に示し、その結果を図１に示す。
一般に、試料のｃＤＮＡ増幅産物は４００～１００００ｂｐ以内に分布しており、主ピークは図１に示すように、２０００ｂｐ付近に位置していた。本出願で使用されたｃＤＮＡは、品質要件に従っていた。
実施例５ 転置及びライブラリー構築
１．ＤＮＡ断片化
（１）断片化緩衝液を－２０℃から取り出し、室温で解凍し、均一に振動させ、フラッシュ中で遠心分離した後、待機した。試料数（Ｎ）に従い、反応系を表４に示した。
１．ＤＮＡ断片化
（１）断片化緩衝液を－２０℃から取り出し、室温で解凍し、均一に振動させ、フラッシュ中で遠心分離した後、待機した。試料数（Ｎ）に従い、反応系を表４に示した。
（２）上記の混合断片溶液９．５μＬをそれぞれ取り、０．２ｍＬ ＰＣＲチューブにサブパッケージし、フラッシュで遠心分離した。０．５μＬ（約１０ｎｇ）のＭＡＬＢＡＣ増幅産物を採取し、前ステップの９．５μＬ混合断片溶液を負荷したＰＣＲチューブにそれぞれ添加した。次に、混合溶液をボルテックスし、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離した。
（３）調製した反応系をＰＣＲ増幅器に入れ、「Ｏｎ、１０５℃」を「加熱蓋」に選択し、加熱蓋をねじ下げ、反応手順を表５に示した。
（３）調製した反応系をＰＣＲ増幅器に入れ、「Ｏｎ、１０５℃」を「加熱蓋」に選択し、加熱蓋をねじ下げ、反応手順を表５に示した。
２．ライブラリー富化
（１）増幅緩衝液を－２０℃から取り出し、室温で解凍し、均一に振動させ、フラッシュで遠心分離した後、待機した。試料数（Ｎ）に従い、反応系を表６に示した。
（１）増幅緩衝液を－２０℃から取り出し、室温で解凍し、均一に振動させ、フラッシュで遠心分離した後、待機した。試料数（Ｎ）に従い、反応系を表６に示した。
（２）混合溶液をボルテックスし、よく混合し、フラッシュ中で遠心分離した。
（３）上記で調製した各混合増幅溶液１２μＬをそれぞれ採取し、「ステップ１．１」で断片化生成物に添加した。３μＬタグプライマーを上記反応系にそれぞれ添加し、ボルテックスし、よく混合し、フラッシュ中で遠心分離した。
（４）各試料に対応するタグプライマーのシリアル番号を記録した（注：２４個のタグプライマーがあり、各反応に１個のタグプライマーを添加し、同じランニングバッチ中の試料は異なる重複しないタグプライマーを有するべきである）。
（５）調製した反応系をＰＣＲ増幅器に入れ、「Ｏｎ、１０５℃」を「加熱蓋」に選択し、蓋をねじ下げ、反応手順を表７に示した。
（３）上記で調製した各混合増幅溶液１２μＬをそれぞれ採取し、「ステップ１．１」で断片化生成物に添加した。３μＬタグプライマーを上記反応系にそれぞれ添加し、ボルテックスし、よく混合し、フラッシュ中で遠心分離した。
（４）各試料に対応するタグプライマーのシリアル番号を記録した（注：２４個のタグプライマーがあり、各反応に１個のタグプライマーを添加し、同じランニングバッチ中の試料は異なる重複しないタグプライマーを有するべきである）。
（５）調製した反応系をＰＣＲ増幅器に入れ、「Ｏｎ、１０５℃」を「加熱蓋」に選択し、蓋をねじ下げ、反応手順を表７に示した。
３．ライブラリー精製
（１）磁気ビーズを４℃から取り出し、室温に置き、室温に平衡させた。磁気ビーズを２０秒間ボルテックスし、均一な溶液に完全にブレンドした。
（２）各構築ライブラリー２０μＬをそれぞれ新しい１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、０．６×再懸濁磁性ビーズをそれぞれ添加し（例えば、初期ライブラリーの容積が２０ μＬの場合、１２μＬの磁性ビーズを添加した）、均一にボルテックスし、室温で５分間放置し、フラッシュ中で遠心分離した。
（３）フラッシュ内での遠心分離：磁気ビーズを約５分間上清から分離するように遠心管を磁気フレーム上に置き、溶液は透明であり、遠心管を磁気フレーム上に置き、液のこぼれを防止するためにチューブキャップを注意深く開け、次に上清を新しい１．５ｍＬ遠心管（磁気ビーズを吸収しない旨）に注意深く移し、次に、磁気ビーズを捨てた（上清を捨てない旨）。
（４）最初のライブラリーの容積の０．１５倍の容積の磁性ビーズを上清に再懸濁し（例えば、最初のライブラリーの容積が２０μＬである場合、３μＬの磁性ビーズを添加した）、ボルテックスし、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、室温で５分間放置した。
（５）遠心管を磁気フレーム上に置き、磁性ビーズを上清から分離し、約５分後に液体が透明になり、上清を注意深く吸収し、廃棄した（磁性ビーズを捨てないように注意し、ピペッティングした）。
（６）遠心管を磁気フレーム上に連続的に固定し、新たに調製した８０％エタノール約２００μＬを遠心管に加えた（注：磁性ビーズが飛散しないように、管壁とともに注意深くエタノールを加え、磁性ビーズをエタノールに浸すようにした）。室温で３０秒間放置した後、上清を注意深く除去した。
（７）前ステップを１回繰り返した。
（８）遠心管を磁気フレーム上に固定し、室温で約１０分間放置し、エタノールが完全に揮発するようにした。
（９）遠心管を磁気フレームから取り出し、１７．５μＬ溶離液に加え、ボルテックスして磁性ビーズを完全に再懸濁し、フラッシュで遠心分離し、室温で５分間置き、遠心管を磁気フレームに置いて、磁性ビーズを液体から分離し、約５分後、溶液を透明にし、１５μＬ上清を慎重に新しい遠心管に吸収し（磁性ビーズを吸収しないように注意）、－２０℃に保存した。
（１）磁気ビーズを４℃から取り出し、室温に置き、室温に平衡させた。磁気ビーズを２０秒間ボルテックスし、均一な溶液に完全にブレンドした。
（２）各構築ライブラリー２０μＬをそれぞれ新しい１．５ｍＬ遠心チューブに入れ、０．６×再懸濁磁性ビーズをそれぞれ添加し（例えば、初期ライブラリーの容積が２０ μＬの場合、１２μＬの磁性ビーズを添加した）、均一にボルテックスし、室温で５分間放置し、フラッシュ中で遠心分離した。
（３）フラッシュ内での遠心分離：磁気ビーズを約５分間上清から分離するように遠心管を磁気フレーム上に置き、溶液は透明であり、遠心管を磁気フレーム上に置き、液のこぼれを防止するためにチューブキャップを注意深く開け、次に上清を新しい１．５ｍＬ遠心管（磁気ビーズを吸収しない旨）に注意深く移し、次に、磁気ビーズを捨てた（上清を捨てない旨）。
（４）最初のライブラリーの容積の０．１５倍の容積の磁性ビーズを上清に再懸濁し（例えば、最初のライブラリーの容積が２０μＬである場合、３μＬの磁性ビーズを添加した）、ボルテックスし、均一に混合し、フラッシュ中で遠心分離し、室温で５分間放置した。
（５）遠心管を磁気フレーム上に置き、磁性ビーズを上清から分離し、約５分後に液体が透明になり、上清を注意深く吸収し、廃棄した（磁性ビーズを捨てないように注意し、ピペッティングした）。
（６）遠心管を磁気フレーム上に連続的に固定し、新たに調製した８０％エタノール約２００μＬを遠心管に加えた（注：磁性ビーズが飛散しないように、管壁とともに注意深くエタノールを加え、磁性ビーズをエタノールに浸すようにした）。室温で３０秒間放置した後、上清を注意深く除去した。
（７）前ステップを１回繰り返した。
（８）遠心管を磁気フレーム上に固定し、室温で約１０分間放置し、エタノールが完全に揮発するようにした。
（９）遠心管を磁気フレームから取り出し、１７．５μＬ溶離液に加え、ボルテックスして磁性ビーズを完全に再懸濁し、フラッシュで遠心分離し、室温で５分間置き、遠心管を磁気フレームに置いて、磁性ビーズを液体から分離し、約５分後、溶液を透明にし、１５μＬ上清を慎重に新しい遠心管に吸収し（磁性ビーズを吸収しないように注意）、－２０℃に保存した。
４．ライブラリーの品質管理
精製されたライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットでそれぞれ定量することができ、その濃度は、一般に５ｎｇ／ｕｌを超えていた（高品質の配列決定結果を得るために、リアルタイム定量ＰＣＲを実施して、適格性を確認することができる）。
精製されたライブラリーは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキットでそれぞれ定量することができ、その濃度は、一般に５ｎｇ／ｕｌを超えていた（高品質の配列決定結果を得るために、リアルタイム定量ＰＣＲを実施して、適格性を確認することができる）。
実施例６ 配列決定実行
Ｉｌｌｕｍｉｎａテストキットの実験手順の説明を参照されたい。配列決定戦略：シングルエンド又はダブルエンドの両方のやり方が利用可能であり、読み取り長は４５ｎｔを超え、２５０万読み取りが保証された。
Ｉｌｌｕｍｉｎａテストキットの実験手順の説明を参照されたい。配列決定戦略：シングルエンド又はダブルエンドの両方のやり方が利用可能であり、読み取り長は４５ｎｔを超え、２５０万読み取りが保証された。
実施例７ データ処理ステップ
明確な臨床転帰を有するボランティアからの試料の発現プロファイルを訓練データとして使用し、分析モデルを機械学習により構築した。その後、位置データを入力し、解析モデルを用いて、具体的には以下のように事前判定を行った。
１．教師付学習方法（図２に示すもの）を使用し、そこで使用される「トレーニングデータ」は、種々の着床状態下での子宮内膜組織、子宮液又は他の生殖内分泌学関連体液又は剥離の発現プロファイル特徴であるラベルを有する。
２．「トレーニングデータ」又は「トレーニングセット」としての知見を決定するためのグループ分け基準は、既往歴又は原発性不妊症のない自然周期の異なる健康な中国人女性で、ボディマスインデックスが１９～２５ｋｇ／ｍ２以内であることである。３つの標識のＲＮＡ－ｓｅｑデータを取得した後、ＦＰＫＭを、配列決定深度の影響を除外するために、遺伝子長及び配列決定深度による正規化に使用する。正規化過程で、異なる標識を有する（複数の）試料からの異なる遺伝子の発現レベルを比較し、それにより遺伝子の差次的発現を分析し、具体的には以下の通りであった：各試料のＦＰＫＭ＞０を有するすべての遺伝子が見出され、「着床前期間」対「着床期間」、「着床前期間」対「着床後期間」、及び「着床期間」対「着床後期間」の間で異なって発現された遺伝子の交差点は、ＦＰＫＭ＞０を有するトレーニングセット試料に属する全ての遺伝子からスクリーニングされ（ｐ値＜０．０５及び倍数変化＞２又は倍数変化＜０．５を満たすいずれもの遺伝子は選択基準を満たす）、このようにして１２７３４個の差次的に発現された遺伝子を得て、ＥＮＳＧ００００００００００３、ＥＮＳＧ０００００１０４８８１、ＥＮＳＧ０００００１２８９２８、ＥＮＳＧ０００００１５１１１６、ＥＮＳＧ０００００１７１２２２、ＥＮＳＧ０００００１９８９６１、ＥＮＳＧ０００００２６１７３２、ＥＮＳＧ００００００００４１９、ＥＮＳＧ０００００１０４８８３、ＥＮＳＧ０００００１２８９４４、ＥＮＳＧ０００００１５１１１７、ＥＮＳＧ０００００１７１２２３、ＥＮＳＧ０００００１９８９６３、ＥＮＳＧ０００００２６１７４０、ＥＮＳＧ００００００００４５７、ＥＮＳＧ０００００１０４８８６、ＥＮＳＧ０００００１２８９５１、ＥＮＳＧ０００００１５１１３１、ＥＮＳＧ０００００１７１２２４、ＥＮＳＧ０００００１９８９６４、ＥＮＳＧ０００００２６１７６０などが含まれる。上記の遺伝子のコードは、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の遺伝子にのみ決定的に対応している。多数の異なる発現遺伝子が得られているにもかかわらず、本明細書中では、明細書の長さを制限する詳細な記載はない。
３．本発明の教師付き学習では、事前着床周期、着床ウィンドウ周期、及び事後着床周期をラベル付けした訓練データを用いてモデルを構築した。トレーニングによって得られたモデルは、未知データの着床状態を予測するために利用することができる（新しい試料を参照する）。例えば、症例からの子宮液発現プロファイルが新たに入力され、機械学習モデルが（図３に示されるように）試料の着床状態を決定するために使用された。
４．ＳＶＭを使用し、３のラベルに対応する試料をトレーニングセット構築のための入力変数として使用した。スクリプトは次のとおりである：
library(e1071)
svm.model<-svm(data.class~.,data4,kernel='linear')
summary(svm.model)
table(data$class,predict(svm.model,data4,type="data.class"))
mydata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
mydata2=log2(mydata+1)
predict(svm.model,mydata2)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
## table(testdata$data.class,predict(svm.model,testdata,type="data.class"))
shdata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
shdata2=log2(shdata[,-length(shdata[1,])]+1)
shdata3=data.frame(shdata2,shdata$class)
predict(svm.model,shdata3)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
５．ＳＶＭの結果によれば、未知試料の着床状態を定義して、試料の子宮内膜着床を決定し、及び胚移植（図４に示すように）は着床状態に応じて指向された。良好な妊娠転帰を得るために、サンプリング時間を数サイクルで何回も調整することができ、着床試験を実施した（図５に示される）。
明確な臨床転帰を有するボランティアからの試料の発現プロファイルを訓練データとして使用し、分析モデルを機械学習により構築した。その後、位置データを入力し、解析モデルを用いて、具体的には以下のように事前判定を行った。
１．教師付学習方法（図２に示すもの）を使用し、そこで使用される「トレーニングデータ」は、種々の着床状態下での子宮内膜組織、子宮液又は他の生殖内分泌学関連体液又は剥離の発現プロファイル特徴であるラベルを有する。
２．「トレーニングデータ」又は「トレーニングセット」としての知見を決定するためのグループ分け基準は、既往歴又は原発性不妊症のない自然周期の異なる健康な中国人女性で、ボディマスインデックスが１９～２５ｋｇ／ｍ２以内であることである。３つの標識のＲＮＡ－ｓｅｑデータを取得した後、ＦＰＫＭを、配列決定深度の影響を除外するために、遺伝子長及び配列決定深度による正規化に使用する。正規化過程で、異なる標識を有する（複数の）試料からの異なる遺伝子の発現レベルを比較し、それにより遺伝子の差次的発現を分析し、具体的には以下の通りであった：各試料のＦＰＫＭ＞０を有するすべての遺伝子が見出され、「着床前期間」対「着床期間」、「着床前期間」対「着床後期間」、及び「着床期間」対「着床後期間」の間で異なって発現された遺伝子の交差点は、ＦＰＫＭ＞０を有するトレーニングセット試料に属する全ての遺伝子からスクリーニングされ（ｐ値＜０．０５及び倍数変化＞２又は倍数変化＜０．５を満たすいずれもの遺伝子は選択基準を満たす）、このようにして１２７３４個の差次的に発現された遺伝子を得て、ＥＮＳＧ００００００００００３、ＥＮＳＧ０００００１０４８８１、ＥＮＳＧ０００００１２８９２８、ＥＮＳＧ０００００１５１１１６、ＥＮＳＧ０００００１７１２２２、ＥＮＳＧ０００００１９８９６１、ＥＮＳＧ０００００２６１７３２、ＥＮＳＧ００００００００４１９、ＥＮＳＧ０００００１０４８８３、ＥＮＳＧ０００００１２８９４４、ＥＮＳＧ０００００１５１１１７、ＥＮＳＧ０００００１７１２２３、ＥＮＳＧ０００００１９８９６３、ＥＮＳＧ０００００２６１７４０、ＥＮＳＧ００００００００４５７、ＥＮＳＧ０００００１０４８８６、ＥＮＳＧ０００００１２８９５１、ＥＮＳＧ０００００１５１１３１、ＥＮＳＧ０００００１７１２２４、ＥＮＳＧ０００００１９８９６４、ＥＮＳＧ０００００２６１７６０などが含まれる。上記の遺伝子のコードは、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の遺伝子にのみ決定的に対応している。多数の異なる発現遺伝子が得られているにもかかわらず、本明細書中では、明細書の長さを制限する詳細な記載はない。
３．本発明の教師付き学習では、事前着床周期、着床ウィンドウ周期、及び事後着床周期をラベル付けした訓練データを用いてモデルを構築した。トレーニングによって得られたモデルは、未知データの着床状態を予測するために利用することができる（新しい試料を参照する）。例えば、症例からの子宮液発現プロファイルが新たに入力され、機械学習モデルが（図３に示されるように）試料の着床状態を決定するために使用された。
４．ＳＶＭを使用し、３のラベルに対応する試料をトレーニングセット構築のための入力変数として使用した。スクリプトは次のとおりである：
library(e1071)
svm.model<-svm(data.class~.,data4,kernel='linear')
summary(svm.model)
table(data$class,predict(svm.model,data4,type="data.class"))
mydata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
mydata2=log2(mydata+1)
predict(svm.model,mydata2)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
## table(testdata$data.class,predict(svm.model,testdata,type="data.class"))
shdata=read.table(file.choose(),header=T,row.names=1)
shdata2=log2(shdata[,-length(shdata[1,])]+1)
shdata3=data.frame(shdata2,shdata$class)
predict(svm.model,shdata3)
table(shdata3$shdata.class,predict(svm.model,shdata3,type="shdata.class"))
５．ＳＶＭの結果によれば、未知試料の着床状態を定義して、試料の子宮内膜着床を決定し、及び胚移植（図４に示すように）は着床状態に応じて指向された。良好な妊娠転帰を得るために、サンプリング時間を数サイクルで何回も調整することができ、着床試験を実施した（図５に示される）。
実施例８ 臨床検証
２３～３９歳の異なる不妊個体を対象とし、本発明で構築した解析モデルを用いて予測した。ＳＶＭの結果に基づいて、試料の子宮内膜着床を決定するために、未知の試料着床状態を定義した。胚移植は着床状態に基づいて指示し、妊娠結果を記録し、結果を表８－１、８－２及び８－３に示した。
２３～３９歳の異なる不妊個体を対象とし、本発明で構築した解析モデルを用いて予測した。ＳＶＭの結果に基づいて、試料の子宮内膜着床を決定するために、未知の試料着床状態を定義した。胚移植は着床状態に基づいて指示し、妊娠結果を記録し、結果を表８－１、８－２及び８－３に示した。
標本期間、標本種、既往歴、不妊症型は検体の臨床情報、ＲＮＡ濃度、ｃＤＮＡ濃度、シークエンスデータサイズ、固有マッピング比、エクソン比率はシークエンシングの品質管理情報、サポートベクトル分類（ＳＶＣ）は機械学習により決定された着床状態、移植方法は機械学習の分析結果による埋め込み時間の調整を指す。表８－１、表８－２、表８－３から、臨床的検証により、１９例の不妊女性が、本発明のモデルを用いて胚の着床時期を指示することによって妊娠成功を達成し、本発明のモデルが非常に高い精度を有し、従って、医学的進歩を促進することに役立つことが示される。
本発明のマーカーの決定結果を表９に示す。
表９に示されるように、本発明では、単一のマーカーのみが使用されるが、所定の値を超える限り、これらのマーカーは、子宮内膜着床の有用な補助的決定又は診断情報として、したがって、特に早期及び／又は補助的診断のために使用され得る。
また、表９に示される複数のマーカーを用いて総合的に判断することにより、エラー率（わずか１７．５％）をさらに大幅に低減することができ、判断の精度を向上させることができる。
複数のマーカー（追加の５～２００遺伝子を含む）を採取する場合、エラー率は１６．５％と低い場合がある。
使用するマーカーの数が１００００になると、エラー率は６．７％になる。
エラー率は、臨床転帰がゴールドスタンダードとなり、胚移植成功日が着床期間となる。精度率＝受胎期間を方法別に決定した症例数／胚移植成功例の総数；エラー率＝受胎期間を方法別に決定しなかった症例数／胚移植成功例数。
したがって、本発明のマーカーは、特に、子宮内膜着床状態の決定のエラー率をさらに低下させ、それによって決定の精度を向上させることができる組み合わせでの使用に関して、非常に高い予測値を有することが、上記の記載から分かる。
さらに、表１１に従って、表９のマーカーをさらにスクリーニングして、非常に低いエラー率及び高い精度効果を有する４０のマーカー、１４７のマーカー及び２５９のマーカーを得た。ここで、ブランクは、＜４の分析値を指す。
さらに、本発明の表９の遺伝子がコア遺伝子であることは、表１０から分かる。これに基づいて、新たに加えられた遺伝子は精度を向上させるが、重さは低い。
要約すると、本発明は、高感度ＲＮＡ逆転写及びｃＤＮＡ増幅プロセスに依存し、ＲＮＡ－ｓｅｑ配列決定方法に基づいており、それにより、子宮内膜、子宮液又は他の生殖内分泌学関連体液又は患者からの剥離の多数の発現プロファイル情報を得る。これらの試料のサンプリング期間及びサンプリング方法は、異なる発現プロファイル特徴を得るために特異的に選択され、それは、バイオインフォマティクス、統計及び機械学習方法による超高次元分類及びタイピングに供される。種々のタイプに応じて、ＥＲ状態が決定される。本発明において、発現プロファイル特徴は、胚移植前のＥＲ状態を決定するモデルにおいて使用され、かくして子宮内膜の着床ウィンドウ期間を正確に決定する。
出願人は、本発明は上記実施例を介して詳細な方法を記載するが、上記詳細な方法に限定されるものではないと述べている。すなわち、本発明が、上記の実施のための詳細な方法に依存しなければならないという意味ではない。当業者は、本発明の製品の各原料に相当する本発明の改良、補助構成要素の追加、特定の手段の選択等が、本発明の保護範囲及び開示範囲に含まれることを知るべきである。
本明細書に記載される全ての文献は、各文献が参照として別々に引用されるのと同様に、参照として本出願において引用される。本明細書において、当業者は、本発明の上記教示内容を読んだ後に、本発明に対して何らかの変更又は補正を行うことができ、これらの等価な形態もまた、本出願の請求項に定義された範囲内にあることを理解されたい。
Claims (10)
- 以下のステップを含む、子宮内膜着床を決定する方法であって、以下：
（ａ）試料を提供するステップ；
（ｂ）試料中の子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルを測定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルを所定の値と比較し、それによって子宮内膜着床を決定するステップ
を含む、上記方法。 - ステップ（ｂ）で得られた子宮内膜着床関連遺伝子の発現レベルが所定の値よりも高い場合、子宮内膜着床が存在することを示す、請求項１に記載の方法。
- 試料が、以下：ＬＨ＋ｎ、ＬＨ＋ｎ＋２、ＬＨ＋ｎ＋４の期間からのものであり、ここで、ｎは３～７であり、好ましくはｎは４～６である、請求項１に記載の方法。
- 子宮内膜着床関連遺伝子が、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む、請求項１に記載の方法：
- 表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含むバイオマーカーのセット。
- 子宮内膜着床状態を決定するために使用される試薬の組み合わせであって、請求項５に記載のセット中の各バイオマーカーを検出するための試薬を含む、試薬の組み合わせ。
- 請求項５に記載のセット及び／又は請求項６に記載の試薬の組み合わせを含むキット。
- キットを製造するための一組のバイオマーカーの使用であって、前記キットは、検出される対象物の子宮内膜着床状態を評価するために使用され、前記一組のバイオマーカーは、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む、上記使用。
- 検査対象物の子宮内膜着床状態を評価するための方法であって、以下：
（１）被検物に由来する試料を提供し、試料セット中の各バイオマーカーのレベルを検出するステップであって、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含むステップ；及び
（２）（１）で検出されたたレベルと所定の値を比較するステップ
を含む、上記方法。 - 被検物の子宮内膜着床状態を評価するためのシステムであって、以下：
（ａ）子宮内膜着床状態特徴入力モジュールであって、入力モジュールは、検出される被検物の子宮内膜着床状態の特徴を入力するために使用され、検出される被検物の子宮内膜着床状態の特徴が、表Ａから選択される遺伝子の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を含む、前記子宮内膜着床状態特徴入力モジュール：
（ｂ）子宮内膜着床状態判定処理モジュールであって、前記処理モジュールは、予め設定された基準によって子宮内膜着床状態の入力された特徴について評価プロセスを実行し、このようにして子宮内膜着床状態のスコアを得て；さらに、前記子宮内膜着床状態のスコアを予め定められた値と比較し、このようにして補助診断結果を得て、ここで、子宮内膜着床状態のスコアが予め定められた値よりも高い場合、前記被検物が子宮内膜着床を有することが示唆される、前記子宮内膜着床状態判定処理モジュール；ならびに
（ｃ）補助診断結果の出力モジュールであって、前記出力モジュールは、補助診断結果を出力するために使用される、前記出力モジュール
を含む、上記システム。
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