CN109983027A - 基于cereblon的可异二聚化嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本文提供包含嵌合受体的经过修饰的T淋巴细胞和其使用方法。

Description

基于CEREBLON的可异二聚化嵌合抗原受体
1.发明领域
本文的公开内容涉及免疫学领域，并且更具体地说涉及T淋巴细胞或其他免疫细胞的修饰。
2.背景技术
免疫系统的细胞(诸如T淋巴细胞，也称为T细胞)通过受体或受体复合物识别特异性抗原并且与其相互作用，在识别此类抗原或与其相互作用后，所述受体或受体复合物引起细胞活化。此类受体的实例为抗原特异性T淋巴细胞受体复合物(TCR/CD3)，它是八种蛋白质的复合物。T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面表达。具有不变结构的一种组分CD3负责配体占用TCR后的细胞内信号传导。抗原-CD3复合物(TCR/CD3)的T淋巴细胞受体识别抗原肽，所述抗原肽是由主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质呈递给它的。MHC和肽的复合物在抗原呈递细胞和其他T淋巴细胞靶标的表面表达。TCR/CD3复合物的刺激引起T淋巴细胞活化和随之而来的抗原特异性免疫反应。TCR/CD3复合物在免疫系统的效应功能和调控中发挥核心作用。
T淋巴细胞需要第二共刺激信号以变为充分活性的。没有此类信号，T淋巴细胞对与TCR结合的抗原无反应，或变得无活动力。此类共刺激信号例如由T淋巴细胞蛋白质CD28提供，所述T淋巴细胞蛋白质与产生抗原的细胞上的CD80和CD86相互作用。另一种T淋巴细胞蛋白质ICOS(诱导型共刺激剂)当与ICOS配体结合时提供共刺激信号。
嵌合抗原受体(CAR)为经过基因工程化以含有TCR复合物的必需抗原结合、信号传导以及刺激功能的多肽。带有此类CAR的T淋巴细胞统称为CAR-T细胞或CAR-T淋巴细胞。然而，虽然CAR可有效地使T淋巴细胞靶向特定肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，但是还可靶向也表达此类抗原的正常健康细胞。本文描述了克服当前CAR设计的此缺点的经过修饰的嵌合受体。
3.发明内容
在一个方面中，本文提供嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含cereblon或其功能部分；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含cereblon相关蛋白或其功能部分，其中第一多肽或第二多肽或两种多肽包含CAR的额外组分，诸如抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞信号传导结构域和/或共刺激结构域。当CAR的第一和第二多肽在存在cereblon结合化合物(例如如本文所描述)的情况下一起在免疫细胞中(例如T淋巴细胞中)表达时，第一多肽的cereblon(或其例如如本文所述的功能部分)和第二多肽的cereblon相关蛋白(或其例如如本文所述的功能部分)结合cereblon结合化合物，从而使得形成具有CAR功能的异二聚体。因此，可通过使表达CAR的第一和第二多肽的细胞(例如经过工程化以表达所述CAR的T淋巴细胞)与cereblon结合化合物接触来选择性地控制本文所述的CAR的活性(例如体内活性)。当免疫细胞中表达的CAR与cereblon结合化合物接触并且CAR与抗原，例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原结合时，CAR传递初级与共刺激信号两者，由此活化免疫细胞。
在一个特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon或其功能部分，其中所述cereblon(或其功能部分)能够与cereblon结合化合物结合；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及初级细胞信号传导结构域，其中所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)能够结合cereblon结合化合物；其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下，所述第一多肽和所述第二多肽形成异二聚体。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为泊马度胺(pomalidomide)(4-氨基-2-[(3RS)-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为沙利度胺(thalidomide)((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为来那度胺(lenalidomide)(3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon或其功能部分；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及初级T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon或其功能部分以及跨膜结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon相关蛋白或其功能部分、跨膜结构域以及初级T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon相关蛋白或其功能部分，其中所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)能够与cereblon结合化合物结合；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域，其中所述cereblon(或其功能部分)能够结合cereblon结合化合物；其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下，所述第一多肽和所述第二多肽形成异二聚体。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在一个特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在一个特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为泊马度胺(4-氨基-2-[(3RS)-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为沙利度胺((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为来那度胺(3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon相关蛋白或其功能部分；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及原代T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在一个特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及跨膜结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon或其功能部分、跨膜结构域以及原代T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon或其功能部分、跨膜结构域以及包含原代细胞信号传导结构域的多肽；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon相关蛋白或其功能部分、跨膜结构域以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分、跨膜结构域以及包含原代细胞信号传导结构域的多肽；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon或其功能部分、跨膜结构域以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在某些实施方案中，当本文所述的CAR的第一或第二多肽包含原代细胞信号传导结构域时，所述多肽为CD3ζ。在一个特定实施方案中，所述细胞信号传导结构域为人细胞信号传导结构域。
在某些实施方案中，当本文所述的CAR的第一或第二多肽包含原代细胞信号传导结构域时，所述原代细胞信号传导结构域为或包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)原代细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，所述ITAM衍生自以下中的一种或多种：FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD20、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、CD66d、DAP10和/或DAP12。在一个特定实施方案中，所述细胞信号传导结构域为人细胞信号传导结构域。
在某些实施方案中，当本文所述的CAR的第一和/或第二多肽包含共刺激结构域时，所述共刺激结构域衍生自以下中的一种或多种：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、CDS、ICAM-L LFA-1(CD11a/CD18)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、DAP10、DAP12、CD83的配体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合素和/或信号传导淋巴细胞活化分子。在一个特定实施方案中，所述共刺激结构域为人共刺激结构域。
在某些实施方案中，本文所提供的CAR的第一多肽和/或第二多肽的跨膜结构域包含来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一个特定实施方案中，所述跨膜结构域为人跨膜结构域。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域包含受体。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域包含抗体或其结合片段。在一个特定实施方案中，所述抗体的结合片段为单链Fv片段(scFv)。
在某些实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合的抗原为肿瘤细胞上的抗原。在一个特定实施方案中，所述抗原为实体肿瘤细胞的抗原。在另一特定实施方案中，所述抗原为血液癌细胞的抗原。
在另一特定实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合的抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在一个特定实施方案中，TAA或TSA为以下中的一种或多种或其片段：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y(Lewis Y)、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在另一方面中，本文提供编码本文所述的CAR的核酸，即，编码本文所述的CAR的第一多肽的核酸以及编码第二多肽的核酸。在某些实施方案中，本文所述的CAR的第一多肽由第一核酸(多核苷酸)编码，并且本文所述的CAR的第二多肽由第二核酸(多核苷酸)编码。在一个特定实施方案中，本文提供一种编码本文所述的CAR的第一多肽与第二多肽两者的核酸(多核苷酸)。
在某些实施方案中，本文所述的编码CAR多肽的核酸是包含在核酸载体内的。在一个特定实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体。在另一特定实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在某些实施方案中，本文所述的编码CAR多肽的核酸可操作地连接至启动子。在一个特定实施方案中，所述启动子为T细胞特异性启动子、自然杀手(NK)细胞特异性启动子、在T细胞或NK细胞内起作用的诱导型启动子或组成性启动子。
在另一方面中，本文提供包含本文所述的编码CAR的核酸和/或载体的细胞(在本文中称为“CAR细胞”)。所述细胞包括原核(例如细菌)细胞和真核(例如哺乳动物)细胞。在一个特定实施方案中，本文提供一种包含本文所述的CAR的T细胞，例如CD4+、CD+T细胞、T效应细胞或T记忆细胞。在另一特定实施方案中，本文提供一种包含本文所述的CAR的自然杀手细胞。
本文所提供的CAR细胞，例如包含本文所述的一种或多种编码CAR的核酸或表达本文所述的CAR(即，表达本文所述的CAR的第一和第二多肽)的T细胞在与以下各项接触时可被活化：(i)CAR对其具特异性的抗原(换言之，由CAR的抗原结合结构域识别的抗原)以及(ii)cereblon结合化合物。因此，在另一方面中，本文提供将包含和/或表达本文所述的CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)活化的方法，所述方法包括使细胞与结合CAR的抗原结合结构域的抗原接触以及进一步使细胞与cereblon结合化合物接触。在一个特定实施方案中，使所述细胞与所述抗原和所述cereblon结合化合物在体内接触，即，在向受试者施用细胞之后发生接触。在另一特定实施方案中，向受试者施用所述细胞并且给予指定时间以进行定位并且与CAR对其具特异性的抗原接触，随后向受试者施用cereblon结合化合物。
在某些实施方案中，本文所提供的CAR细胞还包含人工细胞死亡多肽，所述人工细胞死亡多肽包含凋亡诱导结构域和二聚化结构域，其中人工细胞死亡多肽为使用二聚化剂可二聚化的，并且其中当人工细胞死亡多肽发生二聚化时，多肽在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个特定实施方案中，所述二聚化剂为雷帕霉素(rapamycin)或雷帕霉素的类似物(雷帕霉素类似物(rapalog))。在另一特定实施方案中，所述二聚化剂为AP1903(利米多赛(rimiducid))。在另一特定实施方案中，所述二聚化剂不为cereblon结合化合物。在一个特定实施方案中，所述二聚化结构域为FK结合结构域或其类似物。在另一特定实施方案中，所述二聚化剂为与所述FK结合结构域结合的抗体。
在另一方面中，本文提供杀死表达由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的方法，其中所述方法包括(i)使所述靶细胞与包含/表达本文所述的CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)接触，以及(ii)使所述表达CAR的细胞与cereblon结合化合物接触，其中在存在所述抗原和所述cereblon结合化合物的情况下表达CAR的细胞变为活化的。在一个特定实施方案中，所述靶细胞为癌细胞，例如血液癌细胞或实体肿瘤细胞。在另一特定实施方案中，所述靶细胞表达以下抗原中的一种或多种或其抗原片段：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGEA1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在另一方面中，本文提供治疗癌症的方法，所述方法包括(i)向受试者(例如人受试者)施用本文所述的包含/表达本文所述的CAR(例如包含本文所述的一种或多种编码CAR的核酸或表达本文所述的CAR)的CAR细胞(例如T细胞或NK细胞)群，其中所述CAR包含对癌抗原(例如TSA或TAA)具特异性的抗原结合结构域；以及(ii)向受试者施用包含cereblon结合化合物的组合物。在一个特定实施方案中，首先向受试者施用所述细胞群，随后在施用细胞群之后的指定时间段，例如施用细胞群之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用包含cereblon结合化合物的组合物。在一个特定实施方案中，由所述CAR结合的所述抗原为4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在一个特定实施方案中，根据本文所述的治疗癌症的方法向受试者施用的cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
可根据本文所述的治疗方法治疗的癌症的非限制性列表包括淋巴瘤、白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、外周原始神经外胚层肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、威尔姆氏瘤(Wilms tumor)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤以及脂肪瘤。示例性淋巴瘤和白血病包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症( macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、T淋巴细胞幼淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、鼻型结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾性T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未指定)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)或非霍奇金淋巴瘤。
在另一方面中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)以及Aiolos(或其功能部分)，其中所述cereblon(或其功能部分)和所述Aiolos(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽在存在所述cereblon结合化合物的情况下发生二聚化，以产生凋亡诱导信号。在一个特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在一个特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)的细胞内结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)。在一个特定实施方案中，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，所述cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有cereblon(或其功能部分)的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)的细胞内结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)。在另一特定实施方案中，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞内结构域。在另一特定实施方案中，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在某些实施方案中，本文所提供的可二聚化人工细胞死亡受体的凋亡诱导结构域为半胱天冬酶。在一个特定实施方案中，所述半胱天冬酶为半胱天冬酶9、半胱天冬酶8或半胱天冬酶3。
在另一方面中，本文提供编码本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的核酸，即，编码本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一多肽的核酸和编码第二多肽的核酸。在某些实施方案中，本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一多肽由第一核酸(多核苷酸)编码，并且本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第二多肽由第二核酸(多核苷酸)编码。在一个特定实施方案中，本文提供一种编码本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一多肽与第二多肽两者的核酸(多核苷酸)。
在某些实施方案中，本文所述的编码可二聚化人工细胞死亡受体的核酸是包含在核酸载体内的。在一个特定实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体。在另一特定实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在某些实施方案中，本文所述的编码可二聚化人工细胞死亡受体的核酸可操作地连接至启动子。在一个特定实施方案中，所述启动子为T细胞特异性启动子、自然杀手(NK)细胞特异性启动子、在T细胞或NK细胞内起作用的诱导型启动子或组成性启动子。
在另一方面中，本文提供包含本文所述的编码可二聚化人工细胞死亡受体的核酸和/或本文所述的载体的细胞(在本文中称为“细胞死亡受体细胞”)。所述细胞包括原核(例如细菌)细胞和真核(例如哺乳动物)细胞。在一个特定实施方案中，本文提供一种包含本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的T细胞，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、T效应细胞或T记忆细胞。在另一特定实施方案中，本文提供一种包含本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的自然杀手细胞。
本文所提供的细胞死亡受体细胞，例如包含本文所述的一种或多种编码可二聚化人工细胞死亡受体的核酸或表达本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体(即，表达本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一和第二多肽)的T细胞或NK细胞当与cereblon结合化合物接触时，例如当与以下物质接触时可被诱导经历凋亡：泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在某些实施方案中，本文所提供的细胞死亡受体细胞还包含CAR，例如第一代CAR、第二代CAR或第三代CAR。在一个特定实施方案中，所述CAR包含两个或更多个细胞外抗原靶向结构域。在另一特定实施方案中，所述CAR包含与白介素结合的细胞外结构域，所述白介素为T细胞活性的负调节物；以及来自白介素受体的细胞内结构域，所述白介素受体为T细胞活性的正调节物。在另一特定实施方案中，通过使包含人工细胞死亡受体和CAR的细胞与例如以下cereblon结合化合物接触而在所述细胞中诱导凋亡：泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
3.1.附图说明
图1：cereblon结合化合物(例如泊马度胺)用于调控CAR T细胞活性的用途。所示为在T细胞上的分离型CAR的示意图(其中第一多肽包含肿瘤抗原结合结构域、共刺激结构域(诸如CD28)以及cereblon，并且第二多肽包含ITAM(诸如CD3ζ)和cereblon相关蛋白(诸如Aiolos))，其在暴露于泊马度胺和肿瘤抗原后被活化，其中泊马度胺通过诱导分离型CAR发生二聚化而调控CAR活性。CRBN：cereblon；POM：泊马度胺；Costim.结构域：共刺激结构域。
4.具体实施方式
可通过使活化需要初级与共刺激信号两者的可调节CAR在此类细胞中表达来减少或消除由表达CAR的治疗性免疫细胞介导的可能导致毒性的中靶但脱肿瘤效应。如本文所公开，此分离是通过使用包含两种人工多肽的CAR来实现，其中(i)第一多肽包含cereblon(或其功能部分)并且第二多肽包含cereblon相关蛋白(或其功能部分)，(ii)活化所需的CAR的组分被划分到两种多肽中，并且(iii)在存在结合cereblon的cereblon结合化合物和cereblon相关蛋白的情况下，CAR被活化。
还可通过使用可二聚化人工细胞死亡受体来减少或消除CAR介导的中靶脱肿瘤效应，这允许在需要时杀死表达此类受体的细胞。如本文所述的此类可二聚化人工细胞死亡受体包含第一多肽，所述第一多肽包含凋亡诱导结构域和二聚化结构域，例如cereblon(或其功能部分)；以及第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域和互补二聚化结构域，例如cereblon相关蛋白(或其功能部分)。可通过使表达此类可二聚化人工细胞死亡受体的细胞与能够使第一和第二多肽发生二聚化并且因此活化凋亡诱导结构域的cereblon结合化合物接触来诱导所述细胞经历凋亡。
4.1.嵌合抗原受体和其用途
4.1.1.嵌合抗原受体构建体
本文提供嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含cereblon或其功能部分；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含cereblon相关蛋白或其功能部分，其中第一多肽或第二多肽或两种多肽包含CAR的其余组分，诸如抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞信号传导结构域和/或共刺激结构域。当CAR的第一和第二多肽在存在cereblon结合化合物的情况下一起在免疫细胞中(例如T淋巴细胞或自然杀手细胞中)表达时，第一多肽的cereblon(或其功能部分)和第二多肽的所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)结合cereblon结合化合物，从而使得形成具有CAR功能的异二聚体。因此，可通过使表达CAR的第一和第二多肽的细胞(例如经过工程化以表达所述CAR的T淋巴细胞)与cereblon结合化合物接触来选择性地控制本文所述的CAR的活性(例如体内活性)。如本文所用，“跨膜结构域”包括穿透型跨膜结构域，其中包含跨膜结构域的蛋白质包含细胞内与细胞外结构域两者；以及膜锚定结构域，其中包含跨膜结构域的蛋白质包含细胞内结构域但不包含细胞外结构域。
在一个特定实施方案中，本文提供一种CAR，所述CAR包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon或其功能部分，其中所述cereblon(或其功能部分)能够与cereblon结合化合物结合；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域，其中所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)能够结合cereblon结合化合物；其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下，所述第一多肽和所述第二多肽形成异二聚体。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon或其功能部分，以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及原代T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon或其功能部分以及跨膜结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon相关蛋白或其功能部分、跨膜结构域以及原代T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon相关蛋白或其功能部分，其中所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)能够与cereblon结合化合物结合；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域，其中所述cereblon(或其功能部分)能够结合cereblon结合化合物；其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下，所述第一多肽和所述第二多肽形成异二聚体。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在一个特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为泊马度胺(4-氨基-2-[(3RS)-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为沙利度胺((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为来那度胺(3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。在另一特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域以及cereblon相关蛋白或其功能部分；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及原代T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在一个特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及跨膜结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon或其功能部分、跨膜结构域以及原代T细胞信号传导结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽和第二多肽包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第一多肽包含共刺激结构域而第二多肽不包含共刺激结构域。在另一特定实施方案中，第二多肽包含共刺激结构域而第一多肽不包含共刺激结构域。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon或其功能部分、跨膜结构域以及包含原代细胞信号传导结构域的多肽；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon相关蛋白或其功能部分、跨膜结构域以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、跨膜结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分以及原代细胞信号传导结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含抗原结合结构域、cereblon相关蛋白或其功能部分、跨膜结构域以及包含原代细胞信号传导结构域的多肽；以及(b)第二多肽，所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含cereblon或其功能部分、跨膜结构域以及共刺激结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。在另一实施方案中，所述cereblon(或其功能部分)与所述cereblon相关蛋白(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，其中所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
Cereblon和Cereblon相关蛋白
本文所提供的CAR包含多肽，所述多肽包含cereblon或其功能部分或cereblon相关蛋白(例如Aiolos或Ikaros)或其任一者的功能部分。如本文所用，术语cereblon或cereblon相关蛋白的“功能部分”定义为cereblon或cereblon相关蛋白中能够结合cereblon结合化合物的部分。在一些实施方案中，cereblon或cereblon相关蛋白的功能部分包含所述cereblon或所述cereblon相关蛋白的整个多肽编码序列。在其他实施方案中，cereblon或cereblon相关蛋白的功能部分分别包含所述cereblon或所述cereblon相关蛋白的截短型式。本领域技术人员将识别各蛋白质中维持功能和/或确保各蛋白质与cereblon结合化合物结合所需的组分。在其他实施方案中，cereblon或cereblon相关蛋白的功能部分分别包含衍生自所述cereblon或所述cereblon相关蛋白的肽序列。本领域技术人员将识别各蛋白质中维持功能和/或确保各蛋白质与cereblon结合化合物结合所需的组分。
在一些实施方案中，本文所提供的CAR包含含有能够结合cereblon结合化合物的cereblon或其功能部分的多肽。在一些实施方案中，本文所提供的CAR包含含有能够结合cereblon结合化合物的cereblon相关蛋白(例如Aiolos或Ikaros)或其功能部分的多肽。在一些实施方案中，本文所提供的CAR包含含有能够结合cereblon结合化合物的Aiolos或其功能部分的多肽。在特定实施方案中，本文所提供的CAR包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含能够结合cereblon结合化合物的cereblon或其功能部分；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含能够结合cereblon结合化合物的cereblon相关蛋白(例如Aiolos或Ikaros)或其功能部分。
Cereblon也称为蛋白质“常染色体隐性非综合征性智力迟钝2A”CRBN、MRT2、MRT2A以及AD-006。例如基因库基因编号：51185下提供了编码cereblon的示例性核酸。例如Uniprot编号：Q96SW2-1下提供了示例性cereblon氨基酸序列。本领域技术人员将容易了解如何使用重组工程化来制备和使用含有cereblon的多肽。
如本文所用，术语“cereblon”是指天然存在的cereblon蛋白或其部分，以及与天然存在的cereblon蛋白或其部分包含至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或序列同一性的多肽，其中所述序列例如在存在本文所述的cereblon结合化合物的情况下可结合cereblon相关蛋白。
如本文所用的“cereblon相关蛋白”是指例如在存在cereblon结合化合物的情况下充当cereblon的底物，例如可与cereblon结合和/或与其相关的蛋白质(或其部分)。参见例如Gandhi等,2014,Br.J.Haematol.164(6):811-821。
在一个特定实施方案中，本文所述的CAR中所用的cereblon相关蛋白为Aiolos。Aiolos也称为“IKAROS家族锌指3”、“锌指蛋白亚家族1A，3”以及ZNFN1A3。基因库基因编号：22806下提供了编码Aiolos的示例性核酸。例如Uniprot编号：Q9UKT9-1下提供了示例性Aiolos氨基酸序列。本领域技术人员将容易了解如何使用重组工程化来制备和使用含有Aiolos的多肽。如本文所用，术语“Aiolos”是指天然存在的Aiolos蛋白或其部分，以及与天然存在的Aiolos蛋白或其部分包含至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或序列同一性的多肽。
在另一特定实施方案中，本文所述的CAR中所用的cereblon相关蛋白为Ikaros。Ikaros也称为“IKAROS家族锌指1”、IKZF1、IK1、LYF1、LyF-1、CVID13、PPP1R92、PRO0758、ZNFN1A1以及Hs.54452。例如基因库基因编号：10320下提供了编码Ikaros的示例性核酸。例如Uniprot编号：Q03267-1下提供了示例性Ikaros氨基酸序列。本领域技术人员将容易了解如何使用重组工程化来制备和使用含有Ikaros的多肽。如本文所用，术语“Ikaros”是指天然存在的Ikaros蛋白或其部分，以及与天然存在的Ikaros蛋白或其部分包含至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或序列同一性的多肽。
抗原结合结构域
本文所提供的CAR的抗原结合结构域可为与抗原结合的任何多肽结构域、基序或序列。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域为受体的抗原结合部分。在一个特定实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域为由肿瘤细胞产生的配体的受体。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域为抗体的抗原结合部分。在一个特定实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域为抗体、抗体链、单链抗体或其抗原结合部分、Fc结构域、糖基磷脂酰肌醇锚定结构域或scFv抗体片段。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的抗原结合结构域为基于肽的大分子抗原结合剂，例如噬菌体展示蛋白。
在某些实施方案中，抗原由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合被限制于与主要组织相容性复合物(MHC)相关的抗原呈递。在某些实施方案中，抗原由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合为非MHC限制性的。
由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合/识别的抗原可为任何所关注的抗原。在一个特定实施方案中，抗原为在细胞(例如肿瘤细胞，诸如实体肿瘤细胞或血液癌症肿瘤细胞)表面表达的抗原。
在一个特定实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合/识别的抗原为肿瘤细胞上的抗原，例如抗原为TSA或TAA。可由本文所述的CAR识别(即，由CAR的抗原结合结构域结合)的示例性肿瘤细胞抗原包括但不限于4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8以及波形蛋白。
在另一特定实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合/识别的抗原为在以下疾病的肿瘤细胞上表达或与其相关的抗原：淋巴瘤/白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤(例如恶性黑素瘤)、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤文氏肉瘤、外周原始神经外胚层肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、威尔姆氏瘤、胶质母细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤、脂肪瘤等。
在另一特定实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合/识别的抗原为在以下疾病的肿瘤细胞上表达或与其相关的抗原：慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴节边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、T淋巴细胞幼淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、鼻型结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾性T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未指定)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
在另一特定实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合/识别的抗原为非肿瘤相关抗原或非肿瘤特异性抗原。在某些实施方案中，抗原与肿瘤的一个方面，例如肿瘤环境有关。举例来说，肿瘤可在肿瘤周围的组织中诱导炎性状态，并且可释放血管生成生长因子、白介素和/或细胞因子，从而促进肿瘤中和肿瘤外周的血管生成。因此，在某些实施方案中，抗原为生长因子、细胞因子或白介素(例如与血管生成或血管发生相关的生长因子、细胞因子或白介素)。此类生长因子、细胞因子以及白介素可包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)以及白介素-8(IL-8)。
在另一特定实施方案中，由本文所述的CAR的抗原结合结构域结合/识别的抗原为由正常组织响应于由肿瘤引起的局部损害所释放的损害相关分子模式分子(DAMP；也称为警报素(alarmin))。本文所述的CAR的抗原结合结构域可结合的示例性DAMP包括但不限于热休克蛋白、染色质相关高迁移率族蛋白1(HMGB1)、S100A8(MRP8，钙粒蛋白A)、S100A9(MRP14，钙粒蛋白B)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸以及硫酸肝素。
跨膜结构域
本文所述的CAR的跨膜结构域可包含本领域中已知充当跨膜结构域(例如本领域技术人员已知在CAR背景下起作用)的任何分子。本文所述的CAR的跨膜结构域可获自或衍生自任何跨膜蛋白的跨膜结构域，并且可包括此类跨膜结构域的全部或一部分。
在一个特定实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的跨膜结构域是获自或衍生自T细胞受体，例如本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的跨膜结构域获自或衍生自T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链。
在特定实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的跨膜结构域获自或衍生自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154、细胞因子受体、白介素受体或生长因子受体。
信号传导结构域
本文所述的CAR的原代细胞信号传导结构域可包含本领域中已知充当细胞信号传导结构域(例如本领域技术人员已知在CAR背景下起作用)的任何分子。在一个特定实施方案中，本文所述的CAR的细胞信号传导结构域包含原代T细胞信号传导结构域。
在一个特定实施方案中，本文所述的CAR的原代细胞信号传导结构域为或包含ZAP-70或其信号转导变体。
在另一特定实施方案中，本文所述的CAR的原代细胞信号传导结构域为或包含ITAM。在一个特定实施方案中，所述ITAM为FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、20CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcERI、CD66d、DAP10或DAP12的ITAM。
共刺激结构域
在某些实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽包含共刺激结构域。本文所述的CAR的一个或多个共刺激结构域可包含本领域中已知充当共刺激结构域(例如本领域技术人员已知在CAR背景下起作用)的任何分子。
在一个特定实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的共刺激结构域获自或衍生自共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列或共刺激可诱导T细胞共刺激(ICOS)多肽序列。
在另一特定实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的共刺激结构域为或包含CD28、4-1BB(CD137)、OX40、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、CDS、ICAM-L LFA-1(CD11a/CD18)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、DAP10、DAP12、CD83的配体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合素或信号传导淋巴细胞活化分子。
其他修饰
在某些实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽还包含二聚化结构域，所述二聚化结构域对调节剂(即，不是cereblon结合化合物的剂)有反应。
在某些实施方案中，本文所述的CAR的第一和/或第二多肽还包含T细胞存活基序。T细胞存活基序可为在由抗原刺激之后促进T淋巴细胞存活的任何多肽序列或基序。在某些实施方案中，T细胞存活率基序为或衍生自CD3、CD28、IL-7受体(IL-7R)的细胞内信号传导结构域、IL-12受体的细胞内信号传导结构域、IL-15受体的细胞内信号传导结构域、IL-21受体的细胞内信号传导结构域或转化生长因子β(TGFβ)受体的细胞内信号传导结构域。
4.1.2.CAR多肽修饰
在某些实施方案中，通过例如酰化、酰胺化、糖基化、甲基化、磷酸化、硫酸化、SUMO化(sumoylation)和/或泛素化(或其他蛋白质修饰)对本文所提供的CAR的第一和/或第二多肽进行修饰。
在某些实施方案中，将本文所提供的CAR的第一和/或第二多肽用能够提供可检测信号的标记(例如放射性同位素或荧光化合物)进行标记。
在某些实施方案中，本文所提供的CAR的第一和/或第二多肽的一条或多条侧链被衍生化，例如用琥珀酸酐或其他羧酸酐对赖氨酰基和氨基端残基的衍生化，或用例如以下物质进行衍生化：亚氨酸酯(诸如皮考啉亚氨酸甲酯)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4戊二酮；以及与乙醛酸的转胺酶催化反应。在某些实施方案中，可通过与碳二亚胺(R—N＝C＝N—R')(诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺)反应对羧基侧基、天冬氨酰基或谷氨酰基进行选择性修饰。
4.1.3.核酸
本文提供编码本文所述的CAR的核酸，即，编码本文所述的CAR的第一多肽的核酸以及编码第二多肽的核酸。在某些实施方案中，本文所述的CAR的第一多肽由第一核酸(多核苷酸)编码，并且本文所述的CAR的第二多肽由第二核酸(多核苷酸)编码。在一个特定实施方案中，本文提供一种编码本文所述的CAR的第一多肽与第二多肽两者的核酸(多核苷酸)。
适用于制备本文所述的CAR的核酸包括DNA、RNA以及核酸类似物。核酸类似物可在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链处被修饰，并且可包括脱氧尿苷对脱氧胸苷的取代、5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷对脱氧胞苷的取代。糖部分的修饰可包括对核糖的2'羟基进行修饰以形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。可对脱氧核糖磷酸酯主链进行修饰以产生吗啉代核酸，其中各碱基部分连接至六员吗啉代环；或肽核酸，其中脱氧磷酸酯主链被假肽主链代替并且四种碱基被保留。参见例如Summerton和Weller(1997)Antisense NucleicAcid Drug Dev.7:187-195；以及Hyrup等(1996)Bioorgan.Med.Chain.4:5-23。此外，可将脱氧磷酸酯主链用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、亚磷酰胺或烷基磷酸三酯主链代替。
在某些实施方案中，本文所述的编码CAR多肽的核酸是包含在核酸载体内的。举例来说，可使用含有编码本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的核酸(多核苷酸)的合成载体、慢病毒或逆转录病毒载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)等来转化所关注的细胞，例如T淋巴细胞。在一个特定实施方案中，包含本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的载体为逆转录病毒载体。在另一特定实施方案中，包含本文所述的CAR的第一和/或第二多肽的载体为慢病毒载体。适合于转化细胞(例如T淋巴细胞)的慢病毒载体包括但不限于美国专利号5,994,136；6,165,782；6,428,953；7,083,981；以及7,250,299中所描述的慢病毒载体。适合于转化细胞(例如T淋巴细胞)的HIV载体包括但不限于美国专利号5,665,577中所描述的载体。
在某些实施方案中，本文所述的编码CAR多肽的核酸可操作地连接至启动子。在一个特定实施方案中，所述启动子为T细胞特异性启动子、自然杀手(NK)细胞特异性启动子、在T细胞或NK细胞内起作用的诱导型启动子或组成性启动子。
4.1.4.细胞
本文所提供的CAR可在适用于CAR表达的细胞中表达，即，细胞被工程化以包含本文所提供的编码CAR的核酸，使得在核酸在细胞中表达后，细胞表达本文所述的CAR。举例来说，本文所述的CAR可在T淋巴细胞或自然杀手细胞中表达。本文所提供的表达本文所述的CAR的细胞称为“CAR细胞”。
在某些实施方案中，本文提供一种已被修饰以表达CAR的细胞(例如T淋巴细胞或自然杀手细胞)，所述CAR包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含能够结合cereblon结合化合物的cereblon或其功能部分；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含能够结合cereblon结合化合物的cereblon相关蛋白(例如Aiolos或Ikaros)或其功能部分。在一个特定实施方案中，第一多肽还包含抗原结合结构域和跨膜结构域(以及任选的共刺激结构域)。在一个特定实施方案中，第二多肽还包含跨膜结构域和原代细胞信号传导结构域(以及任选的共刺激结构域)。
在一个特定实施方案中，本文所提供的CAR在T淋巴细胞中表达。T淋巴细胞可为原初T淋巴细胞或MHC限制性T淋巴细胞。在某些实施方案中，T淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在某些实施方案中，已从肿瘤活组织切片分离T淋巴细胞或已由从肿瘤活组织切片分离的T淋巴细胞扩增T淋巴细胞。在某些其他实施方案中，已从外周血、脐带血或淋巴分离T淋巴细胞或由从外周血、脐带血或淋巴扩增的T淋巴细胞扩增T淋巴细胞。
在一个特定实施方案中，被工程化以包含/表达本文所述的CAR的细胞(例如T淋巴细胞)对要施用所述细胞(例如T淋巴细胞)作为本文所述的治疗方法的一部分的个体来说为自体的。在其他实施方案中，被工程化以包含/表达本文所述的CAR的细胞(例如T淋巴细胞)对要施用所述细胞(例如T淋巴细胞)的个体来说为同种异体的。在使用同种异体细胞(例如T淋巴细胞)来产生CAR细胞的情况下，选择将使个体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的可能性降低的细胞(例如T淋巴细胞)为优选的。举例来说，在某些实施方案中，选择病毒特异性T淋巴细胞来制备CAR T淋巴细胞；预期此类淋巴细胞与任何接受者抗原结合并且因此变得被其活化的天然能力将大大减小。在某些实施方案中，可通过向宿主共施用一种或多种免疫抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、环磷酰胺等)来减少接受者介导的对同种异体细胞(例如T淋巴细胞)的排斥。
在一个实施方案中，从个体获得T淋巴细胞，任选然后进行扩增，然后用编码本文所述的CAR的第一多肽的第一载体和编码本文所述的CAR的第二多肽的第二载体进行转化，并且任选然后进行扩增。可使用例如对各个载体来说独特的选择标记物来选择双转化体。
在另一实施方案中，从个体获得T淋巴细胞，任选然后进行扩增，然后用编码本文所述的CAR的第一多肽和第二多肽的载体进行转化，并且任选然后进行扩增。可使用选择标记物获得含有载体的细胞。
在某些实施方案中，除人工共刺激多肽(在使用共刺激多肽的实施方案中)之外，或除第一多肽和第二多肽之外(在CAR细胞包含将抗原结合信号传导与共刺激信号传导分开的多肽的实施方案中)，用于产生本文所提供的CAR细胞的T淋巴细胞还包含能够形成天然TCR复合物的天然TCR蛋白，例如TCR-α和TCR-β。在某些其他实施方案中，T淋巴细胞中编码TCR-α和TCR-β的天然基因中的任一者或两者被修饰为非功能性的，例如一部分或全部缺失或插入了突变。
在某些实施方案中，可使用本文所述的CAR的一个或多个信号传导结构域来促进包含/表达CAR的细胞(例如T淋巴细胞)的增殖和扩增。举例来说，可使用针对CD3和CD28的抗体(例如附着于珠粒的抗体)对未修饰的T淋巴细胞以及包含含有CD3ζ信号传导结构域和CD28共刺激结构域的多肽的T淋巴细胞进行扩增；参见例如美国专利号5,948,893；6,534,055；6,352,694；6,692,964；6,887,466；以及6,905,681。类似地，可使用针对信号传导基序的抗体来刺激包含本文所述的CAR的细胞(例如T淋巴细胞)的增殖。
在某些实施方案中，本文所述的CAR细胞包含在需要时能够杀死基本上所有CAR细胞的“自杀基因”或“安全开关”。举例来说，在某些实施方案中，本文所述的CAR细胞包含HSV胸苷激酶基因(HSV-TK)，所述HSV胸苷激酶基因在与更昔洛韦(gancyclovir)接触后引起细胞死亡。在另一实施方案中，CAR细胞包含诱导型半胱天冬酶，例如诱导型半胱天冬酶9(诱导性半胱天冬酶9(icaspase9))，例如允许使用特定小分子药物进行二聚化的半胱天冬酶9与人FK506结合蛋白之间的融合蛋白。参见Straathof等,Blood105(11):4247-4254(2005)。
在某些实施方案中，本文所提供的CAR细胞还包含人工细胞死亡多肽，所述人工细胞死亡多肽包含凋亡诱导结构域和二聚化结构域，其中人工细胞死亡多肽为使用二聚化剂可二聚化的，并且其中当人工细胞死亡多肽发生二聚化时，多肽在所述细胞中产生凋亡诱导信号。在一个特定实施方案中，所述二聚化剂为雷帕霉素或雷帕霉素的类似物(雷帕霉素类似物)。在另一特定实施方案中，所述二聚化剂为AP1903(利米多赛)。在另一特定实施方案中，所述二聚化剂不为cereblon结合化合物。在一个特定实施方案中，所述二聚化结构域为FK结合结构域或其类似物。在另一特定实施方案中，所述二聚化剂为与所述FK结合结构域结合的抗体。
4.1.5.使用方法
可使用本文所提供的CAR细胞，例如被修饰以包含/表达本文所述的CAR的T淋巴细胞来治疗具有需要由细胞靶向(例如杀死)的一种或多种细胞类型的个体。
在一个特定实施方案中，本文提供杀死表达由本文所述的CAR的抗原结合结构域所结合的抗原的靶细胞的方法，其中所述方法包括(i)使所述靶细胞与包含/表达本文所述的CAR的细胞(例如T细胞或NK细胞)接触，以及(ii)使所述表达CAR的细胞与cereblon结合化合物接触，其中在存在所述抗原和所述cereblon结合化合物的情况下表达CAR的细胞变为活化的。在一个特定实施方案中，所述靶细胞为癌细胞，例如血液癌细胞或实体肿瘤细胞。在另一特定实施方案中，所述靶细胞表达以下抗原中的一种或多种或其片段：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AIMAGE A1、HLA-A2 NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在另一特定实施方案中，本文提供治疗癌症的方法，所述方法包括(i)向受试者(例如人受试者)施用本文所述的包含/表达本文所述的CAR(例如包含本文所述的一种或多种编码CAR的核酸或表达本文所述的CAR)的CAR细胞(例如T细胞或NK细胞)群，其中所述CAR包含对癌抗原(例如TSA或TAA)具特异性的抗原结合结构域，以及(ii)向受试者施用包含cereblon结合化合物的组合物。在一个特定实施方案中，首先向受试者施用所述细胞群，随后在施用细胞群之后的指定时间段，例如施用细胞群之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用包含cereblon结合化合物的组合物。在一个特定实施方案中，由所述CAR结合的所述抗原为4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在一个特定实施方案中，根据本文所述的治疗癌症的方法向受试者施用的cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
可根据本文所述的治疗方法治疗的癌症的非限制性列表包括淋巴瘤、白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤文氏肉瘤、外周原始神经外胚层肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、威尔姆氏瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤以及脂肪瘤。示例性淋巴瘤和白血病包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、T淋巴细胞幼淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、鼻型结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾性T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未指定)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
可通过本领域技术人员已知对特定疾病或病症具特异性的指示疾病或病症的进展的一种或多种准则来评估本文所述的CAR细胞在治疗疾病或病症时(例如在治疗患有癌症的个体时)的功效。通常，当所述准则中的一种或多种可检测地(例如显著地)从疾病状态值或范围移至或移向正常值或范围时，向患有疾病/病症(例如癌症)的个体施用CAR细胞(例如CAR T淋巴细胞)为有效的。
可在任何药学上可接受的溶液，优选为适合于递送活细胞的溶液，例如盐水溶液(诸如林格氏溶液(Ringer's solution))、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉、淀粉等)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷等中对本文所述的CAR细胞进行配制。优选在添加CAR细胞之前对此类制剂进行灭菌，并且可与诸如以下助剂混合：润滑剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂以及染色剂。适合用于配制本文所述的CAR细胞的药物载体为本领域中已知的并且描述于例如WO 96/05309中。
在某些实施方案中，将本文所述的CAR细胞(例如CAR T淋巴细胞)配制成个别剂量，其中所述个别剂量包含至少、至多或约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个CAR细胞。
在某些实施方案中，将本文所述的CAR细胞(例如CAR T淋巴细胞)配制成用于静脉内、动脉内、肠胃外、肌肉内、皮下、鞘内或眼内施用，或者在特定器官或组织内施用。
Cereblon结合化合物
如本文所用，术语“cereblon结合化合物”是指能够结合cereblon(或其功能部分)并且能够结合cereblon相关蛋白(或其功能部分)(例如Aiolos(或其功能部分)或Ikaros(或其功能部分))的分子(例如小分子或蛋白质/多肽(例如抗体))。在一个特定实施方案中，cereblon结合化合物能够结合cereblon(或其功能部分)与Aiolos(或其功能部分)两者，从而使得cereblon(或其功能部分)与Aiolos(或其功能部分)之间相关，例如形成异二聚体。在另一特定实施方案中，cereblon结合化合物能够结合cereblon(或其功能部分)与Ikaros(或其功能部分)两者，从而使得cereblon(或其功能部分)与Ikaros(或其功能部分)之间缔合，例如形成异二聚体。
在一个特定实施方案中，根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物为泊马度胺(4-氨基-2-[(3RS)-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物为沙利度胺((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)。在另一特定实施方案中，根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物为来那度胺(3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)。在另一特定实施方案中，根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物为3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮。在另一特定实施方案中，根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物为3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。关于与这些化合物有关的公开内容参见例如美国专利申请公布号2014/0162282，该专利申请公布以全文引用的方式并入本文中。
根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物或其对映异构体或对映异构体混合物；或其者药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、共晶体、包合物或多晶型物可作为单个剂量(诸如单次团注或口服片剂或丸剂)；或者随时间推移(诸如随时间推移连续输注或随时间推移的分次团注剂量)递送。
可将根据本文所述的方法使用的cereblon结合化合物配制成用于静脉内、动脉内、肠胃外、肌肉内、皮下、鞘内或眼内施用，或在特定器官或组织内施用。
4.2.人工细胞死亡多肽
4.2.1.细胞死亡多肽构建体
本文还提供可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含第一多肽，所述第一多肽包含cereblon或其功能部分；以及第二多肽，所述第二多肽包含cereblon相关蛋白或其功能部分，当所述可二聚化人工细胞死亡受体在存在cereblon结合化合物的情况下在细胞(例如T淋巴细胞或NK细胞)中表达时可引起细胞死亡。以上章节4.1中详细描述了cereblon、cereblon相关蛋白以及cereblon结合化合物。
在一个特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和Aiolos(或其功能部分)，其中所述cereblon(或其功能部分)和所述Aiolos(或其功能部分)均能够结合cereblon结合化合物，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽在存在所述cereblon结合化合物的情况下发生二聚化以产生凋亡诱导信号。在一个特定实施方案中，所述cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)的细胞内结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)。在一个特定实施方案中，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，所述cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有cereblon(或其功能部分)的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)的细胞内结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)。在另一特定实施方案中，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域和含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞内结构域。在另一特定实施方案中，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
在另一特定实施方案中，本文提供一种可二聚化人工细胞死亡受体，所述可二聚化人工细胞死亡受体包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含凋亡诱导结构域(或其功能部分)和cereblon(或其功能部分)；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有cereblon相关蛋白(或其功能部分)的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有凋亡诱导结构域(或其功能部分)的细胞内结构域。在一个特定实施方案中，cereblon相关蛋白为Aiolos或Ikaros。
细胞死亡多肽的凋亡诱导结构域可为例如当发生二聚化时起始细胞中的凋亡诱导信号的任何蛋白质或其部分。在某些实施方案中，凋亡诱导结构域为发生均二聚化的任何半胱天冬酶。在一个特定实施方案中，凋亡诱导结构域为或包含半胱天冬酶，例如半胱天冬酶9、半胱天冬酶8或半胱天冬酶3(例如人半胱天冬酶9、半胱天冬酶8或半胱天冬酶3)。人半胱天冬酶(包括人半胱天冬酶9、人半胱天冬酶8以及人半胱天冬酶3)的氨基酸序列为本领域中熟知的。举例来说，人半胱天冬酶3已被分配NCBI基因编号：836；人半胱天冬酶8已被分配NCBI基因编号：841；并且人半胱天冬酶9已被分配NCBI基因编号：842。在某些实施方案中，为或包含半胱天冬酶结构域的细胞内结构域与细胞外结构域通过至少部分可充当跨膜结构域的CD8α茎或CD8β茎连接。
4.2.2.核酸
本文提供编码本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的核酸，即，编码本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一多肽的核酸和编码第二多肽的核酸。在某些实施方案中，本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一多肽由第一核酸(多核苷酸)编码，并且本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第二多肽由第二核酸(多核苷酸)编码。在一个特定实施方案中，本文提供一种编码本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一多肽与第二多肽两者的核酸(多核苷酸)。
适用于制备本文所述的人工细胞死亡受体的核酸包括DNA、RNA以及核酸类似物。核酸类似物可在碱基部分、糖部分或磷酸酯主链处被修饰，并且可包括脱氧尿苷对脱氧胸苷的取代、5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2'-脱氧胞苷对脱氧胞苷的取代。糖部分的修饰可包括对核糖的2'羟基进行修饰以形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。可对脱氧核糖磷酸酯主链进行修饰以产生吗啉代核酸，其中各碱基部分连接至六员吗啉代环；或肽核酸，其中脱氧磷酸酯主链被假肽主链代替并且四种碱基被保留。参见例如Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195；以及Hyrup等(1996)Bioorgan.Med.Chain.4:5-23。此外，可将脱氧磷酸酯主链用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、亚磷酰胺或烷基磷酸三酯主链代替。
在某些实施方案中，本文所述的编码人工细胞死亡受体的核酸是包含在核酸载体内的。举例来说，可使用含有编码本文所述的人工细胞死亡受体的第一和/或第二多肽的核酸(多核苷酸)的合成载体、慢病毒或逆转录病毒载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)等来转化所关注的细胞，例如T淋巴细胞。在一个特定实施方案中，包含本文所述的人工细胞死亡受体的第一和/或第二多肽的载体为逆转录病毒载体。在另一特定实施方案中，包含本文所述的人工细胞死亡受体的第一和/或第二多肽的载体为慢病毒载体。适合于转化细胞(例如T淋巴细胞)的慢病毒载体包括但不限于美国专利号5,994,136；6,165,782；6,428,953；7,083,981；以及7,250,299中所描述的慢病毒载体。适合于转化细胞(例如T淋巴细胞)的HIV载体包括但不限于美国专利号5,665,577中所描述的载体。
在某些实施方案中，本文所述的编码人工细胞死亡受体的核酸可操作地连接至启动子。在一个特定实施方案中，所述启动子为T细胞特异性启动子、自然杀手(NK)细胞特异性启动子、在T细胞或NK细胞内起作用的诱导型启动子或组成性启动子。
4.2.3.细胞
本文所提供的人工细胞死亡受体可在适合于表达的细胞(即被工程化以包含本文所提供的编码人工细胞死亡受体的核酸的细胞)中表达，使得在核酸在细胞中表达后，细胞表达本文所述的人工细胞死亡受体。举例来说，本文所述的人工细胞死亡受体可在T淋巴细胞或自然杀手细胞中表达。本文所提供的表达本文所述的人工细胞死亡受体的细胞被称为“细胞死亡受体细胞”。
在一个特定实施方案中，本文所提供的人工细胞死亡受体在T淋巴细胞中表达。T淋巴细胞可为原初T淋巴细胞或MHC限制性T淋巴细胞。在某些实施方案中，T淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在某些实施方案中，已从肿瘤活组织切片分离T淋巴细胞或已由从肿瘤活组织切片分离的T淋巴细胞扩增T淋巴细胞。在某些其他实施方案中，已从外周血、脐带血或淋巴分离T淋巴细胞或由从外周血、脐带血或淋巴扩增的T淋巴细胞扩增T淋巴细胞。
在一个特定实施方案中，本文所述的细胞死亡受体细胞对要施用所述细胞(例如T淋巴细胞)作为本文所述的治疗方法的一部分的个体来说为自体的。在其他实施方案中，本文所述的细胞死亡受体细胞对要施用所述细胞(例如T淋巴细胞)的个体来说为同种异体的。在使用同种异体细胞(例如T淋巴细胞)来制备包含/表达人工细胞死亡受体的细胞的情况下，选择将使个体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的可能性降低的细胞(例如T淋巴细胞)为优选的。参见章节4.1。
在一个实施方案中，从个体获得T淋巴细胞，任选然后进行扩增，然后用编码本文所述的人工细胞死亡受体的第一多肽的第一载体和编码本文所述的人工细胞死亡受体的第二多肽的第二载体进行转化，并且任选然后进行扩增。可使用例如对各个载体来说独特的选择标记物来选择双转化体。
在另一实施方案中，从个体获得T淋巴细胞，任选然后进行扩增，然后用编码本文所述的人工细胞死亡受体的第一多肽和第二多肽的载体进行转化，并且任选然后进行扩增。可使用选择标记物获得含有载体的细胞。
在某些实施方案中，除人工共刺激多肽(在使用共刺激多肽的实施方案中)之外，或除第一多肽和第二多肽之外(在细胞包含将抗原结合信号传导与共刺激信号传导分开的多肽的实施方案中)，用于产生本文所提供的细胞死亡受体细胞的T淋巴细胞还包含能够形成天然TCR复合物的天然TCR蛋白，例如TCR-α和TCR-β。在某些其他实施方案中，T淋巴细胞中编码TCR-α和TCR-β的天然基因中的任一者或两者被修饰为非功能性的，例如一部分或全部缺失或插入了突变。
本文所提供的细胞死亡受体细胞，例如包含本文所述的一种或多种编码可二聚化人工细胞死亡受体的核酸或表达本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体(即，表达本文所述的可二聚化人工细胞死亡受体的第一和第二多肽)的T细胞或NK细胞当与cereblon结合化合物接触时，例如当与以下物质接触时可被诱导经历凋亡：泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
本文所提供的细胞死亡受体细胞可被进一步工程化以表达CAR，例如包含肿瘤特异性抗原结合结构域的CAR。CAR可选自例如第一代CAR(其中仅有的信号传导结构域为CD3ζ)、第二代CAR(其包含来自CD3ζ的信号传导结构域和来自CD28的共刺激结构域)以及第三代CAR(其包含来自CD3ζ的信号传导结构域和来自CD28的共刺激结构域以及诸如4-1BB等另一蛋白质)。在一个特定实施方案中，本文所提供的细胞死亡受体细胞的CAR包含两个或更多个细胞外抗原靶向结构域。在另一特定实施方案中，本文所提供的细胞死亡受体细胞的所述CAR包含与白介素结合的细胞外结构域，所述白介素为T细胞活性的负调节物；以及来自白介素受体的细胞内结构域，所述白介素受体为T细胞活性的正调节物。在另一特定实施方案中，通过使包含人工细胞死亡受体和CAR的细胞与例如以下cereblon结合化合物接触而在所述细胞中诱导凋亡：泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
4.2.4.使用方法
可使用本文所提供的包含本文所提供的人工细胞死亡受体和CAR的细胞(例如T淋巴细胞)来治疗具有本文所述的细胞所需靶向的一种或多种细胞类型(例如所要杀死的一种或多种细胞类型)的个体，其中细胞死亡受体细胞的活性可通过施用cereblon结合化合物来控制。特定而言，细胞死亡受体细胞因其CAR组分而可在治疗中使用，并且因其细胞死亡受体组分而可在需要时被杀死，其中所述杀死是通过使细胞死亡受体细胞与cereblon结合化合物接触来实现。
在一个特定实施方案中，本文提供一种受控地杀死靶细胞的方法，其中所述方法包括(i)使所述靶细胞与包含本文所提供的人工细胞死亡受体和CAR的细胞死亡受体细胞(例如T细胞或NK细胞)接触，以及在适当时，(ii)使所述细胞死亡受体细胞与cereblon结合化合物接触，其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下杀死细胞死亡受体细胞，例如细胞死亡受体细胞经历凋亡。在一个特定实施方案中，所述靶细胞为癌细胞，例如血液癌细胞或实体肿瘤细胞。在另一特定实施方案中，所述靶细胞表达以下抗原中的一种或多种或其片段：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在另一特定实施方案中，本文提供一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括(i)向被诊断为患有癌症的受试者(例如人受试者)施用包含本文所提供的人工细胞死亡受体和CAR的细胞死亡受体细胞(例如T细胞或NK细胞)群，其中所述CAR包含对癌抗原(例如TSA或TAA)具特异性的抗原结合结构域；以及在适当时，(ii)使所述细胞死亡受体细胞与cereblon结合化合物接触，其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下细胞死亡受体细胞经历凋亡。在一个特定实施方案中，首先向受试者施用所述细胞群，随后在施用细胞群之后的指定时间段，例如施用细胞群之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用包含cereblon结合化合物的组合物。在另一特定实施方案中，首先向受试者施用包含cereblon结合化合物的所述组合物，随后在施用包含cereblon结合化合物的所述组合物之后的指定时间段，例如在施用包含cereblon结合化合物的所述组合物之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用所述细胞群。
在一个特定实施方案中，由所述CAR结合的所述抗原为4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
在一个特定实施方案中，根据本文所述的治疗癌症的方法向受试者施用的cereblon结合化合物为泊马度胺、沙利度胺、来那度胺、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮或3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
可根据本文所述的治疗方法治疗的癌症的非限制性列表包括淋巴瘤、白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、鼻咽癌、黑素瘤、皮肤癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、尤文氏肉瘤、外周原始神经外胚层肿瘤、实体生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、威尔姆氏瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、粘液瘤、纤维瘤以及脂肪瘤。示例性淋巴瘤和白血病包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(小淋巴细胞性淋巴瘤)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、T淋巴细胞幼淋巴细胞性白血病、T淋巴细胞大颗粒淋巴细胞性白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T淋巴细胞白血病/淋巴瘤、鼻型结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤、肠病型T淋巴细胞淋巴瘤、肝脾性T淋巴细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T淋巴细胞淋巴瘤(未指定)、间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
5.实施例
此实施例描述了包含嵌合抗原受体(CAR)的经过修饰的T淋巴细胞的产生和使用，其中CAR包含第一多肽，所述第一多肽包含对肿瘤特异性抗原具特异性的抗原结合结构域、共刺激结构域以及cereblon；以及第二多肽，所述第二多肽包含cereblon相关蛋白(例如Aiolos)和CD3ζ基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)原代细胞信号传导结构域。
CAR构建体
使用标准方法制备图1中所展示的CAR。
构建第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码第一多肽(基于肿瘤抗原结合蛋白(例如抗HER2scFv、抗PSCA scFv或抗BCMA scFv)cereblon(CRBN)的CAR，即“第一多肽”)，所述第一多肽含有抗肿瘤抗原抗体的scFv、CD28跨膜(TM)结构域、CD28共刺激结构域以及CRBN。将第一多核苷酸克隆至慢病毒载体中。
构建第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码第二多肽(基于Aiolos的ITAM CAR，即“第二多肽”)，所述第二多肽含有CD28跨膜(TM)结构域、Aiolos以及CD3ζITAM结构域。将第二多核苷酸克隆至慢病毒载体中。
CAR构建体在T细胞中的表达
检验T细胞对上文所描述的CAR构建体的表达。为了分离T细胞，从健康供体血液中分离外周血单核细胞(PBMC)(例如使用Ficoll-Paque PlusTM密度梯度离心(GEHealthcare,Piscataway,NJ)从全血衍生的血沉棕黄层分离PBMC)。从PBMC负选(例如通过根据制造商的说明书使用全T分离试剂盒II(Miltenyi Biotec,Cambridge,MA))全T细胞(Pan T cell)。
将包含编码第一多肽和第二多肽CAR的构建体的质粒引入(例如通过电穿孔)原代T细胞中，然后将电穿孔的T细胞在培养基(例如RPMI-10)中培养过夜。检测CAR的抗原结合结构域的表达，确认T细胞由编码第一多肽的构建体稳定转染。举例来说，在电穿孔后24小时收获T细胞并且染色以检测第一多肽的抗原结合结构域(例如对于抗HER2检测，用HER2-人IgG-Fc嵌合体蛋白染色，随后用与APC缀合的抗人IgG-Fc抗体染色)。通过流式细胞术对染色的细胞进行分析。确认T细胞由编码第二多肽的构建体稳定转染。举例来说，将T细胞在补充有泊马度胺或来那度胺的培养基(例如RPMI-10)中培养过夜。在电穿孔后24小时收获T细胞并且溶解，随后使用可结合第一多肽的抗原结合结构域的剂进行免疫沉淀(例如对于抗HER2检测，使用HER2-人IgG-Fc嵌合体蛋白)。将免疫沉淀物用可检测并且标记第二多肽的Aiolos或CD3ζ结构域的剂(例如抗人Aiolos抗体或抗人CD3ζ抗体)处理。通过ELISA对所标记的免疫沉淀物进行分析并且检测第二多肽，确认T细胞由编码第二多肽的构建体稳定转染。
使用泊马度胺或来那度胺来调控癌症患者中的CAR T细胞活性
在暴露于泊马度胺或来那度胺以及肿瘤抗原后，T细胞上的第一多肽和第二多肽CAR被活化。泊马度胺和来那度胺在人中为良好耐受的。
第一和第二多肽CAR的功能评估
进行T细胞中的第一和第二多肽的功能评估(例如HER2-CAR的功能评估；参见下文)。用第一和第二多肽稳定转染T细胞并且在不存在和存在泊马度胺或来那度胺的情况下使用经过固定的肿瘤-抗原-Fc嵌合体蛋白进行刺激。作为CD28共刺激的阳性对照，产生了另一构建体，所述另一构建体与指定为第一多肽的CAR构建体相同，除了包括CD3ζITAM细胞内结构域并且不包括cereblon。作为阴性对照，进行第一多肽(即，仅转染第二多肽)、第二多肽(即，仅转染第一多肽)以及第一与第二多肽两者(即，第一与第二多肽均不转染)的模拟转染(mock tranfection)。
为评估对T细胞的刺激，在刺激后48小时通过流式细胞术和/或ELISA检验T细胞活化标记物CD69和CD71的表达。CD69和CD71表达的上调指示对T细胞的刺激作用。针对CD69和CD71表达对已用编码第一和第二多肽的构建体以及编码阳性和阴性对照多肽的构建体转染的T细胞进行测试。用编码第一和第二多肽的构建体转染的T细胞中的CD69和CD71表达相对于在阴性对照细胞中观测到的CD69和CD71表达的上调指示对用编码第一和第二多肽的构建体转染的T细胞的刺激作用。
乳腺癌的治疗
个体呈现3期乳腺癌，所述乳腺癌已扩散至至少一个区域性淋巴结。在手术移除癌组织之后，历时30分钟通过静脉输注为个体施用含109至1010个包含第一和第二嵌合受体(诸如上文所描述的第一和第二多肽)的经过修饰的T淋巴细胞的200mL盐水溶液。第一嵌合受体包含与结合HER2的细胞外抗原结合区、跨膜结构域、来自CD28的细胞内共刺激结构域以及cereblon结构域。第二嵌合受体包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白(例如Aiolos)以及衍生自CD3ζ的信号转染结构域。
在施用包含第一和第二嵌合受体的经过修饰的T淋巴细胞之后的指定时间段，例如在施用细胞群之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时为个体施用泊马度胺或来那度胺。
或者，首先为个体施用泊马度胺或来那度胺，随后在施用泊马度胺或来那度胺之后的指定时间段，例如在施用泊马度胺或来那度胺之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用包含第一和第二嵌合受体的所述经过修饰的T淋巴细胞。
在施用后30、60、90以及180天时，针对剩余乳房组织中的乳腺癌以及向其他淋巴结的扩散对个体进行评估。
前列腺癌的治疗
个体呈现T2期前列腺癌，并且未扩散至区域性或其他淋巴结(N0，M0)。组织学等级经确定为G2。总的说来，个体被确定为具有II期前列腺癌。历时30分钟通过静脉输注为个体施用含109至1010个包含第一和第二嵌合受体(诸如上文所描述的第一和第二多肽)的经过修饰的T淋巴细胞的200mL盐水溶液。第一嵌合受体包含与PSCA结合的细胞外抗原结合区、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域CD28以及cereblon结构域。第二嵌合受体包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白(例如Aiolos)以及衍生自CD3ζ的信号转染结构域。
在施用包含第一和第二嵌合受体的经过修饰的T淋巴细胞之后的指定时间段，例如在施用细胞群之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时为个体施用泊马度胺或来那度胺。
或者，首先为个体施用泊马度胺或来那度胺，随后在施用泊马度胺或来那度胺之后的指定时间段，例如在施用泊马度胺或来那度胺之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用包含第一和第二嵌合受体的所述经过修饰的T淋巴细胞。
在施用后30、60以及90天时，针对前列腺癌分期以及向淋巴结的扩散对个体进行再评估，并且对活组织切片检查的前列腺组织进行组织学分析。
多发性骨髓瘤的治疗
个体呈现III期多发性骨髓瘤(根据国际分期系统或杜里-萨蒙系统(Durie-Salmon System))，所述多发性骨髓瘤先前已接受过至少一个疗程的治疗(例如来那度胺或泊马度胺)进行治疗。历时30分钟通过静脉输注为个体施用含108至1010个包含第一和第二嵌合受体(诸如上文所描述的第一和第二多肽)的经过修饰的T淋巴细胞的200mL盐水溶液。第一嵌合受体包含与结合BCMA的细胞外抗原结合区、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域CD28以及cereblon结构域。第二嵌合受体包含跨膜结构域、cereblon相关蛋白(例如Aiolos)以及衍生自CD3ζ的信号转导结构域。
在施用包含第一和第二嵌合受体的经过修饰的T淋巴细胞之后的指定时间段，例如在施用细胞群之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时为个体施用泊马度胺或来那度胺。
或者，首先为个体施用泊马度胺或来那度胺，随后在施用泊马度胺或来那度胺之后的指定时间段，例如在施用泊马度胺或来那度胺之后30分钟、1小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周时施用包含第一和第二嵌合受体的所述经过修饰的T淋巴细胞。
在施用后30、60以及90天时针对多发性骨髓瘤分期对个体进行再评估。
等效物
本发明的范围不受本文所述的特定实施方案限制。实际上，由前述描述，除所描述的那些之外，对本文所提供的主题的各种修改对本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改意图属于随附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物、专利以及专利申请，这些文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

Claims (93)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含抗原结合结构域、跨膜结构域及cereblon或其功能部分，其中所述cereblon或其功能部分能够与cereblon结合化合物结合；及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜结构域、Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分，以及包含初级细胞信号传导结构域的多肽，其中所述Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分能够结合cereblon结合化合物；其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下，所述第一多肽和所述第二多肽形成异二聚体。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含所述抗原结合结构域、所述跨膜结构域以及所述cereblon或其功能部分；并且所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含所述跨膜结构域、所述Aiolos或其功能部分或所述Ikaros或其功能部分以及包含初级T细胞信号传导结构域的所述多肽。
3.如权利要求1所述的CAR，其中所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含所述抗原结合结构域、所述cereblon或其功能部分以及所述跨膜结构域；并且所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含所述Aiolos或其功能部分或所述Ikaros或其功能部分、所述跨膜结构域以及包含初级T细胞信号传导结构域的所述多肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的CAR，其中所述第一多肽另外包含共刺激结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的CAR，其中所述第二多肽另外包含共刺激结构域。
6.如权利要求1-5中任一项所述的CAR，其中所述第一多肽和所述第二多肽包含共刺激结构域。
7.一种CAR，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含抗原结合结构域、跨膜结构域、cereblon或其功能部分以及包含初级细胞信号传导结构域的多肽，其中所述cereblon或其功能部分能够与cereblon结合化合物结合，其中所述第一多肽不包含共刺激结构域；以及(b)第二多肽，所述第二多肽包含跨膜结构域、Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分以及共刺激结构域，其中所述Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分能够结合cereblon结合化合物；其中在存在所述cereblon结合化合物的情况下，所述第一多肽和所述第二多肽形成异二聚体。
8.如权利要求7所述的CAR，其中所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含所述抗原结合结构域、所述跨膜结构域、所述cereblon或其功能部分以及包含初级细胞信号传导结构域的所述多肽；并且所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含所述跨膜结构域、所述Aiolos或其功能部分或所述Ikaros或其功能部分以及所述共刺激结构域。
9.如权利要求7所述的CAR，其中所述第一多肽按从N端到C端的顺序包含所述抗原结合结构域、所述cereblon或其功能部分、所述跨膜结构域以及包含初级细胞信号传导结构域的所述多肽；并且所述第二多肽按从N端到C端的顺序包含所述Aiolos或其功能部分或所述Ikaros或其功能部分、所述跨膜结构域以及所述共刺激结构域。
10.如权利要求1-9中任一项所述的CAR，其中包含初级细胞信号传导结构域的所述多肽为CD3ζ。
11.如权利要求1-9中任一项所述的CAR，其中包含初级细胞信号传导结构域的所述多肽为或包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。
12.如权利要求11所述的CAR，其中包含ITAM的所述多肽为来自以下中的一种或多种的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD20、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcERI、CD66d、DAP10和/或DAP12。
13.如权利要求4-12中任一项所述的CAR，其中所述共刺激结构域为一种或多种包含以下一种或多种功能性信号传导结构域的共刺激结构域：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、CDS、ICAM-L LFA-1(CD11a/CD18)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、DAP10、DAP12、CD83的配体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合素和/或信号传导淋巴细胞活化分子。
14.如权利要求1-13中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域为来自T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。
15.如权利要求1-14中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域为所述抗原的受体。
16.如权利要求1-14中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域为结合所述抗原的抗体或其结合片段。
17.如权利要求17所述的CAR，其中所述抗体为单链Fv片段(scFv)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的CAR，其中所述抗原为肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。
19.如权利要求18所述的CAR，其中所述TAA或TSA为以下中的一种或多种：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AIMAGE A1、HLA-A2NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
20.如权利要求1-19中任一项所述的CAR，其中当所述第一多肽和所述第二多肽在T细胞或NK细胞内表达并且发生异二聚化时，所述CAR传递能够活化T细胞或NK细胞的初级活化信号，或初级活化信号和共刺激信号。
21.一种多核苷酸，其包含编码包含如权利要求1-20中任一项所述的CAR的所述第一多肽和所述第二多肽中的一者或两者的核酸序列。
22.如权利要求21所述的多核苷酸，其包含在多核苷酸载体内。
23.如权利要求22所述的多核苷酸，其中所述载体为逆转录病毒载体。
24.如权利要求22所述的多核苷酸，其中所述载体为慢病毒载体。
25.如权利要求20-23中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接至T细胞特异性启动子或NK细胞特异性启动子。
26.如权利要求20-23中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接至在T细胞或NK细胞内起作用的诱导型启动子。
27.如权利要求20-23中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接至组成性启动子。
28.一种细胞，其包含如权利要求21-27中任一项所述的多核苷酸。
29.如权利要求28所述的细胞，其中所述细胞为细菌细胞。
30.如权利要求28所述的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
31.如权利要求30所述的细胞，其中所述细胞为T细胞。
32.如权利要求31所述的细胞，其中所述T细胞为CD4+T细胞。
33.如权利要求31所述的细胞，其中所述T细胞为CD8+T细胞。
34.如权利要求31所述的细胞，其中所述T细胞为T效应细胞。
35.如权利要求31所述的细胞，其中所述T细胞为T记忆细胞。
36.如权利要求30所述的细胞，其中所述细胞为自然杀手细胞。
37.一种活化T细胞或NK细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞或所述NK细胞与以下各项接触：(a)抗原结合结构域对其具特异性的抗原，以及(b)cereblon结合化合物，其中已对所述T细胞进行修饰以表达如权利要求1-20中任一项所述的CAR的所述第一多肽和所述第二多肽，其中所述cereblon结合化合物使得所述第一多肽和所述第二多肽发生二聚化并且活化所述T细胞或所述NK细胞。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述抗原结合结构域对以下中的一种或多种具特异性：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
39.一种杀死靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如权利要求37或权利要求38所述的活化的T细胞或NK细胞接触。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述靶细胞为癌细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述癌细胞为血液癌细胞。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述癌细胞为实体肿瘤细胞。
43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述靶细胞表达以下中的一种或多种：4-1BB、5T4、8H9、B7-H6、腺癌抗原、α-胎蛋白、B细胞成熟抗原(BCMA)、BAFF、B-淋巴瘤细胞、C242抗原、CA9、癌胚抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、CCR4、CD3、CD4、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD38、CD40、CD44v6、CD44v7/8、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD123、CD152、CD171、CD200、CD221、CE7、CEA、C-MET、CNT0888、CTLA-4、DRS、EpCAM、ErbB2、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EGP2、EGP40、FAP、胎儿AchR、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体-a、叶酸受体1、G250/CAIX、GD2、GD3、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、HLA-AI MAGE A1、HLA-A2 NY-ES0-1、HMW-MAA、人分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、IL-6、IL-13、IL-13受体a2、IL-11受体a、胰岛素样生长因子I受体、整合素a5I31、整合素avI33、κ轻链、L1-CAM、λ轻链、路易斯Y、间皮素、MORAb-009、MS4A1、MUC1、MUC16、粘蛋白CanAg、NCAM、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D配体、NPC-1C、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸，前列腺特异性癌抗原(PSCA)、前列腺癌细胞、PSMA、PSC1、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、sp17、TAG72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-I3、TL1A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGF受体、VEGFR-1、VEGFR2、TEM1、TEM8和/或波形蛋白。
44.一种可二聚化人工细胞死亡受体，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽包含凋亡诱导结构域及cereblon或其功能部分，其中所述cereblon或其功能部分能够与cereblon结合化合物结合，及(b)第二多肽，所述第二多肽包含凋亡诱导结构域及Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分，其中所述Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分能够与cereblon结合化合物结合；其中所述第一多肽和所述第二多肽在存在所述cereblon结合化合物的情况下发生二聚化以产生凋亡诱导信号。
45.如权利要求44所述的细胞死亡受体，其中所述第一多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域和所述cereblon的细胞内结构域。
46.如权利要求44所述的细胞死亡受体，其中所述第一多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有所述cereblon或其功能部分的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域的细胞内结构域。
47.如权利要求44所述的细胞死亡受体，其中所述第二多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域和所述Aiolos或Ikaros的细胞内结构域。
48.如权利要求44所述的细胞死亡受体，其中所述第二多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有所述Aiolos或其功能部分或所述Ikaros或其功能部分的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域的细胞内结构域。
49.如权利要求44所述的细胞死亡受体，其中所述第一多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域和所述cereblon的细胞内结构域；并且所述第二多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域和所述Aiolos或Ikaros的细胞内结构域。
50.如权利要求44所述的细胞死亡受体，其中所述第一多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有所述cereblon或其功能部分的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域的细胞内结构域；并且所述第二多肽为跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含含有所述Aiolos或其功能部分或Ikaros或其功能部分的细胞外结构域、跨膜结构域以及含有所述凋亡诱导结构域的细胞内结构域。
51.如权利要求44-50中任一项所述的细胞死亡受体，其中所述第一多肽和所述第二多肽的所述凋亡诱导结构域为半胱天冬酶。
52.如权利要求51所述的细胞死亡受体，其中所述半胱天冬酶为半胱天冬酶9。
53.如权利要求51所述的细胞死亡受体，其中所述半胱天冬酶为半胱天冬酶8。
54.如权利要求51所述的细胞死亡受体，其中所述半胱天冬酶为半胱天冬酶3。
55.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求44-54中任一项所述的细胞死亡受体的所述第一多肽和所述第二多肽中的一者或两者的核酸序列。
56.如权利要求55所述的多核苷酸，其包含在多核苷酸载体内。
57.如权利要求56所述的多核苷酸，其中所述载体为逆转录病毒载体。
58.如权利要求56所述的多核苷酸，其中所述载体为慢病毒载体。
59.如权利要求55-58中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接至T细胞特异性启动子或NK细胞特异性启动子。
60.如权利要求55-58中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接至在T细胞或NK细胞内起作用的诱导型启动子。
61.如权利要求55-58中任一项所述的多核苷酸，其中所述核酸序列可操作地连接至组成性启动子。
62.一种细胞，其包含如权利要求55-61中任一项所述的多核苷酸。
63.如权利要求62所述的细胞，其中所述细胞为细菌细胞。
64.如权利要求62所述的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
65.如权利要求64所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞为T细胞。
66.如权利要求65所述的细胞，其中所述T细胞为CD4+T细胞。
67.如权利要求65所述的细胞，其中所述T细胞为CD8+T细胞。
68.如权利要求65所述的细胞，其中所述T细胞为T效应细胞。
69.如权利要求65所述的细胞，其中所述T细胞为T记忆细胞。
70.如权利要求64所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞为自然杀手细胞。
71.如权利要求62-70中任一项所述的细胞，其中所述细胞另外包含嵌合抗原受体(CAR)。
72.如权利要求71所述的细胞，其中所述CAR为如权利要求1-20中任一项所述的CAR。
73.如权利要求71所述的细胞，其中所述CAR为第一代CAR。
74.如权利要求71所述的细胞，其中所述CAR为第二代CAR。
75.如权利要求71所述的细胞，其中所述CAR为第三代CAR。
76.如权利要求71所述的细胞，其中所述CAR为包含两个或更多个细胞外抗原靶向结构域的CAR。
77.如权利要求71所述的细胞，其中所述CAR包含与白介素结合的细胞外结构域，所述白介素为T细胞活性的负调节物；以及来自白介素受体的细胞内结构域，所述白介素受体为T细胞活性的正调节物。
78.如权利要求28-36中任一项所述的细胞，其包含含有凋亡诱导结构域和二聚化结构域的人工细胞死亡多肽，其中所述多肽为使用二聚化剂可二聚化的，并且其中当所述多肽发生二聚化时，所述多肽在所述细胞中产生凋亡诱导信号。
79.如权利要求78所述的细胞，其中所述二聚化剂不为cereblon结合化合物。
80.如权利要求79所述的细胞，其中所述二聚化剂为雷帕霉素或雷帕霉素的类似物(雷帕霉素类似物)。
81.如权利要求80所述的细胞，其中所述二聚化剂为AP1903(利米多赛)。
82.如权利要求80或权利要求81所述的细胞，其中所述二聚化结构域为FK结合结构域或其类似物。
83.如权利要求80所述的细胞，其中所述二聚化剂为与所述二聚化结构域结合的抗体。
84.一种杀死细胞的方法，其中所述细胞表达如权利要求44-54中任一项所述的人工细胞死亡受体，所述方法包括使所述细胞与cereblon结合化合物接触。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述细胞为如权利要求62-77中任一项所述的细胞。
86.一种杀死细胞的方法，其中所述细胞为如权利要求78-83中任一项所述的细胞，所述方法包括使所述细胞与二聚化剂接触。
87.如权利要求79所述的方法，其中所述二聚化剂为雷帕霉素或雷帕霉素的类似物(雷帕霉素类似物)。
88.如权利要求80所述的方法，其中所述二聚化剂为AP1903(利米多赛)。
89.如权利要求80或权利要求81所述的细胞，其中所述二聚化结构域为FK结合结构域或其类似物。
90.如权利要求80所述的细胞，其中所述二聚化剂为与所述二聚化结构域结合的抗体。
91.如权利要求1-20中任一项所述的CAR，其中所述cereblon结合化合物为沙利度胺((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)、来那度胺(3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)、泊马度胺(4-氨基-2-[(3RS)-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮；或者3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
92.如权利要求37-43中任一项所述的方法，其中所述cereblon结合化合物为沙利度胺((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)、来那度胺(3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)、泊马度胺(4-氨基-2-[(3RS)-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮；或者3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
93.如权利要求44-54中任一项所述的细胞死亡受体，其中所述cereblon结合化合物为沙利度胺((RS)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮)、来那度胺(3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮)、泊马度胺(4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮)、3-[4-(4-吗啉-4-基甲基-苄氧基)-1-氧代-1,3-二氢-异吲哚-2-基]-哌啶-2,6-二酮；或者3-(4-((4-((4-(2,4-二氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮。
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