CN109954024B - 一种蒲桃果实有效部位及其制备方法和在制备具有降血糖作用的药物或食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物化学技术领域，具体公开了一种蒲桃果实有效部位及其制备方法和在制备具有降血糖作用的药物或食品中的应用。所述的蒲桃果实有效部位的制备方法包含如下步骤：醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用乙醇溶液提取得蒲桃果实醇提物；萃取步骤：将蒲桃果实醇提物用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取部位；ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱，先用溶剂A洗脱除杂；再用溶剂B洗脱，收集溶剂B洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种蒲桃果实有效部位及其制备方法和在制备具有降血糖作用的药物或食品中的应用。
背景技术
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，糖尿病患者体内糖、脂肪、蛋白质的代谢紊乱可导致高血压、肾脏病变、血管病变等一系列慢性并发症，糖尿病已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。国际糖尿病联合会(IDF)最新发布的第8版《糖尿病概览》(Diabetes Atlas)指出，2017 年全球约4.25亿成人患糖尿病，预计到2045年，糖尿病患者可能达到6.29亿，每6秒即有1位糖尿病患者死亡，全球每年死于糖尿病的人数超过了疟疾、肺结核与艾滋病的致死人数总和。我国糖尿病患者已超1亿，成人糖尿病和糖尿病前期患病率分别为11.6％和50.1％，呈高度流行态势。因此，进一步开发治疗糖尿病的药物具有重要的意义。
蒲桃(Syzygium jambos)为桃金娘科(Myrtaceae)蒲桃属常绿乔木，主要分布于亚洲热带，在我国主产于广东、广西、海南等省区，为岭南地区民间习用药材，已收载于《广东省中药材标准》，同时也是上市复方药沙溪凉茶、石岐外感茶以及藏药仁青芒觉的主成分之一，具活血化瘀、清热解毒等功效。据《中华本草》、《中药大辞典》等多部药学专著记载，蒲桃种子可以健脾止泻，主治脾虚泄泻、久痢、消渴症。此外，我国两广地区、马达加斯加等地区民间以蒲桃果实制作药膳，用于安胎和防治糖尿病。但根据现有文献资料显示，目前对蒲桃果实的研究工作不够深入，化学成分和药理活性方面的现代研究多集中于蒲桃的枝、叶、茎三个药用部位，对蒲桃果实特别是降血糖的药效物质基础及作用机制方面的系统研究未见报道，其用于治疗糖尿病这一传统功效的科学内涵至今还不明确。值得我们关注的是，国内外学者对同属植物海南蒲桃(Syzygium cumini(L.)Skeels) 的果实在降血糖药效物质基础和作用机制方面开展了大量的研究工作，研究发现海南蒲桃果实具有显著的降血糖活性，并从中分离得到一系列降血糖活性成分。此外，由著名意大利植物药公司Indena研发的一种降血糖专利药物Madeglucyi 的主要组分即为海南蒲桃籽提取物。因此以桃金娘科植物蒲桃的果实基础，进一步研究其中的降血糖有效成分，对开发降血糖药物具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种蒲桃果实有效部位的制备方法，由该方法制备得到的有效部位具有显著的降血糖作用。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种蒲桃果实有效部位的制备方法，其包含如下步骤：
醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用乙醇溶液提取得蒲桃果实醇提物；
萃取步骤：将蒲桃果实醇提物用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取部位；
ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱，先用溶剂A洗脱除杂；再用溶剂B洗脱，收集溶剂B洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
优选地，醇提步骤中所述的乙醇溶液为体积分数为50～95％的乙醇水溶液。
最优选地，醇提步骤中所述的乙醇溶液为体积分数为75％的乙醇水溶液。
优选地，醇提步骤中干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：5～15mL。
进一步优选地，干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：10～15mL。
最优选地，干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：12mL。
优选地，醇提步骤中所述的提取为加热回流提取，提取次数为1～3次，每次 0.5～1.5h。
最优选地，醇提步骤中所述的提取为加热回流提取，提取次数为2次，每次 1h。
优选地，所述萃取步骤的具体方法为：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取1～3次得萃取液，浓缩干燥萃取液即得所述的乙酸乙酯萃取部位；所述的乙酸乙酯与水的体积用量比为0.3～1：1。
最优选地，所述萃取步骤的具体方法为：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取2次得萃取液，浓缩干燥萃取液即得所述的乙酸乙酯萃取部位；所述的乙酸乙酯与水的体积用量比为1：1。
优选地，ODS柱层析步骤中ODS柱中的ODS填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位的20～40倍。
最优选地，ODS柱层析步骤中ODS柱中的ODS填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位的30倍。
优选地，ODS柱层析步骤中溶剂A为体积分数为7～10％的甲醇水溶液；溶剂B为体积分数为20～25％的甲醇水溶液。
最优选地，ODS柱层析步骤中溶剂A为体积分数为8％的甲醇水溶液；溶剂 B为体积分数为22％的甲醇水溶液。
本发明还提供一种由上述制备方法制备得到的蒲桃果实有效部位。
本发明还提供一种上述蒲桃果实有效部位在制备药物或食品中的应用。
优选地，所述的药物或食品为具有降血糖作用的药物或食品。
优选地，所述的药物或食品为具有保肝护肝作用的药物或食品。
优选地，所述的药物或食品为同时具有降血糖作用和保肝护肝作用的药物或食品。
有益效果：本发明提供了一种全新的蒲桃果实有效部位的制备方法，本发明所述的蒲桃果实有效部位经乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及ODS柱层析等步骤制备得到；该方法中，ODS柱层析步骤为关键的有效成分富集步骤，研究表明在本发明所述的ODS柱层析洗脱条件下得到的蒲桃果实有效部位同时具有显著的降血糖以及保肝护肝作用；对比例实验也表明，在其它ODS柱层析洗脱条件下得不到明显的降血糖或保肝护肝作用的有效部位；更得不到同时具有显著降血糖和保肝护肝作用的有效部位。综上所述，本发明制备得到的蒲桃果实有效部位同时具有显著的降血糖和保肝护肝作用，可以用于制备具有降血糖或/和保肝护肝的药物或食品。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1蒲桃果实有效部位的制备
(1)醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用体积分数为75％的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1h，合并提取液浓缩干燥得蒲桃果实醇提物；所述干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：12mL；
(2)萃取步骤：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位；所述蒲桃果实醇提物与水的用量比为 1g：25mL；每次萃取过程中所述乙酸乙酯与水的体积用量比为1：1；
(3)ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱(ODS柱中ODS 填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积分数为8％的甲醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为22％的甲醇水溶液洗脱；收集体积分数为22％的甲醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
实施例2蒲桃果实有效部位的制备
(1)醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用体积分数为95％的乙醇溶液加热回流提取3次，每次0.5h，合并提取液浓缩干燥得蒲桃果实醇提物；所述干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：10mL；
(2)萃取步骤：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位；所述蒲桃果实醇提物与水的用量比为 1g：20mL；每次萃取过程中所述乙酸乙酯与水的体积用量比为0.6：1；
(3)ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱(ODS柱中ODS 填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位重量的20倍)，先用3倍柱体积的体积分数为7％的甲醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为20％的甲醇水溶液洗脱；收集体积分数为20％的甲醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
实施例3蒲桃果实有效部位的制备
(1)醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用体积分数为50％的乙醇溶液加热回流提取3次，每次0.8h，合并提取液浓缩干燥得蒲桃果实醇提物；所述干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：15mL；
(2)萃取步骤：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位；所述蒲桃果实醇提物与水的用量比为 1g：30mL；每次萃取过程中所述乙酸乙酯与水的体积用量比为0.8：1；
(3)ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱(ODS柱中ODS 填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位重量的40倍)，先用3倍柱体积的体积分数为10％的甲醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为25％的甲醇水溶液洗脱；收集体积分数为25％的甲醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
对比例1蒲桃果实有效部位的制备
(1)醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用体积分数为75％的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1h，合并提取液浓缩干燥得蒲桃果实醇提物；所述干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：12mL；
(2)萃取步骤：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位；所述蒲桃果实醇提物与水的用量比为 1g：25mL；每次萃取过程中所述乙酸乙酯与水的体积用量比为1：1；
(3)ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱(ODS柱中ODS 填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积分数为1％的甲醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为10％的甲醇水溶液洗脱；收集体积分数为10％的甲醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
对比例2蒲桃果实有效部位的制备
(1)醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用体积分数为75％的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1h，合并提取液浓缩干燥得蒲桃果实醇提物；所述干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：12mL；
(2)萃取步骤：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位；所述蒲桃果实醇提物与水的用量比为 1g：25mL；每次萃取过程中所述乙酸乙酯与水的体积用量比为1：1；
(3)ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱(ODS柱中ODS 填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位重量的30倍)，先用3倍柱体积的体积分数为20％的甲醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为35％的甲醇水溶液洗脱；收集体积分数为35％的甲醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位。
对比例3蒲桃果实有效部位的制备
(1)醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用体积分数为75％的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1h，合并提取液浓缩干燥得蒲桃果实醇提物；所述干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：12mL；
(2)萃取步骤：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液浓缩干燥得乙酸乙酯萃取部位；浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位；所述蒲桃果实醇提物与水的用量比为1g：25mL；所述乙酸乙酯与水的体积用量比为1：1。
实施例4蒲桃果实有效部位的降血糖降效果评价
取昆明种雄性小鼠(KM)，SPE级，体质量(20±2)g，购自广东省实验动物中心。适应性喂养1周后，随机抽取10只作为空白组，喂养常规饲料，其余小鼠喂养高糖高脂饲料(饲料中含20％的猪油、20％的蛋黄粉、10％的蔗糖、 2％的胆固醇、1％的胆酸盐和47％常规饲料)。4周后，禁食8h，空白组小鼠给予pH 4.4柠檬酸缓冲液40mg/kg腹腔注射4次，高糖高脂饮食组小鼠给予STZ 溶液(pH 4.4柠檬酸缓冲液配制)40mg/kg腹腔注射4次，每天1次，继续用同样的饲料喂养各组小鼠。STZ注射1周后，小鼠尾静脉取血，测定血糖值，将血糖值在11.1mmol/L以上的定为实验性糖尿病模型小鼠。
取按上述方法造模成功的实验性糖尿病模型小鼠进行随机分组，分为模型组、实验组以及阳性对照药二甲双胍组，同时设正常的小鼠做正常组对照，每组各 10只。实验组进行灌胃给药，给药剂量为200mg/(kg·d)；模型组和正常组灌胃生理盐水；阳性对照药二甲双胍组给予阳性对照药二甲双胍，剂量为200mg/ (kg·d)。每天灌胃给药1次，连续4周。每周末称量体重1次，根据体重调整给药剂量。每周取血测空腹血糖值；抽血前大鼠禁食12h；具体结果见表1。
所述实验组分别给药情况如下：实验组1给予实施例1制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组2给予实施例2制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组3给予实施例3制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组4给予对比例1制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组5给予对比例2制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组6 给予对比例3制备得到的蒲桃果实有效部位。
表1本发明蒲桃果实有效部位对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
表1中模型组和正常组空腹血糖数值差距明显，说明本发明糖尿病小鼠造模成功。
从实验组1～3和二甲双胍组对比发现，实验组1～3在0～2周的小鼠的空腹血糖值与二甲双胍组的血糖值相当。随着用药时间的增加，到第3周和第4周实验组1～3小鼠的空腹血糖值要低于二甲双胍组。这说明经本发明所述的乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及ODS柱层析等步骤富集得到大量的降血糖有效成分，该方法得到的蒲桃果实有效部位其降血糖效果与二甲双胍相当；随着用药时间的增加，所述的蒲桃果实有效部位其降血糖效果更显著，其效果要优于二甲双胍；尤其是在实施例1条件参数下制备得到的蒲桃果实有效部位其降血糖效果更显著。
从实验组1和实验组4、5的小鼠的空腹血糖值可以看出，实验组1的空腹血糖值要远远小于实验组4、5的小鼠的空腹血糖值；实验组4、5的小鼠的空腹血糖值和模型组相比，其血糖值降低得并不明显；而实验组1和实验组4、5中使用的蒲桃果实有效部位的区别在于ODS柱层析过程中洗脱条件不同。这说明，在蒲桃果实有效部位制备过程中，按本发明所述的ODS洗脱条件才能富集得到大量的降血糖成分，而在其它洗脱条件下富集不到明显的降血糖成分。
从实验组1和实验组6的小鼠的空腹血糖值可以看出，实验组1的空腹血糖值要远远小于实验组6的小鼠的空腹血糖值；而实验组1和实验组6中使用的蒲桃果实有效部位的区别在于，实验组6中仅仅使用的蒲桃果实有效部位仅仅经过萃取步骤获得，并未进行后续的ODS柱层析富集有效部位；这说明，进一步按本发明所述的ODS洗脱条件可以富集得到大量的降血糖成分。
实施例5蒲桃果实有效部位的对酒精所致小鼠急性肝损伤的治疗作用
取昆明种雄性小鼠(20±2g)，购自广东省实验动物中心。分为模型组、实验组以及阳性对照药水飞蓟宾组，同时设正常的小鼠做正常组对照，每组各10 只。实验组进行灌胃给药，给药剂量为200mg/(kg·d)；模型组和正常组灌胃生理盐水；阳性对照药水飞蓟宾组给予阳性对照药水飞蓟宾，剂量为200mg/(kg·d)；给药后2h，正常组按体重腹腔注射15ml/kg生理盐水，其余组按15ml/kg灌胃给药56％的食用酒精，每天一次，连续灌胃给药5天。末次给药24小时后采血， 3000r/min离心15min，分离血清，测定小鼠血清中ALT、AST含量，结果见表。
所述实验组分别给药情况如下：实验组1给予实施例1制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组2给予实施例2制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组3给予实施例3制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组4给予对比例1制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组5给予对比例2制备得到的蒲桃果实有效部位；实验组6 给予对比例3制备得到的蒲桃果实有效部位。
表2.蒲桃果实有效部位的对酒精所致小鼠急性肝损伤治疗效果
由表2实验数据可以看出，与正常组比较，模型组的ALT、AST的含量显著升高，说明肝损伤小鼠造模成功。
从实验组1～3和阳性对照药水飞蓟宾组对比发现，实验组1～3对肝损伤小鼠血液中的ALT、AST的含量和阳性对照药水飞蓟宾组的相当，甚至低于阳性对照药水飞蓟宾组；这说明经本发明所述的乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及ODS柱层析等步骤富集得到大量的保肝护肝有效成分，该方法得到的蒲桃果实有效部位其保肝护肝效果相当于甚至优于水飞蓟宾；尤其是在实施例1条件参数下制备得到的蒲桃果实有效部位，其保肝护肝作用最强，优于阳性对照药水飞蓟宾。
从实验组1和实验组4、5的小鼠对肝损伤小鼠血液中的ALT、AST的含量可以看出实验组1小鼠血液中的ALT、AST的含量要远远小于实验组4、5的小鼠血液中的ALT、AST的含量；实验组4、5的小鼠的血液中的ALT、AST的含量和模型组相比，其降低得并不明显；而实验组1和实验组4、5中使用的蒲桃果实有效部位的区别在于ODS柱层析过程中洗脱条件不同。这说明，在蒲桃果实有效部位制备过程中，按本发明所述的ODS洗脱条件才能富集得到大量的保肝护肝成分，而在其它洗脱条件下富集不到明显的保肝护肝成分。
从实验组1和实验组6的小鼠对肝损伤小鼠血液中的ALT、AST的含量可以看出实验组1小鼠血液中的ALT、AST的含量要远远小于实验组6的小鼠血液中的ALT、AST的含量；而实验组1和实验组6中使用的蒲桃果实有效部位的区别在于，实验组6中仅仅使用的蒲桃果实有效部位仅仅经过萃取步骤获得，并未进行后续的ODS柱层析富集有效部位。这说明，进一步按本发明所述的ODS 洗脱条件可以富集得到大量的保肝护肝成分。
Claims (13)
1.一种蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
醇提步骤：取干燥的蒲桃果实，用乙醇溶液提取得蒲桃果实醇提物；
萃取步骤：将蒲桃果实醇提物用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯萃取部位；
ODS柱层析步骤：将乙酸乙酯萃取部位上ODS层析柱，先用溶剂A洗脱除杂；再用溶剂B洗脱，收集溶剂B洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的蒲桃果实有效部位；
醇提步骤中所述的乙醇溶液为体积分数为50～95％的乙醇水溶液；
ODS柱层析步骤中溶剂A为体积分数为7～10％的甲醇水溶液；溶剂B为体积分数为20～25％的甲醇水溶液。
2.根据权利要求1所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，醇提步骤中所述的乙醇溶液为体积分数为75％的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，醇提步骤中干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：5～15mL。
4.根据权利要求3所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，干燥的蒲桃果实与乙醇溶液的用量比为1g：10～15mL。
5.根据权利要求1所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，醇提步骤中所述的提取为加热回流提取，提取次数为1～3次，每次0.5～1.5h。
6.根据权利要求5所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，醇提步骤中所述的提取为加热回流提取，提取次数为2次，每次1h。
7.根据权利要求1所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，所述萃取步骤的具体方法为：将蒲桃果实醇提物加水混悬，然后用乙酸乙酯萃取1～3次得萃取液，浓缩干燥萃取液即得所述的乙酸乙酯萃取部位；所述的乙酸乙酯与水的体积用量比为0.3～1：1。
8.根据权利要求1所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，ODS柱层析步骤中ODS柱中的ODS填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位的20～40倍。
9.根据权利要求8所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，ODS柱层析步骤中ODS柱中的ODS填料的重量用量为乙酸乙酯萃取部位的30倍。
10.根据权利要求1所述的蒲桃果实有效部位的制备方法，其特征在于，ODS柱层析步骤中溶剂A为体积分数为8％的甲醇水溶液；溶剂B为体积分数为22％的甲醇水溶液。
11.权利要求1～10任一项所述的制备方法制备得到的蒲桃果实有效部位。
12.权利要求11所述的蒲桃果实有效部位在制备药物或食品中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的药物或食品为具有降血糖作用、保肝护肝作用或同时具有降血糖作用和保肝护肝作用的药物或食品。
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