CN109937034A

CN109937034A - 阿柏西普制剂及其用途

Info

Publication number: CN109937034A
Application number: CN201780069882.9A
Authority: CN
Inventors: 布鲁斯·A·克尔温; 朱莉·A·弗洛伊德; 艾利森·J·吉莱斯皮; 克里斯蒂娜·C·西斯卡
Original assignee: Jishi Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jishi Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: JP7465309B2; US11135266B2; EP3541365A1; CN116327963A; US20190298801A1; CA3043487A1; JP7116059B2; CN109937034B; JP2022153566A; JP2020500195A; US20220016210A1; WO2018094316A1

Abstract

公开了包含阿柏西普的眼科制剂，其适用于通过玻璃体内或外用给药治疗眼部病症或疾病的方法。

Description

阿柏西普制剂及其用途

本申请要求于2016年11月21日在美国专利商标局提交的美国临时专利申请序列号62/497,584的优先权。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2017年11月10日，命名为JUST0271_SL.txt，并且大小为4,093字节。

背景技术

1.技术领域

本发明涉及适用于眼部给药的阿柏西普融合蛋白的药物制剂。

2.相关技术的讨论

阿柏西普是重组融合蛋白，其包括两种主要组分：来自人VEGF受体1和2的细胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分，其融合至人IgG1的Fc部分。(参考，Papadopoulos等人，Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokineticproperties,WO 00/75319Al；US 7070959B2)。结构上，阿柏西普是二聚体糖蛋白，具有的蛋白质分子量为约96.9千道尔顿(kDa)。它含有约15％的糖基化以得到总分子量为约115kDa。由一级序列预测的每条多肽链上的所有五个推定的N-糖基化位点可以被糖(carbohydrate)占据并且表现出一定程度的链异质性，包括末端唾液酸残基的异质性。

美国食品和药物管理局(FDA)于2011年11月批准了阿柏西普上市，并且欧洲药品管理局(EMA)于2012年11月批准。

以商品名为(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)的阿柏西普用作眼科药剂治疗眼部病症或疾病，例如视网膜中央静脉阻塞(CRVO)后的黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿)年龄相关性黄斑变性(AMD)、由于近视脉络膜新生血管形成引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病视网膜病变(DR)和新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)。

商标名为(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)的Ziv-阿柏西普被开发为用于治疗转移性结肠直肠癌的注射剂。

关于阿柏西普的已知制剂包括Furfine等人描述的那些(Furfine等人，VEGFantagonist formulations for intravitreal administration,US8092803；US9580489；EP 2364691B1；WO2007149334A2)和Dix等人描述的那些(Dix等人，VEGF AntagonistFormulations,WO2006104852A2；US8921316；US9636400)。

仍然需要具有增强的稳定性的阿柏西普制剂，本发明提供了这样的制剂。

发明内容

本发明涉及阿柏西普的眼科制剂，该制剂包括：(a)阿柏西普，浓度为5-100mg/mL；(b)浓度为5-50mM的缓冲剂(缓冲液)；(c)非离子表面活性剂；(d)选自由多元醇和氨基酸组成的组的张度调节剂，或在一些实施方式中，是多元醇和氨基酸两者，该制剂具有约300mOsm/kg(即300±50mOsm/kg)的最终重量摩尔渗透压浓度。本发明的眼科制剂中氯阴离子(Cl^-)的浓度小于约10mM，并且在一些实施方式中小于约5mM或小于约1mM；并且制剂的pH为约pH5.0至约pH6.5。本发明的眼科制剂适用于玻璃体内或外用给药。本发明的含阿柏西普的眼科制剂具有稳定性特征，例如随时间显著降低的聚集，和视觉特征，与其他已知的阿柏西普眼科制剂，例如含有添加的氯化钠的制剂相比，有利或更有利。如果需要，本发明的制剂还可以冻干和重构。

本发明的眼科制剂可用作治疗眼部病症或疾病的方法中的药用眼科药剂，例如视网膜静脉阻塞(RVO)后的黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿)年龄相关性黄斑变性(AMD)、由于近视脉络膜新生血管形成引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病视网膜病变(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。本发明的眼科制剂的给药可以通过玻璃体内注射，或者在一些情况下，通过外用给药眼部，如医学上合适。本发明的制剂可用于治疗这些眼部病症或疾病，并用于制备治疗这些眼部病症和疾病的药物。

前述发明内容并非旨在限定本发明的每个方面，并且在其他章节诸如具体实施方式中描述了附加的方面。整个文档旨在作为统一的公开相互关联，并且应当理解的是，即使特征的组合未在该文档的同一句子、段落或章节中找到，本文描述的特征的所有组合都是预期的。

除了前述内容，作为附加的方面，本发明包括本发明的所有实施方式，其范围以任何方式都比上述具体段落所限定的变型更窄。例如，被描述为属的本发明的某些方面，并且应当理解，属的每个成员单独地是本发明的一方面。此外，描述为属或选择属的成员的方面应理解为包括该属的两个或更多个成员的组合。尽管申请人发明了本文所述的本发明的全部范围，但申请人并不打算要求其他人的现有技术工作中描述的主题。因此，如果专利局或其他实体或个人提请申请人注意权利要求范围内的法定现有技术，申请人保留根据适用的专利法行使修改权的权利以重新定义该权利要求的这一主题，以明确地将这种法定现有技术或法定现有技术的明显变型排除在该权利要求的范围外。由这些修改的权利要求限定的本发明的变型也旨在作为本发明的各方面。

附图说明

图1示出了通过小体积HIAC分析进行的亚可见颗粒(不溶性微粒)分析的结果。10μm颗粒结果示出了所有样品都具有较低水平的颗粒，除制剂7之外，该制剂在储存期间表现出颗粒水平增加。

图2示出了通过小体积HIAC分析进行的亚可见颗粒分析的结果。25μm结果表明所有样品具有较低水平或不可检测水平的颗粒。表示三次重复测量的标准偏差的误差线大于观察到的颗粒数。

图3示出了在4℃下储存的样品的尺寸排阻高效液相色谱的结果。除制剂8外，所有制剂都示出了相似的HMW形成率。

图4示出了在30℃下储存的样品的尺寸排阻高效液相色谱的结果。除制剂8外，所有制剂都示出了相似的HMW形成率。

图5示出了对于4℃储存条件的还原CE-SDS分析的结果。在7周的测试期间，所有制剂都表现出相似水平的纯度百分比。

图6示出了对于30℃储存条件的还原CE-SDS分析的结果。除制剂7外，所有制剂在30℃储存期间表现出相似水平的纯度百分比。制剂7表现出纯度百分比随时间持续降低。

图7示出了用于评估4℃储存期间阿柏西普电荷分布的cIEF分析的结果。所有制剂都表现出随时间相似水平的碱性物质百分比。

图8示出了用于评估4℃储存期间阿柏西普电荷分布的cIEF分析的结果。所有制剂都表现出随时间相似水平的酸性物质百分比。

图9示出了用于评估30℃储存期间阿柏西普电荷分布的cIEF分析的结果。所有制剂都表现出随时间相似水平的碱性物质百分比。

图10示出了用于评估30℃储存期间阿柏西普电荷分布的cIEF分析的结果。所有制剂都表现出随时间相似水平的酸性物质百分比。

图11示出了如通过SE-HPLC测量的在30℃下储存的各种阿柏西普制剂中的HMW形成。(关于制剂缩写，参考表4)。

图12示出了在30℃下重组产生的阿柏西普相比于商购(aflibercept；Regeneron Pharmaceuticals，Inc.，Tarrytown，NY)的稳定性比较结果。重组产生的阿柏西普由Just Biotherapeutics(Seattle，WA)制备，并且使用10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH5.2 0.1％(w/v)泊洛沙姆(poloxamer)制剂(A52ProP1-0.1)配制。

图13示出了与对照(减去任何添加的氯化钠)相比，100mM氯化钠(“盐”)对于重组产生的阿柏西普在10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2制剂(A52ProPl-0.1)中，在30℃下储存的稳定性的影响。

具体实施方式

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应解释为限制所描述的主题。

定义

除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。因此，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”，“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括多个细胞的群体。

本发明涉及适用于向患者玻璃体内或外用给药的水性眼科制剂，该制剂包括在商业上也称为的阿柏西普。阿柏西普是具有阿柏西普氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两条相同融合多肽链的组装体，通常通过重组DNA表达技术最方便地产生。阿柏西普氨基酸序列如下：

预期在SEQ ID NO：1的下述氨基酸位置处的半胱氨酸残基之间存在二硫桥键(上述SEQ ID NO：1中示出的加下划线的半胱氨酸(C)残基)：

30-79(链内)

124-185(链内)

211-211(链间)

214-214(链间)

246-306(链内)

352-410(链内)。

阿柏西普的两条融合多肽链通过SEQ ID NO：1的氨基酸位置211和214处的二硫键共价连接。融合蛋白通常是糖基化的，其中，N-聚糖在SEQ ID NO：1的位置36、68、123、196和282处的天冬酰胺残基(上述SEQ ID NO：1中所示的粗体/斜体天冬酰胺(N)残基)处共价连接。本发明范围内的“阿柏西普”还包括以下实施方式，其中一个、两个或无融合多肽链具有带额外羧基末端赖氨酸(K)残基的氨基酸序列SEQ ID NO：1。本发明的眼科制剂中阿柏西普的浓度为约20mg/mL至约80mg/mL，或约30mg/mL至约50mg/mL；例如，约40mg/mL的浓度在制剂的许多实施方式中是有用的。

“稳定”制剂是指在含有阿柏西普的药物和/或药物产品的加工(例如，超滤、渗滤、其他过滤步骤、小瓶填充)、运输和/或储存时，其中的蛋白质基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。总之，制剂中蛋白质的物理、化学和生物稳定性体现了蛋白质制剂的“稳定性”，例如，阿柏西普制剂，其特定于配制的药物产品(DP)的储存条件。例如，预计在零下温度下储存的药物产品在化学、物理或生物活性方面没有显著变化，而预计在40℃储存的药物产品在物理、化学和生物活性方面会发生变化，变化程度取决于药物或药物产品的储存时间。蛋白质制剂的配置也可以影响变化速度。例如，聚集体形成受蛋白质浓度的高度影响，随着更高的蛋白质浓度观察到更高的聚集速度。还已知赋形剂影响药物产品的稳定性，例如，储存期间添加盐增加某些蛋白质的聚集速度，而已知其他赋形剂诸如蔗糖降低聚集速度。不稳定性还受pH的极大影响，取决于修饰类型和pH依赖性，导致较高和较低的降解速度。

用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的，并且在例如Wang,W.(1999),Instability,stabilization and formulation of liquid proteinpharmaceuticals,Int J Pharm 185:129-188中进行了综述。可以在选定的温度选定的时间段测量稳定性。为了快速筛选，例如，可以将制剂在40℃保存2周至1个月，此时测量稳定性。如果制剂需要在2-8℃储存，通常该制剂应在30℃稳定至少1个月，或在40℃稳定至少一周，和/或在2-8℃稳定至少两年。

如果在颜色和/或透明度的目视检查中，或如通过UV光散射或通过尺寸排阻高效液相色谱或其他合适的方法测量显示出二级和/或三级结构(即内在结构)、或聚集和/或沉淀和/或变性的最小变化迹象，则蛋白质在药物制剂中“保持其物理稳定性”。蛋白质的物理不稳定性，即物理稳定性的丧失，可以是由寡聚化产生二聚体和更高级的聚集、亚可见的和可见的颗粒形成以及沉淀造成的。取决于目标降解物类型，可以使用不同的技术确定物理降解的程度。二聚体和更高级的可溶聚集体可以使用尺寸排阻色谱法定量，而亚可见颗粒可使用光散射、不透光度或其他合适的技术定量。在一种实施方式中，根据具有较低百分比的降解(例如，片段化)和/或聚集蛋白质的溶液中阿柏西普单体蛋白质的百分比确定蛋白质的稳定性。“阿柏西普单体”是指具有阿柏西普氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两个多肽链的组装体，在任何多肽链上具有或不具有额外的羧基末端赖氨酸残基。在“阿柏西普单体”中，如上所述，两个阿柏西普多肽链通过序列的免疫球蛋白Fc结构域部分的缔合和二硫键交联来组装。例如，包含稳定蛋白质的水性制剂可以包括(如占总蛋白质的百分比)至少95％的阿柏西普单体，至少96％的阿柏西普单体，至少97％的阿柏西普单体，至少98％的阿柏西普单体，或者至少99％的阿柏西普单体蛋白质。或者，本发明的水性制剂可以包括(如占总蛋白质的百分比)约5％的聚集体和/或降解的阿柏西普蛋白质。

如果在给定时间化学稳定性使得不产生或破坏导致蛋白质组分例如阿柏西普的一级结构改变的共价键，则蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。一级结构的改变可导致蛋白质的二级和/或三级和/或四级结构的改变，并且可以导致聚集体的形成或已形成的聚集体的逆转。典型的化学改性可以包括异构化、脱酰胺、N-末端环化、骨架水解、甲硫氨酸氧化、色氨酸氧化、组氨酸氧化、β-消除、二硫化物形成、二硫化物杂化、二硫化物裂解和导致一级结构变化(包括D-氨基酸形成)的其他改变。化学不稳定性，即化学稳定性的丧失，可以通过各种技术来确定，包括离子交换色谱、毛细管等电聚焦、肽消化分析和多种类型的质谱技术。可以通过检测和定量蛋白质的化学改变的形式来评估化学稳定性。化学改变可以涉及尺寸修饰(例如剪切(clipping))，其可使用例如尺寸排阻色谱、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如由于脱酰胺作用而发生)，其可以通过基于电荷的方法来评估，诸如，但不限于离子交换色谱、毛细管等电聚焦或肽图谱分析。

物理和/或化学稳定性的丧失可能导致生物活性的变化，如目标生物活性的增加或减少，这取决于改性和被改性的蛋白质。如果蛋白质在给定时间的生物活性在制备药物制剂时所显示的生物活性的约30％以内，则蛋白质在药物制剂中“保留其生物活性”。如果活性小于其起始值的70％，则认为活性降低。生物测定可以包括基于体内和体外的测定，诸如，配体结合、效力、细胞增殖或其生物药物活性的其他替代测量。例如，可以使用体外配体结合测定来评估阿柏西普的生物活性，诸如通过ELISA或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖测定的与PGF结合的抗胎盘生长因子的抑制。

用于本发明的阿柏西普通常通过重组表达技术产生。术语“重组”表示材料(例如核酸或多肽)通过人为干预已经人工地或合成地(即非天然地)改变。改变可以在其自然环境或状态内的材料上进行或者从其自然环境或状态中移除的材料上进行。例如，“重组核酸”是通过重组核酸制备的，例如在克隆期间、DNA改组或其他熟知的分子生物学过程期间。这种分子生物学过程的实例见于Maniatis等人，Molecular Cloning.A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982)。“重组DNA分子”由通过这种分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成。如本文所用的术语“重组蛋白质”或“重组多肽”指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。可用于表达阿柏西普融合蛋白质的重组DNA分子描述于例如Papadopoulos等人，Modified Chimeric Polypeptides with Improved PharmacokineticProperties，US 7,070,959B2和WO 00/75319A1)。

术语“天然存在的”，当其在本说明书中与生物材料诸如多肽、核酸、宿主细胞等一起出现时，指天然存在的物质。

术语“控制序列”或“控制信号”指在特定宿主细胞中可以影响与其连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。这种控制序列的性质可以取决于宿主有机体。在具体实施方式中，用于原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。用于真核生物的控制序列可以包括启动子，启动子包含一个或多个识别位点用于转录因子、转录增强子序列或元件、多腺苷酸化位点和转录终止序列。控制序列可包括前导序列和/或融合伴侣(配偶，partner)序列。启动子和增强子由短DNA阵列组成，其与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatis等人，Science 236：1237(1987))。已经从多种真核来源(包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因)分离了启动子和增强子元件(类似的控制元件，即启动子，也见于原核生物中)。具体启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他则在有限的细胞类型子集中起作用(参见Voss等人，Trends Biochem.Sci.,11:287(1986)和Maniatis等人，Science 236:1237(1987))。

“启动子”是DNA的一个区域，其包括一个位点，RNA聚合酶结合至该位点以通过一个或多个下游结构基因启动信使RNA的转录。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链且上游(朝向有义链的5'区域)。启动子的长度通常为约100-1000bp。

“增强子”是DNA的短(50-1500bp)区域，其可以与一种或多种激活蛋白质(转录因子)结合以激活基因的转录。

如本文所用的术语“以可操作组合”、“以可操作顺序”和“可操作地连接”指核酸序列的连接使得产生的核酸分子能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成。该术语还指氨基酸序列的连接使得产生了功能性蛋白质。例如，与蛋白质编码序列“可操作地连接”的载体中的控制序列连接到其上，使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。

“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括通过肽键共价连接的两个或更多个氨基酸的分子链。这些术语不指产品的特定长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，蛋白质片段、类似物、突变或变体蛋白质、融合蛋白质等包括在多肽的含义内。该术语还包括下述分子，在该分子中包括如可以使用已知的蛋白质工程技术重组表达的一个或多个氨基酸类似物或非标准或非天然氨基酸。另外，融合蛋白可以如本文所述通过熟知的有机化学技术衍生。

多肽(例如，免疫球蛋白或抗体)的“变体”包含氨基酸序列，其中，相对于另一多肽序列该氨基酸序列插入、缺失和/或取代了一个或多个氨基酸残基。变体包括融合蛋白质。

术语“融合蛋白”，例如，对于阿柏西普，表示该蛋白质包括衍生自超过一种亲本蛋白质或多肽的多肽组分。通常，融合蛋白由“融合基因”表达，其中，编码来自一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码来自不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列附加在框架内并且任选地通过接头分开。然后融合基因可以由重组宿主细胞表达为单一蛋白质。

“分泌的”蛋白质指由于分泌的信号肽序列而能够被导向内质网(ER)、分泌囊泡或细胞外空间的那些蛋白质，以及释放到细胞外空间而不必包含信号序列的那些蛋白质。如果分泌的蛋白质释放到细胞外空间，分泌的蛋白质可以经历细胞外加工以产生“成熟”蛋白质。向细胞外空间的释放可以通过许多机制发生，包括胞吐作用和蛋白水解裂解。在一些其他实施方式中，目标阿柏西普融合蛋白可以由宿主细胞合成为分泌蛋白质，然后可以从细胞外空间和/或培养基中进一步纯化。

如本文所用，当提到在宿主细胞中通过重组DNA技术产生的蛋白质时，“可溶的”是蛋白质存在于水溶液中；如果蛋白质含有双精氨酸信号氨基酸序列，可溶性蛋白质被输出到革兰氏阴性细菌宿主的周质空间，或被能够分泌的真核宿主细胞或者被具有适当基因(例如，kil基因)的细菌宿主分泌到培养基中。因此，可溶性蛋白质是在宿主细胞内的包涵体中未发现的蛋白质。或者，取决于上下文，可溶性蛋白质是未被发现整合在细胞膜中的蛋白质，或者在体外，是溶解的或者是能够在生理条件下溶解在缓冲剂水溶液中而不形成显著量的不溶性聚集体的蛋白质(即，形成的聚集体小于总蛋白质的10％，并且通常小于约5％)，当在生理条件下，在没有其他蛋白质的情况下悬浮于目标缓冲剂水溶液中时，这种缓冲剂中不含离子洗涤剂或离液剂，诸如，十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、盐酸胍或高氯酸锂。相反，不溶性蛋白质是以变性形式存在于宿主细胞中细胞质颗粒(称为包涵体)内的蛋白质，或者再次取决于上下文，不溶性蛋白质是存在于细胞膜中的蛋白质，细胞膜包括但不限于细胞质膜、线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜等，或在生理条件下的体外缓冲剂水溶液中形成显著量的不溶性聚集体(即，形成的聚集体等于或大于总蛋白质的约10％)，当在生理条件下，在没有其它蛋白质(在生理学上相容的温度下)的情况下悬浮于目标缓冲剂水溶液中时，这种缓冲剂不含离子洗涤剂或离液剂，诸如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、盐酸胍或高氯酸锂。

术语“多核苷酸”或“核酸”包括含有两个或更多个核苷酸残基的单链和双链核苷酸聚合物两者。构成多核苷酸的核苷酸残基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，诸如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰诸如2',3'-二脱氧核糖和核苷酸间键修饰，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。

术语“寡核苷酸”指包含200个或更少核苷酸残基的多核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为10至60个碱基。在其他实施方式中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如，用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记，用于检测测定。寡核苷酸可以用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。

如本文中可互换使用的“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”或“核酸序列”是多核苷酸中核苷酸残基的一级序列，包括寡核苷酸、DNA和RNA、核酸或代表核苷酸残基一级序列的字符串，这取决于上下文。根据任何指定的多核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补的多核苷酸序列。包括基因组或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表有义链或反义链。除非另有说明，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列的左手末端是5'末端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'添加方向称为转录方向；在具有与RNA转录物相同序列(RNA转录物的5'端到5'端)的DNA链上的序列区域被称为“上游序列”；在具有与RNA转录物相同序列(RNA转录物的3'末端的3'末端)的DNA链上的序列区域被称为“下游序列”。

如本文所用，“分离的核酸分子”或“分离的核酸序列”是下述核酸分子(1)从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离，其通常与核酸的天然来源相关联或者(2)克隆、扩增、标记或以其他方式区别于背景核酸，使得可以确定目标核酸的序列。分离的核酸分子不是在自然界中发现的形式或设置。然而，分离的核酸分子包括通常表达免疫球蛋白(例如抗体)的细胞中含有的核酸分子，其中，例如，核酸分子在染色体中的位置与天然细胞不同。

如本文所用，术语“编码核酸分子”、“编码DNA序列”和“编码DNA”指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了核糖核苷酸沿mRNA链的顺序，并且还决定了沿多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此，DNA序列编码RNA序列和氨基酸序列。

术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或表达这种编码序列所需的调节序列。术语“基因”适用于特定的基因组或重组序列，以及由该序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括非表达核酸片段，其例如形成用于其他蛋白质的识别序列。非表达调节序列包括转录控制元件，调节蛋白(诸如转录因子)与其结合，使得相邻或邻近序列转录。

“基因的表达”或“核酸的表达”指DNA转录成RNA(任选地包括RNA的修饰，例如剪接)、RNA翻译成多肽(可能包括多肽随后的翻译后修饰)或如上下文所指出的转录和翻译两者。

表达盒是重组表达技术的典型特征。表达盒包括编码目标蛋白质的基因，例如编码阿柏西普融合蛋白序列的基因。真核“表达盒”指能够在真核细胞诸如哺乳动物细胞中产生蛋白质的表达载体的部分。它包括可在真核细胞中起作用的启动子，用于mRNA转录，编码目标蛋白的一种或多种基因和mRNA终止和加工信号。表达盒可以有用地包括编码序列中，可用作选择标记的基因。在表达盒中，启动子将5'可操作地连接至编码目标外源蛋白质的开放阅读框；并且多腺苷酸化位点将3'可操作地连接至开放阅读框。还可以包括其他合适的控制序列，只要表达盒保持可操作即可。开放阅读框可以任选地包括用于超过一种目标蛋白质的编码序列。

如本文所用，当提及指结构基因时术语“编码区”或“编码序列”指由于mRNA分子的翻译而编码在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区通过在5'侧编码起始子蛋氨酸的核苷酸三联体“ATG”，和3'侧指定终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的三个三联体之一限定。

重组表达技术通常涉及使用包含表达盒的重组表达载体。

术语“载体”意指用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。

如本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指含有所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的合适核酸控制序列的重组DNA分子。表达载体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译的序列，并且如果存在内含子，则影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地被表达载体编码，可操作地连接至目标编码序列，使得表达的多肽可以被重组宿主细胞分泌，如果需要可以更容易地从细胞分离目标多肽。这些技术在本领域中是熟知的(E.g.,Goodey,Andrew R等人，Peptide and DNAsequences,美国专利No.5,302,697；Weiner等人，Compositions and methods forprotein secretion,美国专利No.6,022,952和美国专利No.6,335,178；Uemura等人，Protein expression vector and utilization thereof,美国专利No.7,029,909；Ruben等人，27human secreted proteins,US 2003/0104400 A1)。为了表达目标多亚单位蛋白，可以使用合适数量和比例的单独表达载体来转化宿主细胞，每个单独表达载体含有用于每种不同亚单位单体的编码序列。在其他实施方式中，单一表达载体可用于表达目标蛋白质的不同亚单位。

重组表达技术通常涉及包含重组表达载体的哺乳动物宿主细胞。

术语“宿主细胞”指已经用核酸转化或能够用核酸转化并且因此表达目标基因或编码序列的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论后代是否与原始亲本细胞在形态或遗传组成方面相同，只要存在目标基因即可。在本发明的实践中可以使用大量可获取的和熟知的宿主细胞中的任何一种以获得阿柏西普。具体宿主的选择取决于本领域已知的许多因素。这些因素包括，例如，与所选择的表达载体的相容性、被DNA分子编码的肽的毒性、转化速度、肽的易回收性、表达特征、生物安全性和成本。这些因素的平衡必须理解对于特定DNA序列的表达可能并非所有宿主同样有效。在这些一般指导原则中，培养物中有用的微生物宿主细胞包括细菌(诸如大肠杆菌属(Escherichia coli sp.))、酵母(诸如酵母属(Saccharomyces sp.))和其他真菌细胞、藻类或藻类样细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人)细胞，例如CHO细胞和HEK-293细胞。还可以在DNA水平上进行修饰。编码肽的DNA序列可以改变为与所选择的宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌，优化的密码子是本领域已知的。密码子可以被取代以消除限制性位点或包括沉默限制性位点，这可以帮助所选宿主细胞中DNA的加工。接下来，培养并纯化转化的宿主。宿主细胞可以在常规发酵条件下培养，以便表达所需的化合物。这种发酵条件是本领域熟知的。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是中国仓鼠卵巢细胞，包括CHO-K1细胞(例如，ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养基中生长(Graham等人，J.GenVirol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals NY Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞或FS4细胞；或哺乳动物骨髓瘤细胞。

“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”通常可互换使用，并且本文中的所有这些名称包括细胞后代。例如，“衍生”自CHO细胞的细胞是中国仓鼠卵巢细胞的细胞后代，其可以与原始原代细胞亲本隔任何代数，并且还可以包括转化子后代细胞。转化子和转化细胞包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解，由于故意或无意的突变，所有后代在DNA含量上可能不完全相同。包括下述突变后代，该突变后代具有的功能或生物活性与筛选的用于原始转化细胞的相同。

用上述核酸或载体转化或转染宿主细胞以产生多肽(包括抗原结合蛋白质，诸如抗体)，并在适当修饰的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。另外，具有被选择标记分隔的多拷贝转录单位的新载体和转染细胞系特别适用于表达多肽，诸如抗体。

术语“转染”指细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA已经被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域熟知的并且在本文中公开。参见，例如，Graham等人，1973，Virology 52：456；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，同上；Davis等人，1986，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人，1981，Gene13：197。这些技术可用于将一种或多种外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。

术语“转化”指细胞的遗传特征的变化，并且当细胞被修饰为含有新的DNA或RNA时，细胞已经被转化。例如，当通过转染、转导或其他技术引入新的遗传物质使细胞从其天然状态被遗传修饰时，细胞被转化了。在转染或转导后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加体元件瞬时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立地复制。当转化DNA随着细胞分裂被复制时，认为细胞已经被“稳定转化”。

用于产生可用于本发明的阿柏西普融合多肽的宿主细胞可以在各种培养基中培养。可商购的培养基诸如Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)、Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)、美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO90103430；WO 87/00195；或美国专利申请号30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素^TM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能量源，以便培养基中或培养基上的细胞的生理条件促进宿主细胞表达目标蛋白质；还可以包括本领域技术人员已知的合适浓度的任何其他必需的补充剂。培养条件，诸如温度(通常但不一定是约37℃)、pH(通常但不一定是约pH6.5-7.5)、氧合(加氧，溶氧，oxygenation)等，是之前选择用于表达目标蛋白质的宿主细胞所使用的那些培养条件，并且对于普通技术人员来说将是显而易见的。培养基可以包括适量的血清，诸如胎牛血清(FBS)，或优选地，宿主细胞可以适用于在无血清培养基中培养。在一些实施方式中，水性培养基是液体，使得宿主细胞培养在液体培养基内的细胞悬浮液中。宿主细胞可以在分批培养或连续培养系统中有效地生长。

在其他实施方式中，哺乳动物宿主细胞可以培养在固体或半固体水性培养基(例如，含有琼脂或琼脂糖)上以形成细胞与之粘附的培养基或基质表面并且形成粘附层。

在培养宿主细胞后，重组多肽可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果多肽诸如阿柏西普是在细胞内产生的，作为第一步，例如通过离心或超滤除去颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。

目标蛋白质，诸如阿柏西普，可以使用例如羟磷灰石层析、阳离子或阴离子交换层析，或优选使用目标抗原或蛋白质A或蛋白质G作为亲和配体的亲和层析来纯化。蛋白质A可以用于纯化包括基于人γ1、γ2或γ4重链的多肽的蛋白质(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，推荐蛋白质G(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。最常见的亲和配体附接的基质是琼脂糖，但也可以使用其他基质。与使用琼脂糖实现相比，机械稳定的基质诸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的加工时间。当蛋白质包含CH3结构域时，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)可以用于纯化。取决于待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其他技术诸如乙醇沉淀、反相HPLC、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可能的。

关于孵育缓冲剂和免疫球蛋白或其他结合测定试剂的“在生理条件下”指在允许发生生化反应，诸如非共价结合反应的温度、pH和离子强度的条件下孵育。通常，温度在室温或环境温度，最高至约37℃和pH 6.5-7.5。

物质组合物的“生理学上可接受的盐”，例如目标蛋白质(例如融合蛋白或免疫球蛋白诸如抗体，或任何其他目标蛋白质)的盐，或氨基酸的盐(诸如但不限于赖氨酸、组氨酸或脯氨酸盐)，是指已知或后来发现是药学上可接受的任何一种或多种盐。药学上可接受的盐的一些非限制性实例是：乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤化物诸如盐酸盐(例如一盐酸盐或二盐酸盐)和氢溴酸盐；硫酸盐；柠檬酸盐；马来酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；葡萄糖酸盐；琥珀酸盐；甲磺酸盐；苯磺酸盐；没食子酸酯(没食子酸也称为3,4,5-三羟基苯甲酸)，诸如五没食子酰葡萄糖(PGG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的盐、胆固醇硫酸盐、双羟萘酸盐、单宁酸盐和草酸盐。

“反应混合物”是含有所有必需试剂和因子的水性混合物，其在培养的生理条件下，允许发生目标体外生化反应，诸如共价或非共价结合反应。

多核苷酸的“结构域”或“区域”(在本文中可互换使用)是整个多核苷酸的任何部分，最高达并包括完整的多核苷酸，但通常包含少于完整的多核苷酸。结构域可以但不需要独立于多核苷酸链的其余部分(例如，DNA发夹折叠)折叠和/或与特定的生物学、生物化学或结构功能或位置(诸如编码区域或调节区域)关联。

蛋白质的“结构域”或“区域”(在本文中可互换使用)是整个蛋白质的任何部分，最高达并包括完整的蛋白质，但通常包含少于完整的蛋白质。结构域可以但不需要独立于蛋白质链的其余部分折叠和/或与特定的生物学、生物化学或结构功能或位置(例如，配体结合结构域或胞质、跨膜或细胞外结构域)相关联。

阿柏西普融合蛋白的定量通常在跟踪蛋白质产生或对于含有阿柏西普的药物或药物产品的批次放行测定中是有用的或必需的。因此，特异性结合阿柏西普的抗体，特别是单克隆抗体，可用于这些目的。

术语“抗体”或可互换的“Ab”以最广泛的含义使用，并且包括完全组装的抗体、单克隆抗体(包括人、人源化或嵌合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及可以结合抗原的抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、单链抗体、双抗体)，包括前述的互补决定区(CDR)，只要它们表现出所需的生物学活性。考虑了完整分子和/或片段的多聚体或聚集体，包括化学衍生的抗体。考虑了任何同种型或亚类的抗体，包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2，或任何同种异型。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如，IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)活性。

“分离的”蛋白质，例如阿柏西普融合蛋白，指已经从其天然环境或培养基中的一种或多种组分鉴定和分离的蛋白质，在该培养基中融合蛋白被生产细胞分泌。在一些实施方式中，分离的蛋白质基本上不包含在其天然或培养基环境中发现的蛋白质或多肽或其他污染物，这些蛋白质或多肽或其他污染物会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途。其天然环境或培养基中的“污染物”组分是会干扰蛋白质(例如抗体)的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质(例如，多核苷酸、脂质、碳水化合物)溶质。通常，“分离的蛋白质”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％、或至少约50％。在一些实施方式中，目标蛋白质，例如阿柏西普融合蛋白或抗体，将被纯化(1)至按重量计大于蛋白质的95％，并且最优选按重量计大于99％，或者(2)至均一，通过SDS-PAGE或其他合适的技术，在还原或非还原条件下，任选地使用染色剂，例如考马斯蓝或银染色。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为蛋白质的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的目标蛋白质(例如，阿柏西普或抗体)将通过至少一个纯化步骤制备。

如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，作为抗原结合蛋白的单克隆抗体是针对单个抗原位点或表位的高度特异性结合物。单克隆抗体的非限制性实例包括鼠、兔、大鼠、鸡、嵌合、人源化或人抗体、完全组装的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(包括Fab、Fab'、F(ab)₂、Fv、单链抗体、双抗体)、巨型抗体、纳米抗体和包含前述CDR的重组肽(只要它们显示出所需的生物学活性)，或其变体或衍生物。

修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。例如，单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。还可以使用Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。

术语“免疫球蛋白”包括下述完整抗体，所述完整抗体含有两个二聚化重链(HC)，每个重链与轻链(LC)共价连接；单个未二聚化的免疫球蛋白重链和共价连接的轻链(HC+LC)，或嵌合免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异源三聚体(所谓的“半体，hemibody”)。“免疫球蛋白”是蛋白质，但不一定是抗原结合蛋白。

在“抗体”中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个约220个氨基酸(约25kDa)的“轻”链和一个约440个氨基酸(约50-70kDa)的“重”链。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的“可变”(“V”)区。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。不同抗体之间可变区不同。不同抗体之间的恒定区是相同的。在每条重链或轻链的可变区内，存在三个高变亚区，其在抗体是抗原结合蛋白的情况下帮助确定针对抗原的抗体特异性。高变区之间的可变结构域残基称为框架残基，并且通常在不同抗体之间在某种程度上同源。免疫球蛋白可以根据其重链恒定结构域的氨基酸序列分为不同的类别。人轻链被分类为卡帕(.κ.)和拉姆达(.λ.)轻链。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中，重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology，Ch.7(Paul,W.,ed.,2nded.Raven Press,N.Y.(1989))。“抗体”还包括重组制备的抗体，以及糖基化或缺乏糖基化的抗体。

术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括全长轻链以及其具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域、V_L和恒定区结构域、C_L。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。

术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括全长重链以及其具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域、V_H和三个恒定区结构域、C_H1、C_H2和C_H3。V_H结构域位于多肽的氨基末端，并且C_H结构域位于羧基末端，其中C_H3最接近多肽的羧基末端。重链分为缪(μ)、德尔塔(δ)、伽马(γ)、阿尔法(α)和艾普西龙(ε)，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。这些中的一些可以进一步分为亚类或同种型，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的IgG同种型可以具有不同的效应子功能(由Fc区介导)，诸如抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合免疫效应子细胞(诸如自然杀伤细胞和巨噬细胞)表面上的Fc受体(Fc.伽马Rs)，导致靶细胞的吞噬或裂解。在CDC中，抗体通过触发细胞表面的补体级联来杀死靶细胞。

“Fc区”或本文可互换使用的“Fc结构域”或“免疫球蛋白Fc结构域”含有两个重链片段，其在完整抗体中包含抗体的C_H1和C_H2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过C_H3结构域的疏水相互作用保持在一起。

术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区的负责增加IgG分子的体内血清半衰期的表位。

关于抗体的结构和产生的详细描述，参见Roth,D.B.和Craig,N.L.,Cell,94:411-414(1998)，其通过引用整体并入本文。简而言之，产生编码重链和轻链免疫球蛋白序列的DNA的过程主要发生在发育中的B细胞中。在重排和连接各种免疫球蛋白基因片段之前，在单个染色体上通常发现V、D、J和恒定(C)基因片段相对接近。在B细胞分化期间，各个V、D、J基因片段(或者在轻链基因的情况下仅有V和J)的适当家族成员中的一个基因片段被重组以形成重链和轻链功能重排的可变区。该基因片段重排过程似乎是依序的。首先，制备重链D-至-J接头，然后是重链V-至-DJ接头和轻链V-至-J接头。除了V、D和J片段的重排外，通过轻链中V和J片段连接以及重链中D和J片段连接的位置处的可变重组，在免疫球蛋白重链和轻链的一级库中产生其他多样性。轻链中的这种变异通常发生在V基因片段的最后一个密码子和J片段的第一个密码子内。连接中的类似不精确发生在D和J_H片段之间的重链染色体上，并且可以延伸多达10个核苷酸。此外，可以在D和J_H之间以及V_H和D基因片段之间插入几个核苷酸，其不由基因组DNA编码。这些核苷酸的添加被称为N区多样性。可变区基因片段中的这种重排和在这种连接期间中可能发生的可变重组的净效应是产生一级抗体库。

术语“高变”区指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基[即轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)，如Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所述]。甚至单个CDR也可以识别并结合抗原，尽管亲和力低于包含所有CDR的整个抗原结合位点。

来自高变“环”的残基的替代定义被Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述成轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中的26-32(HI)、53-55(H2)和96-101(H3)。

“框架”或“FR”残基是除高变区残基之外的那些可变区残基。

“抗体片段”包含完整全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人，ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，和残留的含有恒定区的“Fc”片段。Fab片段包含所有可变结构域，以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fc片段显示碳水化合物并且负责许多抗体效应子功能(诸如结合补体和细胞受体)，其将一类抗体与另一类抗体区分开。

胃蛋白酶处理产生的F(ab')₂片段具有包含抗体V_H和V_L结构域的两个“单链Fv”或“scFv”抗体片段，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端包含一些额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。优选地，Fv多肽还包含V_H和V_L结构域之间的多肽连接子，这使得Fv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。

“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，重链的该部分含有V_H结构域和C_H1结构域以及C_H1和C_H2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')₂分子。

“F(ab')₂片段”含有两条轻链和两条重链，重链含有C_H1和C _H2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')₂片段由两个Fab'片段组成，两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以在V_H V_L二聚体的表面上限定抗原结合位点。单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

“单链抗体”是Fv分子，其中，重链和轻链可变区通过柔性连接子连接以形成单个多肽链，其形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开No.WO 88/01649和美国专利No.4,946,778和No.5,260,203中详细讨论，其公开内容通过引用整体并入本文。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链中，并且任选地包含V_H和V_L结构域之间的多肽连接子，多肽连接子能够使得Fv形成结合抗原所需的结构(Bird等人，Science 242：423-426,1988和Huston等人，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 85：5879-5883,1988)。“Fd”片段由V_H和C_H1结构域组成。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接至同一多肽链(V_HV_L)中的轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的连接子，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更全面地描述了双抗体。

“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个V_H区与肽连接子共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个V_H区可以靶向相同或不同的抗原。

术语“抗原结合蛋白”(ABP)包括如本文所定义的阿柏西普，或抗体或抗体片段，以及重组肽或其他化合物，重组肽或其他化合物含有衍生自具有所需抗原结合特性的CDR的序列，使得它们特异性结合目标靶抗原。

通常，与抗原结合蛋白在相似结合测定条件下对其他无关蛋白的亲和力相比较，当抗原结合蛋白对该抗原具有显著更高的结合亲和力，并且因此能够区分该抗原时，抗原结合蛋白(例如阿柏西普或抗体或抗体片段)“特异性结合”目标抗原。通常，当解离常数(K_D)为10^-8M或更低时，抗原结合蛋白被称为“特异性结合”其靶抗原。当K_D为10^-9M或更低时，抗原结合蛋白特异性结合抗原具有“高亲和力”，并且当K_D为10^-10M或更低时，具有“非常高的亲和力”。

“抗原结合区”或“抗原结合位点”指特异性结合特定抗原的蛋白质的部分。例如，含有与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗原结合蛋白的那部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架”区(“FR”)。“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区可以帮助维持CDR的正确构象以促进抗原结合区和抗原之间的结合。在传统抗体中，CDR包埋至重链和轻链可变区的框架内，其中，它们构成负责抗原结合和识别的区域。免疫球蛋白抗原结合蛋白的可变区包含至少三个重链或轻链CDR，参考上文(Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Public Health Service NIH，Bethesda，Md；另见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：877-883)，在框架区内(指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4，Kabat等人，1991，同上；也参见Chothia和Lesk，1987，同上)。

术语“抗原”指能够被选择性结合剂诸如抗原结合蛋白(包括例如阿柏西普，或抗体或抗体的免疫功能片段)结合，并且还能够在动物中使用以产生能够结合该抗原的抗体的分子或分子的部分。抗原可以具有一个或多个能够与不同抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。

术语“表位”是被抗原结合蛋白(例如，阿柏西普或抗体)结合的分子的部分。该术语包括能够特异性结合抗原结合蛋白，诸如抗体或T细胞受体的任何决定簇。表位可以是连续的或非连续的(例如，在单链多肽中，在多肽序列中彼此不连续但在分子的环境中被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在某些实施方式中，表位可以是模拟物，因为它们包含三维结构，其类似于用于产生抗原结合蛋白的表位，但是不包含或仅包含在用于产生抗原结合蛋白的表位中发现的一些氨基酸残基。大多数情况下，表位存在于蛋白质上，但在某些情况下可能存在于其他种类的分子上，诸如核酸。表位决定簇可以包括分子(诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)的化学活性表面基群(grouping)，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，特异于特定靶抗原的抗体将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。

术语“同一性”指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过序列比对和比较所确定的。“同一性百分比”指比较的分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且基于所比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，对齐中的间隙(如果有的话)必须通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来处理。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在下述中描述的那些：Computational MolecularBiology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:AcademicPress；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysisin Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；以及Carillo等人,1988,SIAM J.Applied Math.48:1073。例如，序列同一性可以通过标准方法确定，标准方法通常用于比较两个多肽的氨基酸位置的相似性。使用诸如BLAST或FASTA的计算机程序，对齐两个多肽或两个多核苷酸序列以使它们各自的残基最佳匹配(或沿着一个或两个序列的全长，或沿着一个或两个序列的预定部分)。程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，以及评分矩阵，诸如PAM 250[标准评分矩阵；参见Dayhoff等人，in Atlas of ProteinSequence and Structure,vol.5,supp.3(1978)]可以与计算机程序结合使用。例如，同一性百分比可以计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和为了比对两个序列引入较长序列的间隙数之和。在计算同一性百分比时，比对比较的序列使得序列之间得到最大匹配。

GCG程序包是可用于确定同一性百分比的计算机程序，该程序包包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)。计算机算法GAP用于比对两个多肽或两个多核苷酸以测定序列的同一性百分比。比对序列以使它们各自的氨基酸或核苷酸最佳匹配(如通过算法确定的“匹配跨度”)。空位开放罚分(计算为对角线平均值的3倍，其中，“对角线平均值”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)以及空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及诸如PAM 250或BLOSUM 62的比较矩阵与算法结合使用。在某些实施方式中，算法还使用标准比较矩阵(参考Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352for PAM250comparison matrix；Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919for the BLOSUM 62comparison matrix)。

使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数包括以下：

算法：Needleman等人,1970,J.Mol.Biol.48:443-453；

比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff等人,1992,同上；

空位罚分：12(但是没有对末端空位的罚分)

空位长度罚分：4

相似度阈值：0。

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以得到仅两个序列的短区域匹配，并且即使在两个全长序列之间没有明显关系，该较小比对区域也可以具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，可以调整所选择的比对方法(GAP程序)以产生跨靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。

当与目标蛋白质结合使用时，术语“修饰”包括但不限于一个或多个氨基酸变化(包括取代、插入或缺失)；化学改性；通过缀合治疗剂或诊断剂的共价修饰；标记(例如，用放射性核素或各种酶)；共价聚合物附接诸如PEG化(用聚乙二醇衍生化)和通过化学合成非天然氨基酸进行插入或取代。通过本领域技术人员已知的方法，在“工程化”蛋白的编码序列包括在表达盒中之前，可以“工程化”或修饰蛋白质以改善靶亲和力、选择性、稳定性和/或可制造性。

当与目标蛋白质(诸如阿柏西普或抗体)结合使用时，术语“衍生物”指通过缀合至治疗剂或诊断剂、标记(例如，用放射性核素或各种酶)、共价聚合物附接诸如PEG化(用聚乙二醇衍生化)和通过化学合成非天然氨基酸进行插入或取代被共价修饰的蛋白质。

在本发明的范围内，阿柏西普蛋白质可以是治疗性蛋白质或“生物制剂”用于治疗疾病，包括但不限于人类疾病或病症，例如眼部疾病或病症。“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是为了预防疾病的发展或改变疾病的病理而进行的干预。因此，“治疗”指治疗性治疗和防疫性(prophylactic)或预防性(preventative)措施。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些和需要预防病症的那些。“治疗”包括成功改善损伤、病理或病况的任何迹象，包括任何客观或主观参数，诸如症状的减轻；缓解；减弱或使患者更容易忍受损伤、病理或病况；减慢退化或衰退的速度；使退化的终点不那么令人虚弱；改善患者的身心健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括由医生，例如眼科医生或其他健康护理提供者进行的身体检查的结果，或患者的自我报告。

治疗剂的“有效量”通常是足以降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在病因、预防症状和/或其潜在病因的发生，和/或改善或修复由眼部病症或疾病引起或与之相关的损害。在一些实施方式中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是下述量，该量足以治疗疾病状态(例如，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)后的黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿)相关性黄斑变性(AMD)、由近视脉络膜新生血管形成引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病视网膜病变(DR)以及新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)、移植排斥或GVHD、炎症、多发性硬化症、癌症、心血管疾病、糖尿病、神经病、疼痛)或症状，特别是与疾病状态相关的状态或症状，或以其他方式预防、阻碍、延缓或逆转疾病状态的演进或者与疾病相关的任何其他不良症状(即提供“治疗功效”)。“预防有效量”是下述药物组合物的量，当给药至受试者时，其将会具有预期的预防效果。完全治疗效果或预防效果不一定通过给药一剂就发生，并且可能在给药一系列剂量后才发生。因此，治疗或预防有效量可以以一次或多次给药的方式给药。

克隆DNA

使用标准技术进行DNA的克隆(参考，例如，Sambrook等人(1989)MolecularCloning：A Laboratory Guide，Vols 1-3，Cold Spring Harbor Press，其通过引用并入本文)。例如，通过polyA+mRNA，优选膜关联的mRNA的逆转录可以构建cDNA库，并使用特异于人免疫球蛋白多肽基因序列的探针筛选该库。然而，在一种实施方式中，聚合酶链式反应(PCR)用于扩增编码目标免疫球蛋白基因片段(例如轻链或重链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。扩增的序列可以容易地克隆到任何合适的载体中，例如表达载体、微小基因(minigene)载体或噬菌体展示载体。应当理解，所使用的克隆的具体方法并不重要，只要可以确定目标多肽某些部分(例如阿柏西普融合多肽序列的)的序列。

抗体核酸的一个来源是通过从用目标抗原免疫的动物中获得B细胞并将B细胞融合到永生细胞中产生的杂交瘤。或者，可以从免疫动物的B细胞(或整个脾)中分离核酸。编码抗体的核酸的另一个来源是例如通过噬菌体展示技术产生的此类核酸的库。编码目标肽的多核苷酸，例如具有所需结合特征的可变区肽，可以通过标准技术诸如淘选来鉴定。

使用标准技术进行了DNA测序(参考，例如，Sambrook等人(1989)MolecularCloning：A Laboratory Guide，Vols 1-3，Cold Spring Harbor Press，和Sanger，F等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467，其通过引用并入本文)。通过比较克隆核酸的序列与公开的基因和cDNA序列，技术人员将能够根据测序的区域容易地确定。基因序列信息的一个来源是国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)、国家医学图书馆(National Library of Medicine)、美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,MD)。

分离的DNA可以与控制序列可操作地连接或置于表达载体中，然后将其转染到不产生免疫球蛋白的宿主细胞中，以指导重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。抗体的重组产生是本领域熟知的。

当核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，则为可操作地连接。例如，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白，则用于前序列或分泌前导的DNA可操作地连接至用于多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。

许多载体是本领域已知的。载体组分可包括以下一种或多种：信号序列(例如，可以指导表达的蛋白质的分泌；复制起点，一种或多种选择性标记基因(例如，可以赋予抗生素或其他药物抗性，补体营养缺陷型或提供培养基中不可获得的关键营养素)，增强子元件，启动子和转录终止序列，所有这些都是本领域熟知的。

水和其他成分的纯度：用于制备本发明的眼科制剂的水和所有其他成分优选纯度水平满足在目标管辖区域中的此类药物组合物和药物所需的适用法律或药典标准，例如，美国药典(USP)、欧洲药典、日本药典或中国药典等。例如，根据USP，注射用水在肠胃外制剂和其他制剂的生产中用作赋形剂，其中，必须控制产品内毒素含量；以及其他药物应用中，诸如某些设备和肠外产品-接触部件的清洁；用于产生注射用水的水源或给水的最低质量是饮用水，如美国环境保护局(EPA)、EU、日本或WHO所限定的。

在向患者给药之前，本发明的制剂应满足目标管辖区内此类药物组合物和药物关于无菌、缺乏内毒素或病毒污染物等所需的适用法律或药典标准。

缓冲体系

本发明的眼科制剂包括浓度范围为约5至50mM的缓冲剂。用于本发明眼科制剂的合适的缓冲体系可以选自磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、谷氨酸盐和乳酸盐，或者缓冲剂可以是这些缓冲剂系统中两种或更多种的组合。本发明的一些有用的实施方式具有的缓冲剂浓度为约5mM至约20mM，并且其他实施方式具有的缓冲剂浓度为约5至约10mM。如果选择组氨酸缓冲剂，则优选组氨酸浓度为约5-20mM。

非离子表面活性剂

本发明的眼科制剂包括非离子表面活性剂，优选浓度为约0.001％(w/v)至约5.0％(w/v)。在一些实施方式中，非离子表面活性剂的浓度为约0.001％(w/v)至约2.0％(w/v)，或约0.001％(w/v)至约1.0％(w/v)，或约0.001％(w/v)至约0.10％(w/v)，或约0.001％(w/v)至约0.01％(w/v)。有用的非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、35(即聚乙二醇十二烷基醚)、泊洛沙姆(即聚乙二醇-聚丙二醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；聚(环氧乙烷-co-聚环氧丙烷))，诸如泊洛沙姆188(即Pluronic F68)，或Triton ^TM X-100(即4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇))。出于实施本发明的目的，还包括在“非离子表面活性剂”中的是烷基糖或烷基糖苷(例如，由Aegis Therapeutics，LLC以商品名销售；参考例如Maggio,StabilizingAlkylglycoside Compositions And Methods Thereof,US 8,133,863B2)。

张度调节剂

本发明的眼科制剂包括张度调节剂，使得制剂具有约300mOsm/kg(即300±50mOsm/kg)的最终重量摩尔渗透压浓度，并且氯阴离子浓度小于约10mM，优选小于约5mM，并且更优选小于约1mM。重量摩尔渗透压浓度是每单位水中溶解颗粒数量的量度。在溶液中，与水(溶剂)单位数成比例的溶质颗粒数越少，溶液浓度越低，渗透性越低。如果使用半透膜(仅可透过溶剂分子的膜)来分离不同溶质浓度的溶液，则会发生称为渗透的现象，其中，溶剂分子从较低浓度向较高浓度跨过膜以建立浓度平衡。驱动这种运动的压力称为渗透压，并且由溶液中溶质的“颗粒”数决定。含有相同浓度的颗粒并因此施加相等的渗透压的溶液称为等渗。例如，血红细胞(rbc)内的渗透压等于周围溶液，使得它不会收缩或膨胀。如果将rbc置于水中，它将会破裂，因为水本身是低渗透的。如果将rbc置于高盐溶液中，即大于0.9％(w/v)氯化钠，则由于溶液是高渗的，它将收缩。在两个例子中，rbc都被损坏了。任何生物细胞都会发生同样的情况，诸如眼内的生物细胞。如果将低渗或高渗溶液置于眼上将会导致损伤，因此迫使对于用于眼部的药物需要使用等渗溶液。在实践中，0.9％(w/v)氯化钠溶液是等渗的并且具有270-300mOsm/kg的浓度。将所有溶液与该标准进行比较，如果它们落入250-350mOsm/kg的扩展范围内，则被认为是等渗的。用于稳定蛋白质的赋形剂以产生等渗溶液的浓度添加。例如，二糖诸如蔗糖和海藻糖在9.25％的浓度下是等渗的，单糖诸如葡萄糖和甘露糖在5％的浓度下是等渗的，并且氨基酸诸如脯氨酸在约3％的浓度下是等渗的。重量摩尔渗透压浓度可以在理论上或实验上确定。理论计算可以根据以下等式确定：

重量摩尔渗透压浓度＝(g化合物/100mL溶液)*(化合物的E值).

化合物的E值由以下等式确定：

E值＝(MW NaCl/i值NaCl)*(i值化合物/MW化合物)。

i值是基于80％理论解离率的化合物的离子数。对于不解离的化合物，即蔗糖，i值为1。对于解离成2种离子的化合物，即NaCl，i值为1.8，并且对于解离成3种离子的化合物，i值为2.6。由于重量摩尔渗透压浓度是溶液的依数性质，因加入溶质的凝固点下降或蒸气压的降低都与液体中溶质分子的总数直接相关。在本领域中已经利用这些原理中的每一个来开发测量重量摩尔渗透压浓度的有用仪器。任何一种或两种类型的仪器都可用于生物样品。例如，含有10mM磷酸钠、40mM NaCl、5％(w/v)蔗糖和0.03％(w/v)聚山梨醇酯20的溶液具有263mOsm/kg的理论重量摩尔渗透压浓度。在我们的实验室中，如通过凝固点降低测量的实际测量值为270mOsm/kg。这说明实验值与理论值紧密匹配，进一步证明，为了实施本发明的目的，可以使用理论值或实验值来基于其重量摩尔渗透压浓度确定溶液是否适合于玻璃体内注射。

有用的张度调节剂可以是多元醇或氨基酸。有用的多元醇张度调节剂的实例包括蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇和甘油。通常，多元醇张度调节剂在5-10％(w/v)的浓度范围内，这取决于缓冲剂浓度和其他制剂赋形剂。氨基酸张度调节剂在2-4％(w/v)的浓度范围内，这取决于缓冲剂浓度和所用的其它张度调节剂。在本发明的眼科制剂中，如果药学上可接受，氨基酸张度调节剂可以是L-氨基酸形式和/或D-氨基酸形式。在“氨基酸张度调节剂”的含义内还包括药学上可接受的氨基酸盐形式。

另外的稳定剂

在本发明的眼科制剂的一些实施方式中，其中，张度调节剂是多元醇，例如蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇或甘油，该制剂还含有另外的氨基酸稳定剂。另外的氨基酸稳定剂可以是例如脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸或赖氨酸。另外的氨基酸稳定剂可以是L-氨基酸或D-氨基酸，或盐形式，只要该氨基酸是药学上可接受的，以及是药学上可接受的形式，例如药学上可接受的盐形式。(参考，例如Falconer等人.,Stabilization of amonoclonal antibody during purification and formulation by addition of basicamino acid excipients,J Chem Technol Biotechnol(2011)86:942-948；Platts等人.,Control of Globular Protein Thermal Stability in Aqueous Formulations by thePositively Charged Amino Acid Excipients,Journal of Pharmaceutical Sciences105(2016)3532-3536；Wang,W.,Instability,stabilization,and formulation ofliquid protein pharmaceuticals,International Journal of Pharmaceutics 185(1999)129-188；Yin等人.,Effects of Antioxidants on the Hydrogen Peroxide-Mediated Oxidation of Methionine Residues in Granulocyte Colony-StimulatingFactor and Human Parathyroid Hormone Fragment 13-34,Pharmaceutical Research(2004)21(12):2377-2383；Lam等人.,Antioxidants for Prevention of MethionineOxidation in Recombinant Monoclonal Antibody HER2,Journal of PharmaceuticalSciences 86(11):1250-1255(1997)；Levine等人.,Methionine Residues as EndogenousAntioxidants in Proteins,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93(26):15036-15040(1996)；Maeder等人.,Local tolerance and stability up to 24months of a new 20％proline-stabilized polyclonal immunoglobulin for subcutaneous administration,Biologicals 39:43-49(2011)；Cramer等人.,Stability over 36months of a newliquid 10％polyclonal immunoglobulin product(IgProlO,Privigen)stabilizedwith L-proline,Vox Sanguinis(2009)96,219-225；Bolli等人,L-Proline reduces IgGdimer content and enhances the stability of intravenous immunoglobulin(WIG)solutions,Biologicals 38(2010)150-157；Truong,Combination of D-Amino Acids andLipoteichoic Acid,EP2545909Al；Stroppolo等人.,Pharmaceutical compositionscontaining the salts of S(+)-2-(4-isobutylphenyl)propionic acid with basicaminoacids,US5510385)。与多元醇组合的另外的氨基酸稳定剂的浓度有用地为约0.01-3％(w/v)，这取决于与氨基酸组合的多元醇的浓度。然而，如果选择甲硫氨酸与多元醇张度调节剂组合，则甲硫氨酸可以低浓度(即10mM或更低)用作活性氧物质的清除剂。

本发明的示例性制剂

本发明的示例性眼科制剂包括在其中缓冲剂是磷酸盐缓冲剂的那些。在一种这样的实施方式中，(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；(b)磷酸盐缓冲剂浓度为约10mM；(c)非离子表面活性剂是浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨醇酯20；(d)张度调节剂是：

(i)浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，或

(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；(e)氯阴离子的浓度小于约1mM；并且制剂的pH为约pH 6.0至约pH 6.5。在该制剂的一些优选实施方式中，张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，具有的阿柏西普的浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。在其它优选的实施方式中，张度调节剂是浓度为约3％(w/v)的脯氨酸，具有的阿柏西普浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。

本发明的示例性眼科制剂还包括在其中缓冲剂是浓度为5-20mM的组氨酸缓冲剂的那些。在一种这样的实施方式中，(a)阿柏西普的浓度为20-80mg/mL；(b)组氨酸缓冲剂的浓度为约10mM；(c)非离子表面活性剂是浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨醇酯20；(d)张度调节剂为：

(i)浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，或

(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；(e)氯阴离子的浓度小于约10mM，或更优选小于约5mM；并且制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.5，或在一些实施方式中为约pH 6.0至约pH6.5。在该制剂的一些优选实施方式中，张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，具有的阿柏西普浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。在其它优选实施方式中，张度调节剂是脯氨酸，浓度为约3％(w/v)，具有的阿柏西普浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。

本发明的其他示例性眼科制剂包括在其中缓冲剂是乙酸盐缓冲剂的那些。在一种这样的实施方式中，(a)阿柏西普的浓度为20-80mg/mL；(b)乙酸盐缓冲剂为约10mM；(c)非离子表面活性剂是聚山梨醇酯20，或聚山梨醇酯80，或泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188，浓度为约0.01％(w/v)，约0.03％(w/v)，约0.1(w/v)，或约1％(w/v)；(d)张度调节剂是：

(i)浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，或

(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；(e)氯阴离子的浓度小于约1mM；并且制剂的pH为约pH 5.0至约pH 5.5。在该制剂的一些优选实施方式中，张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，具有的阿柏西普的浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。在其它优选的实施方式中，张度调节剂是浓度为约3％(w/v)的脯氨酸，具有的阿柏西普的浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。

为了进一步说明，本发明包含以下编号的实施方式：

实施方式1：一种眼科制剂，包含：

(a)阿柏西普，浓度为5-100mg/mL；

(b)浓度为5-50mM的缓冲剂；

(c)非离子表面活性剂；

(d)选自由多元醇和氨基酸组成的组的张度调节剂，其中，该制剂具有约300mOsm/kg的最终重量摩尔渗透压浓度，以及

(e)其中，氯阴离子的浓度小于约10mM；以及

其中，制剂的pH为约pH 5.0至约pH 6.5。

实施方式2：实施方式1的眼科制剂，其中，氯阴离子的浓度小于约5mM。

实施方式3：实施方式1-2的眼科制剂，其中，氯阴离子的浓度小于约1mM。

实施方式4：实施方式1-3的眼科制剂，其中，缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。

实施方式5：实施方式1-3的眼科制剂，其中，缓冲剂是浓度为5-20mM的组氨酸缓冲剂。

实施方式6：实施方式1-3的眼科制剂，其中，缓冲剂是乙酸盐缓冲剂。

实施方式7：实施方式1-3的眼科制剂，其中，缓冲剂选自磷酸盐、组氨酸、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐和乳酸盐；或者是这些中的两种或更多种的组合。

实施方式8：实施方式1-7的眼科制剂，其中，缓冲剂浓度为5-20mM。

实施方式9：实施方式1-8的眼科制剂，其中，非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、聚乙二醇十二烷基醚(即35)、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(即Triton ^TM X-100)、烷基糖和烷基糖苷。

实施方式10：实施方式1-9的眼科制剂，其中，非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。

实施方式11：实施方式1-10的眼科制剂，其中，张度调节剂是选自蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露醇和甘油的多元醇。

实施方式12：实施方式1-11的眼科制剂，其中，张度调节剂是蔗糖。

实施方式13：实施方式1-11的眼科制剂，其中，张度调节剂是海藻糖。

实施方式14：实施方式11的眼科制剂，还包含另外的氨基酸稳定剂。

实施方式15：实施方式14的眼科制剂，其中，另外的氨基酸稳定剂选自由以下组成的组：脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和赖氨酸。

实施方式16：实施方式1-15的眼科制剂，其中，张度调节剂是选自脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的氨基酸。

实施方式17：实施方式1-16的眼科制剂，其中，张度调节剂是脯氨酸。

实施方式18：实施方式4的眼科制剂，其中：

(a)阿柏西普的浓度为20-80mg/mL；

(b)磷酸盐缓冲剂的浓度为约10mM，

(c)非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆，

(d)张度调节剂是(i)浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖或(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；

(e)氯阴离子的浓度小于约1mM；

并且眼科制剂的pH为约pH 6.0至约pH 6.5。

实施方式19：实施方式18的眼科制剂，其中，张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖。

实施方式20：实施方式18的眼科制剂，其中，张度调节剂是浓度为约3％(w/v)的脯氨酸。

实施方式21：实施方式5的眼科制剂，其中：

(a)阿柏西普的浓度为20-80mg/mL；

(b)组氨酸缓冲剂为约10mM；

(c)非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆；

(d)张度调节剂是(i)浓度为约9％(w/v)的海藻糖或(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；

并且眼科制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.5。

实施方式22：实施方式21的眼科制剂，其中，张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的海藻糖。

实施方式23：实施方式21的眼科制剂，其中，张度调节剂浓度为约3％(w/v)的脯氨酸。

实施方式24：实施方式6的眼科制剂，其中：

(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；

(b)乙酸盐缓冲剂为约10mM；

(c)非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆；

(e)氯阴离子的浓度小于约1mM；

并且眼科制剂的pH为约pH 5.0至约pH 5.5。

实施方式25：实施方式1-24的任何制剂用于治疗眼部病症或疾病的用途。

实施方式26：实施方式25的用途，其中，眼部病症或疾病选自视网膜静脉阻塞(RVO)后的黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿)年龄相关性黄斑变性(AMD)、由于近视脉络膜新生血管形成引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病视网膜病变(DR)和新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)。

实施方式27：实施方式25-26的用途，其中，通过玻璃体内注射向患有眼部病症或疾病的患者给药该眼科制剂。

以下工作实施例是说明性的，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1.稳定性研究

材料：使用工业标准重组表达技术和纯化方法产生了VEGF特异性阿柏西普融合蛋白拮抗剂。使用Millipore Corporation实验室规模的切向流过滤系统，将纯化的药物与特定的制剂缓冲液进行缓冲剂交换。通过用制剂缓冲液稀释将蛋白质浓度调节至最终目标浓度。用于制备所有制剂的水通过(Millipore Corporation)水净化系统纯化，该系统包括离子交换柱。通过测量电导率监测水的纯度，其值大于18.2MΩcm-1(@ 25 ℃)是可接受的。用于制备制剂缓冲液的所有赋形剂、缓冲剂和其他成分均为USP级或等效物。

方法

滴定：将以相等摩尔浓度制备的酸和碱缀合物以适当的摩尔比混合在一起，以获得组氨酸和磷酸盐缓冲体系的所需制剂pH。使用冰乙酸加入到Milli-Q纯化的水中，然后进行氢氧化钠滴定以达到所需的最终pH，制备了乙酸盐制剂。

外观：进行了定性视觉外观测试以评估药物产品的蛋白质颗粒或环境污染物。将蛋白质样品的等分试样(1.1mL)置于预先灭菌的1型玻璃小瓶中，并盖上13mm的封闭物。在环境光条件下，轻轻旋转样品并目视检查5秒以检测可见颗粒。对于所有测试的样品，记录了任何检测到的颗粒的数量和描述。

颜色：进行了定性视觉颜色评估以监测产品稳定期间的药物产品的颜色。将来自Ricca Chemicals的商购EP 2.2.2棕黄色标准品(BY1-BY7)等分到预先灭菌的1型玻璃小瓶中。将药物产品的等分试样(1.1mL)置于小瓶中，并与等体积的每种棕黄色标准物进行了比较以确定着色水平。所有样品均在白色背景前检测，并记录了每个样品的着色水平。

减少体积光阻的亚可见颗粒分析：使用配备有HRLD-150传感器(BeckmanCorporation)的HIAC计数器通过光阻法测量了亚可见颗粒。使用1-100μm范围内的聚苯乙烯珠校准了传感器。在分析之前，将MilliQ水冲洗通过系统，直到达到清洁的基线，并且使用15μm聚苯乙烯珠的标准溶液确认了系统适用性。将复制样品在玻璃小瓶中合并至终体积1.1mL，并在75托下真空脱气2小时。对于每个样品，将仪器设定为汲取五个0.2mL的等分试样并测量大于10μm和25μm的颗粒。报告了最后三次测量的平均值。

尺寸排阻色谱法：使用Waters XBridge Protein BEH SEC 200A柱进行了尺寸排阻高效液相色谱(SE-FIPLC)分析。使用磷酸盐、氯化钠运行缓冲剂在天然条件下进行了分离。通过UV吸光度检测了峰值洗脱，并且整合纯度结果报告为较高分子量(HMW)组分、主要组分(单体)和较低分子量(LMW)组分相对于总校正面积的相对峰面积百分比。

CZE氯离子分析：使用Microsolv Technologies CElixirOA pH 5.4试剂盒进行的氯离子分析在Beckman PA 800毛细管电泳仪上进行。根据制造商的说明制备了样品和标准品。在50.2cm有效长度的裸熔融毛细管上以1psi的压力注射了10秒。通过光电二极管阵列检测器(PDA)监测样品。标准曲线的分析用于量化每个样品中氯阴离子的浓度。

还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rCE SDS)：通过在SDS中70℃下加热10分钟使蛋白质样品变性，并用β-巯基乙醇还原。将样品电动注射到填充有SDS凝胶缓冲剂的30.2cm裸熔融二氧化硅毛细管中。将-15kV的电压施加穿过毛细管，毛细管通过它们的尺寸差异来分离物质。使用光电二极管阵列检测器检测蛋白质。通过测定每种组分的峰面积百分比来评估纯度。

非还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(nrCE SDS)：在SDS和N-乙基马来酰亚胺(NEM)存在下，在低pH下，通过在60℃加热5分钟使样品变性。将得到的带负电荷的SDS-蛋白质复合物电动注射到填充有SDS凝胶缓冲剂的30.2cm裸熔融二氧化硅毛细管中。将-15kV的电压施加穿过毛细管，通过它们的尺寸差异来分离物质。当蛋白质通过检测窗口时，蛋白质物质被光电二极管阵列(PDA)检测器检测。通过测定每种组分的峰面积百分比来评估纯度。

毛细管等电聚焦：基于等电点(pI)的差异，使用毛细管等电聚焦(cIEF)来分离蛋白质。用两性溶液填充中性涂覆的毛细管，并施加电压，使两性物质聚焦成pH梯度。将蛋白质物质聚焦到pH梯度的部分，其中，pH等于它们的等电点。蛋白质是化学不固定的，并且当它们通过检测窗口时，通过UV吸光度(280nm)检测。通过测定每种组分的峰面积百分比来评估纯度。

效力评估：在基于细胞的VEGF-A165依赖性增殖测定中评估了阿柏西普的效力。在不存在生长因子的情况下，将人脐静脉内皮细胞接种在含有不同浓度的药物产品和100ng/mL VEGF-A165的96孔板中。将测定板在37℃、5％CO下孵育约3天，然后加入荧光活力试剂。通过绘制药物产品浓度与荧光的关系曲线，并且然后采用4参数拟合方程拟合产生了剂量响应曲线。通过评估测试样品和参考标准之间沿x轴的偏移测量了相对效力。

重量摩尔渗透压浓度测量：使用Advanced Instruments，Inc.凝固点渗透压计测量了样品的重量摩尔渗透压浓度。在样品分析之前，使用290mOsm/kg Clinitrol^TM 290参照溶液(Fisher Scientific)检查了仪器校准。将来自样品的20μL等分子样转移到样品管中并放入仪器中用于凝固点分析。每个样品一式三份进行分析，并且报告的结果是这些值的平均值。

实施例2.稳定性研究

进行了阿柏西普的稳定性分析以理解氯离子、pH、缓冲剂和稳定剂类型对分子稳定性的重要性。表1中概述了每种阿柏西普(40mg/mL)制剂的组成和在本文实施例2和图1-图10中的结果中使用的缩写(即制剂编号)。使用的氨基酸是L-异构构型。

表1.研究的制剂。阿柏西普浓度为40mg/mL。

氯离子检测：通过毛细管区域电泳测量了氯离子水平。测试了制剂缓冲液和配制的药物产品以确定每个样品中存在的氯离子的水平。配制有氯化钠的药物产品样品或配制有组氨酸的药物产品样品预期具有存在于缓冲液和药物产品样品中的氯离子。如表2所示，添加有氯化钠的制剂缓冲液具有预期的氯离子水平，而没有添加氯化钠的组氨酸制剂显示出低水平的氯离子，该结果由于缓冲液制备期间使用的组氨酸单盐酸盐。所有配制的药物产品样品显示出比相应的缓冲液样品略高的氯离子水平。该结果可能是由于来自产物纯化的残留氯化物。

表2.来自制剂缓冲液与配制的药物产品阿柏西普样品的毛细管区域电泳氯离子结果。与单独的制剂缓冲液相比，来自纯化过程的残留氯离子导致药物产品样品中的氯离子水平略微升高。

重量摩尔渗透压浓度：测量了药物产品溶液的重量摩尔渗透压浓度以确保在药物产品制备过程期间制剂组分的共浓缩或排阻不会导致玻璃体内注射的不可接受的重量摩尔渗透压浓度水平。在该研究中评估的八种药物产品制剂的重量摩尔渗透压浓度结果显示重量摩尔渗透压浓度水平在可接受的250-350mOsm/kg范围内。这些结果的总结在表3中示出。

表3.通过凝固点渗透压计测量了八种阿柏西普配制的药物产品样品的重量摩尔渗透压浓度，其表明所有样品都在可接受的范围内。

制剂编号	重量摩尔渗透压浓度(mOsm/kg)
		1	258
2	326
		3	277
4	302
		5	320
6	297
		7	330
8	332

视觉评估：可见颗粒和颜色检查进行了药物产品样品的视觉评估以确定环境或产品相关颗粒的存在或不存在，并评估稳定性研究期间产品颜色。检查了在4℃储存7周，在30℃储存4周的稳定性样品的视觉颗粒，并且所有样品都通过了该评估。

通过将配制的蛋白质与商购的棕黄色药典颜色标准(EP 2.2.2)比较，进行了阿柏西普药物产品稳定性样品的颜色检查。该评估的结果确定了无论配方和温度如何，药物产品颜色在储存期间都没有变化。

亚可见颗粒测试：HIAC：对4℃稳定性样品进行了亚可见颗粒分析。图1和图2中分别示出了10μm和25μm颗粒尺寸的结果。图1和图2中的误差线表示根据三个读数计算的标准偏差。测得的亚可见颗粒水平远低于USP专著<789>{Particulate Matter In OphthalmicSolutions}规定的水平。除了制剂7(具有随时间增加的亚可见颗粒水平的条件)之外，对于在4℃下储存的所有制剂观察到十(10)μm颗粒。当在4℃下储存时，图2中所示的25μm颗粒水平不可检测或处于非常低的水平。应当注意，25μm结果的误差线大于报告的颗粒数，并且因此不能从这些早期时间点数据得出任何趋势。

SE-HPLC：尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析被用于评估整个研究持续期间稳定性样品中高分子量物质(HMW)的水平。对于所有温度条件，在所有时间点进行了SE-HPLC。在图3和图4中分别示出了来自4℃和30℃温度储存条件的结果。在4℃储存7周后，制剂1-制剂7具有彼此难以区分的HMW水平，其具有相等的pH，但在缓冲剂类型、张度调节剂和氯化钠的存在方面存在差异。令人惊讶的是，与其他制剂相比，具有显著低于其他制剂pH的制剂8还具有显著降低的聚集体水平。在4℃观察到的趋势与在30℃储存4周后检测到的趋势相当。

SE-HPLC测量的HMW数据暗示，对于任何研究的制剂，氯化钠对于在长期储存期间稳定阿柏西普不是必需的，这与Dix等人的教导令人惊讶地相反。(参考US 8,921,316,第6栏,62-65行；指出“although either NaCl or sucrose can be used as a stabilizer,acombination of NaCl and sucrose has been established to stabilize the fusionprotein more effectively than either individual stabilizer alone,(虽然NaCl或蔗糖可以用作稳定剂，但已建立的NaCl和蔗糖的组合比任何的单独稳定剂更有效地稳定融合蛋白)”，这与我们在本文报道的实验结果相反。)组氨酸和乙酸盐缓冲体系是磷酸盐的可行替代品，这取决于所需的pH。使用pH范围为5左右的缓冲剂可以显著降低聚集体水平。除蔗糖外，可以使用张度调节剂脯氨酸和海藻糖以达到适当的重量摩尔渗透压浓度(～300mOsm/kg)，同时保持或增强阿柏西普分子稳定性。

还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)：rCE-SDS方法用于监测产物随时间的降解，诸如氨基酸骨架的裂解，结果报告为纯度百分比，即重链和轻链的总百分比。4℃的结果总结在图5中，并且30℃的数据在图6中示出。无论储存温度如何，除制剂7外，所有研究的制剂在整个测试时间点具有相似的纯度水平。在制剂之间观察到的数值差异在测定可变性内。制剂7示出了在30℃升高的温度条件下产品降解增加，导致纯度百分比随时间降低。

毛细管等电聚焦(cIEF)：毛细管等电聚焦(cIEF)被用于监测电荷变体的分布随时间的变化。为了评估不同的制剂，将碱性物质百分比水平和酸性物质百分比水平相对于时间作图。这些物质的增加或减少将表明蛋白质电荷的变化，可能是由于肽骨架的化学修饰。如图7、图8、图9和图10所示，随着时间的推移，没有观察到电荷变体分布的变化。这些数据表明没有发生可检测的影响阿柏西普蛋白电荷的化学修饰。

实施例3.稳定性研究

进行了本发明制剂的各种实施方式中阿柏西普稳定性的其它测试。表4列出了所测试的阿柏西普(40mg/mL)制剂及其缩写。使用的氨基酸是L-异构构型。

表4.测试的阿柏西普(40mg/mL)的制剂及其重量摩尔渗透压浓度和在本文表5-表15中使用的相关缩写。

材料：使用工业标准重组表达技术和纯化方法产生了VEGF特异性阿柏西普融合蛋白拮抗剂。使用Millipore Corporation的实验室规模(lab scale)或实验室规模(benchscale)的切向流过滤系统，将纯化的药物与具体制剂缓冲液进行了缓冲剂交换。通过用制剂缓冲液稀释将蛋白质浓度调节至最终目标浓度。用于制备所有制剂的水通过(Millipore Corporation)水净化系统纯化，该系统包括离子交换盒。通过测量电导率监测水的纯度，其值大于18.2MΩcm^-1(@25℃)是可接受的。用于制备制剂缓冲液的所有赋形剂、缓冲剂和其他成分均为USP级或等效物。

方法

滴定：将以相等摩尔浓度制备的酸和碱缀合物以适当的摩尔比混合在一起，以获得组氨酸和磷酸盐缓冲体系的所需制剂pH。使用缀合法或通过使用向Milli-Q纯化水中添加冰乙酸，然后通过氢氧化钠滴定以达到最终所需的pH，制备了乙酸盐制剂。

基于质谱的多属性方法(MAM)：稳定性样品用6.8M胍变性，用10mM二巯基苏糖醇(DTT)还原，并用20mM碘乙酸烷基化。通过基于尺寸排阻的脱盐柱除去过量的试剂。以1:10的酶与底物比率加入胰蛋白酶，并将样品在37℃消化30分钟。通过RP-HPLC用甲酸/乙腈(FA/ACN)梯度经C18柱分离所得肽，并使用Thermo Fisher Q-Exactive质谱仪通过质谱检测进行监测。使用Genedata's Expressionist软件对各种肽进行了鉴定和定量。

其他分析方法如上文实施例1中所述进行。

pH对阿柏西普稳定性的影响：使用以不同生产规模在三(3)个不同批次中重组产生的阿柏西普检测了pH对如通过SE-HPLC在4℃和30℃(参见图11)测量的高分子量形成速度和如通过HIAC在4℃测量的亚可见颗粒形成的影响。以三种不同规模产生的阿柏西普显示出相似的产品特征，包括所有批次的相似糖基化水平。然后将阿柏西普与10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸和0.1％(w/v)泊洛沙姆188配制成三(3)种不同的pH值(见表4，关于制剂缩写)。如表5和表6和图11中所示，用10mM乙酸盐、3％(w/v)脯氨酸和0.1％(w/v)泊洛沙姆188配制的SE-HPLC测量的阿柏西普的HMW形成速度不受pH影响并且始终低于用10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖和0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2配制的相同批次的阿柏西普所观察到的变化率。还检查了在4℃储存期间通过HIAC测量的亚可见颗粒形成，并且在储存期间，任何制剂中的阿柏西普都没有显著变化(表7)。

表5.通过SE-HPLC测量的4℃下HMW的形成速度；*括号中的值指测量的溶液的pH。

表6.如通过SE-HPLC测量的30℃下HMW的形成速度；*括号中的值指测量的溶液的pH。

表7.通过小体积HIAC分析测量的4℃下亚可见颗粒形成；*括号中的值指测量的溶液的pH。

含有不同非离子表面活性剂的脯氨酸和精氨酸制剂中阿柏西普的稳定性：检测了在两种表面活性剂泊洛沙姆188或聚山梨醇酯80中的任一种存在下含有脯氨酸或精氨酸作为张度调节剂的制剂中阿柏西普的稳定性(分别见表8和表9；关于制剂缩写，见表4)。当每一种都配制有聚山梨醇酯80或泊洛沙姆188时，与10mM磷酸钠，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，pH 6.2相比，当用10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2配制阿柏西普时，如通过SE-HPLC测量的30℃下HMW物质形成显著降低。与10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖、pH 6.2制剂中的阿柏西普相比，在10mM磷酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 6.2中的阿柏西普显示出相似的SE-HPLC测量的HMW形成速度(各自配制有聚山梨醇酯80或泊洛沙姆188，作为非离子表面活性剂)。相反，在pH 5.2的乙酸盐制剂中用精氨酸替代脯氨酸作为张度调节剂使得SE-HPLC测量的HMW形成速度提高至少10倍。然而，无论存在何种类型的非离子表面活性剂，在pH6.2制剂的10mM磷酸盐缓冲剂中，精氨酸显示出对10mM磷酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 6.2制剂中的阿柏西普相似的稳定性。

表8.通过SE-HPLC测量的在30℃下HMW形成速度。

在每种测试的制剂中泊洛沙姆188(0.1％(w/v))作为非离子表面活性剂存在。

表9.通过SE-HPLC测量的30℃下HMW形成速率。

在每种测试的制剂中，聚山梨醇酯80(0.03％(w/v))作为非离子表面活性剂存在。

模拟运输(simulated shipping)后阿柏西普的稳定性及表面活性剂浓度的影响：在模拟运输后表征了在具有各种表面活性剂和浓度的10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH5.2的制剂中阿柏西普的稳定性。模拟运输协议旨在考虑可能潜在地损坏产品并影响稳定性简况的多种运输模式。如表10中所示，在4℃下储存的10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH5.2制剂中的SE-HPLC测量的阿柏西普的HMW形成速度不依赖于表面活性剂的类型或表面活性剂的浓度，并且显著低于10mM磷酸盐，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，pH 6.2制剂中阿柏西普所观察到的。与先前的结果一致，10mM磷酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 6.2中的阿柏西普稳定性与10mM磷酸盐，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，pH 6.2制剂中阿柏西普稳定性相似。此外，虽然30℃时HMW形成速率快于4℃时HMW形成速度，但稳定性顺序没有变化，其中，10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2最稳定(表11)。在模拟运输之后，通过HIAC测量的亚可见颗粒计数在所有制剂中增加至相似程度(表12，比较列0周对照至0周)。由HIAC测量的亚可见颗粒计数似乎不取决于制剂。对于制剂和储存温度的子集，在13周的时间点评估了产品效力(见表13)。当与10mM磷酸盐，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，pH 6.2制剂相比，10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2制剂或10mM磷酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 6.2之间未检测到效力差异。这些结果表明各种脯氨酸制剂稳定蛋白质并维持功能活性。

基于质谱的多属性方法(MAM)分析：进行了MAM分析以评估关于属性(诸如天冬氨酸残基的异构化、天冬酰胺的去酰胺和甲硫氨酸的氧化)翻译后修饰水平的变化。与-70℃对照样品相比，在4℃、30℃和40℃下储存3个月后评估了来自三种制剂的样品。在该分析中，将10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，0.1％(w/v)泊洛沙姆188，pH 5.2和10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，0.03％(w/v)聚山梨醇酯80，pH 5.2与阿柏西普商购制剂(10mM磷酸钠，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2)进行了比较。

在-70℃对照和三种制剂的4℃稳定性样品之间观察到了等效水平的甲硫氨酸氧化。在30℃和40℃储存后，在所有三种制剂中观察到了更高水平的氧化，其中，10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，0.1％(w/v)泊洛沙姆188，pH 5.2报道了最低氧化水平。具有较高甲硫氨酸氧化水平的两种制剂，含有聚山梨醇酯，一种已知促进蛋白质氧化的赋形剂(Kerwin,Polysorbates 20and 80Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics:Structure and Degradation Pathways,Journal of Pharmaceutical Sciences,(2008)97,8:2924-2934)。

在4℃、30℃和40℃储存3个月后评估了三种制剂的脱酰胺水平。在4℃样品之间未观察到可检测的差异，但是在升高的温度下储存的样品具有显著增加的脱酰胺水平。例如，40℃的阿柏西普制剂(10mM磷酸钠，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2)在N84位置具有7.6％脱酰胺作用，而10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，0.1％(w/v)泊洛沙姆188，pH 5.2和10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，0.03％(w/v)聚山梨醇酯80，pH 5.2制剂分别具有2.8％和3.0％的N84脱酰胺。在所有五个检测的脱酰胺位点中，10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2制剂在升高的温度储存后具有的脱酰胺作用显著低于pH 6.2的磷酸盐制剂。

在MAM分析期间还评估了异构化的天冬氨酸残基的水平。六(6)个天冬氨酸残基易于异构化。无论温度或制剂如何，％异构化水平的测量差异都在测量技术的误差范围内，因此无法从这些数据中得出结论。

总之，相比于商购阿柏西普制剂10mM磷酸钠，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH6.2，MAM数据表明10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，0.1％(w/v)泊洛沙姆188，pH 5.2制剂具有更低或等效的翻译后修饰形成速度。

表10.通过SE-HPLC测量的4℃下HMW形成速率；*对照指在运输研究期间保持在4℃且不经过模拟运输处理的材料。(关于制剂缩写，见表4)。

表11.通过SE-HPLC测量的在30℃下HMW形成速率；*对照指在运输研究期间保持在4℃且不经过模拟运输处理的材料。(有关制剂缩写，见表4)。

表12.通过HIAC测量的在4℃下亚可见颗粒形成速率；*对照指在运输研究期间保持在4℃且不经过模拟运输处理的材料。(有关制剂缩写，见表4)。

表13.相对效力；*NT-所有温度均未通过效力测定进行测试；否则n＝3。

与商购的相比，本发明的乙酸盐缓冲制剂中重组产生的阿柏西普的比较：30℃下在10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2，0.1％(w/v)泊洛沙姆制剂中重组产生的阿柏西普的稳定性与(阿柏西普；Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY；见表14)的进行比较。除非在本文中特别指出是商购的，否则本文所述的所有实验中使用的阿柏西普是由Just Biotherapeutics，Inc.(Seattle，WA)为了这些研究而重组产生的，并且以本文表1和表4中所述配方配制。药物产品购自欧洲市场，并在其自身容器中保持稳定。在指定的时间点从小瓶中取出样品，并通过SE-HPLC分析以表征存在的HMW物质的量。表14中的数据表明，由Just Biotherapeutics生产并且以指定配方配制的阿柏西普具有比药物产品中的阿柏西普更低的％HMW和更低的HMW物质形成速度。

表14.本发明制剂的实施方式和商购阿柏西普制剂在30℃下HMW形成速度(SE-HPLC)的比较。(有关制剂缩写，见表4)。

盐对阿柏西普制剂稳定性的影响：研究了在30℃储存期间，在10mM乙酸盐，3％(w/v)脯氨酸，pH 5.2制剂中盐对阿柏西普稳定性的影响。如表15所示，向制剂中加入的100mM氯化钠盐使得SE-HPLC测量的HMW物质形成速度提高了3.8倍。

表15.具有或不具有100mM氯化钠盐的本发明制剂的实施方式在30℃下HMW形成速度(SE-HPLC)的比较

商购阿柏西普与在这些实验中使用的重组阿柏西普的稳定性比较：作为(ziv-aflibercept；Regeneron Pharmaceuticals，Inc.，Tarrytown，NY)商购的阿柏西普再加工以除去商业制剂组分(除了ziv-阿柏西普之外)，并再配制成10mM磷酸盐，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2的制剂(P62NaSuT)。用于这些研究的商购的再加工的阿柏西普和重组阿柏西普(由Just Biotherapeutics，Inc.生产，并且配制在10mM磷酸盐，40mM氯化钠，5％(w/v)蔗糖，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2中)在30℃孵育并监测HMW形成。如表16中所示，从商购纯化的阿柏西普的HMW形成速度略快于由Just Biotherapeutics生产的阿柏西普所观察到的速度。这些结果表明，与本文所述实验中使用的阿柏西普蛋白相比，商购阿柏西普融合蛋白的固有聚集率没有实质性差异。

表16.与重组产生的阿柏西普(Just Biotherapeutics，Inc.)相比，商购的ziv-阿柏西普在30℃下的HMW形成(SE-HPLC)。

实施例4.通过在兔子中玻璃体内给药进行的多种安慰剂制剂的耐受性研究

为了确定旨在与阿柏西普药物产品一起使用的本发明制剂的一些实施方式的耐受性，将安慰剂制剂的玻璃体内注射液作为单次剂量对兔子进行给药，在Charles RiverLaboratories,Inc.,640N.Elizabeth Street,Spencerville,OH 45887,United Statesof America，如表17所示。

表17.在雄性兔中作为单次剂量测试的安慰剂制剂。

根据研究设计评估了以下参数和终点：临床体征、体重、体重增加、食物消耗和眼科学。

在该研究中的受试兔中，没有早期死亡，没有与治疗相关的临床体征，并且未发现对体重、体重增加、食物消耗或任何眼科的任何影响。总之，通过玻璃体内注射给药的所有安慰剂制剂在兔中具有良好耐受。

序列表

<110> 济世生物药业有限公司(JUST BIOTHERAPEUTICS, INC.)

<120> 阿柏西普制剂及其用途

<130> PN19013244P

<140>

<141>

<150> 62/497,584

<151> 2016-11-21

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /note="人工序列的描述: 合成多肽"

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

370 375 380

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

385 390 395 400

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

405 410 415

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

Claims

1.一种眼科制剂，包括：

(a)阿柏西普，浓度为5-100mg/mL；

(b)缓冲剂，浓度为5-50mM；

(c)非离子表面活性剂；

(d)张度调节剂，选自由多元醇和氨基酸组成的组，其中，所述制剂具有约300mOsm/kg的最终重量摩尔渗透压浓度，以及

(e)其中，氯阴离子的浓度小于约10mM；

并且

其中，所述制剂的pH为约pH5.0至约pH6.5。

2.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述氯阴离子的浓度小于约5mM。

3.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述氯阴离子的浓度小于约1mM。

4.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。

5.根据权利要求1的所述眼科制剂，其中，所述缓冲剂是浓度为5-20mM的组氨酸缓冲剂。

6.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述缓冲剂是乙酸盐缓冲剂。

7.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述缓冲剂选自磷酸盐、组氨酸、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐和乳酸盐，或者是这些中的两种或更多种的组合。

8.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述缓冲剂浓度为5-20mM。

9.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、聚乙二醇十二烷基醚、泊洛沙姆、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、烷基糖和烷基糖苷。

10.根据权利要求9所述的眼科制剂，其中，所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。

11.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是选自蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露醇和甘油的多元醇。

12.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是蔗糖。

13.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是海藻糖。

14.根据权利要求11所述的眼科制剂，还包括另外的氨基酸稳定剂。

15.根据权利要求14所述的眼科制剂，其中，所述另外的氨基酸稳定剂选自由脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和赖氨酸组成的组。

16.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是选自脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的氨基酸。

17.根据权利要求16所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是脯氨酸。

18.根据权利要求4所述的眼科制剂，其中：

(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；

(b)所述磷酸盐缓冲剂浓度为约10mM，

(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆，

(d)所述张度调节剂是

(i)浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，或者

(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；

(e)所述氯阴离子的浓度小于约1mM；

并且，所述制剂的pH为约pH6.0至约pH6.5。

19.根据权利要求18所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖。

20.根据权利要求18所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是浓度为约3％(w/v)的脯氨酸。

21.根据权利要求5所述的眼科制剂，其中：

(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；

(b)所述组氨酸缓冲剂为约10mM；

(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆；

(d)所述张度调节剂是

(i)浓度为约9％(w/v)的海藻糖，或

(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；

并且，所述制剂的pH为约pH5.5至约pH6.5。

22.根据权利要求21所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是浓度为约9％(w/v)的海藻糖。

23.根据权利要求21所述的眼科制剂，其中，所述张度调节剂是浓度为约3％(w/v)的脯氨酸。

24.根据权利要求6所述的眼科制剂，其中：

(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；

(b)所述乙酸盐缓冲剂为约10mM；

(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊洛沙姆；

(d)所述张度调节剂是

(i)浓度为约9％(w/v)的蔗糖或海藻糖，或

(ii)浓度为约3％(w/v)的脯氨酸；

(e)所述氯阴离子的浓度小于约1mM；

并且，所述制剂的pH为约pH5.0至约pH5.5。

25.一种治疗眼部病症或疾病的方法，包括向有此治疗需要的患者给药治疗有效量的权利要求1、权利要求4、权利要求5、权利要求6或权利要求7所述的眼科制剂。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述眼部病症或疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞(RVO)后黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿)与年龄相关性的黄斑变性(AMD)、由于近视脉络膜新生血管形成引起的视力受损、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者的糖尿病视网膜病变(DR)和新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD)。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，通过玻璃体内注射给药所述眼科制剂。