CN109932446A - 一种枸杞多糖提取物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞多糖提取物的检测方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：称取枸杞多糖提取物适量配制成溶液；(2)供试品特征谱分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器检测，二乙氨乙基弱阴离子交换色谱柱，无机盐溶液为流动相洗脱；供试品溶液注入液相色谱仪，测定，计算；(3)供试品分子量分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器检测，高效分子排阻色谱柱，无机盐溶液为流动相等度洗脱；供试品溶液注入液相色谱仪，测定，计算；(4)供试品含量分析：采用紫外‑可见分光光度仪，分别测定中性糖、糖醛酸、总蛋白质含量，计算。本发明能够对枸杞多糖进行在线分析和结构表征，为枸杞多糖的纯化技术和专属性质量分析方法提供参考。

Description

一种枸杞多糖提取物的检测方法

技术领域

本发明涉及一种枸杞多糖提取物的检测方法，属于食品科学与生物化工技术领域。

背景技术

茄科枸杞属植物全球约80种，主要分布于南美洲等温带地区。我国有宁夏枸杞、北方枸杞(河北)、新疆枸杞、红枝枸杞(新疆)、截萼枸杞(内蒙)、柱筒枸杞(新疆)、云南枸杞(云南)、黑果枸杞(青海)、黄果枸杞等品种，其中宁夏枸杞(Lycium barbarum)是目前获得规模化人工种植的唯一种，是市场主流产品。枸杞是中国传统的药食两用功能食品，《神农本草经》中有“久服坚筋骨”之记载，《名医别录》中有“补益精气”之说，《食疗本草》中有“能益人，去虚劳”之誉。中国药典收载枸杞子为宁夏枸杞的干燥成熟果实，功能滋补肝肾，益精明目，用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，阳萎遗精，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明；枸杞茎叶(天精草)、根茎(地骨皮)也是常用中药之一。枸杞中含有枸杞多糖、玉米黄素、甜菜碱、黄酮等功效成分，这些功效成分具有调节免疫，抗炎，保护细胞、血管、神经，以及抗衰老和抗肿瘤等多种药理作用。现代药理研究证明，枸杞中所含的枸杞多糖是其重要的功效成分之一，它是一种结构复杂的水溶性糖蛋白，其免疫调节、降血糖等作用较为明确。枸杞在21世纪初开始出口到欧洲、北美洲等世界各地，被誉为超级水果，其保健功效得到国际认可。近年来，枸杞多糖提取物的开发应用受到市场青睐。

现有文献研究中，枸杞多糖的提取工艺相关报道较多。在成分组成方面，现已基本明确，枸杞子中的多糖主要由4-5种均一多糖组分(分子量23.7-214.8kD)构成，其主链一般组成为半乳糖连接，侧链内侧由半乳糖、外侧由阿拉伯糖连接；糖链上还有不同程度的O-糖苷连接的复杂多肽链修饰，包括18种氨基酸(田庚元.枸杞子糖缀合物的结构与生物活性研究.世界科学技术-中医药现代化,2003,5,22-30)。中国药典收载了采用葡萄糖为对照品测定枸杞多糖总含量的方法；田丽梅等报道了枸杞多糖的中性糖、糖醛酸、总蛋白质的含量分析方法(枸杞多糖的提取分离和其组成研究,中国中药杂志,2006,19,1603-1607)；韩红报道了采用高效分子排阻色谱法分析枸杞多糖分子量的研究(枸杞多糖GPC检测、提取工艺优化及其稳定性研究，华南农业大学硕士学位论文，2016)。这些研究成果大力推进了枸杞多糖的研究进展，但由于枸杞多糖相对含量较低、组成复杂，其均一多糖组分较难分离获得，相关结构表征方法和技术相对复杂，因而现有文献中还缺乏枸杞多糖专属性的质量分析方法，这成为限制枸杞多糖应用推广的瓶颈问题。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种枸杞多糖提取物的检测方法，能够对枸杞多糖提取物进行定性和定量分析，可为枸杞多糖的质量分析方法提供参考。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种枸杞多糖提取物的检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取枸杞多糖提取物适量，用水或所需流动相溶液配制为供试品溶液，即得；

(2)供试品特征谱分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器以波长210和280nm检测，二乙氨乙基弱阴离子交换色谱柱，无机盐溶液为流动相洗脱；供试品溶液进样体积2-20μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

(3)供试品分子量分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器以波长210和280nm检测，高效分子排阻色谱柱，无机盐溶液为流动相等度洗脱；供试品溶液进样体积10-100μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

(4)供试品含量分析：采用紫外-可见分光光度仪，分别测定供试品溶液的中性糖、糖醛酸、总蛋白质含量，计算，即得。

上述技术方案中，所述枸杞属植物可选自宁夏枸杞、北方枸杞(河北)、新疆枸杞、红枝枸杞(新疆)、截萼枸杞(内蒙)、柱筒枸杞(新疆)、云南枸杞(云南)、黑果枸杞(青海)、黄果枸杞等品种，常规选用宁夏枸杞所述植物部位可以是果实、茎、叶或根茎。所述枸杞多糖可参考文献已公开的方法进行提取。以枸杞子为例，一般采用热水回流提取、乙醇沉淀、干燥等工序制备获得；根据需要，可进一步选用超滤浓缩等方式除去5k以下的小分子杂质。

上述技术方案中，所述步骤(1)中，供试品溶液在配制前，根据需要可选用Sevag法除去蛋白质类杂质。

上述技术方案中，所述步骤(2)中，所述二乙氨乙基(DEAE)弱阴离子交换色谱柱可选自纤维素、琼脂、高分子树脂等市售色谱柱，所述无机盐可选用氯化钠(NaCl)、硫酸铵或者Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl，其中，优选20-40mM Tris-HCl、和0.3-1.0M NaCl～20-40mM Tris-HCl进行梯度洗脱，溶液优选pH7.5-9.5范围。所述计算方法采用各组分色谱峰的保留时间进行分析。

上述技术方案中，所述步骤(3)中，所述高效分子排阻色谱柱可选自葡聚糖凝胶、高分子树脂等市售色谱柱，所述无机盐可选用氯化钠、硫酸铵或者Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl，其中，优选0.2-0.5M硫酸铵等度洗脱。所述计算方法采用各组分色谱峰的保留时间，以系列分子量葡聚糖作为对照品测定标准曲线，进行各枸杞多糖组分的相对平均重均分子量分析。

上述技术方案中，所述步骤(4)中，所述中性糖含量的测定采用硫酸-苯酚法，检测波长490nm，以葡萄糖或者半乳糖或者阿拉伯糖为对照品；

所述半乳糖醛酸含量的测定采用咔唑-硫酸法，检测波长540nm，以葡萄糖醛酸或者半乳糖醛酸为对照品；

所述总蛋白质含量的测定采用BAC蛋白浓度测定试剂盒检测，检测波长562nm，以牛血清白蛋白为对照品。所述计算方法采用各组分中性糖、糖醛酸、总蛋白质以及三者总和作为枸杞多糖相关样品含量进行分析。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明针对枸杞多糖的分子量和结构特征，采用DEAE色谱柱对枸杞多糖各组分的组成进行多波长在线特征谱分析，结合HPSEC色谱对其分子量进行测定，从而实现了枸杞多糖的专属性特征分析。本发明研究表明，枸杞多糖组分主要由4-6种分子量相近的组分构成，仅采用HPSEC无法进行有效分离和表征，因而选用DEAE色谱柱实现在线分离和检测，并结合HPSEC法测定分子量，紫外-可见分光光度法测定中性糖、糖醛酸、总蛋白质含量，从而实现了枸杞多糖的定性和定量分析。研究方法可适用于枸杞属植物的枸杞多糖提取物及其组合提取物进行产品质量控制，特别适用于宁夏枸杞果实或茎叶或根皮中的枸杞多糖提取物及其组合提取物的产品质量控制。枸杞多糖的系统质量分析方法未见文献报道，相关研究成果具有创新性和新颖性。

附图说明

图1是本发明实施例一的枸杞多糖提取物样品LBP的DEAE离子交换色谱图。

图2至6是发明实施例一的枸杞多糖提取物样品LBP、P1-P4(1-4)的HPSEC色谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

一种枸杞多糖提取物的检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取枸杞多糖提取物适量，进行精密称定，用水或所需流动相溶液配制为供试品溶液，即得；

(2)供试品特征谱分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器以波长210和280nm检测，二乙氨乙基弱阴离子交换色谱柱，无机盐溶液为流动相洗脱；供试品溶液进样体积2-20μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

(3)供试品分子量分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器以波长210和280nm检测，高效分子排阻色谱柱，无机盐溶液为流动相等度洗脱；供试品溶液进样体积10-100μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

(4)供试品含量分析：采用紫外-可见分光光度仪，分别测定供试品溶液的中性糖、糖醛酸、总蛋白质含量，计算，即得。

一、枸杞多糖提取物和供试品溶液的制备

以枸杞子为实施例，枸杞多糖提取物的制备方法：称取干燥的枸杞子药材500g，分别用5L 75％乙醇回流提取2次，每次1.5h；药渣再分别用5L去离子水回流提取2次，每次1h，水提液合并，在搅拌下加入乙醇至醇浓度70％，过滤，水复溶、sevag法去蛋白，冷冻干燥，得枸杞多糖提取物(LBP)。

此外，另取枸杞多糖提取物5g，采用中压制备色谱系统，依次经DEAE650M填料分离、色谱峰1-4各经超滤浓缩、Sephadex G25脱盐，冷冻干燥，获得4个枸杞多糖纯品P1-P4。

取枸杞多糖提取物适量，精密称定，用水或所需流动相溶液配制为供试品溶液，即得。

二、特征谱分析

选用岛津LC 20A液相系统，DAD检测器以波长210和280nm检测，DEAE-5PW(2.0×75mm，10μm)离子交换色谱柱；以40mM Tris-HCl(pH9.0)为流动相，0.3M NaCl～40mM Tris-HCl(pH9.0)为流动相B，线性梯度洗脱40min，流速0.1mL·min^-1，柱温30℃；供试品溶液(1.0mg/mL)进样体积3μL，注入液相色谱仪，测定，计算主要色谱峰的保留时间，即得。LBP的分析结果参见附图1。

由图1可见，LBP的特征谱中显示：280nm谱图中主要由色谱峰1-6组成，210nm谱图中主要由色谱峰1-4组成，对应于6个主要的枸杞多糖组分；色谱峰2在280nm检测时的吸光度较低，在210nm检测时表明其含量较高；色谱峰5-6的含量较低。

研究过程中，首先考察了分离填料的影响，发现强阴离子交换填料(GP-Q30)、疏水层析填料(SP、HP6030、GP)分离效果欠佳，弱阴离子交换层析填料(DEAE 80、DEAE 60、DEAE-6XL、DEAE-650M、DEAE-FF)均有较好分离效果；其中DEAE-650M填料(对应色谱柱填料型号为DEAE-5PW)。在分析系统方面，选用中压色谱或高效液相色谱均可取得良好分离，其中高效液相系统分离周期短，选作为优选方案。

进一步考察流动相的影响，发现无机盐种类对分离度有较大影响，其中NaCl、Tris-HCl为流动相效果较优，选用Tris-HCl作为平衡流动相A，含NaCl的Tris-HCl作为流动相B。研究中意外发现，流动相浓度、pH值对枸杞多糖的保留行为有重大影响，常规的低盐浓度(0.05-0.15)、中性pH(6.0-7.0)条件下枸杞多糖保留时间重复性欠佳；经多次实验尝试，最终选用20-40mM Tris-HCl(pH7.5-9.5)作为A相可取得满意分离效果，相应的B相可选用0.3-1.0M NaCl～20-40mM Tris-HCl(pH7.5-9.5)进行梯度洗脱。

三、分子量分析

采用高效分子排阻色谱色谱法，检测供试品分子量。色谱条件：选用岛津LC 20A液相系统，DAD检测器以波长210和280nm检测，TSK G4000PW_XL色谱柱(7.8×300mm)色谱柱；以0.5M硫酸铵为流动相等度洗脱30min，流速0.5mL·min^-1，柱温30℃。供试品溶液(1.0mg/mL)进样体积20μL，注入液相色谱仪，测定，计算主要色谱峰的保留时间；采用T10、T40、T70、T110、T200系列分子量的葡聚糖(5.0mg/mL)为标准品绘制标准曲线，测定枸杞多糖的相对平均重均分子量。附图1中LBP和色谱峰1-4的分析结果参见附图2-6。

结果分析：以葡聚糖系列对照品的重均分子量对数值lg Mw对t_R作线性回归，得到回归方程为y＝-28.486x+474.42，R²＝0.9919，表明该多糖在10-200kD的分子量范围内lgMw对t_R呈较好的线性关系。相应地，枸杞多糖样品P1-P4按葡聚糖标曲计算的相对重均分子量约在65-69kD，见表1。结果表明，枸杞多糖组分1-4主要由分子量6-7万的一组多糖组成，这些多糖分子量相近，但所带蛋白质含量不同。

表1枸杞多糖LBP中四种组分的相对重均分子量

样品	P1	P2	P3	P4
					<u>t<sub>R</sub></u>/min	14.22	14.35	14.28	14.35
Mw/<u>kD</u>	69.11	65.42	67.01	65.42

在方法学考察中，同样发现流动相中无机盐种类和浓度对分析结果的重现性有重大影响。其中，选用0.2-0.5M NaCl或者硫酸铵较优。

四、供试品含量分析

采用紫外-可见分光光度仪，分别测定供试品溶液的中性糖、糖醛酸、总蛋白质含量。其中，中性糖含量的测定采用硫酸-苯酚法，检测波长490nm，以葡萄糖或者半乳糖或者阿拉伯糖为对照品；半乳糖醛酸含量的测定采用咔唑-硫酸法，检测波长540nm，以葡萄糖醛酸为对照品；总蛋白质含量的测定采用BAC蛋白浓度测定试剂盒检测，检测波长562nm，以牛血清白蛋白为对照品。

结果分析：枸杞多糖LBP和组分P1-P4的中性糖、糖醛酸、蛋白质总含量见表2。由总含量可见，各多糖组分纯度均大于93％。其中，P1-P4各组分的总蛋白质含量依此增高，而总糖醛酸含量变化趋势不一致，表明总蛋白质是影响离子交换分离作用的主要因素。

表2枸杞多糖LBP的中性糖、糖醛酸、蛋白质总含量

样品	LBP	P1	P2	p3	P4
						总中性糖(％)	46.44	67.90	73.05	71.15	64.08
总糖醛酸(％)	36.85	18.08	11.85	8.50	14.63
						总蛋白质(％)	15.10	7.27	8.23	15.77	18.67
总计	98.39	93.25	93.13	95.42	97.37

此外，采用HPAEC-PAD离子色谱仪，对枸杞多糖LBP和组分P1-P4的全水解样品进行单糖组成分析。Dionex CarboPac PA-1色谱柱(4×250mm)；以15mM NaOH为流动相A，以15mMNaAc-15mM NaOH为流动相B，梯度洗脱程序为0～10min，0％B；10～40min，0-100％B；流速1mL/min；根据单糖的保留时间确定样品中存在的各单糖组成成分。结果：枸杞多糖组分P1-P4均主要含有岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡糖糖、甘露糖等六种单糖，其中阿拉伯糖与半乳糖含量较高；总多糖LBP中也含有该6种多糖，其中阿拉伯糖、葡萄糖含量较高，并含有较高含量的半乳糖醛酸。结果提示，可对枸杞多糖中的中性糖、糖醛酸含量进行测定，作为质量标准指标之一。

采用氨基酸自动分析仪，检测枸杞多糖样品的氨基酸组成。经测定，枸杞多糖LBP和组分P1-P4均含有组氨酸，胱氨酸，天门冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，羟脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，精氨酸等18种氨基酸。结果提示，可对枸杞多糖中的总蛋白质含量进行测定，作为质量标准指标之一。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取枸杞多糖提取物适量，用水或所需流动相溶液配制为供试品溶液，即得；

(2)供试品特征谱分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器以波长210和280nm检测，二乙氨乙基弱阴离子交换色谱柱，无机盐溶液为流动相洗脱；供试品溶液进样体积2-20μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

(3)供试品分子量分析：采用高效液相色谱仪，紫外检测器以波长210和280nm检测，高效分子排阻色谱柱，无机盐溶液为流动相等度洗脱；供试品溶液进样体积10-100μL，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

(4)供试品含量分析：采用紫外-可见分光光度仪，分别测定供试品溶液的中性糖、糖醛酸、总蛋白质含量，计算，即得。

2.根据权利要求1所述的枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于：所述枸杞多糖提取物由枸杞属植物中提取获得。

3.根据权利要求1所述的枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的无机盐选用NaCl或者Tris-HCl。

4.根据权利要求3所述的枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的无机盐溶液选用20-40mM Tris-HCl、0.3-1.0M NaCl和20-40mM Tris-HCl梯度洗脱；

其中，所述20-40mM Tris-HCl的pH为7.5-9.5，所述0.3-1.0M NaCl和20-40mM Tris-HCl的pH为7.5-9.5。

5.根据权利要求1所述的枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的无机盐选用NaCl或者硫酸铵。

6.根据权利要求5所述的枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的无机盐溶液选用0.2-0.5M硫酸铵。

7.根据权利要求1所述的枸杞多糖提取物的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中的中性糖含量的测定采用硫酸-苯酚法，检测波长490nm，以葡萄糖或者半乳糖或者阿拉伯糖为对照品；

所述半乳糖醛酸含量的测定采用咔唑-硫酸法，检测波长540nm，以葡萄糖醛酸或者半乳糖醛酸为对照品；

所述总蛋白质含量的测定采用BAC蛋白浓度测定试剂盒检测，检测波长562nm，以牛血清白蛋白为对照品。

8.权利要求1至7任一项所述的枸杞多糖提取物的检测方法在枸杞属植物的枸杞多糖提取物及其组合提取物中质量控制方面的应用。

9.权利要求1至7任一项所述的枸杞多糖提取物的检测方法在宁夏枸杞果实或茎叶或根皮中的枸杞多糖提取物及其组合提取物中质量控制方面的应用。