CN105158391B - 诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，具体步骤为将诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎经固相萃取等步骤制备成供试品溶液，在一定条件下进行高效液相色谱分析检测，获得诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物的HPLC指纹图谱。通过对10批次样品的HPLC指纹图谱分析，确定共有特征峰，得到标准指纹图谱。该标准指纹图谱能够为诱导愈伤组织培养大蒜的品种鉴别和生产质量控制提供可靠的依据。本发明操作便捷，稳定性高，特异性强，重现性好，特征峰较多，分析效率高，利用本发明将能对诱导愈伤组织培养大蒜进行真伪鉴别，并能全面、准确、有效的评价其内在品质质量。

Description

诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立 方法

本发明得到“天津市农委重点项目（201302030）和天津师范大学应用开发研究基金”资助。

技术领域

本发明属于涉及诱导愈伤组织培养植物指纹图谱的构建方法，尤其是诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。

背景技术

大蒜(Allium sativum L.)百合科葱属，二年生草本植物，食药兼用，在世界范围内被广泛种植。目前，我国是最大的大蒜生产国，国内种植大蒜69.2万公顷，占世界种植面积的1/2左右，我国大蒜的总产量占世界总产量3/4以上，产量1208.8万吨。大蒜作为人们生活中必不可少的蔬菜和调味品，营养丰富，含有多种对人体有益的化学成分，包括其中含硫挥发物43种，硫化亚磺酸（如大蒜素）酯类13种、氨基酸9种、肽类8种、糖苷类12种、酶类11种等。大蒜鳞茎、幼苗及花茎均可食用。大蒜还具有较强的药用价值，具有杀菌、消炎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效。但目前在农业生产上，由于大蒜常年进行无性繁殖，致使大蒜花叶病毒、洋葱黄矮病毒、韭葱黄条纹病毒、青葱潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒、洋葱螨传潜隐病毒、马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒等病原体在大蒜母体内传播，逐代积累，导致大蒜优良种性不断退化，严重影响大蒜产量。

植物组织培养脱毒快繁技术能有效地降低大蒜体内的病毒，使大蒜保持优良种性，提高农业生产上的繁殖系数。植物组织培养是指在无菌环境条件下，人工控制温度、光照、湿度、营养、激素等条件，利用培养基提供养分，对离体的植物器官、组织、细胞或者原生质体进行培养，使其再生细胞或形成完整植株的生物技术。本发明涉及的材料取自农艺性状优良的宝坻特有大蒜品种“六瓣红”，经过愈伤组织培养所培育的大蒜。

宝坻特有品种“六瓣红”大蒜，蒜头致密紧实，一般每头6瓣左右，单柱型围座，无加楔，无重瓣，蒜瓣洁白脆嫩，辛辣汁多味浓，易贮藏，耐运输，抗病性较强，辣味柔和适口，生、熟食用俱佳。“六瓣红”大蒜以其优良的农艺性状、丰富的营养成分以及良好的口感，一直保持着名优特产的地位，深受国内外消费者喜爱，目前已远销日本、韩国及东南亚等多个国家和地区。

如何评价诱导愈伤组织培养植物是否完全继承亲本植物所具有的优良农艺性状，既全面评估和控制愈伤组织培养植物的品质质量，是这一技术应用于农业生产方面亟待解决的问题。

指纹图谱技术已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一。它可以较全面、准确、直观的反映多种成分在中药或其制剂中的分布，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法。运用指纹图谱技术，通过对指纹图谱中主要特征峰的识别或比例的测定，可以鉴别中药材和中成药的真伪，有效评价产品质量的均一性和稳定性

蒜氨酸酶是大蒜中的一类内源酶，存在于细胞液泡内，蒜氨酸则以稳定的形态存在于细胞质中。当大蒜鳞茎收到外力作用，细胞结构遭到破坏，蒜氨酸酶与蒜氨酸相接触，发生酶解反应，生成一系列蒜氨酸代谢产物如二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚等。由此可见，在提取过程中使蒜酶灭活，可充分反应大蒜中天然状态下的化合物成分。但是目前有关诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物的指纹图谱还未见报道。

鉴于以上不足，有必要发明一种建立诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物指纹图谱的新方法，使之能够简便、稳定、可重复、全面、精确的评价诱导愈伤组织培养大蒜的质量，从而既加强了对诱导愈伤组织培养大蒜真伪鉴别能力，又能提高了诱导愈伤组织培养大蒜质量的全面评估和控制，弥补了现有检测方法的不足，使之更加科学、完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有诱导愈伤组织培养大蒜品质管理检测方法的不足，而提供一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法。该方法通过将诱导愈伤组织培养大蒜制备成蒜酶灭活提取物待测溶液，经固相萃取技术分离浓缩，再经由高效液相色谱仪分析检测，获得指纹图谱，为其真伪鉴别以及品质控制提供可靠依据和技术方法。

本发明诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：该方法按如下的步骤进行：

（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（3）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6×12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱；

本发明还提供上述大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱得到的诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。

将10批次诱导愈伤组织培养大蒜样品按上述方法制备成供试品溶液，由上述方法分离检测，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物标准指纹图谱。该方法确定了14个共有特征峰，其保留时间分别为：2.178 min、2.756 min、2.946 min、3.382 min、3.823 min、4.712min、6.511 min、7.088 min、8.021 min、9.143 min、10.639 min、13.107 min、14.973 min、18.391 min，相对标准偏差（RSD）<1%，这些共有特征峰构成了诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。

本发明公开的诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法与现有技术相比所具有关键之处在于：

（1）样品前处理简便，易于操作，采用固相萃取技术对样品进行预分离浓缩，得到的供试品溶液所含杂质少，不污染色谱柱，对色谱图信号干扰小；

（2）色谱条件简便易行，重现性好；

（3）本发明能够最大程度上提取大蒜鳞茎天然状态下的有机物成分，在此基础之上建立的HPLC指纹图谱对“六瓣红”大蒜品质控制更具针对性和实用性。

（4）本发明色谱体系下各色谱峰分离较好，不仅能从整体上识别诱导愈伤组织培养大蒜化学成分的特点。

（5）本发明分析效率高，稳定性好，特异性强，重现性好，特征峰较多，利用本发明能对诱导愈伤组织培养大蒜进行真伪鉴别，并能全面、准确地评价其内在品质质量。

附图说明：

图1是诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱；

图2是诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。所用各种原料均有市售。

实施例1：

诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，该方法步骤如下：

（1）样品、试剂盒仪器：诱导愈伤组织培养大蒜，使用安捷伦1200型高效液相色谱仪，试剂均为色谱纯或分析纯；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（3）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（4）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6×12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL。

分别精密吸取各供试品液溶液，在上述色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测，得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱,见图1。

实施例2：诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱的建立方法，该方法步骤如下：

（1）样品、试剂盒仪器：诱导愈伤组织培养大蒜共10批次，使用安捷伦1200型高效液相色谱仪，试剂均为色谱纯或分析纯；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（3）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（4）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6×12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱。

（5）重复上述（1）至（4），使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件对10批次诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱进行分析，确定了14个共有特征峰，其保留时间分别为：2.178 min、2.756 min、2.946 min、3.382min、3.823 min、4.712 min、6.511 min、7.088 min、8.021 min、9.143 min、10.639 min、13.107 min、14.973 min、18.391 min，相对标准偏差（RSD）<1%，这些共有特征峰构成了诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱，见图2。

表1提供的是《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件相似度计算结果，各样品与对照指纹图谱的相似度均达到0.99以上，说明本发明确定的诱导愈伤组织培养蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱是准确的。

表1 各批次诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱相似度计算结果

实施例3：

利用对诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱与其亲本及其他品种大蒜进行色谱分析，该方法步骤如下：

（1）样品、试剂盒仪器：亲本宝坻“六瓣红”大蒜，新疆白皮大蒜，使用安捷伦1200型高效液相色谱仪，试剂均为色谱纯或分析纯；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（3）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（4）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6×12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱。

分别精密吸取供试品液溶液，在上述色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测，得到相应大蒜样品的HPLC指纹图谱。

表2提供的是《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件相似度计算结果，其中S1为诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物标准指纹图谱，S2、S3为亲本宝坻“六瓣红”大蒜，S4、S5为新疆白皮大蒜。由计算结果可以看出，亲本宝坻“六瓣红”大蒜与标准指纹图谱相似度较高，为0.999，说明组织培养后获得的大蒜与亲本相比品质稳定；而新疆白皮大蒜与标准指纹图谱相似度较低，为0.984和0.983，说明利用该方法可以有效进行诱导愈伤组织培养大蒜的真伪鉴别，并能全面、准确地评价其内在品质质量，确保与亲本品质的一致性。

表2 不同大蒜样品与标准图谱相似度计算结果

Claims (2)

1.一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（3）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6×12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱；

（4）重复上述（1）至（3），对10批次诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物建立HPLC指纹图谱，通过比较分析确定了14个共有特征峰，其保留时间分别为：2.178 min、2.756 min、2.946 min、3.382 min、3.823 min、4.712 min、6.511 min、7.088 min、8.021 min、9.143min、10.639 min、13.107 min、14.973 min、18.391 min，相对标准偏差（RSD）<1%，这些共有特征峰构成了诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。

2.一种诱导愈伤组织培养大蒜品种鉴别的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；5ml甲醇洗脱后室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（3）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6x12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC色谱图；

（4）将步骤（3），得到的大蒜HPLC色谱图与诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱进行对比，通过对其所含化学成分差异的分析鉴别大蒜品种或品质质量。