CN109852714B

CN109852714B - 一种肠癌早期诊断和腺瘤诊断标志物及用途

Info

Publication number: CN109852714B
Application number: CN201910170797.2A
Authority: CN
Inventors: 邵阳; 汪笑男; 包华; 丁克峰; 吴雪; 刘凯华; 张宪; 刘思思
Original assignee: 南京世和基因生物技术有限公司
Priority date: 2019-03-07
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2039-03-07
Also published as: CN109852714A

Abstract

本发明涉及一种肠癌早筛和腺瘤诊断标志物及用途，属于分子生物医学技术领域。本研究首次通过血浆cfDNA来研究肠癌、腺瘤和健康人的菌群差异，并筛选出具有明显差异的肠道菌群，然后通过随机森林的方法，建立肠癌风险预测模型，适用于肠癌和腺瘤的筛查与诊断，用于鉴定早期肠癌和腺瘤。

Description

一种肠癌早期诊断和腺瘤诊断标志物及用途

技术领域

本发明涉及一种肠癌（colorectal adenocarcinoma ,ADC）早筛和腺瘤(adenoma,ADM)诊断标志物及用途，属于分子生物医学技术领域。

背景技术

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，全球每年的新发病例是1.3亿，到目前为止，结直肠癌的病因及发病机制仍不完全明确，若肠癌在早期中被诊断出来，5年的生存率可达到80%以上，而发展成为晚期被发现，生存率仅有10%。因此，现在亟需新型的诊断标志物来进行肠癌的早期诊断。Fearon等认为大部分的腺瘤会进展为肠癌，因此，腺瘤是肠癌早期的一个指征，进行腺瘤的诊断也具有重要意义。

目前腺瘤和肠癌的金标准是肠镜，但是肠镜具有侵入性，因此通过无创的方法来对腺瘤和腺瘤进行筛查是目前需要解决的问题，但受限于现有无创诊断的方法敏感性低。近年来的研究发现肠道微生物及其代谢产物的改变可能在结直肠癌的发生发展过程中发挥着举足轻重的作用，组织和粪便检测是肠癌和腺瘤诊断的选择媒介，由于组织样本为有创检测，且样本难以获得，所以应用最广泛的为粪便的检测。通过16s rDNA的测序，鉴定出菌群的情况。其中检测为阳性的患者会进一步用金标准肠镜侵入性方法进行确认。粪便菌群预测的敏感性低，在诊断肠癌上仅有13%-50%，在诊断腺瘤上敏感性更低，仅为9%-24%。因此，现有技术中的方法存在着以下问题：1、对肿瘤组织部位进行提取样本时，存在着创伤性；2、早期诊断效果差； 3、检测敏感性低。

发明内容

本发明的目的是：提供了一种对血浆样本cfDNA进行WGS测序，通过对高通量测序结果进行肠癌健康人差异菌群分析、构建模型，实现了对肠癌和腺瘤无创精准诊断的目的。

本发明的第一个方面，提供了：

一种肠癌诊断标志物，包括以下的菌种：

柱状黄杆菌（Flavobacterium）、极地杆菌（Polaribacter）、Lacinutrix、Formosa、黄杆菌属（Tenacibaculum）、海洋细菌（Maribacter）、噬碳酸菌（Capnocytophaga）、藤黄栖沉积物杆菌（Sediminicola）、肠球菌（Enterococcus）、盐厌氧菌（Halanaerobium）、链球菌（Streptococcus）、Yoonia、Frondihabitans、Nakamurella、棍状杆菌（Clavibacter）、冷冻杆菌（Cryobacterium）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium）、Sulfuricaulis、海草球菌（Phycicoccus）、微杆菌（Microbacterium）、罗斯氏菌（Roseburia）、布劳特氏菌（Blautia）、类诺卡氏菌（Nocardioides）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、真杆菌（Eubacterium）。

本发明的第二个方面，提供了：

上述的诊断标志物的检测试剂在应用于制备肠癌或者腺瘤的无创诊断试剂中的应用。

在一个实施方式中，所述的应用还包括如下步骤：

S1：获取待测样本以及正常样本的血浆，提取cfDNA，采用高通量测序方法进行测序，获得测序读段；

S2；将测序读段比对至人类参考基因组，去除掉人源的DNA序列读段；

S3：将剩下的读段比对至微生物基因组数据库，获得能够比对至所述的诊断标志物的微生物序列的读段，统计读段数目；

S4：对于每种细菌，将数目对所述的细菌的基因全长做归一化处理，得到相对丰度；

S5：采用细菌的相对丰度作为输入值，通过机器学习分类算法判断待测样本与正常样本进行分类。

在一个实施方式中，机器学习过程采用患病的概率作为输出值。

在一个实施方式中，机器学习分类算法是随机森林算法。

在一个实施方式中，高通量测序方法的测序深度为1-30乘。

在一个实施方式中，诊断标志物用于提高诊断特异性和敏感性。

本发明的第三个方面，

一种用于肠癌诊断的细菌种类的筛选方法，包括如下步骤：

S1，获取病人样本和正常样本的血浆，提取cfDNA，采用高通量测序方法进行测序，获得测序读段；

S2，将测序读段比对至人类参考基因组，去除掉人源的DNA序列读段；

S3，确定出候选细菌种类；

S4，将剩下的读段比对至微生物基因组数据库，获得能够比对至所述的候选细菌的序列的读段，统计读段数目；

S5，对于每种细菌，将数目对所述的细菌的基因全长做归一化处理，得到相对丰度；

S6，从病人样本和正常健康人样本中选取一部分作为训练集，另一部分作为验证集，采用机器学习方法进行分类模型构建，以采用每种细菌的相对丰度作为输入值，对病人样本和正常健康人样本进行分类，通过验证集进行模型的验证，并且通过递归特征消除方法删除掉不具有显著区别的细菌种类。

在一个实施方式中，采用是否患病的概率作为输出值。

在一个实施方式中，机器学习采用随机森林算法。

有益效果

本发明首次基于血浆cfDNA高通量测序提供了菌群与肠癌关系的诊断模型，该模型不仅能够诊断早期肠癌还能够诊断腺瘤，具有无创检测、通量高、检测特异性和敏感性高的优点。

附图说明

图1：肠道菌群作为肠癌和腺瘤的无创诊断模型的研究设计和实验流程图

图2：肠癌和健康人显著差异的菌群（Q-Value<0.05）

图3：肠癌预测模型在验证组中独立诊断肠癌和健康人

图4：肠癌预测模型在验证组中独立诊断肠癌和健康人的ROC曲线图

图5：肠癌预测模型在验证组中独立诊断腺瘤和健康人

图6：肠癌预测模型在验证组中独立诊断腺瘤和健康人的ROC曲线图

图7：1乘测序条件下肠癌预测模型在验证组中独立诊断肠癌和健康人

图8：1乘测序条件下肠癌预测模型在验证组中独立诊断肠癌和健康人的ROC曲线图

图9：1乘测序条件下肠癌预测模型在验证组中独立诊断腺瘤和健康人

图10：1乘测序条件下肠癌预测模型在验证组中独立诊断腺瘤和健康人的ROC曲线图

具体实施方式

本发明探究了一种新的检测媒介，血浆cfDNA用来进行菌群的检测。旨在通过无创的方法评估肠道微生物组作为肠癌和腺瘤的诊断能力，提高早期肠癌和腺瘤无创诊断的精确性。

本发明的实验方法步骤如图1所示。

本发明中的涉及到的人群样本的情况

从2017.8-2018.12收集了25例II期和III期肠癌，11例腺瘤和22例健康人，所有入组的患者签署知情同意书。肠癌和腺瘤均为活体组织经病理学确认结果，健康人为常规体检正常，并且做肠镜排除肠道病变的人群。将入组人员分为训练组和验证组，信息如下：

表1 训练组人员的临床信息

表2 验证组人员的临床信息

血浆cfDNA样本的提取

采用紫色血液收集管（EDTA抗凝管）收集患者8ml全血样本，及时离心分离血浆（2小时内），转运至实验室后，血浆样本采用QIAGEN血浆DNA提取试剂盒按照说明书进行ctDNA提取。

测序方法

本发明中对采集到的cfDNA样本进行WGS~30乘测序。在获得了下机数据之后，首先将数据比对至人类参考基因组上，去除掉能够比对至人类基因组参考序列的读段；再将剩下的读段通过kraken软件比对至微生物基因组数据库中（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/, July 19, 2018），根据比对到该菌种上的读段数目来计算箘的丰度。将菌的长度与测序的读段数目进行均一化，将读段数目除以菌的基因长度之后，就可以使得菌群的丰度不受菌群基因大小的影响，计为菌的相对丰度（relative abundance）。

菌群的筛选

将训练组（表1）中的12例肠癌和11例健康人进行差异菌群的筛选，使用多变量相关线性模型 (Multivariate association with linear models, Maaslin)来计算两组之间菌群丰度差异的概率。确立一个非常严格的显著阈值，Q-Value < 0.05，定义菌群的特异性。

经过了筛选之后，得到了具有显著性差异的75个细菌类别。这75个细菌类别的信息如下：

Flavobacterium gilvum（柱状黄杆菌）、Yoonia vestfoldensis、Polynucleobacter duraquae（多核杆菌）、Flavobacterium branchiophilum（分枝黄杆菌）、Maribacter sp. T28（海洋细菌T28）、Bifidobacterium adolescentis（双歧杆菌）、Flavobacterium commune（黄杆菌）、Polaribacter sp. BM10（极地杆菌BM10）、Rhodolunalacicola、Lacinutrix sp. 5H-3-7-4、Polynucleobacter necessarius（多核杆菌）、Polaribacter vadi、Aurantimicrobium sp. MWH-Mo1、Olleya sp. Bg11-27、Streptococcus suis（链球菌）、Roseburia intestinalis（罗斯氏菌）、Aurantimicrobiumminutum、Polaribacter sp. ALD11、Flavobacterium crassostreae（克拉索氏黄杆菌）、Clavibacter michiganensis subsp. Capsici（棍状杆菌）、Flavobacterium sp.MEBiC07310（黄杆菌）、Flavobacterium columnare（柱状黄杆菌）、Croceibacteratlanticus、Nocardioides dokdonensis（类诺卡氏菌属）、Flavobacteriumpsychrophilum（黄杆菌）、Wenyingzhuangia fucanilytica、Flavobacterium faecale（黄杆菌）、Myroides odoratus（气味类香味菌）、Flavobacterium sp. HYN0086（黄杆菌）、apnocytophaga sp. H4358（二氧化碳噬纤维菌属）、Limnohabitans sp. 63ED37-2、Polaribacter sp. KT25b、Faecalibacterium prausnitzii、Algibacteralginicilyticus、Formosa sp. Hel3_A1_48、Ruminococcus torques（瘤胃球菌）、Sulfuricaulis limicola（有限硫菌）、Gramella flava、Flavobacterium crocinum（（黄杆菌）、Microbacterium foliorum（细杆菌）、Propionibacterium freudenreichii（费氏丙酸杆菌）、Rhodoplanes sp. Z2-YC6860（红曲霉）、Lutibacter sp. LPB0138、Tenacibaculumdicentrarchi（双乳杆菌）、Polynucleobacter difficilis（多核杆菌）、Eubacteriumrectale（真杆菌）、Flavobacterium indicum（黄杆菌）、Nonlabens sp. MB-3u-79、Phycicoccus dokdonensis、Polaribacter sejongensis（中华波氏杆菌）、Olleyaaquimaris（水曲霉）、Halanaerobium hydrogeniformans、Flavobacterium sp. AJ004（黄杆菌）、Limnohabitans sp. 103DPR2、Polaribacter sp. MED152、Pseudarcicella sp.HME7025、Candidatus Pelagibacter sp. RS39、Blautia obeum、Ruminococcus sp. SR1/5、Enterococcus rotai（罗泰肠球菌）、Nakamurella multipartita、Tenacibaculumjejuense、Sediminicola sp. YIK13、Conexibacter woesei、Zunongwangia profunda、Polaribacter sp. KT 15、Polaribacter sp. SA4-12、Tamlana sp. UJ94、CandidatusPlanktophila dulcis（白斑假丝酵母）、Winogradskyella sp. J14-2、Fluviicolataffensis、Cryobacterium sp. LW097（冷杆菌）、Mycoplasma dispar（不等支原体）、betaproteobacterium CB（变形菌）、Frondihabitans sp. PAMC 28766

以上的菌种信息可以在（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/, July19, 2018）进行获取。

接下来，将Q-Value< 0.05的75个细菌类别使用随机森林算法进行分类，同时采用递归特征消除筛选（recursive feature elimination）算法来筛选最佳菌种组合，在75个菌种中分别做 5-30 个菌种组合筛选，将训练组样本随机对半，一半用来训练，一半用来验证, 模型的输入变量是75个细菌类别相对丰度，模型的输出变量是对病人和健康人群的分类概率，重复50次交叉验证，选择性能最好的菌种组合，其中在28个菌组合时ROC值最高为0.9441，如表3所示。

表3 特征递归消除筛选最佳数目菌种组合

经过以上的筛选过程，得到了本发明所提供的肠癌诊断标志物，包括以下的菌：

柱状黄杆菌（Flavobacterium）、极地杆菌（Polaribacter sp.）BM10、极地杆菌（Polaribacter）vadi、极地杆菌（Polaribacter）sejongensis、Lacinutrix、Formosa、黄杆菌属（Tenacibaculum）、海洋细菌（Maribacter）、噬碳酸菌（Capnocytophaga）、藤黄栖沉积物杆菌（Sediminicola）、肠球菌（Enterococcus）、盐厌氧菌（Halanaerobium）、链球菌（Streptococcus）、Yoonia、Frondihabitans、Nakamurella、棍状杆菌（Clavibacter）、冷冻杆菌（Cryobacterium）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium）、Sulfuricaulis、海草球菌（Phycicoccus）、微杆菌（Microbacterium）、罗斯氏菌（Roseburia）、布劳特氏菌（Blautia）、类诺卡氏菌（Nocardioides）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、真杆菌（Eubacterium）。

注：以上菌有属和种两个分级，种为属的下一级，其中Polaribacter sp. BM10、Polaribacter vadi、Polaribacter sejongensis为种的级别，其它25个菌为属的级别。极地杆菌可以选自极地杆菌（Polaribacter sp.）BM10、极地杆菌（Polaribacter）vadi、极地杆菌（Polaribacter）sejongensis。

以上25个菌属细化到种分别为：Flavobacterium sp. MEBiC07310、Lacinutrixsp. 5H-3-7-4、Formosa sp. Hel3_A1_48、Tenacibaculum dicentrarchi、Maribacter sp. T28、Capnocytophaga sp. H4358、Sediminicola sp. YIK13、Enterococcus rotai、Halanaerobium hydrogeniformans、Streptococcus suis、Yoonia vestfoldensis、Frondihabitans sp. PAMC 28766、Nakamurella multipartita、Clavibacter capsici、Cryobacterium sp. LW097、Propionibacterium freudenreichii、

Sulfuricaulis limicola、Phycicoccus dokdonensis、Microbacteriumfoliorum、Roseburia intestinalis、

Blautia obeum、Nocardioides dokdonensis、Ruminococcus torques、Bifidobacterium adolescentis、

Eubacterium rectale。

以上的菌种可以用于对肠癌进行诊断，在诊断的过程中，首先，通过血浆提取cfDNA，进行高通量测序，从测序结果当中去除掉人源的DNA读段，并对比出标志物菌种的读段，以读段的丰度作为数值，将肠癌与健康人的菌群相对丰度进行比对，筛选出肠癌和健康人差异明显的菌群，并通过递归特征消除筛选算法来筛选最佳菌种组合，筛出28个差异菌群用于建立区分肠癌和健康人的模型，分析在检测样本与健康人样本是否存在差异性，来判定是否存在肠癌。

另外，上述的菌种标志物同样也可以应用于对早期的腺瘤的诊断，方法也一致。

上述的菌种是本发明通过在众多的菌种中进行筛选得到的，意外地发现了这28种菌表面出了极高的检测灵敏性和特异性。

采用以上表2的训练样本，使用28个菌种组合在训练组中用随机森林方法建模，模型的输入值为28个菌的相对丰度（relative abundance）,并通过随机森林的模型输出样本在两个分类（肠癌和健康人）中的概率。其中Predict ADC Value为样本定义为诊断成肠癌的概率，Predict HP Value为样本定义为诊断为健康人的概率。

表4 训练组中模型计算结果

表4为12例肠癌和11例健康人训练组的计算结果。模型在该训练组中ADC风险预测概率（ Predict ADC Value）在肠癌和健康人中分开显著， ADC和HP 达到100%分开。且将Predict ADC Value 的cut off值设在0.31-0.81区间内均能将肠癌和健康人分开。

模型的验证

1.肠癌的诊断

在验证组中该模型同样能够完全区分肠癌和健康人：将验证组13例老年肠癌和11例年轻健康人（表2）输入肠癌风险预测模型， Predict ADC Value在肠癌和健康人中分开显著， ADC和HP 100%分开，模型预测 AUC值达到了1，95％置信区间(CI)为1到1，如图3和图4所示。

2.腺瘤的诊断

将验证组中10例腺瘤和11例肠癌输入风险预测模型，结果发现该模型能够完全区分健康人和腺瘤。如图5所示，该模型能够100%将腺瘤和健康人区分开来。ADC风险预测值（Predict ADC Value）在腺瘤和健康人中分开显著， ADM和HP 100%分开，模型预测 AUC值达到了1，95％置信区间(CI)为1到1，如图5和图6所示。

3. 1乘数据下的肠癌的诊断

降低测序成本，模拟1乘测序，能够完全诊断出肠癌。为降低测序成本，更容易将模型转化到临床应用中，将测序数据进行稀释，使其模拟1乘低深度的测序结果，然后用以上的28个菌种重新建模，并在验证集中验证。结果表明，1乘测序条件下的模型在依然能够将肠癌和健康人和完全区分开，如图5所示，Predict ADC Value在肠癌和健康人中分开显著，达到100%分开，模型预测 AUC值仍然为1， 95％置信区间(CI)为1到1，如图7和图8所示。

4. 1乘数据下的腺瘤的诊断

将验证组的腺瘤和健康人输入 1乘预测的模型，虽然没有肠癌组那样显著，但是Predict ADC Value在腺瘤和健康人中也达到了100%分开，ADM组Predict ADC Value最低值为0.31，HP组Predict ADC Value最高值为0.308。模型预测 AUC值仍然为1，95％置信区间(CI)为1到1，如图9和图10所示。

本研究首次通过血浆cfDNA来研究肠癌、腺瘤和健康人的菌群差异，并筛选出28个具有明显差异的肠道菌群，然后通过随机森林的方法，建立肠癌风险预测模型，适用于肠癌和腺瘤的筛查与诊断，用于鉴定早期肠癌和腺瘤。

Claims

1.肠癌诊断标志物的检测试剂在应用于制备血浆cfDNA的肠癌或者腺瘤的诊断试剂中的应用，其特征在于，肠癌诊断标志物是由以下的菌种所组成：

柱状黄杆菌（Flavobacterium）、极地杆菌（Polaribacter）、Lacinutrix、Formosa、黄杆菌属（Tenacibaculum）、海洋细菌（Maribacter）、噬碳酸菌（Capnocytophaga）、藤黄栖沉积物杆菌（Sediminicola）、肠球菌（Enterococcus）、盐厌氧菌（Halanaerobium）、链球菌（Streptococcus）、Yoonia、Frondihabitans、Nakamurella、棍状杆菌（Clavibacter）、冷冻杆菌（Cryobacterium）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium）、Sulfuricaulis、海草球菌（Phycicoccus）、微杆菌（Microbacterium）、罗斯氏菌（Roseburia）、布劳特氏菌（Blautia）、类诺卡氏菌（Nocardioides）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、真杆菌（Eubacterium）；

所述的应用，还包括如下步骤：

S5：采用细菌的相对丰度作为输入值，通过机器学习分类算法判断待测样本与正常样本进行分类；

机器学习过程采用患病的概率作为输出值；

机器学习分类算法是随机森林算法；

高通量测序方法的测序深度为1-30乘。