CN108504739A - 一种用于肝癌早期诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种肠道微生态标志物及其应用。本发明提供了一种用于肝癌诊断的生物标志物，由SEQ ID NO:1‑34所示的34种基因组成，所述基因在肠道中富集。本发明还提供一种用于检测试剂，包括用于检测SEQ ID NO:1‑34所示的34种基因的引物。本发明通过无创的方法收集入组患者的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序。在标志物发现期，通过随机森林法，在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间，鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物，建立肝癌患病率(probability of disease,POD)指数，实现自身标志物发现期的验证。在标志物验证期，计算验证期患者的POD指数，实现POD指数对于验证期肝癌患者的诊断价值的验证。

Description

一种用于肝癌早期诊断的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肠道微生态标志物及其应用。

背景技术

肝癌是全球范围内肿瘤相关死亡的第三位主要原因。在美国，目前男性有预计29200例新发的肝癌患者，女性有11510例新发的肝癌患者。在中国由于乙肝病毒持续感染及其引起的肝硬化的流行，导致肝癌的发病情况更严重，男性有343700例新发肝癌患者，女性有122300例新发肝癌患者。由于肝癌早期缺乏特异性症状和有效的早期诊断标志物，大部分肝癌患者诊断时已是晚期，预后很差(死亡率/发生率的整体比例约0.95)。因此，当下亟需新型的诊断标志物和新型的治疗策略来改善肝癌患者的预后。

人体肠道微生态是机体最重要的微生态系统。它不仅作为肠道炎症的关键决定因子，而且在慢性肝脏疾病中发挥重要作用。肠道微生态的改变促进多种慢性肝脏疾病的进展，包括酒精性肝脏疾病、非酒精性脂肪性肝脏疾病、肝硬化及其并发症。近来的动物实验指出肠道微生态通过微生态-肝脏轴促进肝细胞的发生发展。然而临床肝癌患者的肠道微生态特征还未曾报道过。

肠道微生态作为特定疾病或肿瘤的无创诊断工具正在被广泛认可。Qin J等鉴定和验证了60000个2型糖尿病相关的微生物标志物，指出了区别2型糖尿病的微生物标志物的有效性。Yu J等在不同民族患者中揭示并验证了结直肠癌的微生物标志物，指出微生物标志物作为一种可支付的、无创的结直肠癌的早期诊断标志物。我们之前研究了肝硬化和健康对照的肠道微生物组，建立了基于肠道微生物标志物的患者区分指数。然而，肠道微生物标志物是否能够用于区别早期肝癌还未曾报道过。本发明旨在评估肠道微生物组作为肝癌无创标志物的诊断能力。

发明内容

本发明提供了一种用于肝癌诊断的生物标志物，由SEQ ID NO:1-34所示的34种基因组成，所述基因在肠道中富集。

另外本发明还提供了一种用于检测试剂，包括用于检测SEQ ID NO:1-34所示的34种基因的引物。

所述引物序列为SEQ ID NO:35-36。

本发明还提供了检测试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述检测试剂适用于检测SEQ ID NO:1-34所示的34种基因。

所述肝癌诊断试剂盒适用于肝癌早期筛查和诊断。

对所述对象的粪便排泄物进行检测，以便确定是否存在所述生物标志物。

通过无创的方法收集入组对象的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序，检测是否存在权利要求1所述的生物标志物。

进一步的，通过无创的方法收集入组对象的粪便，进行肠道菌群的16S rRNAMiseq测序；在标志物发现期，通过随机森林法，在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间，鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物。

具体包括：

(1)通过无创的方法收集入组对象的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序；

(2)在标志物发现期，通过随机森林法，在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间，鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物。

(3)建立肝癌患病率(POD)指数，实现自身标志物发现期的验证。

(4)在标志物验证期，计算验证期患者的POD指数，实现POD指数对于验证期肝癌患者的诊断价值的验证。

(5)同时，入组不同地区的肝癌患者样本，再次实现肠道微生态诊断标志物的跨地区验证。

(6)对于早期肝硬化肝癌的诊断，联合肠道微生物标志物建立的患病率(POD)指数和血清AFP可以增强单纯血清AFP对早期肝硬化肝癌的诊断能力，表明POD指数可以作为血清AFP的一种辅助性诊断工具。

另外，还提供了一种用于肝癌早期诊断的试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的SEQ ID NO:1-34所示的34种基因的引物。

本发明的其操作步骤如下：

(1)按照前瞻性样本收集和回顾性盲法评估的设计原则，肠道微生态作为肝癌无创诊断工具的研究设计如图1所示。该研究方案得到了浙江大学医学院第一附属医院和郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署知情同意书。

(2)每一个患者提供一份新鲜的粪便样本，分装样本并立即冻存于-80℃。粪便细菌DNA抽提按照试剂盒的说明书进行。

(3)完成粪便细菌DNA样本的扩增和DNA文库构建，在IlluminaMiseq测序平台完成16S rRNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。

(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrRNA基因序列分类单元(Operational Taxonomy Units,OTUs)。按照标志物发现期、标志物验证期和独立诊断期，将产生的OTUs收集整理。使用RDP分类器2.6版本注释基于序列。

(5)通过基于样本的OTUs分析，使用R软件程序包计算并获得微生物多样性指数，并获得OTUs对应的细菌分类和菌属组成。

(6)基于代表性的序列，产生出标志物发现期的OTUs频率文件、验证期OTUs频率文件和独立诊断期OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在患者和健康对照之间差异明显的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验联合Benjamin和Hochberg多重检验校正来计算两组之间OTUs频率文件差异的概率。对于特异性，使用一个非常严格的显著阈值：FDR<0.0001。

(7)为了阐明粪便微生物组对早期肝癌的诊断价值，我们构建了一个能够特异性鉴定早期肝癌样本的随机森林区分模型。为了鉴定早期肝癌的独特的OTUs标志物，在标志物发现期，我们分别在75例早期肝硬化肝癌和40例肝硬化(模型A)、75例健康对照和75例早期肝硬化肝癌(模型B)、40例肝硬化和75例健康对照(模型C)之间进行5次尝试的10倍交差验证(即50次)(图2)。在每一个模型中，计算5次尝试的交叉验证的错误率并用交叉验证错误曲线显示。基于错误曲线的平均值，最小的错误值作为cut-off值使用。在50次尝试验证中，筛选出低于cut-off值的错误率的OTUs标志物，选择错误率最小的OTUs标志物作为最佳的标志物集。

(8)基于标志物发现期的OTUs丰度文件集，通过Leave-one-out(LOO)交叉验证模式，我们使用R软件3.0.2和随机森林软件包4.6-7(除了设置“importance＝TRUE,proximity＝TRUE,ntree＝1000”之外，软件参数默认)，来构建随机森林模型。通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“HCC”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的150个随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。对于每一个样本，POD指数构建的流程图如图3所示。随后，进一步在标志物验证集和独立诊断集中检验了POD指数，并决定了预测错误率。另外，在早期肝癌样本中，我们进一步分析了POD指数和血清AFP联合标志物的诊断能力。

(9)我们从中国的华东(杭州)、华中(郑州)和西北地区(新疆)前瞻性地收集了486例粪便样本。经过严格的病理诊断和排除过程以后，最终419例患者样本纳入研究，完成了肠道微生物16S rRNA Miesq测序。纳入的患者随机分为标志物发现期和验证期。在发现期，75例早期肝硬化肝癌，40例肝硬化和75例健康对照描述了肝癌患者肠道微生态特征，鉴定了微生物标志物，通过随机森林法建立了HCC分类模型并计算了HCC患病率(POD)指数。在验证期，56例健康对照、30例早期肝癌和45例晚期肝癌验证了模型的诊断效能。18例新疆的肝癌患者和80例郑州的肝癌患者用于POD指数的独立诊断(图1)。

(10)在标志物发现期，在模型A(75例早期肝硬化肝癌和40例肝硬化)中，最佳的6个OTUs标志物集被鉴定，在两组之间显示了80.43％的曲线下面积(AUC)；在模型B(75例健康对照和75例早期肝硬化肝癌)中，最佳的29个OTUs标志物集被筛选，在两组之间达到了85.59％的AUC值；在模型C(40例肝硬化和75例健康对照)中，最佳的2个OTUs标志物集被检测，在两组之间达到了81.07％的AUC值。为了鉴定早期肝癌特异性的微生物标志物，我们删除了在模型A和模型C中肝硬化患者富集的OTUs。最终剩余的肝癌特异性的最佳的34个OTUs标志物用于建立早期肝癌的POD指数(图2)。34个OTUs的基因序列见SEQ ID NO:1-34。

(11)首先，我们使用基于微生物标志物的HCC区分器在75例早期肝硬化肝癌和75例健康对照之间开展自我诊断。其AUC值达到了86.2％，95％置信区间(CI)为0.801-0.922。我们进而计算了每一个健康对照和患者的POD指数，表明了POD指数在早期肝癌和健康对照之间显示了强有力的区分能力(图4)。

(12)其次，在标志物验证期，56个健康对照，11个早期肝硬化肝癌，19个无肝硬化肝癌和45个晚期肝癌用于验证HCC区分器的诊断效能。每一个患者的POD指数被计算。其中11个早期肝硬化肝癌患者的POD指数平均值为81.82％，19个无肝硬化肝癌患者的POD指数平均值为73.68％。重要的是，在45个晚期肝癌患者中，POD指数平均值为77.78％。这些结果表明了我们发明的肝癌诊断的POD指数对于肝硬化肝癌、无肝硬化肝癌和晚期肝癌都显示了强有力的诊断能力。

(13)为了进一步确认微生物标志物对于肝癌的诊断能力和适用范围，18个来自新疆的HCC患者和80个来自郑州的HCC患者作为独立诊断集来验证HCC区分器的诊断能力。结果显示：18个新疆HCC样本的POD指数平均值为72.22％，而80个郑州地区HCC样本的POD指数平均值为73.75％。这些结果进一步指出了微生物标志物对于华中地区(郑州)和西北地区(新疆)肝癌患者的强有力的诊断能力(图5)。

(14)血清AFP值在肝癌的诊断中已经有很长的使用历史和应用价值。因此，我们进一步探索了肝癌POD指数和血清AFP的联合应用对肝癌的诊断能力。结果显示：肝癌POD指数和血清AFP值的联合应用对于早期肝癌的诊断能力优于单纯的血清AFP的诊断效能，表明我们发明的基于肠道微生物标志物的POD指数可以作为增强血清AFP对早期肝癌诊断能力的辅助性工具(图6)。

本发明通过无创的方法收集入组患者的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序。在标志物发现期，通过随机森林法，在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间，鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物，建立肝癌患病率(probability ofdisease,POD)指数，实现自身标志物发现期的验证。在标志物验证期，计算验证期患者的POD指数，实现POD指数对于验证期肝癌患者的诊断价值的验证。同时，入组不同地区的肝癌患者样本，再次实现肠道微生态诊断标志物的跨地区验证。本发明可达到肠道微生物标志物对于早期肝癌的特异性诊断，并成功实现该诊断模型的跨地区验证，最终建立早期肝癌的无创诊断新方法，实现肝癌的早期筛查、早期诊断和早期治疗。

附图说明

图1.肠道微生态作为肝癌无创诊断工具的研究设计和实验流程图。

图2.通过随机森林法鉴定早期肝癌特异性的肠道微生物基因标志物。

图3.在标志物发现集和验证集中，每一个样本的患病率(POD)指数的建立和计算流程。

图4.基于肠道微生物标志物建立的患病率(POD)指数在发现期对早期肝硬化肝癌和健康对照的区别能力。

图5.基于肠道微生物标志物建立的患病率(POD)指数在验证期和独立诊断期患者中的诊断能力。

图6.基于肠道微生物标志物建立的患病率(POD)指数和血清AFP对早期肝硬化肝癌和健康对照的联合诊断。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。

下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为公开商业途径获得。

我们从中国的华东、华中和西北地区前瞻性地收集了486例粪便样本。经过严格的病理诊断和排除过程以后，最终419例患者样本纳入研究，完成了肠道微生物16S rRNAMiesq测序。纳入的患者随机分为标志物发现期和验证期。在发现期，75例早期肝硬化肝癌，40例肝硬化和75例健康对照描述了肝癌患者肠道微生态特征，鉴定了微生物标志物，通过随机森林法建立了HCC分类模型并计算了HCC患病率(POD)指数。在验证期，56例健康对照、30例早期肝癌和45例晚期肝癌验证了模型的诊断效能。18例新疆的肝癌患者和80例郑州的肝癌患者用于POD指数的独立诊断。

其操作步骤如下：

(1)按照前瞻性样本收集和回顾性盲法评估的设计原则，肠道微生态作为肝癌无创诊断工具的研究设计如图1所示。该研究方案得到了浙江大学医学院第一附属医院和郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署知情同意书。

(2)每一个患者提供一份新鲜的粪便样本，分装样本并立即冻存于-80℃。粪便细菌DNA抽提按照试剂盒的说明书进行。

(3)完成粪便细菌DNA样本的扩增和DNA文库构建，在IlluminaMiseq测序平台完成16S rRNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。

(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrRNA基因序列分类单元(Operational Taxonomy Units,OTUs)。按照标志物发现期、标志物验证期和独立诊断期，将产生的OTUs收集整理。使用RDP分类器2.6版本注释基于序列。

(5)通过基于样本的OTUs分析，使用R软件程序包计算并获得微生物多样性指数，并获得OTUs对应的细菌分类和菌属组成。

(6)基于代表性的序列，产生出标志物发现期的OTUs频率文件、验证期OTUs频率文件和独立诊断期OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在患者和健康对照之间差异明显的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验联合Benjamin和Hochberg多重检验校正来计算两组之间OTUs频率文件差异的概率。对于特异性，使用一个非常严格的显著阈值：FDR<0.0001。

(7)为了阐明粪便微生物组对早期肝癌的诊断价值，我们构建了一个能够特异性鉴定早期肝癌样本的随机森林区分模型。为了鉴定早期肝癌的独特的OTUs标志物，在标志物发现期，我们分别在75例早期肝硬化肝癌和40例肝硬化(模型A)、75例健康对照和75例早期肝硬化肝癌(模型B)、40例肝硬化和75例健康对照(模型C)之间进行5次尝试的10倍交差验证(即50次)(图2)。在每一个模型中，计算5次尝试的交叉验证的错误率并用交叉验证错误曲线显示。基于错误曲线的平均值，最小的错误值作为cut-off值使用。在50次尝试验证中，筛选出低于cut-off值的错误率的OTUs标志物，选择错误率最小的OTUs标志物作为最佳的标志物集。

(8)基于标志物发现期的OTUs丰度文件集，通过Leave-one-out(LOO)交叉验证模式，我们使用R软件3.0.2和随机森林软件包4.6-7(除了设置“importance＝TRUE,proximity＝TRUE,ntree＝1000”之外，软件参数默认)，来构建随机森林模型。通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“HCC”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的150个随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。对于每一个样本，POD指数构建的流程图如图3所示。随后，进一步在标志物验证集和独立诊断集中检验了POD指数，并决定了预测错误率。另外，在早期肝癌样本中，我们进一步分析了POD指数和血清AFP联合标志物的诊断能力。

(9)我们从中国的华东(杭州)、华中(郑州)和西北地区(新疆)前瞻性地收集了486例粪便样本。经过严格的病理诊断和排除过程以后，最终419例患者样本纳入研究，完成了肠道微生物16S rRNA Miesq测序。纳入的患者随机分为标志物发现期和验证期。在发现期，75例早期肝硬化肝癌，40例肝硬化和75例健康对照描述了肝癌患者肠道微生态特征，鉴定了微生物标志物，通过随机森林法建立了HCC分类模型并计算了HCC患病率(POD)指数。在验证期，56例健康对照、30例早期肝癌和45例晚期肝癌验证了模型的诊断效能。18例新疆的肝癌患者和80例郑州的肝癌患者用于POD指数的独立诊断(图1)。

(10)在标志物发现期，在模型A(75例早期肝硬化肝癌和40例肝硬化)中，最佳的6个OTUs标志物集被鉴定，在两组之间显示了80.43％的曲线下面积(AUC)；在模型B(75例健康对照和75例早期肝硬化肝癌)中，最佳的29个OTUs标志物集被筛选，在两组之间达到了85.59％的AUC值；在模型C(40例肝硬化和75例健康对照)中，最佳的2个OTUs标志物集被检测，在两组之间达到了81.07％的AUC值。为了鉴定早期肝癌特异性的微生物标志物，我们删除了在模型A和模型C中肝硬化患者富集的OTUs。最终剩余的肝癌特异性的最佳的34个OTUs标志物用于建立早期肝癌的POD指数(图2)。34个OTUs的基因序列见SEQ ID NO:1-34。

(11)首先，我们使用基于微生物标志物的HCC区分器在75例早期肝硬化肝癌和75例健康对照之间开展自我诊断。其AUC值达到了86.2％，95％置信区间(CI)为0.801-0.922。我们进而计算了每一个健康对照和患者的POD指数，表明了POD指数在早期肝癌和健康对照之间显示了强有力的区分能力(图4)。

(12)其次，在标志物验证期，56个健康对照，11个早期肝硬化肝癌，19个无肝硬化肝癌和45个晚期肝癌用于验证HCC区分器的诊断效能。每一个患者的POD指数被计算。其中11个早期肝硬化肝癌患者的POD指数平均值为81.82％，19个无肝硬化肝癌患者的POD指数平均值为73.68％。重要的是，在45个晚期肝癌患者中，POD指数平均值为77.78％。这些结果表明了我们发明的肝癌诊断的POD指数对于肝硬化肝癌、无肝硬化肝癌和晚期肝癌都显示了强有力的诊断能力。

(13)为了进一步确认微生物标志物对于肝癌的诊断能力和适用范围，18个来自新疆的HCC患者和80个来自郑州的HCC患者作为独立诊断集来验证HCC区分器的诊断能力。结果显示：18个新疆HCC样本的POD指数平均值为72.22％，而80个郑州地区HCC样本的POD指数平均值为73.75％。这些结果进一步指出了微生物标志物对于华中地区(郑州)和西北地区(新疆)肝癌患者的强有力的诊断能力(图5)。

(14)血清AFP值在肝癌的诊断中已经有很长的使用历史和应用价值。因此，我们进一步探索了肝癌POD指数和血清AFP的联合应用对肝癌的诊断能力。结果显示：肝癌POD指数和血清AFP值的联合应用对于早期肝癌的诊断能力优于单纯的血清AFP的诊断效能，表明我们发明的基于肠道微生物标志物的POD指数可以作为增强血清AFP对早期肝癌诊断能力的辅助性工具(图6)。

本研究基于大批量的肝癌患者粪便样本，在国际上率先建立了基于肠道微生物组的早期肝癌诊断模型，并在中国西北和华中地区成功实现了跨区域验证。因此，靶向肠道微生态标志物代表了一种肝癌早期诊断的潜在的无创诊断工具。

本发明可达到肠道微生物标志物对于早期肝癌的特异性诊断，并成功实现该诊断模型的跨地区验证，最终建立早期肝癌的无创诊断新方法，实现肝癌的早期筛查、早期诊断和早期治疗。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于肝癌早期诊断的生物标志物及其应用

<130> 21-2018-1801

<141> 2018-05-15

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 430

<212> DNA

<213> 厚壁菌目(Selenomonadales)

<400> 1

gtggggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 60

gatttcggtc tgtaaagctc tgttgtttat gacgaacgtg cagtgtgtga acaatgcatt 120

gcaatgacgg tagtaaacga ggaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 180

cgtaggtggc gagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agcatgtagg cggcttaata 240

agtcgagcgt gaaaatgcgg ggctcaaccc cgtatggcgc tggaaactgt taggcttgag 300

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caccagtggc gaaggcgcct ttctggactg tgtctgacgc tgagatgcga aagccagggt 420

agcgaacggg 430

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 根瘤菌目(Rhizobiales)

<400> 2

gtgggggata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg gaggaagaag 60

gttttcggat tgtaaactcc tgtcgttagg gacgataatg acggtaccta acaagaaagc 120

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ggcaccaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcaa acagg 405

<210> 3

<211> 425

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 3

gtgaggaata ttggtcaatg ggcgagagcc tgaaccagcc aagtagcgtg aaggatgaag 60

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acagg 425

<210> 4

<211> 408

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 4

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gttttcggat tgtaaacttc ttttcttagt gacgaagaca gtgacggtag ctaaggaata 120

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<210> 5

<211> 425

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 5

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<210> 6

<211> 425

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 6

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gttctatgga ttgtaaactt cttttatacg ggaataaacg gatccacgtg tggatttttg 120

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attgcgaagg cagcttacta acctgtaact gacattgatg ctcgaaagtg tgggtatcaa 420

acagg 425

<210> 7

<211> 431

<212> DNA

<213> 脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)

<400> 7

gtggggaata ttgcgcaatg ggcgaaagcc tgacgcagcg acgccgcgtg agggatgaag 60

gttctcggat cgtaaacctc tgtcaggggg gaagaaaccc cctcgtgtga ataatgcgag 120

ggcttgacgg tacccccaaa ggaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata 180

cggagggtgc aagcgttaat cggaatcact gggcgtaaag cgcacgtagg cggcttggta 240

agtcaggggt gaaatcccac agcccaactg tggaactgcc tttgatactg ccaggcttga 300

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<210> 8

<211> 408

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 8

gtggggaata ttgcgcaatg ggggcaaccc tgacgcagca acgccgcgtg caggaagaag 60

gtcttcggat tgtaaactgt tgtcgcaagg gaagaagaca gtgacggtac cttgtgagaa 120

agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtgacaag cgttgtccgg 180

atttactggg tgtaaagggc gcgtaggcgg actgtcaagt cagtcgtgaa ataccggggc 240

ttaaccccgg ggctgcgatt gaaactgaca gccttgagta tcggagagga aagcggaatt 300

cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt 360

ctggacgaca actgacgctg aggcgcgaaa gtgtggggag caaacagg 408

<210> 9

<211> 407

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 9

gtggggaata ttgggcaatg ggcgaaagcc tgacccagca acgccgcgtg aaggaagaag 60

gccttcgggt tgtaaacttc ttttaagagg gacgaagaag tgacggtacc tcttgaataa 120

gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcgagc gttatccgga 180

tttactgggt gtaaagggcg cgtaggcggg aatgcaagtc agatgtgaaa tccaagggct 240

caacccttga actgcatttg aaactgtatt tcttgagtgt cggagaggtt gacggaattc 300

ctagtgtagc ggtgaaatgc gtagatatta ggaggaacac cagtggcgaa ggcggtcaac 360

tggacgataa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacagg 407

<210> 10

<211> 430

<212> DNA

<213> 肠杆菌目(Enterobacteriales)

<400> 10

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag 60

gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcggg gaggaaggcg acagggttaa taaccctgtc 120

gattgacgtt acccgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 180

ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggtctgtcaa 240

gtcggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat tcgaaactgg caggctagag 300

tcttgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 360

taccggtggc gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg 420

agcaaacagg 430

<210> 11

<211> 425

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 11

gtgaggaata ttggtcaatg gccgagaggc tgaaccagcc aagtcgcgtg agggatgaag 60

gttctatgga tcgtaaacct cttttataag ggaataaagt gcgggacgtg tcccgttttg 120

tatgtacctt atgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggtgcg taggcggcct tttaagtcag 240

cggtgaaagt ctgtggctca accatagaat tgccgttgaa actggggggc ttgagtatgt 300

ttgaggcagg cggaatgcgt ggtgtagcgg tgaaatgcat agatatcacg cagaaccccg 360

attgcgaagg cagcctgcca agccattact gacgctgatg cacgaaagcg tggggatcaa 420

acagg 425

<210> 12

<211> 424

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 12

gtgaggaata ttggtcaatg gacgtaagtc tgaaccagcc aagtcgcgtg agggaagact 60

gccctatggg ttgtaaacct cttttataag ggaagaataa gttctacgtg tagaatgatg 120

cctgtacctt atgaataagc atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atgcgagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggtgcg taggcggttt attaagttag 240

tggttaaata tttgagctaa actcaattgt gccattaata ctggtaaact ggagtacaga 300

cgaggtaggc ggaataagtt aagtagcggt gaaatgcata gatataactt agaactccga 360

tagcgaaggc agcttaccag actgtaactg acgctgatgc acgagagcgt gggtagcgaa 420

cagg 424

<210> 13

<211> 430

<212> DNA

<213> 伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)

<400> 13

gtggggaatt ttggacaatg ggggcaaccc tgatccagcc atgccgcgtg caggatgaag 60

gtcttcggat tgtaaactgc ttttgtcagg gacgaaaagg gatgcgataa caccgcattc 120

cgctgacggt acctgaagaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggttctgtaa 240

gatagatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaattgcat atatgactgc aggacttgag 300

tttgtcagag gagggtggaa ttccacgtgt agcagtgaaa tgcgtagata tgtggaagaa 360

caccgatggc gaaggcagcc ctctgggaca tgactgacgc tcatgcacga aagcgtgggg 420

agcaaacagg 430

<210> 14

<211> 425

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 14

gtgaggaata ttggtcaatg gacgcaagtc tgaaccagcc atgccgcgtg caggaagacg 60

gctctatgag ttgtaaactg cttttgtacg agagtaaacg ctcttacgtg taagagcctg 120

aaagtatcgt acgaataagg atcggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 180

atccaagcgt tatccggatt tattgggttt aaagggtgcg taggcggttt gataagttag 240

aggtgaaata ccggtgctta acaccggaac tgcctctaat actgttgaac tagagagtag 300

ttgcggtagg cggaatgtat ggtgtagcgg tgaaatgctt agagatcata cagaacaccg 360

attgcgaagg cagcttacca aactatatct gacgttgagg cacgaaagcg tggggagcaa 420

acagg 425

<210> 15

<211> 405

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 15

gtggggaata ttgcacaatg gaggaaactc tgatgcagcg acgccgcgtg agtgaagaag 60

tatttcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagacagtg acggtacctg actaagaagc 120

tccggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg gagcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagtg taggtggtat cacaagtcag aagtgaaagc ccggggctca 240

accccgggac tgcttttgaa actgtggaac tggagtgcag gagaggtaag tggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gactgtaact gacactgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acagg 405

<210> 16

<211> 406

<212> DNA

<213> 红蝽菌目(Coriobacteriales)

<400> 16

gtggggaatc ttgcgcaatg gggggaaccc tgacgcagcg acgccgcgtg cgggacggag 60

gccttcgggt cgtaaaccgc tttcagcagg gaagagtcaa gactgtacct gcagaagaag 120

ccccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggggcgagcg ttatccggat 180

tcattgggcg taaagcgcgc gtaggcggcc cggcaggccg ggggtcgaag cggggggctc 240

aaccccccga agcccccgga acctccgcgg cttgggtccg gtaggggagg gtggaacacc 300

cggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcgg gtggaacacc ggtggcgaag gcggccctct 360

gggccgagac cgacgctgag gcgcgaaagc tgggggagcg aacagg 406

<210> 17

<211> 406

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 17

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagca acgccgcgtg aaggaagacg 60

gttttcggat tgtaaacttc tgttcttagt gaagaataat gacggtagct aaggagcaag 120

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 180

ttactgggtg taaagggagc gcaggcgggt gatcaagtca gctgtgaaaa ctacgggctt 240

aacccgtaga ctgcagttga aactgttcat cttgagtgaa gtagaggttg gcggaattcc 300

gagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattcg gaggaacacc ggtggcgaag gcggccaact 360

gggctttaac tgacgctgag gctcgaaagt gtggggagca aacagg 406

<210> 18

<211> 405

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 18

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg aaggaagaag 60

tatctcggta tgtaaacttc tatcagcagg gaagaaaatg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggagcg tagacggatg gacaagtctg atgtgaaagg ctggggctca 240

accccgggac tgcattggaa actgcccgtc ttgagtgccg gagaggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cggcttactg 360

gacggtaact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acagg 405

<210> 19

<211> 405

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 19

gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg acgccgcgtg agtgaagaag 60

tatctcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagaaaatg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggaat 180

tactgggtgt aaagggtgcg taggtggtat ggcaagtcag aagtgaaaac ccagggctta 240

actctgggac tgcttttgaa actgtcagac tggagtgcag gagaggtaag cggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacatca gtggcgaagg cggcttactg 360

gactgaaact gacactgagg cacgaaagcg tggggagcaa acagg 405

<210> 20

<211> 408

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 20

gtggggaata ttgcgcaatg ggggaaaccc tgacgcagca acgccgcgtg attgaagaag 60

gccttcgggt tgtaaagatc tttaatcagg gacgaaacaa atgacggtac ctgaagaata 120

agctccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggagcaag cgttatccgg 180

atttactggg tgtaaagggc gcgcaggcgg gccggcaagt tggaagtgaa atctatgggc 240

ttaacccata aactgctttc aaaactgctg gtcttgagtg atggagaggc aggcggaatt 300

ccgtgtgtag cggtgaaatg cgtagatata cggaggaaca ccagtggcga aggcggcctg 360

ctggacatta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacagg 408

<210> 21

<211> 430

<212> DNA

<213> 乳杆菌目(Lactobacillales)

<400> 21

gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag 60

gtcttcggat cgtaaaactc tgttgttaga gaagaacacg agtgagagta actgttcatt 120

cgatgacggt atctaaccag caagtcacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 180

gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagg gaacgcaggc ggtcttttaa 240

gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agtagtgcat tggaaactgg aagacttgag 300

tgcagaagag gagagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa 360

caccagtggc gaaagcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggttcga aagcgtgggt 420

agcaaacagg 430

<210> 22

<211> 406

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 22

gtggggaata ttgcgcaatg ggggaaaccc tgacgcagca acgccgcgtg attgaagaag 60

gccttcgggt tgtaaagatc tttaattcgg gacgaatttt gacggtaccg aaagaataag 120

ctccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggagcaagcg ttatccggat 180

ttactgggtg taaagggcgc gcaggcgggc cggcaagttg gaagtgaaat ccgggggctt 240

aacccccgaa ctgctttcaa aactgctggt cttgagtgat ggagaggcag gcggaattcc 300

gtgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatacg gaggaacacc agtggcgaag gcggcctgct 360

ggacattaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacagg 406

<210> 23

<211> 406

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 23

gtgggggata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagcg atgccgcgtg gaggaagaag 60

gttttcggat tgtaaactcc tgtcgtaagg gaagaggaag gactgtacct tacaagaaag 120

ctccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggagcgagcg ttgtccggaa 180

tgactgggtg taaagggagc gtaggcggga tggcaagtca gatgtgaaac ctgagggctc 240

aaccttcaga ctgcatttga aactgctgtt cttgagtgaa gtagaggtaa gcggaattcc 300

tggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatcag gaggaacatc ggtggcgaag gcggcttact 360

gggcttttac tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagca aacagg 406

<210> 24

<211> 405

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 24

gtgggggata ttgcacaatg ggggaaaccc tgatgcagca acgccgcgtg agggaagaag 60

gttttcggat tgtaaacctc tgttcttagt gacgataatg acggtagcta aggagaaagc 120

tccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gagcgagcgt tgtccggatt 180

tactgggtgt aaagggtgcg taggcggcga ggcaagtcag gcgtgaaatc tatgggctta 240

acccataaac tgcgcttgaa actgtcttgc ttgagtgaag tagaggtagg cggaattccc 300

ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatcggg aggaacacca gtggcgaagg cggcctactg 360

ggctttaact gacgctgaag cacgaaagca tgggtagcaa acagg 405

<210> 25

<211> 405

<212> DNA

<213> 红蝽菌目(Coriobacteriales)

<400> 25

gtggggaatt ttgcgcaatg ggggaaaccc tgacgcagca acgccgcgtg cgggacgacg 60

gccttcgggt tgtaaaccgc tttcagcagg gaagaaattc gacggtacct gcagaagaag 120

ctccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggagcgagcg ttatccggat 180

tcattgggcg taaagagcgc gtaggcggcc tctcaagcgg gatctctaat ccgagggctc 240

aacccccggc cggatcccga actgggaggc tcgagttcgg tagaggcagg cggaattccc 300

ggtgtagcgg tggaatgcgc agatatcggg aagaacaccg atggcgaagg cagcctgctg 360

ggccgcaact gacgctgagg cgcgaaagct aggggagcga acagg 405

<210> 26

<211> 404

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 26

gtgggggata ttgcacaatg gaggaaactc tgatgcagcg acgccgcgtg agggaagacg 60

gtcttcggat tgtaaacctc tgtctttggg gacgataatg acggtaccca aggaggaagc 120

tccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gagcgagcgt tgtccggaat 180

tactgggtgt aaagggagcg taggcggggt ctcaagtcga atgttaaatc taccggctca 240

actggtagct gcgttcgaaa ctggggctct tgagtgaagt agaggcaggc ggaattccta 300

gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag tggcgaaggc ggcctgctgg 360

gcttttactg acgctgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa cagg 404

<210> 27

<211> 408

<212> DNA

<213> 梭杆菌目(Fusobacteriales)

<400> 27

gtggggaata ttggacaatg gaccaaaagt ctgatccagc aattctgtgt gcacgatgac 60

gtttttcgga atgtaaagtg ctttcagttg ggaagaaaaa aatgacggta ccaacagaag 120

aagtgacggc taaatacgtg ccagcagccg cggtaatacg tatgtcacaa gcgttatccg 180

gatttattgg gcgtaaagcg cgtctaggtg gttatgtaag tctgatgtga aaatgcaggg 240

ctcaactctg tattgcgttg gaaactgcat gactagagta ctggagaggt aagcggaact 300

acaagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt tgtaggaatg ccgatgggga agccagctta 360

ctggacagat actgacgcta aagcgcgaaa gcgtgggtag caaacagg 408

<210> 28

<211> 430

<212> DNA

<213> 巴斯德氏菌目(Pasteurellales)

<400> 28

gtggggaata ttgcgcaatg ggggcaaccc tgacgcagcc atgccgcgtg aatgaagaag 60

gccttcgggt tgtaaagttc tttcggtgac gaggaaggcg tgatgtttaa taggcatcac 120

gattgacgtt aatcacagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 180

ggagggtgcg agcgttaatc ggaataactg ggcgtaaagg gcacgcaggc ggctatttaa 240

gtgaggtgtg aaatccccgg gcttaacctg ggaattgcat ttcagactgg gtagctagag 300

tactttaggg aggggtagaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 360

taccgaaggc gaaggcagcc ccttgggaat gtactgacgc tcatgtgcga aagcgtgggg 420

agcaaacagg 430

<210> 29

<211> 430

<212> DNA

<213> 厚壁菌目(Selenomonadales)

<400> 29

gtggggaatc ttccgcaatg ggcgaaagcc tgacggagca acgccgcgtg aacgatgaag 60

gtcttaggat cgtaaagttc tgttgttagg gacgaagggc aagggttata atacagcctt 120

tgtttgacgg tacctaacga ggaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 180

cgtaggcggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggagcgcagg cgggaaacta 240

agcggatctt aaaagtgcgg ggctcaaccc cgtgatgggg tccgaactgg ttttcttgag 300

tgcaggagag gaaagcggaa ttcccagtgt agcggtgaaa tgcgtagata ttgggaagaa 360

caccagtggc gaaggcggct ttctggactg taactgacgc tgaagctcga aagtgcgggt 420

atcgaacagg 430

<210> 30

<211> 408

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 30

gtggggaata ttgggcaatg ggcgaaagcc tgacccagca acgccgcgtg aaggaagaag 60

gccttcgggt tgtaaacttc ttttaccagg gacgaaggac gtgacggtac ctggagaaaa 120

agcaacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggttgcaag cgttgtccgg 180

atttactgag tgtaaagggc gtgtaggcgg agatgcaagt taggagtgaa atctgtgggc 240

tcaacccata aactgcttct aaaactgtat cccttgagta tcggagaggc aagcggaatt 300

cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga aggcggcttg 360

ctggacgaca actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacagg 408

<210> 31

<211> 425

<212> DNA

<213> 拟杆菌目(Bacteroidales)

<400> 31

gtgaggaata ttggtcaatg ggcgagagtc tgaaccagcc aagtagcgtg caggatgacg 60

gccctatggg ttgtaaactg cttttataag ggaataaagt gagctacgtg tagctttttg 120

catgtacctt atgaataagg accggctaat tccgtgccag cagccgcggt aatacggaag 180

gtccgggcgt tatccggatt tattgggttt aaagggagcg taggccgtct tataagcgtg 240

ttgtgaaatg tagatgctca acatctgcac tgcagcgcga actggtttcc ttgagtacgc 300

acaaagtggg cggaattcgt ggtgtagcgg tgaaatgctt agatatcacg aagaactccg 360

attgcgaagg cagctcactg gagcgcaact gacgctgaag ctcgaaagtg cgggtatcga 420

acagg 425

<210> 32

<211> 430

<212> DNA

<213> 肠杆菌目(Enterobacteriales)

<400> 32

gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tgtgaagaag 60

gccttcgggt tgtaaagcac tttcagcggg gaggaaggcg gtgaggttaa taacctcacc 120

gattgacgtt acccgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac 180

ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggtttgttaa 240

gtcagatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat tcgaaactgg caggctagag 300

tcttgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 360

taccggtggc gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg 420

agcaaacagg 430

<210> 33

<211> 408

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 33

gtgggggata ttggtcaatg ggggaaaccc tgaaccagca atgccgcgtg agggaagaag 60

gtcttcggat tgtaaaccta agtagtcagg gacgaagaaa gtgacggtac ctgaagagta 120

agctccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggagcgag cgttgtccgg 180

atttactggg tgtaaagggt gcgtaggcgg gtcggcaagt cagatgtgaa ataccggggc 240

ttaactccgg ggctgcattt gaaactgttg atcttgagtg aagtagaggc aggcggaatt 300

cctagtgtag cggtgaaatg cgtagatatt aggaggaaca ccagtggcga aggcggcctg 360

ctgggcttta actgacgctg aggcaccaaa gcatggggag caaacagg 408

<210> 34

<211> 405

<212> DNA

<213> 梭菌目(Clostridiales)

<400> 34

gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agtgaagaag 60

tatttcggta tgtaaagctc tatcagcagg gaagaaaatg acggtacctg actaagaagc 120

cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gggcaagcgt tatccggatt 180

tactgggtgt aaagggggcg tagacggtaa agcaagtctg aagtgaaagc ccgcggctca 240

actgcgggac tgctttggaa actgtttaac tggagtgtcg gagaggtaag tggaattcct 300

agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg aggaacacca gtggcgaagg cgacttactg 360

gacgataact gacgttgagg ctcgaaagcg tggggagcaa acagg 405

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 35

actcctacgg gaggcagca 19

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (10)

1.一种用于肝癌诊断的生物标志物，其特征在于：由SEQ ID NO:1-34所示的34种基因组成，所述基因在肠道中富集。

2.一种用于检测权利要求1所述生物标志物的检测试剂，包括用于检测权利要求1所述的SEQ ID NO:1-34所示的34种基因的引物。

3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述引物序列为SEQ ID NO:35-36。

4.权利要求2所述检测试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述检测试剂适用于检测权利要求1所述的生物标志物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肝癌诊断试剂盒适用于肝癌早期筛查和诊断。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：对所述对象的粪便排泄物进行检测，以便确定是否存在所述生物标志物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：通过无创的方法收集入组对象的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序，检测是否存在权利要求1所述的生物标志物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：通过无创的方法收集入组对象的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序；在标志物发现期，通过随机森林法，在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间，鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体包括：

(1)通过无创的方法收集入组对象的粪便，进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序；

(2)在标志物发现期，通过随机森林法，在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间，鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物。

(3)建立肝癌患病率(POD)指数，实现自身标志物发现期的验证。

(4)在标志物验证期，计算验证期患者的POD指数，实现POD指数对于验证期肝癌患者的诊断价值的验证。

(5)同时，入组不同地区的肝癌患者样本，再次实现肠道微生态诊断标志物的跨地区验证。

(6)对于早期肝硬化肝癌的诊断，联合肠道微生物标志物建立的患病率(POD)指数和血清AFP可以增强单纯血清AFP对早期肝硬化肝癌的诊断能力，表明POD指数可以作为血清AFP的一种辅助性诊断工具。

10.一种用于肝癌早期诊断的试剂盒，其特征在于：包括用于检测权利要求1所述的SEQID NO:1-34所示的34种基因的引物。