CN111549155A - 一种通过肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，属于生物技术及医学技术领域，包括步骤一，取健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者中段粪便并提取总RNA，通过对微生物16S rRNA基因V4可变区进行PCR扩增，进行文库构建，对微生物rRNA基因V4可变区进行测序，分析粪便中肠道菌群相对丰度；步骤二，将上述肠道菌群相对丰度进行ROC分析，获得AUC、灵敏度、特异度和cut‑off值，选取AUC>0.7，相对丰度cut‑off值>0.001的肠道微生物作为检测指标预测肝脏疾病。本发明根据上述患者肠道菌群相关菌群丰度，筛选出预测肝脏疾病的肠道微生物，之后以筛选出的肠道微生物作为检测指标综合判断，可以有效预测和监测肝脏疾病的易感人群或者发现早期患者，以及监控肝脏疾病的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及医学技术领域，具体是涉及一种通过肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术。
背景技术
在人类的肠道中，存在着大量微生物。这些肠道微生物除了传统意义上的肠道细菌群，还包括古细菌、病毒和原生动物，其中98％以上是细菌，统称为肠道菌群。正常肠道菌群有500～1500种不同细菌种类，其中绝大多数为厌氧菌。从基因层面上看，人体自身的基因组大约携带了2.5万个基因，而人体肠道微生物编码的基因总数约是人自身基因总数的150倍，被视作人类“第二基因组”。人体肠道微生物的全部基因信息称为人体肠道宏基因组(Matagenome)。
肠道既是吸收营养物质的主要器官，也是机体抵御食物中有害物质的重要免疫屏障，更与肝脏的免疫细胞构成免疫平衡，共同维持机体稳态，肝脏疾病的发生、发展与肠道菌群的变化关系紧密。
肝脏疾病是发生在肝脏的所有疾病的总称，包括一、肝硬化(Liver cirrhosis)，肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。肝硬化是许多肝脏疾病的晚期病变，是由病毒性肝炎、酒精中毒、营养障碍、胆汁淤积、血吸虫病、循环障碍等各种原因所致，其特点是肝细胞变性和坏死。早期肝硬化通过及时防治可以逆转或不再进展，而晚期将不可逆转，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。
二、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝癌，是常见的与肥胖相关的代谢性疾病之一。一项关于中国NAFLD的流行病学研究表明中国NAFLD的综合患病率从2008-2010年的25.4％上升到2015-2018年的32.3％，患病率增长速度是西方国家的两倍。
然而，与肝硬化和NAFLD进程相关的肠道微生物的系统发育及功能成分的变化还不清楚，对这种菌群失衡影响的认识仍很局限。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种通过肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，有助于更加全面的理解菌群对宿主生理和病理的影响，将肠道菌群作为检测指标预测肝脏疾病，为人群健康监测提供指导和依据。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，包括如下步骤：
步骤一，取健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者中段粪便并提取总RNA，通过对微生物16S rRNA基因V4可变区进行PCR扩增，进行文库构建，对微生物rRNA基因V4可变区进行测序，分析粪便中肠道菌群相对丰度；
步骤二，将上述肠道菌群相对丰度进行ROC分析，获得AUC、灵敏度、特异度和cut-off值，选取AUC>0.7，相对丰度cut-off值>0.001的肠道微生物作为检测指标预测肝脏疾病。
在步骤一中，取健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者100mg中段粪便并提取总RNA。
在步骤一中，所述肝硬化患者包括代偿性肝硬化、轻度失代偿性肝硬化、重度失代偿性肝硬化患者。
经分析筛选后，作为预测非酒精性脂肪肝的肠道微生物包括：p_firmicutes，c_clostridia，o_clostridiales，f_ruminococcaceae，f_bacteroidaceae，g_bacteroides，g_lachnoclostridium，s_bacteroides_vulgatus，s_blautia_obeum，p_bacteroidetes/p_firmicutes；作为预测代偿性肝硬化的肠道微生物包括：p_proteobacteria，g_streptococcus；作为预测轻度失代偿性肝硬化的肠道微生物包括：c_clostridia，o_clostridiales，f_lachnospiraceae，g_blautia，g_unidentified_lachnospiraceae，c_bacilli，o_lactobacillales，f_streptococcaceae，g_streptococcus，s_ruminococcus_sp_5_1_39bfaa，c_negativicutes，o_selenomonadales，f_veillonellaceae，g_romboutsia，g_unidentified_ruminococcaceae，g_fusicatenibacter，s_bifidobacterium_adolescentis，s_lactobacillus_salivarius，s_blautia_obeum，o_pasteurellales，f_pasteurellaceae，g_anaerostipes，g_veillonella，f_lactobacillaceae，g_lactobacillus；作为预测重度失代偿性肝硬化的肠道微生物包括：o_enterobacteriales，f_enterobacteriaceae，c_gammaproteobacteria，g_unidentified_enterobacteriaceae，s_escherichia_coli，p_proteobacteria，c_bacilli，o_lactobacillales，f_streptococcaceae，g_streptococcus，g_veillonella，o_pasteurellales，f_pasteurellaceae，p_firmicutes，c_clostridia，o_clostridiales，f_lachnospiraceae，f_ruminococcaceae，g_faecalibacterium，p_actinobacteria，g_unidentified_lachnospiraceae，g_blautia，o_bifidobacteriales，f_bifidobacteriaceae，g_bifidobacterium，s_ruminococcus_sp_5_1_39bfaa，c_erysipelotrichia，o_erysipelotrichales，f_erysipelotrichaceae，g_romboutsia，f_bacteroidaceae，g_bacteroides，g_dorea，g_roseburia，g_fusicatenibacter，g_anaerostipes，g_unidentified_ruminococcaceae，s_bacteroides_uniformis，s_bifidobacterium_adolescentis，s_bacteroides_uniformis，f_tannerellaceae，g_parabacteroides；作为预测肝癌的肠道微生物包括：p_bacteroidetes/p_firmicutes，p_firmicutes，c_clostridia，o_clostridiales，f_lachnospiraceae，f_ruminococcaceae，p_proteobacteria，g_faecalibacterium，g_blautia，c_gammaproteobacteria，o_enterobacteriales，f_enterobacteriaceae，c_negativicutes，o_selenomonadales，c_alphaproteobacteria，f_porphyromonadaceae，g_parabacteroides，g_ruminococcus_torques_group，s_ruminococcus_sp_5_1_39bfaa，f_veillonellaceae，s_bacteroides_fragilis，o_sphingobacteriales，g_fusicatenibacter，c_erysipelotrichia，o_erysipelotrichales，f_erysipelotrichaceae，o_rhizobiales，s_parabacteroides_distasonis，g_romboutsia，s_bacteroides_plebeius，p_tenericutes，c_mollicutes，g_dorea，f_streptococcaceae，g_prevotella_9，f_rikenellaceae，g_alistipes，g_anaerostipes，g_streptococcus，g_megamonas，f_lactobacillaceae，g_lactobacillus，s_blautia_obeum，g_veillonella，g_unidentified_ruminococcaceae。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：从宏基因组水平研究患者肠道菌群的总体构成特点，有助于更加全面的理解菌群对宿主生理和病理的影响。根据健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者肠道菌群相关菌群丰度，筛选出预测肝脏疾病的肠道微生物，之后以筛选出的肠道微生物作为检测指标综合判断，可以有效预测和监测肝脏疾病的易感人群或者发现早期患者，以及监控肝脏疾病的治疗效果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步叙述本发明：
本发明提供了一种肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，包括如下步骤：
步骤一，取健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者100mg中段粪便并提取总RNA，通过对微生物16S rRNA基因V4可变区进行PCR扩增，进行文库构建，对微生物rRNA基因V4可变区进行测序，分析粪便中肠道菌群相对丰度；所述肝硬化患者包括代偿性肝硬化、轻度失代偿性肝硬化、重度失代偿性肝硬化患者；
步骤二，将上述分析后得到的差异性肠道菌群相对丰度进行ROC分析，获得AUC、灵敏度、特异度和cut-off值，选取AUC>0.7，相对丰度cut-off值>0.001(AUC(AreaUnderCurve)被定义为ROC曲线下与坐标轴围成的面积，显然这个面积的数值不会大于1。又由于ROC曲线一般都处于y＝x这条直线的上方，所以AUC的取值范围在0.5和1之间。AUC越接近1.0，检测方法真实性越高；等于0.5时，则真实性最低，无应用价值。同时，实验证明cut-off值小于0.001准确度低，不作为参考)的肠道微生物作为检测指标预测肝脏疾病，筛选出可作为预测非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌疾病进程的肠道微生物。
通过上述方法筛选出的非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌诊断的肠道菌群AUC、灵敏度、特异度和cut-off值见表1至表5，肠道微生物符合以下cut-off的患者则具有患有相应肝脏疾病的可能。
表1脂肪肝预测相关菌群丰度
表2代偿性肝硬化预测相关菌群丰度
表3轻度失代偿性肝硬化预测相关菌群丰度
表4重度失代偿性肝硬化预测相关菌群丰度
表5肝癌预测相关菌群丰度
从宏基因组水平研究患者肠道菌群的总体构成特点，有助于更加全面的理解菌群对宿主生理和病理的影响。根据健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者肠道菌群相关菌群丰度，筛选出预测肝脏疾病的肠道微生物，之后以筛选出的肠道微生物作为检测指标综合判断，可以有效预测和监测肝脏疾病的易感人群或者发现早期患者，以及监控肝脏疾病的治疗效果。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
Claims (4)
1.一种肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一，取健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者中段粪便并提取总RNA，通过对微生物16SrRNA基因V4可变区进行PCR扩增，进行文库构建，对微生物rRNA基因V4可变区进行测序，分析粪便中肠道菌群相对丰度；
步骤二，将上述肠道菌群相对丰度进行ROC分析，获得AUC、灵敏度、特异度和cut-off值，选取AUC>0.7，相对丰度cut-off值>0.001的肠道微生物作为检测指标预测肝脏疾病。
2.根据权利要求1所述的肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，其特征在于：在步骤一中，取健康人、非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌患者100mg中段粪便并提取总RNA。
3.根据权利要求2所述的肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，其特征在于：在步骤一中，所述肝硬化患者包括代偿性肝硬化、轻度失代偿性肝硬化、重度失代偿性肝硬化患者。
4.根据权利要求3所述的肠道菌群相对丰度预测肝脏疾病的分析技术，其特征在于：经分析筛选后，作为预测非酒精性脂肪肝的肠道微生物包括：p_firmicutes，c_clostridia，o_clostridiales，f_ruminococcaceae，f_bacteroidaceae，g_bacteroides，g_lachnoclostridium，s_bacteroides_vulgatus，s_blautia_obeum，p_bacteroidetes/p_firmicutes；作为预测代偿性肝硬化的肠道微生物包括：p_proteobacteria，g_streptococcus；作为预测轻度失代偿性肝硬化的肠道微生物包括：c_clostridia，o_clostridiales，f_lachnospiraceae，g_blautia，g_unidentified_lachnospiraceae，c_bacilli，o_lactobacillales，f_streptococcaceae，g_streptococcus，s_ruminococcus_sp_5_1_39bfaa，c_negativicutes，o_selenomonadales，f_veillonellaceae，g_romboutsia，g_unidentified_ruminococcaceae，g_fusicatenibacter，s_bifidobacterium_adolescentis，s_lactobacillus_salivarius，s_blautia_obeum，o_pasteurellales，f_pasteurellaceae，g_anaerostipes，g_veillonella，f_lactobacillaceae，g_lactobacillus；作为预测重度失代偿性肝硬化的肠道微生物包括：o_enterobacteriales，f_enterobacteriaceae，c_gammaproteobacteria，g_unidentified_enterobacteriaceae，s_escherichia_coli，p_proteobacteria，c_bacilli，o_lactobacillales，f_streptococcaceae，g_streptococcus，g_veillonella，o_pasteurellales，f_pasteurellaceae，p_firmicutes，c_clostridia，o_clostridiales，f_lachnospiraceae，f_ruminococcaceae，g_faecalibacterium，p_actinobacteria，g_unidentified_lachnospiraceae，g_blautia，o_bifidobacteriales，f_bifidobacteriaceae，g_bifidobacterium，s_ruminococcus_sp_5_1_39bfaa，c_erysipelotrichia，o_erysipelotrichales，f_erysipelotrichaceae，g_romboutsia，f_bacteroidaceae，g_bacteroides，g_dorea，g_roseburia，g_fusicatenibacter，g_anaerostipes，g_unidentified_ruminococcaceae，s_bacteroides_uniformis，s_bifidobacterium_adolescentis，s_bacteroides_uniformis，f_tannerellaceae，g_parabacteroides；作为预测肝癌的肠道微生物包括：p_bacteroidetes/p_firmicutes，p_firmicutes，c_clostridia，o_clostridiales，f_lachnospiraceae，f_ruminococcaceae，p_proteobacteria，g_faecalibacterium，g_blautia，c_gammaproteobacteria，o_enterobacteriales，f_enterobacteriaceae，c_negativicutes，o_selenomonadales，c_alphaproteobacteria，f_porphyromonadaceae，g_parabacteroides，g_ruminococcus_torques_group，s_ruminococcus_sp_5_1_39bfaa，f_veillonellaceae，s_bacteroides_fragilis，o_sphingobacteriales，g_fusicatenibacter，c_erysipelotrichia，o_erysipelotrichales，f_erysipelotrichaceae，o_rhizobiales，s_parabacteroides_distasonis，g_romboutsia，s_bacteroides_plebeius，p_tenericutes，c_mollicutes，g_dorea，f_streptococcaceae，g_prevotella_9，f_rikenellaceae，g_alistipes，g_anaerostipes，g_streptococcus，g_megamonas，f_lactobacillaceae，g_lactobacillus，s_blautia_obeum，g_veillonella，g_unidentified_ruminococcaceae。
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- 2020-05-13 CN CN202010404396.1A patent/CN111549155A/zh active Pending
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