CN109913567A - 系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测方法及试剂盒 - Google Patents

系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN109913567A CN201910317397.XA CN201910317397A CN109913567A CN 109913567 A CN109913567 A CN 109913567A CN 201910317397 A CN201910317397 A CN 201910317397A CN 109913567 A CN109913567 A CN 109913567A
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古洁若
林智明
桂连
左晓宇
冯俊梅
崔春平
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Abstract

系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测方法及试剂盒，属于生物医学检测技术领域，本发明申请即是针对当前缺乏SLE疾病病情判断的特异性检测方法及相关试剂盒的问题，提供一种针对3种SLE致病相关的肠道菌群检测试剂盒，以协助进行特异的SLE疾病病情判断。本发明的有益效果在于，提供了一种更加方便准确的系统性红斑狼疮病情判断的评估方式。

Description

系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明申请涉及一种联合肠道埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)和普氏菌属(Prevotella)的多菌属定量法进行系统性红斑狼疮的病情评估方法及专用试剂盒，属于生物医学检测技术领域。
背景技术
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，全球患病率为0.02％-0.24％，临床症状多样，主要表现为皮肤红斑、光过敏、关节炎、肾小球肾炎、心包炎、癫痫等神经系统症状和贫血、血小板减少等血液系统症状。以往的研究表明遗传学、表观遗传学、激素等年龄相关性因素和环境因素的相互作用引发免疫系统异常，导致患者易发SLE。
正常人体肠道内定植着大量的微生物，其中肠道细菌占肠道微生物总数的90％，其种类超过1000种，肠道菌群细胞总数目高达100万亿个，是人体细胞数目的10倍，这些肠道菌群基因数是人类基因数目的100倍，统称为宏基因组。因此肠道菌群被视为人体的“隐藏的器官”，携带着人类的第二套基因组。生理状态下，肠道菌群不仅参与防御细菌、病毒等病原体入侵的肠粘膜屏障的构建，还参与人体多种生理代谢过程。大量研究表明,当肠道微生物与机体之间的平衡被打破后,菌群会通过影响能量吸收，改变肠道通透性，以及影响短链脂肪酸、胆碱、胆汁酸和丁酸盐的代谢，以及利用对免疫细胞的影响打破免疫稳态等途径影响宿主的健康。
目前研究认为肠道菌群作为重要的环境因素，不仅是引起类风湿性关节炎、脊柱关节炎和1型糖尿病等疾病的重要病因，也与系统性红斑狼疮的发生密切相关。但系统性红斑狼疮相关的肠道菌群研究存在样本量小的不足，这在一定程度上限制的研究证据的说服力，且研究对象集中处于单一的疾病活动或非活动阶段，所得的致病性菌群也不同。因此，我们有必要进一步扩大研究的样本量，纳入处于不同疾病阶段的研究病例，借助先进的16SrRNA基因高通量测序技术对健康人群和SLE患者的肠道菌群进行分析，以此找到SLE疾病的相关性致病菌。
SLE是较为常见的慢性自身免疫性疾病，病程迁延，且随着病情进展会危及肾脏和脑，严重威胁到患者的生命，故应争取早预防、早发现、早诊断和早治疗。然而，截至目前，通常主要采用临床症状以及血清学的实验室自身抗体等检测的辅助检查来进行判断，缺乏特异性的辅助病情判断方法及相关检测试剂盒，因此，我们期望基于前期SLE疾病相关的肠道菌群的研究发现发明特异性SLE检测试剂盒，以协助进行早期的SLE疾病病情的判断。
发明内容
本发明申请即是针对当前缺乏SLE疾病病情判断的特异性检测方法及相关试剂盒的问题，提供一种针对3种SLE致病相关的肠道菌群检测试剂盒，以协助进行特异的SLE疾病病情判断。
本申请经过广泛而深入的研究，通过16S rRNA基因扩增子测序对健康人群和SLE患者进行肠道菌群结构和丰度的分析，结果首次发现SLE患者的Escherichia表达量[中位数(四分位间距)＝0.19(0.09-0.44)]显著高于健康对照组[中位数(四分位间距)＝0.06(0.02-0.11)]，P＝3.80×10-15；SLE患者的Streptococcus表达量[中位数(四分位间距)＝0.08(0.03-0.15)]显著高于健康对照组[中位数(四分位间距)＝0.03(0.02-0.04)]，P＝3.80×10-13；SLE患者的Prevotella表达量[中位数(四分位间距)＝0(0-0.01)]显著高于健康对照组[中位数(四分位间距)＝0.01(0.01-0.53)]，P＝1.22×10-14。由此可见，这3种肠道菌属的改变与系统性红斑狼疮的发病密切相关，可根据其表达量的改变协助进行系统性红斑狼疮的病情判断，以此为基础完成了本发明。
本发明申请的目的之一是提供一个系统性红斑狼疮的病情评估的综合性指标，所述的肠道Escherichia和Streptococcus高于健康人群，而Prevotella表达量低于健康人群。
本发明申请的目的之二是提供一种系统性红斑狼疮的病情评估方法，所述的评估方法是计算受测人群的肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella表达量，并与健康人群参考值((基于前期研究结果制定的医学参考值范围分别为0.01-0.36，0.0-0.13和0.0-0.78))进行比较，当Escherichia和(或)Streptococcus高于健康人群和(或)Prevotella低于健康人群时，则可协助判断风险人群的病情。
检测肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella的样品为粪便。
所述的评估方法包括如下的步骤：
1)提取待测样本粪便中的基因组DNA；
2)利用16S rRNA基因V3-V4区特异性引物通过PCR法对其进行扩增标记和Miseq测序仪测序；
3)对测序所得测序序列(reads)进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU，再将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对，获得肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella微生物物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换；
4)将计算出的肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella与健康人群参考值(基于前期134例健康者的研究结果采用百分位数法制定出3种肠道菌属的医学参考值范围分别为0.01-0.36，0.0-0.13和0.0-0.78)进行比较。
本发明申请的目的之三是提供一种系统性红斑狼疮致病相关的肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
样本建库测序
在从粪便样本中提取基因组DNA后，所有的DNA的上样终浓度均标准化为5ng/ul(PCR级水稀释)，体积至少是2.5ul，即总质量是12.5ng。
(1)PCR扩增
反应体系为：
微生物基因组DNA(5ng/ul)2.5μl；
扩增子PCR正向引物(1uM)5μl；
扩增子PCR反向引物(1uM)5μl；
2×KAPA Hifi hotstar readymix 12.5μl，总体系25μl。
反应程序为：
95℃3min；
95℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环；
72℃5min，4℃-∞。
Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测PCR扩增产物约550bp即为合格，进行下一步操作。
(2)PCR纯化
1.室温离心扩增子PCR板1000g，1min,撕去密封膜；
2.涡旋震荡AMPure XP磁珠30s，混匀磁珠，使用多通道移液器在上述PCR扩增产物中每孔加入20ul AMPure XP磁珠，加样后及时更换枪头；
3.用移液器上下轻柔混匀10次，室温静置孵育5min；
4.放于磁力架上静置2min；
PCR板放置在在磁力架，进行以下操作：
5.使用多通道移液器弃去上清，更换枪头；
6.每孔加入200ul新鲜配置的80％乙醇进行清洗；
7.静置30s，最大限度的吸走上清；
8.重复清洗一次，最大限度吸走上清；
9.室温放置，风干10min；
10.从磁力架上移开扩增子PCR板，加入52.5ul PCR级水；
11.上下吹打10次充分混合磁珠，室温孵育2min；
12.将扩增子PCR板放回磁力架上静置2min，吸取50ul上清液加入1块新的96孔PCR板中，注意及时更换枪头避免交叉污染。
(3)Index PCR
反应体系为：
DNA 5μl；
Nextera XT Index 1引物(N7XX)5μl；
Nextera XT Index 2引物(S5XX)5μl；
2×KAPA Hifi hotstar readymix 25μl；
PCR级水10μl总体系50μl。
反应程序为：
95℃3min；
95℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环；
72℃5min，4℃-∞。
(4)PCR纯化
1.室温下离心上述index PCR板280g，1min,撕去密封膜；
2.涡旋震荡AMPure XP磁珠30s混匀磁珠，使用排枪在上述标记的PCR产物中每孔加入56ul AMPure XP磁珠，注意及时更换枪头；
3.用移液器上下混匀10次，室温静置5min；
4.放在磁力架上静置2min；
5.使用排枪弃去上清；
6.每孔加入200ul新鲜配置的80％乙醇进行清洗；
7.静置30s，最大限度的吸走上清；
8.重复清洗1次，吸走上清；
9.室温放置10min，风干；
10.从磁力架上取出index PCR板，加入27.5ul PCR级水；
11.上下吹打10次充分混合磁珠，室温孵育2min；
12.将index PCR板重新放在磁力架上，吸取25ul上清液加入1块新的96孔PCR板中，注意及时更换枪头避免交叉污染。
13.磁珠纯化后，Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测文库大小约630bp即为合格，可进行下一步操作。
(5)文库的定量、标准化和池化(pooling)
计算文库的浓度，DNA浓度(nM)＝DNA文库的浓度(ng/μl)/[(660g/mol×平均文库大小]×106。
基于上述文库浓度，将其稀释至4nM，然后每个库各取5ul进行池化。
(6)文库变性和Miseq样本上样
1)DNA变性及稀释
①在微量离心管里加入4nM pooled library 5μl和新鲜配置的0.2N NaOH 5μl。
②充分的混匀，室温离心280g，1min；
③室温孵育5min；
④加入990μl预冷的杂交缓冲液HT1制备20pM变性文库；
⑤取上述120ul 20pM变性文库，加入480ul预冷的杂交缓冲液HT1制备4pM上样变性文库，充分混合，置于冰上待用。
2)Phix文库对照品的变性和稀释
取10nM PhiX library 2μl加入3μl的PCR级水制成4nM PhiX library，其余步骤同上述DNA变性和稀释。
3)扩增子文库和Phix文库对照品的混合
①取上述稀释的Phix文库对照品30μl和扩增子文库570μl进行混合，然后放在冰上直到下一步操作；
②放在恒温加热仪上96℃加热2min；
③孵育后混匀1-2次后立即进行冰浴5min，待上机测序。
4)测序
利用MiSeq测序仪进行测序并通过MiSeq报告软件(MiSeq Reporter software，MSR)对MiSeq测序原始数据进行分析。
数据分析
1)测序序列统计、质控与组装
原始数据保存为fastq格式。使用软件去除接头、低质量序列，比对数据库去除污染序列，对优化序列进行组装；
2)对这些测序序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella微生物物种和表达丰度信息，并对表达丰度进行平方根的转换；
本发明申请的目的之四是提供一种用于系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测试剂盒，所述的试剂盒内包括有：
1)PCR法扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区的特异性正反向引物冻干粉，
正向引物序列5’-3’：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGGGGCAGCAG，
反向引物序列5’-3’：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACCGGGGTATCTAATCC；
2)2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix(高保真热启动DNA聚合酶预混液)；
3)AMPure XP磁珠；
4)Nextera XT Index 1引物(N7XX)，Nextera XT Index 2引物(S5XX)
5)HT1(杂交缓冲液)；
6)PhiX文库对照品；
7)PCR级水；
8)多通道无RNA/DNA酶试剂槽；
9)Illumina Miseq Reagent Cartridge；
10)Illumina Miseq PR2(Miseq结合缓冲液)；
11)Illumina Miseq Flow Cell(Miseq流动槽)；
本发明申请的目的之五是提供系统性红斑狼疮致病相关的肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella在系统性红斑狼疮治疗中的应用。
本发明提供一种药物，所述的药物用于调节体内肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella的数量。
具体来讲，主要是通过降低肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella表达量在研制系统性红斑狼疮治疗药物中的应用，包括诱导Escherichia和Streptococcus死亡或抑制其生长，或者通过抑制Prevotella死亡和促进其生长等途径，制备成治疗药物。
本发明的有益效果在于，提供了一种更加方便准确的系统性红斑狼疮病情判断的评估方式。
具体实施方式
以下结合具体的实施方式，对本发明申请所述的具有辅助系统性红斑狼疮风险人群病情评估价值的肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella的检测方法及其试剂盒进行描述，目的是为了公众更好的理解本发明申请所述的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在以相同或近似的原理，对所述方法步骤、试剂、反应条件已经对所述试剂盒做出的任何改进，以实现基本相同的效果为目的，则都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。
实施例1
肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella与系统性红斑狼疮的发病相关性研究
1.研究对象
研究中的50例SLE病例和92例健康对照，主要来自于在中山大学附属第三医院门诊就诊或住院的SLE患者，这些SLE患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和实验室检查结果诊断的符合1997年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准的SLE患者。对于每位SLE患者，在被告知之该研究目的之后同意捐献其粪便用于此项研究，并签署知情同意书。合并怀孕、自身免疫性疾病、风湿性疾病和肿瘤的SLE患者被排除。92例健康对照人群为未使用抗生素或免疫调节剂治疗，无怀孕、肿瘤、感染或任何自身免疫性或风湿性疾病症状或病史的健康志愿者，这些健康志愿者同样在被告知此项研究目的之后同意捐献其粪便用于该项研究，并签署知情同意书。
收集粪便标本时，风湿病专家仔细询问并记录下每个SLE患者和健康对照人群的情况，尤其是SLE患者时记录下基本情况(包括：性别、年龄、发病年龄、病程和抗生素及免疫调节剂的用药情况)和收集临床资料包括SLEDAI评分，anti-dsDNA、C3、C4和Cr。取捐献者新鲜粪便每人10-50g，放于带盖的无菌容器中，带回实验室于4℃冰箱保存，确保在4小时内提取DNA或立即置于-80℃保存待以后提取。而对于健康对照人群，则仔细询问既往病史，包括呼吸系统、心血管系统、内分泌系统、血液系统、消化系统、骨骼肌肉系统、神经系统等各个专科的情况和用药情况，重点排除怀孕和自身免疫性疾病、风湿性疾病、肿瘤等既往病史和抗生素及免疫调节类药物的用药史。
2.实验方法和结果
2.1DNA的提取
在该研究中，我们使用的是QIAamp DNA stool Kit粪便基因组DNA提取试剂盒，从人的粪便样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：QIAamp离心柱、收集管、InhibitEXTM药片、ASL裂解液、AL液、AW1洗液、AW2洗液、AE洗脱液，蛋白酶K。
2.2研究步骤
我们通过16S rRNA扩增子测序技术对SLE病例和健康对照人群进行粪便的肠道菌群16S rRNA V3-V4进行测序，再对所测序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OUT，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得肠道微生物物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换，通过Kruskal-Wallis秩和检验(偏态分布资料)或t检验(正态分布资料)查找有意义的差异菌群，从而该菌群与SLE发病密切相关，可为疾病的病情评估提供帮助。
2.2.1样本的建库测序
在从粪便样本中提取基因组DNA后，所有的DNA的上样终浓度均标准化为5ng/ul，体积至少是2.5ul，即总质量是12.5ng。我们根据Illumina推荐的16S metagenomicsequencing library preparation操作指导手册进行建库和上机前的准备。利用MiSeq报告软件(MiSeq Reporter software，MSR)对MiSeq测序原始数据进行分析。
2.2.2数据分析
①测序序列统计、质控与组装：
原始数据保存为fastq格式。使用软件去除接头、低质量序列，比对数据库去除污染序列，对优化序列进行组装；
②对这些reads进行归类
将序列以97％相似度为阈值划分OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库的代表性菌种Escherichia coli、Streptococcus pneumoniae和Prevotella copri比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，相似度达到90％以上的序列分别聚类成Escherichia、Streptococcus和Prevotella菌属并获得其表达丰度，对表达丰度值进行平方根转换后，采用均数±标准差或中位数(四分位间距)表示；
附：代表性菌种序列
>Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacteriales；Enterobacteriaceae；Escherichia；Escherichia_coli
ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTAGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGAACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTG
>Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Streptococcaceae；Streptococcus；Streptococcus_pneumoniae
GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGGAGGAGCTTGCTTCTCTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTGGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAGAGTAGATGTTGCATGACATTTGCTTAAAAGGTGCACTTGCATCACTACCAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTATCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTAGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTTAACCATAGTAGGCTTTGGAAACTGTTTAACTTGAGTGCAAGAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCTTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGACCCTTTCCGGGGTTTAGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACGACTCTAGAGATAGAGTTTTCCTTCGGGACAGAGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAACGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGTAAGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTG
>Bacteria；Bacteroidetes；Bacteroidia；Bacteroidales；Prevotellaceae；Prevotella；Prevotella_copris
GATGAACGCTAGCTACAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGAAACGACATCGAAAGCTTGCTTTTGATGGGCGTCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTGCCCAYCACTTGGGGATAACCTTGCGAAAGTAAGACTAATACCCAATGATATCTCTAGAAGACATCTGAAAGAGATTAAAGATTTATCGGTGATGGATGGGGATGCGTCTGATTAGCTTGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGRCGAGAGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGCAGGATGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTATAAGGGAATAAAGTGAGCCTCGTGAGGCTTTTTGCATGTACCTTATGAATAAGGACCGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAAGGTCCGGGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGGCCGGAGATTAAGCGTGTTGTGAAATGTAGACGCTCAACGTCTGCACTGCAGCGCGAACTGGTTTCCTTGAGTACGCACAAAGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTCACTGGAGCGCAACTGACGCTGAAGCTCGAAAGTGCGGGTATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCGCACGGTAAACGATGGATGCCCGCTGTTGGTCTGAACAGGTCAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGCATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAATTGCAGAGGAAGGATTTGGAGACAATGACGCCCTTCGGGGYCTCTGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCCTCTCCTTAGTTGCCATCAGGTYAAGCTGGGCACTCTGGGGACACTGCCACCGTAAGGTGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGCAGGTACAGAGAGACGGTYSCYYGYAAAGTSGATCAAATCCTTAAAGCCTGTCTCAGTTCGGACTGGGGTCTGCAACCCGACCCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAGCCGGGGGCGCCTAAAGTCCGTGACCGTAAGGAGCGGCCTAGGGCGAAACTGGTAATTGGGGCT
③通过Kruskal-Wallis秩和检验(偏态分布资料)或t检验(正态分布资料)获得两组间丰度差异显著的物种。
2.3结果
50例系统性红斑狼疮和92例健康对照人群的肠道菌群在菌门水平存在差异(P<0.05)，并且患者的Escherichia表达量0.2(0.11-0.39)高于健康对照组0.04(0.02-0.09)，差异具有显著的统计学差异(P＝1.14×10-9)；患者的Streptococcus表达量0.09(0.04-0.13)高于健康对照组0.03(0.02-0.04)，差异具有显著的统计学差异(P＝3.67×10-9)；患者的Prevotella表达量0(0-0.01)低于健康对照组0.03(0.01-0.57)，差异具有显著的统计学差异(P＝3.68×10-9)，提示肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella表达量与系统性红斑狼疮的发病密切相关。由此可得，当受测人群的肠道Escherichia和(或)Streptococcus高于正常人，和(或)Prevotella低于正常人时，则患系统性红斑狼疮的几率越大，由此有助于协助疾病病情的判断。
实施例2
肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella与系统性红斑狼疮的发病相关性研究
1.研究对象
研究中的94例SLE病例和42例健康对照，主要来自于在中山大学附属第三医院门诊就诊或住院的SLE患者，这些SLE患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和实验室检查结果诊断的符合1997年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准的SLE患者。对于每位SLE患者，在被告知之该研究目的之后同意捐献其粪便用于此项研究，并签署知情同意书。合并怀孕、自身免疫性疾病、风湿性疾病和肿瘤的SLE患者被排除。42例健康对照人群为未使用抗生素或免疫调节剂治疗，无怀孕、肿瘤、感染或任何自身免疫性或风湿性疾病症状或病史的健康志愿者，这些健康志愿者同样在被告知此项研究目的之后同意捐献其粪便用于该项研究，并签署知情同意书。
收集粪便标本时，风湿病专家仔细询问并记录下每个SLE患者和健康对照人群的情况，尤其是SLE患者时记录下基本情况(包括：性别、年龄、发病年龄、病程和抗生素及免疫调节剂的用药情况)和收集临床资料包括SLEDAI，anti-dsDNA、C3、C4和Cr。取捐献者新鲜粪便每人10-50g，放于带盖的无菌容器中，带回实验室于4℃冰箱保存，确保在4小时内提取DNA或立即置于-80℃保存待以后提取。而对于健康对照人群，则仔细询问既往病史，包括呼吸系统、心血管系统、内分泌系统、血液系统、消化系统、骨骼肌肉系统、神经系统等各个专科的情况和用药情况，重点排除怀孕和自身免疫性疾病、风湿性疾病、肿瘤等既往病史和抗生素及免疫调节类药物的用药史。
2.实验方法和结果
2.1DNA的提取
在该研究中，我们使用的是QIAamp DNA stool Kit粪便基因组DNA提取试剂盒，从人的粪便样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：QIAamp离心柱、收集管、InhibitEXTM药片、ASL裂解液、AL液、AW1洗液、AW2洗液、AE洗脱液，蛋白酶K。
2.2研究步骤
我们通过16S rRNA扩增子测序技术对SLE病例和健康对照人群进行粪便的肠道菌群16S rRNA V3-V4进行测序，再对所测序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得肠道微生物物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换，通过Kruskal-Wallis秩和检验(偏态分布资料)或t检验(正态分布资料)查找有意义的差异菌群，从而该菌群与SLE发病密切相关，可为疾病的病情评估提供帮助。
2.2.1样本的建库测序
在从粪便样本中提取基因组DNA后，所有的DNA的上样终浓度均标准化为5ng/ul，体积至少是2.5ul，即总质量是12.5ng。我们根据Illumina推荐的16S metagenomicsequencing library preparation操作指导手册进行建库和上机前的准备。利用MiSeq报告软件(MiSeq Reporter software，MSR)对MiSeq测序原始数据进行分析。
2.2.2数据分析
①测序序列统计、质控与组装：
原始数据保存为fastq格式。使用软件去除接头、低质量序列，比对数据库去除污染序列，对优化序列进行组装；
②对这些reads进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得OTU代表的微生物物种和表达丰度信息，表达丰度值进行平方根转换后，采用均数±标准差或中位数(四分位间距)表示；
③通过Kruskal-Wallis秩和检验(偏态分布资料)或t检验(正态分布资料)获得两组间丰度差异显著的物种。
2.3结果
94例系统性红斑狼疮和42例健康对照人群的肠道菌群在菌门水平存在差异(P<0.05)，并且患者的Escherichia表达量0.18(0.09-0.44)高于健康对照组0.1(0.04-0.16)，差异具有显著的统计学差异(P＝0.0013)；患者的Streptococcus表达量0.07(0.03-0.16)高于健康对照组0.04(0.03-0.06)，差异具有显著的统计学差异(P＝0.0011)；患者的Prevotella表达量0(0.0-0.01)低于健康对照组0.01(0-0.14)，差异具有显著的统计学差异(P＝0.0096)，提示肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella表达量与系统性红斑狼疮的发病密切相关。由此可得，当受测人群的肠道Escherichia和(或)Streptococcus高于正常人，和(或)Prevotella低于正常人时，则患系统性红斑狼疮的几率越大，由此有助于协助疾病病情的判断。
实施例3
肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella与系统性红斑狼疮的发病相关性研究
1.研究对象
研究中的对象是所有实例1和实例2中的SLE人群和健康对照人群，这些SLE患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和实验室检查结果诊断的符合1997年美国风湿病协会制定的SLE诊断标准的SLE患者。对于每位SLE患者，在被告知之该研究目的之后同意捐献其粪便用于此项研究，并签署知情同意书。合并怀孕、自身免疫性疾病、风湿性疾病和肿瘤的SLE患者被排除。134例健康对照人群为未使用抗生素或免疫调节剂治疗，无怀孕、肿瘤、感染或任何自身免疫性或风湿性疾病症状或病史的健康志愿者，这些健康志愿者同样在被告知此项研究目的之后同意捐献其粪便用于该项研究，并签署知情同意书。
收集粪便标本时，风湿病专家仔细询问并记录下每个SLE患者和健康对照人群的情况，尤其是SLE患者时记录下基本情况(包括：性别、年龄、发病年龄、病程和抗生素及免疫调节剂的用药情况)和收集临床资料包括SLEDAI，anti-dsDNA、C3、C4和Cr。取捐献者新鲜粪便每人10-50g，放于带盖的无菌容器中，带回实验室于4℃冰箱保存，确保在4小时内提取DNA或立即置于-80℃保存待以后提取。而对于健康对照人群，则仔细询问既往病史，包括呼吸系统、心血管系统、内分泌系统、血液系统、消化系统、骨骼肌肉系统、神经系统等各个专科的情况和用药情况，重点排除怀孕和自身免疫性疾病、风湿性疾病、肿瘤等既往病史和抗生素及免疫调节类药物的用药史。
2.实验方法和结果
2.1DNA的提取
在该研究中，我们使用的是QIAamp DNA stool Kit粪便基因组DNA提取试剂盒，从人的粪便样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：QIAamp离心柱、收集管、InhibitEXTM药片、ASL裂解液、AL液、AW1洗液、AW2洗液、AE洗脱液，蛋白酶K。
2.2研究步骤
我们通过16S rRNA扩增子测序技术对SLE病例和健康对照人群进行粪便的肠道菌群16S rRNA V3-V4进行测序，再对所测序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得肠道微生物物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换，通过Kruskal-Wallis秩和检验(偏态分布资料)或t检验(正态分布资料)查找有意义的差异菌群，从而该菌群与SLE发病密切相关，可为疾病的病情评估提供帮助。
2.2.1样本的建库测序
在从粪便样本中提取基因组DNA后，所有的DNA的上样终浓度均标准化为5ng/ul，体积至少是2.5ul，即总质量是12.5ng。我们根据Illumina推荐的16S metagenomicsequencing library preparation操作指导手册进行建库和上机前的准备。利用MiSeq报告软件(MiSeq Reporter software，MSR)对MiSeq测序原始数据进行分析。
2.2.2数据分析
①测序序列统计、质控与组装：
原始数据保存为fastq格式。使用软件去除接头、低质量序列，比对数据库去除污染序列，对优化序列进行组装；
②对这些reads进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得OTU代表的微生物物种和表达丰度信息，表达丰度值进行平方根转换后，采用均数±标准差或中位数(四分位间距)表示；
③通过Kruskal-Wallis秩和检验(偏态分布资料)或t检验(正态分布资料)获得两组间丰度差异显著的物种。
2.3结果
144例系统性红斑狼疮和134例健康对照人群的肠道菌群在菌门水平存在差异(P<0.05)，并且患者的Escherichia表达量0.19(0.09-0.44)高于健康对照组0.06(0.02-0.11)，差异具有显著的统计学差异(P＝3.80×10-15)；患者的Streptococcus表达量0.08(0.03-0.15)高于健康对照组0.03(0.02-0.04)，差异具有显著的统计学差异(P＝3.80×10-13)；患者的Prevotella表达量0(0-0.01)低于健康对照组0.01(0.01-0.53)，差异具有显著的统计学差异(P＝1.22×10-14)，提示肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella表达量与系统性红斑狼疮的发病密切相关。由此可得，当受测人群的肠道Escherichia和(或)Streptococcus高于正常人，和(或)Prevotella低于正常人时，则患系统性红斑狼疮的几率越大，由此有助于协助疾病病情的判断。此外，据此采用百分位数法制定肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella医学参考值范围(P2.5-P97.5)分别为0.01-0.36，0.0-0.13和0.0-0.78作为本发明采用的医学参考值范围。
实施例四
肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella与系统性红斑狼疮的发病相关性研究
1.研究对象
所有欲检测是否存在肠道Escherichia和Streptococcus增高或Prevotella减少的待测人群及普通人群。
2.DNA的提取
在对待检测的标本，我们使用的是QIAamp DNA stool Kit粪便基因组DNA提取试剂盒，从人的粪便样本中提取DNA，该试剂盒的组成是：QIAamp离心柱、收集管、InhibitEXTM药片、ASL裂解液、AL液、AW1洗液、AW2洗液、AE洗脱液，蛋白酶K。
3.实验步骤
我们通过上述16S rRNA扩增子测序技术对所有待检测的标本进行粪便的肠道菌群检测，通过V3-V4区两个连续高变区的测序，利用定量PCR技术对16S rRNA基因片段进行扩增，通过高通量测序测定出所有扩增产物序列，分析各序列所代表的细菌物种和表达丰度信息。计算肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella的表达量并分别与正常值(三者的医学参考值范围(P2.5-P97.5)分别为0.01-0.36，0.0-0.13和0.0-0.78)比较，若Escherichia和(或)Streptococcus高于健康人群和(或)Prevotella低于健康人群时，则患病风险越高。
具体如下：
3.1所述的试剂盒包括：
1)PCR法扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区的特异性正反向引物冻干粉，正向引物序列5’-3’：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGGGGCAGCAG，
反向引物序列5’-3’：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACCGGGGTATCTAATCC；
2)2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix(高保真热启动DNA聚合酶预混液)；
3)AMPure XP磁珠；
4)Nextera XT Index 1引物(N7XX)，Nextera XT Index 2引物(S5XX)
5)HT1(杂交缓冲液)；
6)PhiX文库对照品；
7)PCR级水；
8)多通道无RNA/DNA酶试剂槽；
9)Illumina Miseq Reagent Cartridge；
10)Illumina Miseq PR2(Miseq结合缓冲液)；
11)Illumina Miseq Flow Cell(Miseq流动槽)；
3.2所述检测方法
样本建库测序
在从粪便样本中提取基因组DNA后，所有的DNA的上样终浓度均标准化为5ng/ul(PCR级水稀释)，体积至少是2.5ul，即总质量是12.5ng。
(1)PCR扩增
反应体系为：
微生物基因组DNA(5ng/ul)2.5μl；
扩增子PCR正向引物(1uM)5μl；
扩增子PCR反向引物(1uM)5μl；
2×KAPA Hifi hotstar readymix 12.5μl，总体系25μl。
反应程序为：
95℃3min；
95℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环；
72℃5min，4℃-∞。
Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测PCR扩增产物约550bp即为合格，进行下一步操作。
(2)PCR纯化
1.室温离心扩增子PCR板1000g，1min,撕去密封膜；
2.涡旋震荡AMPure XP磁珠30s，混匀磁珠，使用多通道移液器在上述PCR扩增产物中每孔加入20ul AMPure XP磁珠，加样后及时更换枪头；
3.用移液器上下轻柔混匀10次，室温静置孵育5min；
4.放于磁力架上静置2min；
PCR板放置在在磁力架，进行以下操作：
5.使用多通道移液器弃去上清，更换枪头；
6.每孔加入200ul新鲜配置的80％乙醇进行清洗；
7.静置30s，最大限度的吸走上清；
8.重复清洗一次，最大限度吸走上清；
9.室温放置，风干10min；
10.从磁力架上移开扩增子PCR板，加入52.5ul PCR级水；
11.上下吹打10次充分混合磁珠，室温孵育2min；
12.将扩增子PCR板放回磁力架上静置2min，吸取50ul上清液加入1块新的96孔PCR板中，注意及时更换枪头避免交叉污染。
(3)Index PCR
反应体系为：
DNA 5μl；
Nextera XT Index 1引物(N7XX)5μl；
Nextera XT Index 2引物(S5XX)5μl；
2×KAPA Hifi hotstar readymix 25μl；
PCR级水10μl总体系50μl。
反应程序为：
95℃3min；
95℃30s，55℃30s，72℃30s，共25个循环；
72℃5min，4℃-∞。
(4)PCR纯化
1.室温下离心上述index PCR板280g，1min,撕去密封膜；
2.涡旋震荡AMPure XP磁珠30s混匀磁珠，使用排枪在上述标记的PCR产物中每孔加入56ul AMPure XP磁珠，注意及时更换枪头；
3.用移液器上下混匀10次，室温静置5min；
4.放在磁力架上静置2min；
5.使用排枪弃去上清；
6.每孔加入200ul新鲜配置的80％乙醇进行清洗；
7.静置30s，最大限度的吸走上清；
8.重复清洗1次，吸走上清；
9.室温放置10min，风干；
10.从磁力架上取出index PCR板，加入27.5ul PCR级水；
11.上下吹打10次充分混合磁珠，室温孵育2min；
12.将index PCR板重新放在磁力架上，吸取25ul上清液加入1块新的96孔PCR板中，注意及时更换枪头避免交叉污染。
13.磁珠纯化后，Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测文库大小约630bp即为合格，可进行下一步操作。
(5)文库的定量、标准化和池化(pooling)
计算文库的浓度，DNA浓度(nM)＝DNA文库的浓度(ng/μl)/[(660g/mol×平均文库大小]×106。
基于上述文库浓度，将其稀释至4nM，然后每个库各取5ul进行池化。
(6)文库变性和Miseq样本上样
1)DNA变性及稀释
①在微量离心管里加入4nM pooled library 5μl和新鲜配置的0.2N NaOH 5μl。
②充分的混匀，室温离心280g，1min；
③室温孵育5min；
④加入990μl预冷的杂交缓冲液HT1制备20pM变性文库；
⑤取上述120ul 20pM变性文库，加入480ul预冷的杂交缓冲液HT1制备4pM上样变性文库，充分混合，置于冰上待用。
2)Phix文库对照品的变性和稀释
取10nM PhiX library 2μl加入3μl PCR级水的制成4nM PhiX library，其余步骤同上述DNA变性和稀释。
3)扩增子文库和Phix文库对照品的混合
①取上述稀释的Phix文库对照品30μl和扩增子文库570μl进行混合，然后放在冰上直到下一步操作；
②放在恒温加热仪上96℃加热2min；
③孵育后混匀1-2次后立即进行冰浴5min，待上机测序。
4)测序
利用MiSeq测序仪进行测序并通过MiSeq报告软件(MiSeq Reporter software，MSR)对MiSeq测序原始数据进行分析。
数据分析
2)测序序列统计、质控与组装
原始数据保存为fastq格式。使用软件去除接头、低质量序列，比对数据库去除污染序列，对优化序列进行组装；
2)对这些测序序列reads进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对(Greengenes数据库(http://greengenes.lbl.gov/)等)，获得肠道Escherichia、Streptococcus和Prevotella物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换；
3)与医学参考值范围进行比较从而进行病情评估。
4.实验结果：
检测结果为高肠道Escherichia、Streptococcus和(或)低Prevotella时，则有助于系统性红斑狼疮的辅助性诊断评估。
序列表
<110> 系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测方法及试剂盒
中山大学附属第三医院
<120> 系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群的检测方法及试剂盒
<130> PJ1910324.06
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 1
taaggcga 8
<210> 2
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 2
cgtactag 8
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 3
aggcagaa 8
<210> 4
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 4
tcctgagc 8
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 5
ggactcct 8
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 6
taggcatg 8
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 7
ctctctac 8
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 8
cagagagg 8
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 9
gctacgct 8
<210> 10
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 10
cgaggctg 8
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 11
aagaggca 8
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 12
gtagagga 8
<210> 13
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 13
tagatcgc 8
<210> 14
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 14
ctctctat 8
<210> 15
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 15
tatcctct 8
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 16
agagtaga 8
<210> 17
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 17
gtaaggag 8
<210> 18
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 18
actgcata 8
<210> 19
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 19
aaggagta 8
<210> 20
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 20
ctaagcct 8
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 21
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg ggggcagcag 50
<210> 22
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 22
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac cggggtatct aatcc 55
<210> 23
<211> 1464
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 23
attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggtaacagga agcagcttgc 60
tgctttgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg 120
gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc 180
ttagggcctc ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc 240
tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga 300
cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 360
gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg 420
aggaagggag taaagttaat acctttgctc attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 480
taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540
gcgtaaagcg cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg 600
gaactgcatc tgatactggc aagcttgagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa 720
gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg 840
cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg 960
gtcttgacat ccacggaagt tttcagagat gagaatgtgc cttcgggaac cgtgagacag 1020
gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac tcaaaggaga ctgccagtga 1140
taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgac cagggctaca 1200
cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc gaacctcata 1260
aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag 1320
taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440
actttgtgat tcatgactgg ggtg 1464
<210> 24
<211> 1468
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 24
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtagaac gctgaaggag gagcttgctt 60
ctctggatga gttgcgaacg ggtgagtaac gcgtaggtaa cctgcctggt agcgggggat 120
aactattgga aacgatagct aataccgcat aagagtagat gttgcatgac atttgcttaa 180
aaggtgcact tgcatcacta ccagatggac ctgcgttgta ttagctagtt ggtggggtaa 240
cggctcacca aggcgacgat acatagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttcggca atggacggaa 360
gtctgaccga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgta 420
agagaagaac gagtgtgaga gtggaaagtt cacactgtga cggtatctta ccagaaaggg 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt cccgagcgtt gtccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggttag ataagtctga agttaaaggc tgtggcttaa 600
ccatagtagg ctttggaaac tgtttaactt gagtgcaaga ggggagagtg gaattccatg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggag gaacaccggt ggcgaaagcg gctctctggc 720
ttgtaactga cgctgaggct cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgctgt aaacgatgag tgctaggtgt tagacccttt ccggggttta gtgccgtagc 840
taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatccctc tgacgactct agagatagag ttttccttcg ggacagaggt 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccctattgtt agttgccatc atttagttgg gcactctagc gagactgccg 1140
gtaataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatggc tggtacaacg agtcgcaagc cggtgacggc aagctaatct 1260
cttaaagcca gtctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccgtaa ggagccagcc 1440
gcctaaggtg ggatagatga ttggggtg 1468
<210> 25
<211> 1454
<212> DNA
<213> Prevotella corporis
<400> 25
gatgaacgct agctacaggc ttaacacatg caagtcgagg ggaaacgaca tcgaaagctt 60
gcttttgatg ggcgtcgacc ggcgcacggg tgagtaacgc gtatccaacc tgcccaycac 120
ttggggataa ccttgcgaaa gtaagactaa tacccaatga tatctctaga agacatctga 180
aagagattaa agatttatcg gtgatggatg gggatgcgtc tgattagctt gttggcgggg 240
taacggccca ccaaggcgac gatcagtagg ggttctgaga ggaaggtccc ccacattgga 300
actgagacac ggtccaaact cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg tcaatggrcg 360
agagcctgaa ccagccaagt agcgtgcagg atgacggccc tatgggttgt aaactgcttt 420
tataagggaa taaagtgagc ctcgtgaggc tttttgcatg taccttatga ataaggaccg 480
gctaattccg tgccagcagc cgcggtaata cggaaggtcc gggcgttatc cggatttatt 540
gggtttaaag ggagcgtagg ccggagatta agcgtgttgt gaaatgtaga cgctcaacgt 600
ctgcactgca gcgcgaactg gtttccttga gtacgcacaa agtgggcgga attcgtggtg 660
tagcggtgaa atgcttagat atcacgaaga actccgattg cgaaggcagc tcactggagc 720
gcaactgacg ctgaagctcg aaagtgcggg tatcgaacag gattagatac cctggtagtc 780
cgcacggtaa acgatggatg cccgctgttg gtctgaacag gtcagcggcc aagcgaaagc 840
attaagcatc ccacctgggg agtacgccgg caacggtgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggaggaac atgtggttta attcgatgat acgcgaggaa ccttacccgg 960
gcttgaattg cagaggaagg atttggagac aatgacgccc ttcggggyct ctgtgaaggt 1020
gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgtcggc ttaagtgcca taacgagcgc 1080
aacccctctc cttagttgcc atcaggtyaa gctgggcact ctggggacac tgccaccgta 1140
aggtgtgagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcagcacggc ccttacgtcc ggggctacac 1200
acgtgttaca atggcaggta cagagagacg gtyscyygya aagtsgatca aatccttaaa 1260
gcctgtctca gttcggactg gggtctgcaa cccgacccca cgaagctgga ttcgctagta 1320
atcgcgcatc agccatggcg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
agccatgaaa gccgggggcg cctaaagtcc gtgaccgtaa ggagcggcct agggcgaaac 1440
tggtaattgg ggct 1454

Claims (4)

1.一种系统性红斑狼疮致病相关的肠道菌群检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
1)PCR法扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区的特异性正反向引物冻干粉，
正向引物序列5’-3’：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGGGGCAGCAG，
反向引物序列5’-3’：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACCGGGGTATCTAATCC；
2)2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix；
3)AMPure XP磁珠；
4)Nextera XT Index 1引物，Nextera XT Index 2引物
5)HT1；
6)PhiX文库对照品；
7)PCR级水；
8)多通道无RNA/DNA酶试剂槽；
9)Illumina Miseq Reagent Cartridge；
10)Illumina Miseq PR2；
11)Illumina Miseq Flow Cell。
2.一种药物，其特征在于，所述的药物用于调剂肠道内埃希氏菌属、链球菌属和/或普氏菌属的数量。
3.如权利要求2所述的药物，其特征在于，所述的调节是指：包括诱导埃希氏菌属和/或链球菌属死亡或抑制其生长，或者通过抑制普氏菌属死亡和/或促进其生长。
4.一种系统性红斑狼疮致病相关的肠道埃希氏菌属、链球菌属普氏菌属表达量的检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
1)提取待测样本粪便中的基因组DNA；
2)利用16S rRNA基因V3-V4区特异性引物通过PCR法对其进行扩增标记和Miseq测序仪测序；
3)对测序所得测序序列进行归类，将序列以97％相似度为阈值划分OTU，再将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对，获得肠道埃希氏菌属、链球菌属和普氏菌属微生物物种和表达丰度信息，表达丰度进行平方根的转换。
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