CN109843921A - 程序性死亡1配体1(pd-l1)结合蛋白及其应用方法 - Google Patents

程序性死亡1配体1(pd-l1)结合蛋白及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供蛋白质，例如抗体，其包括特异性结合程序性死亡1配体1(PD‑L1)的抗原结合部分。还提供了编码蛋白质的核酸和包含此类核酸的细胞(例如，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)。在一些实施方案中，主题方法包括降低第一种细胞上PD‑L1与第二种细胞上PD‑1之间的相互作用。在某些情况下，接触是体内的。例如，所提供的方法和组合物可用于治疗病毒感染和癌症，例如通过ACT或通过施用特异性结合PD‑L1的主题蛋白质来治疗实体瘤。

Description

程序性死亡1配体1(PD-L1)结合蛋白及其应用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年7月7日提交的美国临时申请No.62/359,612的权益，其全部内容均通过引用整体明确地并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年7月7日创建的该ASCII副本命名为116983-5024_ST25.txt，大小为101,943字节。
背景技术
过继细胞转移(ACT)是一种治疗方法，其中，扩增患者的自体T细胞，离体操作，然后重新引入患者体内以产生应答，例如，抗肿瘤应答。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)通常是指可在肿瘤微环境中发现的异质淋巴细胞群。使用TIL进行ACT治疗的一般原理是，通过将具有抗肿瘤潜能的细胞从免疫抑制性肿瘤微环境中移除，在体外扩增该细胞，然后使扩增的细胞群返回肿瘤部位，杀死肿瘤细胞和可能的其他维持肿瘤的靶细胞，如血管内皮细胞，可以增强抗肿瘤免疫应答。参见Lee和Margolin，Curr.Oncol.Rep.2012；14(5)468-474。
程序性死亡1(PD-1)是在活化的人T细胞上表达的经充分描述的抑制性受体，其与其配体(程序性死亡1配体1(PD-L1)和程序性死亡1配体2(PD-L2))配合，作为限制T细胞介导的多种人类癌症(包括黑素瘤)中的抗肿瘤活性的检查点因子起作用。PD-1由TIL表达，因此，PD-L1在肿瘤微环境中的表达抑制癌症疾病进展，包括例如肿瘤生长。
因此，本领域需要新的组合物和方法，其干扰PD-1与PD-L1相互作用的抑制作用，例如，在使用TIL的ACT治疗的情况下。
发明内容
本公开提供蛋白质，例如抗体，其包括特异性结合程序性死亡1配体1(PD-L1)的抗原结合部分。还提供了编码蛋白质的核酸和包含此类核酸的细胞(例如，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)。在一些实施方案中，主题方法包括降低第一种细胞上的PD-L1与第二种细胞上的PD-1之间的相互作用。例如，所提供的方法和组合物可用于治疗病毒感染和癌症，例如通过ACT或通过施用特异性结合PD-L1的主题蛋白质来治疗实体瘤。
本公开的组合物和方法可以允许基因修饰的细胞毒性淋巴细胞(例如，活化的T细胞、TIL和NK细胞)繁殖和输注，作为可以在基因修饰的细胞毒性淋巴细胞中分泌PD-L1结合蛋白(例如，scFV、大抗体(maxibody))的细胞疗法施用于受试者。以这种方式，本公开的细胞毒性淋巴细胞能够“减轻”它们自身对PD-1检查点的抑制作用，从而在施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的受试者中提供改善的抗癌作用。本公开的特异性结合蛋白(例如，抗PD-L1抗体)也可以向个体直接施用，例如，静脉注射(i.v.)或肿瘤内注射。
本公开提供了特异性结合PD-L1的蛋白质，其包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽；或(b)包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽，并且第一多肽和/或第二多肽的3个CDR氨基酸序列各自对于指定的SEQ ID编号包含两个以下保守氨基酸替换。
在一些实施方案中，抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：6-8中所示的3个CDR氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16中所示的3个CDR氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽是轻链，第二多肽是重链。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的蛋白质是单链抗体(scFv)，并且第一多肽和第二多肽直接融合或通过接头彼此融合。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的蛋白质是包含免疫球蛋白Fc结构域的大抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过接头与抗原结合部分融合。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1Fc结构域。在一些实施方案中，蛋白质包含SEQ ID NO：18或SEQID NO：20所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG4Fc结构域。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的蛋白质是人源化抗体。
本公开还提供了核酸，其包含编码特异性结合PD-L1的蛋白质(如本文所讨论的)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含与编码蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。
本公开还提供了包含编码特异性结合PD-L1的蛋白质的核酸的细胞。在一些实施方案中，所述核酸整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述细胞是经基因修饰以表达和分泌所述蛋白质的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T辅助细胞。在一些实施方案中，T细胞来源于外周血。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，NK来源于外周血。
在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是源自受试者的肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，TIL包含对源自肿瘤的抗原有特异性的受体。
在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。在一些实施方案中，一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞包含对肿瘤相关的抗原有特异性的T细胞受体。
本公开还提供了一种方法，包括：通过向细胞毒性淋巴细胞中引入编码特异性结合PD-L1的蛋白质的核酸，对从受试者肿瘤中分离的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质；扩增所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，以产生基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群；以及，将基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群施用于受试者以治疗肿瘤。
在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。在一些实施方案中，核酸整合到细胞毒性淋巴细胞的基因组中。
在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T辅助细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对源自肿瘤的抗原有特异性的受体。
在一些实施方案中，该方法包括在基因修饰之前从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞。
在该方法的一些实施方案中，蛋白质特异性结合PD-L1并且包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽；或(b)包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽，并且第一多肽和/或第二多肽的3个CDR氨基酸序列各自对于指定的SEQ ID编号包含两个以下保守氨基酸替换。
在该方法的一些实施方案中，抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：6-8中所示的3个CDR氨基酸序列。
在该方法的一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
在该方法的一些实施方案中，抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO：14-16中所示的3个CDR氨基酸序列。
在该方法的一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列。
在该方法的一些实施方案中，第一多肽是轻链，第二多肽是重链。
在该方法的一些实施方案中，蛋白质是单链抗体(scFv)，并且第一多肽和第二多肽直接融合或通过接头彼此融合。
在该方法的一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。
在该方法的一些实施方案中，蛋白质是包含免疫球蛋白Fc结构域的大抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过接头与抗原结合部分融合。
在该方法的一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1Fc结构域。
在该方法的一些实施方案中，蛋白质包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
本公开还提供了制备基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的方法，该方法包括：通过向细胞毒性淋巴细胞中引入编码特异性结合PD-L1的蛋白质的核酸，对从患有或怀疑患有癌症的受试者中分离的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质。在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
在一些实施方案中，该方法包括在体外扩增细胞毒性淋巴细胞，以提供扩增的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群。
在一些实施方案中，该方法包括在基因修饰之前从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞。
在一些实施方案中，分离包括从受试者的肿瘤中分离细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，分离包括从受试者的外周血中分离细胞毒性淋巴细胞。
在该方法的一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是T细胞。在该方法的一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在该方法的一些实施方案中，T细胞是CD4+T辅助细胞。在该方法的一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
在该方法的一些实施方案中，核酸整合到细胞毒性淋巴细胞的基因组中。
在该方法的一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。在该方法的一些实施方案中，一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
在该方法的一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对来自受试者肿瘤的抗原具有特异性的T细胞受体。
本公开还提供了治疗患有或怀疑患有癌症的个体的方法，该方法包括：将特异性结合PD-L1的蛋白质施用于个体(例如，受试者或患者，包括例如哺乳动物，如人)
在该方法的一些实施方案中，施用包括向受试者引入编码特异性结合PD-L1的蛋白质的核酸。
在该方法的一些实施方案中，施用包括向受试者引入表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。
在该方法的一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。在该方法的一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。在一些实施方案中，该方法包括诱导特异性结合PD-L1的蛋白质的表达。
在该方法的一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是T细胞。在该方法的一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在该方法的一些实施方案中，T细胞是CD4+T辅助细胞。在该方法的一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
在该方法的一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。在该方法的一些实施方案中，一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
在该方法的一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对来自受试者肿瘤的抗原具有特异性的T细胞受体。
本公开还提供了降低第一种细胞上的PD-L1与第二种细胞上的PD-1之间相互作用的方法，该方法包括：使第一种细胞上的PD-L1与特异性结合PD-L1的蛋白质接触。
在该方法的一些实施方案中，将第一种细胞和第二种细胞引入个体，并且，接触包括施用特异性结合PD-L1的蛋白质。在该方法的一些实施方案中，引入包括全身施用。在该方法的一些实施方案中，引入包括局部施用。在该方法的一些实施方案中，局部施用包括肿瘤内施用。在该方法的一些实施方案中，该个体患有癌症。在该方法的一些实施方案中，该个体患有实体瘤。
附图说明
从以下详细描述中结合说明书附图进行阅读，可以最佳地理解本发明。
附图中包括以下图：
图1提供了用于产生38A1-Fc、19H9-Fc和FMC63-Fc的慢病毒质粒的示意图。在来自MSCV启动子的U3启动子的下游和IRES-eGFP盒的上游编码抗PD-L1大抗体。
图2提供了用于产生38A1-Fc、19H9-Fc和FMC63-Fc的逆转录病毒质粒的示意图。在来自MSCV启动子的U3启动子的下游和IRES-eGFP盒的上游编码抗PD-L1大抗体。
图3A-3B提供了来自基于细胞的ELISA的数据，以确定38A1-scFV-Fc和19H9-scFV-Fc对PD-L1的亲和力。用19H9-scFV-Fc(图A)或38A1-scFV-Fc(图B)染色293-PD-L1。在293-PD-L1上将大抗体从100nM滴定至0.01nM、洗涤并用HRP标记的抗人Fcγ特异性抗体染色。在加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)后，通过在450nm处的光密度测定结合。12D10-scFV-Fc用作阴性对照。
图4A-4C提供的数据显示293-PD-L1细胞结合由Jurkat T细胞分泌的抗PD-L1大抗体。将稳定表达FMC63-scFV-Fc(图A)、38A1-scFV-Fc(图B)或19H9-scFV-Fc(图C)的JurkatT细胞以1：1的比例共培养16小时。收获细胞并用Alexa 647标记的抗人Fcγ特异性抗体染色。与阴性对照大抗体(FMC63-scFV-Fc)相比，观察到19H9-scFV-Fc和38A1-scFV-Fc的平均荧光强度(大抗体的结合)分别增加100倍至300倍之间。
图5A-5D提供的数据显示293-PD-L1细胞结合由肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分泌的抗PD-L1大抗体。来自稳定表达FMC63-scFV-Fc(图A、图C)或38A1-scFV-Fc(图B、图D)的TIL系M1034(图A、图B)和M1015(图C、图D)的上清液被浓缩10倍，并用于染色293-PD-L1。使用Alexa 647标记的抗人Fcγ特异性抗体，检测大抗体。与阴性对照大抗体(FMC63-scFV-Fc)相比，我们观察到38A1-scFV-Fc的平均荧光强度(大抗体的结合)增加超过50倍。
图6提供的数据显示了抗PD-L1大抗体限制PD-L1介导的NFAT活性抑制的能力。在NFAT启动子下游表达PD1和萤火虫荧光素酶的Jurkat T细胞与CHO细胞以2：1的比例共培养，该CHO细胞表达PD-L1和专有的T细胞激动蛋白(PD1/PD-L1阻断生物测定试剂盒(PD1/PD-L1 Blockade Bioassay Kit)，Promega产品目录号CS187111)，以及12D10-scFV-Fc(阴性对照；灰色)、19H9-scFV-Fc(红色)、38A1-scFV-Fc(蓝色)或阳性对照PD1特异性抗体EH12.2H7(Biolegend；绿色)之一。将大抗体从25μg/ml滴定至0.016μg/ml。在加入5'-氟荧光素后，将Jukat T细胞活化(PD-L1的去抑制)测量为生物发光活性(相对发光单位；RLU)。
图7提供了新产生的38A1和19H9抗体的抗原结合区的序列，以及包括抗原结合区38A1或19H9的scFV蛋白(例如scFV和scFV-FC融合体)的例子。
图8描绘了编码诱导型启动子的表达载体(例如，慢病毒载体)的实例示意图。
图9描绘了编码诱导型启动子的表达载体(例如，慢病毒载体)的实例示意图。
图10提供了用作本发明方法中的示例性载体的pLEV载体的空载体序列。(A)pLV430G(慢病毒载体)(SEQ ID NO：35)和(B)pCIGO-VSV.G(VSVG)(SEQ ID NO：36)。
图11A-11B提供了(A)pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37)和(B)pLV4301GPDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38)的完整载体核苷酸序列。
图12提供的数据显示19H9表现出更高分泌能力。提供了过表达抗PD-L1 ScFV克隆19H9与38A1的Jurkat细胞的分泌能力的比较。收获并浓缩来自过表达抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的Jurkat细胞的上清液，用于IgG ELISA测定以确定抗PD-L1 ScFV浓度。发现与38A1相比，Jurkat细胞克隆19H9具有更高的分泌能力(9.82μg/细胞对6.75μg/细胞)。
图13A-13B提供的数据显示在过表达PD-L1的Jurkat细胞中38A1表现出更高的结合能力。利用EL4 PD-L1细胞，检测抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的结合亲和力。将EL4 PD-L1与浓度为1、3、10、30、100和300ng/ml的抗PD-L1 ScFV克隆19H9或38A1一起孵育，并用Amcyan和山羊抗人FITC染色。用FAC缓冲液洗涤细胞并用流式细胞仪分析。就(A)PD-L1阳性细胞百分比和(B)荧光强度平均值(MFI)来说，克隆38A1在过表达PD-L1的Jurkat细胞中都表现出更高的结合能力。
图14A-14B提供的数据显示在黑素瘤肿瘤细胞中38A1表现出更高的结合能力。提供了利用EL4 PD-L1细胞的抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的结合亲和力比较。将EL4 PD-L1与浓度为1、3、10、30、100和300ng/ml的抗PD-L1 ScFV克隆19H9或38A1一起孵育，并用Amcyan和山羊抗人FITC染色。用FAC缓冲液洗涤细胞并用流式细胞仪分析。就(A)PD-L1阳性细胞百分比和(B)荧光强度平均值(MFI)来说，克隆38A1在过表达PD-L1的Jurkat细胞中都表现出更高的结合能力。为了验证抗PD-L1 ScFV在肿瘤细胞中的结合，用IFN-γ(100ng/ml)处理三种黑素瘤肿瘤细胞以增强PD-L1表达。三天后，用细胞解离缓冲液收获细胞，与浓度为100ng/ml的抗PD-L1 ScFV克隆19H9或38A1一起孵育，并用山羊抗人FITC染色。用FAC缓冲液洗涤细胞并用流式细胞仪分析。我们发现，就PD-L1阳性细胞百分比和MFI来说，克隆38A1都表现出更大的结合亲和力。总之，与克隆19H9相比，克隆38A1具有更高的结合亲和力，但分泌能力略低。
图15A-15B提供的数据显示，38A1表现出比19H9更高的生物学功能。为了进一步确定抗PD-L1 ScFV的两个克隆(19H9和38A1)的生物学功能，进行PD-L1阻断测定，该测定可用于确定抗PD-1或PD-L1抗体阻断PD-1和PD-L1参与相互作用的效力。该测定由两种基因工程细胞系组成：PD-1效应细胞(稳定表达人PD-1和NFAT诱导的荧光素酶的Jurkat T细胞)和PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞(稳定表达人PD-L1、具有活化同源TCR的细胞表面蛋白)。当这两种细胞类型共培养时，PD-1和PD-L1的结合抑制TCR信号传导并降低荧光素酶活性。添加抗-PD-1或PD-L1阻断抗体有助于释放被抑制的信号，导致TCR信号传导和NFAT介导的荧光素酶活性增强。与抗-PD1相比，当用抗-PD-L1阻断时，发现荧光素酶信号(RLU)更大，表明在这种情况下阻断PD-L1似乎比阻断PD-1更有效(A)。预期地，先前显示具有更高结合亲和力的抗PD-L1 ScFV克隆38A1由于在纯化的ScFV(P)和未纯化的(NP)设置中荧光素酶信号都显著增加而提供了更高的生物学功能(B)。
图16提供了(A)pLV4301G PDLV scFV 38A1和(B)pLV4301G PDLV scFV 19H9的载体图谱。
图17提供了IgG1(SEQ ID NO：39)、IgG2(SEQ ID NO：40)、IgG3(SEQ ID NO：41)和IgG4(SEQ ID NO：42)序列的实例。
具体实施方式
本公开提供蛋白质，例如抗体，其包括特异性结合程序性死亡1配体1(PD-L1)的抗原结合部分。还提供了编码蛋白质的核酸和包含此类核酸的细胞(例如，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)。在一些实施方案中，主题方法包括降低第一种细胞上的PD-L1与第二种细胞上的PD-1之间的相互作用。例如，所提供的方法和组合物可用于治疗病毒感染和癌症，例如通过ACT或通过施用特异性结合PD-L1的主题蛋白质来治疗实体瘤。
本公开的组合物和方法提供基因修饰的细胞毒性淋巴细胞(例如，活化的T细胞、TIL和NK细胞)，其可以作为细胞疗法繁殖和输注，导致在输入受试者的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞中分泌PD-L1结合蛋白(例如，scFV、大抗体(maxibody)等)。以这种方式，本公开的细胞毒性淋巴细胞能够“减轻”它们自身对PD-1检查点的抑制作用，从而提供改善的抗癌作用。本公开的特异性结合蛋白(例如，抗PD-L1抗体)也可以向个体直接施用，例如，静脉注射(i.v.)或肿瘤内注射。
在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的至下限单位十分之一的每个中间值。在规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或在该范围内排除，并且在较小范围中包括零个、任一个或两个限制的每个范围都包括在本发明内，受规定范围内任何特别排除的限制的约束。在规定的范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。已发现这些术语在各种标准参考文献中定义和使用，示例地包括：J.Sambrook和D.W.Russell，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；第4版，2012；F.M.Ausubel,Ed.，分子生物学中的短方案，现行方案(ShortProtocols in Molecular Biology,Current Protocols)；第5版，2002年；B.Alberts等，细胞分子生物学(Molecular Biology of the Cell)，第4版，Garland，2002；D.L.Nelson和M.M.Cox，Lehninger生物化学原理(Lehninger Principles of Biochemistry)，第4版，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Company)，2004；以及Herdewijn,P.(编)，寡核苷酸合成：方法和应用(Oligonucleotide Synthesis：Methods and Applications)，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，Humana出版社，2004。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，描述了优选的方法和材料。
如本文所用，以下每个术语都具有本节中与其相关的含义。
这里使用的冠词“一种(a)”和“一种(an)”是指该冠词的一种以上(即至少一种)语法对象。举例来说，“一种元素”表示一种以上元素。
当提及诸如量、持续时间等可测量值时，本文所用的“约”意味着包括规定值的±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1，还优选±0.1％，因此，这些变化适合于实施所公开的方法。
本文所用的术语“抗肿瘤作用”是指表现出肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加，或与癌症相关的各种生理症状改善的生物效应。“抗肿瘤作用”也可以通过所公开的组合物和方法最初防止肿瘤发生的能力来体现。
除非另有说明，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括，例如，完整的免疫球蛋白或其抗原结合部分，其与完整抗体竞争特异性结合。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv和结构域抗体(dAb)，和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(单链可变结构域片段；scFv)、双抗体、三抗体、四抗体和多肽，该多肽含有足以赋予与该多肽进行特异性抗原结合的至少一部分免疫球蛋白。抗体包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、大抗体(通过接头融合或直接连接Fc或Fc片段的scFv)、双抗体、三抗体、四抗体、Fab片段、F(fa′)x片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体，以及在铰链区中具有至少一个突变的IgG4抗体，所述突变减轻了形成H链内二硫键的倾向。
“Fab片段”是具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab′)2片段是具有两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫键连接；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH结构域；dAb片段具有VH结构域、VL结构域，或VH或VL结构域的抗原结合片段。
“单链抗体”(scFv)是如下的抗体：其中VL和VH区域直接融合或通过接头(例如，氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续蛋白质链，其中接头足够长以允许蛋白质链自身回折并形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等，1988，Science 242：423-26和Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，85：5879-83)。双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含由接头连接的VH和VL结构域，所述接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对，因此允许每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见，例如，Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，90：6444-48和Poljak等，1994，Structure 2：1121-23)。如果双抗体的两条多肽链相同，则由它们配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别是包含三条和四条多肽链的抗体，并分别形成三个和四个相同或不同的抗原结合位点。
可以使用Kabat等人在免疫学蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第5版,US Dept.of Health and Human Services,公共卫生署(PHS),美国国立卫生研究院(NIH),NIH公开号91-3242,1991中描述的系统来鉴定给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。可以将一个或多个CDR共价或非共价地结合到分子中以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以结合CDR作为较大多肽链的一部分，可以将CDR共价连接至另一条多肽链，或者可以非共价地结合CDR。CDR允许抗原结合蛋白特异性结合特定的目标抗原。
术语“人抗体”包括具有一个以上衍生自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中，所有可变区和恒定区均衍生自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。可以以多种方式制备人抗体，包括免疫经基因修饰以表达人抗体的小鼠。人们可以利用人Ig基因座的大片段编辑缺乏小鼠抗体产生的小鼠品系，以期这样的小鼠会在没有小鼠抗体的情况下产生人抗体。大的人Ig片段可以保留大的可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调节。通过利用小鼠组织(mouse machinery)进行抗体多样化和选择以及对人蛋白质免疫耐受性的缺乏，这些小鼠品系中的再生人抗体库可以产生针对任何目标抗原(包括人抗原)的高亲和力完全人抗体。使用杂交瘤技术，可以产生和选择具有所需特异性的抗原特异性人MAb。还可以通过淘选在噬菌体、噬菌粒、核糖体或其他粒子上表达的人抗体库，来制备人抗体。
“人源化抗体”通过一个以上氨基酸替换、缺失和/或添加而具有不同于源自非人物种的抗体序列的序列，使得当施用于人受试者时，人源化抗体不太可能诱导免疫应答，和/或与非人物种的抗体相比，人源化抗体诱导较不严重的免疫应答。在一个实施方案中，使非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸突变，以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，来自人抗体的恒定结构域与非人物种的可变结构域融合。在另一个实施方案中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个以上氨基酸残基，以降低当将非人抗体施用于人受试者时可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者所做的氨基酸序列的改变是保守的改变，使得人源化抗体与抗原的结合并不会明显差于非人抗体与抗原的结合。制备人源化抗体的方法的实例可以在美国专利No.6,054,297、5,886,152和5,877,293中找到，其各自的公开内容在此引入作为参考。
术语“嵌合抗体”是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。“CDR移植抗体”是包含一种或多种CDR的抗体，所述CDR衍生自特定物种或同种型的抗体，以及相同或不同物种或同种型的另一种抗体的框架。
如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”意指解离常数，由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)得到，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域中完善的方法测定抗体的KD值。在一些实施方案中，用于测定抗体的KD的方法是通过使用表面等离振子共振，例如，通过使用生物传感器系统，例如系统。
如本文所用，用于IgG抗体的术语“高亲和力”是指抗体对目标抗原的KD为10-8M以下，在一些实施方案中，10-9M以下，并且在一些实施方案中，10-10M以下。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和力”结合可以变化。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体的KD为10- 7M以下，在一些实施方案中，10-8M以下，在一些实施方案中，10-9M以下。
“组成型”表达包括在细胞的大多数或所有生理条件下在活细胞中产生基因产物的状态。
基因的“编码区”包括基因编码链的核苷酸残基和基因非编码链的核苷酸，它们分别与通过基因转录产生的mRNA分子的编码区同源或互补。mRNA分子的“编码区”还包括mRNA分子的核苷酸残基，其在mRNA分子翻译期间与转运RNA分子的反密码子区匹配或编码终止密码子。因此，编码区可以包括核苷酸残基，该核苷酸残基包含氨基酸残基的密码子，该氨基酸残基不存在于由mRNA分子编码的成熟蛋白质中(例如，蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)。
本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指最初作为白细胞获得的细胞群，其已经离开受试者的血流并迁移到肿瘤中。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17CD4+T细胞、天然杀伤细胞、树突细胞和M1巨噬细胞。TIL包括初级TIL和次级TIL。“初级TIL”是从本文概述的患者组织样品获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次级TIL”是如本文所讨论的已经扩增或增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于本文所讨论的本体(bulk)TIL和扩增的TIL(“REP TIL”)。
TIL通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或通过其渗透肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。TIL通常可以通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外或可替代地，TIL可以通过其在重新引入患者时渗入实体瘤的能力来在功能上定义。
术语“细胞毒性淋巴细胞”包括细胞毒性T(CTL)细胞(包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T辅助淋巴细胞)、天然杀伤T(NKT)细胞和天然杀伤(NK)细胞。细胞毒性淋巴细胞可包括，例如，由肿瘤相关抗原活化和/或用肿瘤特异性嵌合抗原受体或T细胞受体转导的外周血来源的αβTCR阳性或γδTCR阳性T细胞，以及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。细胞毒性淋巴细胞通常杀死癌细胞、被感染的细胞(特别是被病毒感染)，或者受损或有缺陷的细胞。细胞毒性淋巴细胞也可称为细胞毒性T细胞，TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T-杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞是T淋巴细胞(一种白细胞)。
本文用于描述破坏肿瘤的方法的术语“片段化(fragmenting)”、“碎片化(fragment)”和“碎片的(fragmented)”包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分裂和粉碎肿瘤组织以及任何其他破坏肿瘤组织物理结构的方法。
术语“体内”是指在受试者体内发生的事件。
术语“体外”是指在受试者体外发生的事件。体外试验包括使用活细胞或死细胞的基于细胞的试验，并且还可以包括不使用完整细胞的无细胞试验。
术语“抗CD3抗体”是指抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的人、人源化、嵌合或鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗(muromonab)。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)，替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也称为“OKT3”)是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物仿制药或变体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，还包括市售形式，如OKT-3(30ng/mL，纯MACS GMP CD3，Miltenyi Biotech，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)和莫罗单抗或变体、保守氨基酸替换、糖链异质体或其生物仿制药。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心，并分配了ATCC保藏号CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)，并分配目录号86022706。
表1.莫罗单抗的氨基酸序列。
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人的和哺乳动物的形式、保守氨基酸替换、糖链异质体、生物仿制药及其变体。IL-2描述于例如Nelson，J.Immunol.，2004，172，3983-88和Annu.Rev.，Immunol.，2008，26，453-79，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2包括人重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可从多个供应商商购，每个单独使用的小瓶2200万IU)，以及由CellGenix，Inc.，朴茨茅斯，新罕布什尔州，美国(CELLGRO GMP)或ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.，东布伦瑞克，新泽西州，美国(目录号CYT-209-b)商业提供的重组IL-2的形式以及来自其他供应商的其他商业等价物。阿地白介素(des-丙氨酰-1，丝氨酸-125人IL-2)是一种非糖基化的人重组形式的IL-2，分子量约为15kDa。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：30)。术语IL-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化的IL2前药NKTR-214，可从Nektar Therapeutics，南旧金山，加利福尼亚州，美国获得。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化的IL-2描述于美国专利申请公开号US2014/0328791A1和国际专利申请公开号WO2012/065086A1中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的缀合的IL-2的替代形式描述于美国专利4,766,106、5,206,344、5,089,261和4902,502中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利6,706,289中，其公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和IL-21。这些白细胞介素的示例序列在下表2中提供。
表2.白细胞介素的氨基酸序列
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)是指称为白细胞介素4的细胞因子，其由Th2T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节幼稚辅助T细胞(Th0细胞)向Th2T细胞的分化。参见Steinke和Borish，Respir.Res.2001，2，66-70。在被IL-4激活后，Th2T细胞随后在正反馈环中产生额外的IL-4。IL-4还刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并诱导从B细胞转换为IgE和IgG1表达的类别。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购获得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布伦瑞克，新泽西州，美国(目录号CYT-211)和ThermoFisher Scientific,Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：31)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生的细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突细胞中获得。参见Fry和Mackall，Blood2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体结合，IL-7受体是由IL-7受体α和常见γ链受体组成的异二聚体，其在一系列信号中对T细胞在胸腺内的发育和外周存活是重要的。适用于本发明的重组人IL-4可从多个供应商商购获得，包括ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.，东布伦瑞克，新泽西州，美国(目录号CYT-254)和ThermoFisherScientific,Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国(人IL-15重组蛋白，目录号GibcoPHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：32)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白细胞介素15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人的和哺乳动物的形式、保守氨基酸替换、糖链异质体、生物仿制药及其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri，Blood 2001，97，14-32中，其公开内容通过引用并入本文。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚基。重组人IL-15是单个非糖基化多肽链，含有114个氨基酸(和N-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kDa。重组人IL-15可从多个供应商商购获得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布伦瑞克，新泽西州，美国(目录号CYT-230-b)和ThermoFisher Scientific,Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：33)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白细胞介素21的多效细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包括人的和哺乳动物的形式、保守氨基酸替换、糖链异质体、生物仿制药及其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，Nat.Rev.Drug.Disc.2014，13，379-95，其公开内容通过引用并入本文。IL-21主要由天然杀伤T细胞和活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21是单个非糖基化多肽链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kDa。重组人IL-21可从多个供应商商购获得，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，东布伦瑞克，新泽西州，美国(目录号CYT-408-b)和ThermoFisher Scientific,Inc.，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国(人IL-15重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：34)。
“疾病”包括动物的如下健康状态：动物不能维持体内平衡，以及其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。
相反，动物中的“失调”包括动物的如下健康状态：动物能够维持体内平衡，但动物的健康状态不如没有失调时。如果不治疗，失调不一定会导致动物的健康状况进一步下降。
如果疾病或失调的症状严重程度降低，患者经历这种症状的频率降低，或两者都降低，则疾病或失调“减轻”。
关于本发明的方法，术语“肿瘤”或“癌症”可以是任何癌症，包括任意以下：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌、肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌、胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌、中耳癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞癌、宫颈癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、腹膜癌、大网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、软组织癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌、膀胱癌和消化道癌、如食道癌、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌、胃肠道癌(stomach cancer)、小肠癌、胃肠道类癌、口腔癌、结肠癌，以及肝胆癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性黑素瘤。
如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物，例如兔。在一些实施方案中，哺乳动物来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。在一些实施方案中，哺乳动物来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，或奇蹄目(Perssodactyla)，包括马科动物(马)。最优选哺乳动物是灵长目(Primates)、Ceboids或Simoids(猴子)，或类人目(Anthropoids)(人和猿)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“消退”以及由此产生的词语不一定意味着100％或完全消退。相反，存在不同程度的消退，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明的方法可以在哺乳动物中提供任何量的任何水平的癌症消退。此外，由本发明方法提供的消退可以包括疾病(例如，癌症)的一种或多种病症或症状的消退。而且，出于本文的目的，“消退”可以包括延迟疾病的发作，或延迟症状的发作和/或延迟其病症的发作。
组合物的“有效量”或“治疗有效量”包括足以对施用组合物的受试者提供有益效果的组合物的量。递送载体的“有效量”包括足以有效结合或递送组合物的量。
“编码”包括多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性以及由此产生的生物学特性，以作为在具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板。因此，如果例如该基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，“内源的”包括来自生物体、细胞、组织或系统或在内部产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源的”包括从生物体、细胞、组织或系统外引入或产生的任何材料。
“表达盒”包括能够指导目的基因/编码序列表达的任何核酸构建体，其可操作地连接于表达盒的启动子。这种盒可以构建成“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”，以便将表达盒转移到靶细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
如本文所用，术语“片段”，如应用于核酸或多肽，包括较大核酸或多肽的子序列。核酸的“片段”长度可以是至少约15个核苷酸；例如，至少约50个核苷酸至约100个核苷酸；至少约100个至约500个核苷酸，至少约500个至约1000个核苷酸，至少约1000个核苷酸至约1500个核苷酸；或约1500个核苷酸至约2500个核苷酸；或约2500个核苷酸(和其间的任何整数值)。多肽的“片段”长度可以是至少约15个氨基酸；例如，至少约50个氨基酸至约100个氨基酸；至少约100个至约500个氨基酸，至少约500个至约1000个氨基酸，至少约1000个氨基酸至约1500个氨基酸；或约1500个氨基酸至约2500个氨基酸；或约2500个氨基酸(和其间的任何整数值)。
如本文所用，术语“基因”和“重组基因”包括含有编码多肽的开放阅读框的核酸分子。这种天然等位基因变异通常可导致给定基因的核苷酸序列中1～5％的变异。可以通过在许多不同个体中测序目的基因，来识别替代等位基因。这可以通过使用杂交探针在多种个体中识别相同的遗传基因座而容易地进行。由天然等位基因变异引起的且不改变功能活性的任何和所有此类核苷酸变异，以及所得的氨基酸多态性或变异都在本发明的范围内。
如本文所用，“同源的”包括两个聚合分子之间的亚基序列相似性，例如，两个核酸分子(例如，两个DNA分子或两个RNA分子)之间，或两个多肽分子之间。当两个分子中的亚基位置均被相同的单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配的数量或同源位置数量的直接函数，例如，如果两个化合物序列中一半的位置(例如，聚合物长度为10个亚基的5个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的，如果90％的位置，例如，10个中的9个是匹配的或同源的，这两个序列具有90％的同源性。举例来说，DNA序列5'-ATTGCC-3'和5'-TATGGC-3'具有50％的同源性。
“诱导型”表达包括响应于细胞中存在的信号而在活细胞中产生基因产物的状态。
如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或任何其他表达介质，可用于传达本公开的化合物、组合物、载体或递送系统在根据本公开的试剂盒(例如，用于实现减轻本文所述的各种疾病或失调的试剂盒)中的有用性和/或用途。任选地或替代地，说明材料可以描述一种以上减轻哺乳动物细胞或组织中的疾病或失调的方法。本发明的试剂盒的说明材料可以例如固定在容器上，该容器含有本发明的识别化合物、组合物、载体或递送系统，或者该说明材料与含有识别化合物、组合物、载体或递送系统的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，意图是使接受者可协同地使用说明材料和化合物。
术语“核酸”包括具有多于一种核苷酸的RNA或DNA分子，核苷酸可以是任何形式，包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”包括寡核苷酸或多核苷酸中核苷酸以单链形式的核酸排序。
“核酸构建体”是指被构建为包含一种以上天然不共同存在的功能单元的核酸序列。例子包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)，包括非天然核酸序列的病毒基因组等。
如本文所用，术语“可操作地连接”包括与第二多核苷酸功能性关系的多核苷酸，例如，单链或双链核酸部分，其包含排列在核酸部分内的两个多核苷酸，使得两个多核苷酸中的至少一个能够根据另一个发挥其特征的生理效应。举例来说，可操作地连接到基因编码区的启动子能够促进编码区的转录。提及可操作连接时，详细说明的顺序并不重要。例如，短语：“启动子与核苷酸序列可操作地连接”和“核苷酸序列与启动子可操作地连接”在本文中可互换使用并被认为是等同的。在一些情况下，当编码所需蛋白质的核酸进一步包含启动子/调控序列时，该启动子/调控序列位于所需蛋白质编码序列的5'端，使得其驱动细胞中所需蛋白质的表达。
本文可互换使用的术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖基和磷酸基团(通常可在RNA或DNA中发现)，或经修饰或替换的糖基或磷酸基团。或者，多核苷酸的主链可以包含合成亚基(例如亚磷酰胺和/或硫代磷酸酯)的聚合物，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。参见Peyrottes等(1996)，Nucl.Acids Res.24：1841-1848；Chaturvedi等，(1996)Nucl.Acids Res.24：2318-2323。多核苷酸可包含一种以上L-核苷。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。当存在修饰时，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构修饰。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，例如氟代核糖和硫代酸酯，以及核苷酸分支。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。该定义中包括的其他类型的修饰是带帽，用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入将多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的装置。除非另有说明或从上下文中显而易见，每当多核苷酸或寡核苷酸由一系列字母(大写或小写)表示时，例如“ATGCCTG”，应理解，核苷酸从左到右依次为5'→3'，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有说明，否则术语和原子编号惯例将遵循Strachan和Read，Human Molecular Genetics2(威利利斯，纽约，1999)中的公开。多核苷酸可以是单、双或三链，线性或环状，并且可以是任何长度。在讨论多核苷酸时，本文可根据以5'至3'方向提供序列的惯例，描述特定多核苷酸的序列或结构。
应用于多核苷酸的术语“重组”是指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合的产物，以及导致与天然存在的多核苷酸差异和/或不同的构建体的其他步骤的产物。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制和原始病毒构建体的后代。
术语“程序性死亡1配体1(PD-L1)结合蛋白”是指多肽(例如，融合蛋白、scFV、大抗体、抗体等)，其能够特异性结合细胞表面表达的程序性死亡1配体1(PD-L1)蛋白(又名CD274或B7-H1)。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的聚合形式的氨基酸，其可包括编码的和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，和具有修饰的肽骨架的多肽。该术语包括以任何方式修饰或衍生的多肽链，包括但不限于糖基化、甲酰化、环化、乙酰化、磷酸化等。该术语包括天然存在的肽、合成肽和包含一种或多种氨基酸类似物的肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白、具有或不具有N端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记的蛋白质等。
术语“肿瘤相关抗原”是本领域熟知的术语，并且是指相对于相同细胞类型的非癌细胞在肿瘤细胞中差异过表达的分子。如本文所用，“肿瘤相关抗原”不仅包括可在细胞表面表达的完整肿瘤相关抗原，还包括被T细胞识别的包含表位的部分(片段)。肿瘤相关抗原(TAA)可以是天然存在的抗原，或者可以是天然存在的TAA的合成形式，或者可以是天然存在的TAA的变体，例如，具有增强的免疫原性的变体。TAA可以是天然存在的过表达蛋白质，或仅在肿瘤细胞或肿瘤中的其他转化细胞中表达的突变蛋白质。
如本文所用的术语“启动子”包括与待转录的核酸序列(例如编码所需分子的核酸序列)可操作地连接的DNA序列。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游，并提供RNA聚合酶和其他转录因子特异性结合的位点。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。由“多核苷酸序列”编码的“多肽”、“蛋白质”和“肽”包括全长天然序列，如天然存在的蛋白质，以及功能子序列，修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保留了天然全长蛋白质的一定程度的功能即可。在如本文所述的方法和应用中，由多核苷酸序列编码的此类多肽、蛋白质和肽可以但不必须与缺陷的内源蛋白质或者在治疗的哺乳动物中表达不足或缺乏的那些蛋白质相同。该术语还包括修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化、甲基化、羧化、脱酰胺、乙酰化或与标记组分缀合。当在将基因产物递送至哺乳动物受试者的背景下讨论时，多肽如抗血管生成多肽、神经保护多肽等及它们的组合物是指各自的完整多肽，或其任意片段或基因工程衍生物，保留完整蛋白质的所需生化功能。
“重组多肽”包括在表达重组多核苷酸时产生的多肽。
如本文所用，术语“特异性结合”(例如，关于抗体/抗原结合区)包括抗体/抗原结合区，其识别特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体(例如，scFV)也可以与来自一种或多种其他物种的该抗原结合。但是，这种交叉物种反应性本身并不会使抗体的归类改变为特异性。作为另一个例子，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会使抗体的归类改变为特异性。
在一些情况下，术语“特异性的结合”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意指该相互作用取决于化学物质上具体结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特定的蛋白质结构而非一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和该抗体的反应中，含有表位A(或游离的无标记A)的分子的存在将使与抗体结合的标记的A的量减少。
如本文所用，术语“合成抗体”包括使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为通过合成编码抗体的DNA分子或抗体的特异性氨基酸序列而产生的抗体，其DNA分子表达抗体蛋白，其中该DNA或氨基酸序列已利用本领域可获得和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
本文使用的术语“变体”包括核酸序列或肽序列，其在序列上分别不同于参比核酸序列或肽序列，但保留参比分子的基本生物学特性。核酸变体序列的改变可以不改变由参比核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可以导致氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的变化通常是受限的或保守的，因此参比肽和变体的序列总体非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参比肽的氨基酸序列可以通过一个或多个替换、添加、缺失的任意组合而不同。核酸或肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。核酸和肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。
与多肽的氨基酸序列或核苷酸序列相比，“替换”分别由不同氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸产生。如果替换是保守的，则替换成多肽的氨基酸具有与其替换的氨基酸相似的结构或化学性质(例如，电荷、极性、疏水性等)。天然存在的氨基酸的保守替换(“保守氨基酸替换”)通常导致第一氨基酸被来自与第一氨基酸相同的组的第二氨基酸替换，其中氨基酸基团的例子如下：(1)酸性(带负电荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；以及(4)中性非极性氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。在一些实施方案中，多肽变体可具有“非保守”变化，其中替换的氨基酸在结构和/或化学性质上不同。
“缺失”定义为氨基酸或核苷酸序列的如下变化：与天然存在的多肽或多核苷酸的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分别缺少一个或多个氨基酸或核苷酸残基。在多肽或多核苷酸序列的情况下，考虑到被修饰的多肽或多核苷酸序列的长度，缺失可涉及缺失2个、5个、10个、高至20个、高至30个或高至50个或更多个氨基酸或核苷酸残基。
“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列的如下变化：与天然存在的多肽或多核苷酸的氨基酸序列或核苷酸序列相比，该变化导致分别加入了一个或多个氨基酸或核苷酸残基。“插入”通常是指在多肽的氨基酸序列内添加一个或多个氨基酸残基(或多核苷酸内的核苷酸残基)，而“添加”可以是插入或指在多肽的N-或C-末端添加的氨基酸残基(或在多核苷酸的5'或3'末端添加的核苷酸残基)。在多肽或多核苷酸序列的情况下，插入或添加可以是高至10个、高至20个、高至30个、高至50个或更多个氨基酸(或核苷酸残基)。
“分离的”质粒、核酸、载体或其他物质是指，不含至少一些其他成分的物质的制剂，所述其他成分在物质或类似物质自然发生或最初制备时是存在的。因此，例如，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集来制备分离的物质。可以在绝对基础上测量富集，例如每体积溶液的重量，或者可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物质测量富集。增加本发明实施方案的富集程度越来越多地分离。在一些实施方案中，分离的质粒、核酸、载体或其他物质是纯化的，例如，纯度为约80％至约90％，纯度至少约90％，纯度至少约95％，纯度至少约98％，或纯度至少约99％或以上。
“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常情况下，“载体构建体”，“表达载体”和“基因转移载体”是指能够指导目的基因表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体，这可以通过载体的全部或部分的基因组整合，或作为染色体外元件(extrachromosomal element)的载体的瞬时或可遗传维持来实现。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。
如本文所用，术语“调节元件”包括控制核酸序列表达的某些方面的核苷酸序列。调节元件的例子示例性地包括：增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、内含子、复制起点、多腺苷酸化信号(pA)、启动子、增强子、转录终止序列和上游调节域，这有助于核酸序列的复制、转录和/或转录后加工。在一些情况下，调节元件还可以包括顺式调节DNA元件以及转座因子(TE)。本领域普通技术人员能够通过常规实验在表达构建体中选择和使用这些和其他调节元件。表达构建体可以使用遗传重组方法产生或使用熟知的方法合成产生。
“控制元件”或“控制序列”是参与有助于多核苷酸功能调节的分子相互作用的核苷酸序列，包括多核苷酸的重复(replication)、复制(duplication)、转录、剪接、翻译或降解。该调节可能影响该过程的频率、速度或特异性，并且可能本质上是增强或抑制的。本领域已知的控制元件包括，例如，转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是在一定条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(3'方向)的编码区转录的DNA区域。
“可操作地连接”或“可操作连接”是指遗传元件的并置(juxtaposition)，其中所述元件处于允许它们以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码区。只要保持这种功能关系，在启动子和编码区之间可存在间插残基。
术语“癌症(cancer)”、“瘤(neoplasm)”、“肿瘤(tumor)”和“癌(carcinoma)”本文中可互换使用，是指表现出相对自主生长的细胞，因此它们表现出异常生长表型，其特征在于显著丧失对细胞增殖的控制。癌细胞可以是良性或恶性的。各种癌症的实例包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
短语“同源肿瘤”是指由其发育的相同类型组织组成的任何肿瘤。另外，肿瘤可以与源自所述肿瘤的TIL同源。例如，黑素瘤肿瘤可以与源自黑素瘤肿瘤的TIL同源和/或源自黑素瘤肿瘤的TIL可以用于治疗作为其来源的同源黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，来源于同源肿瘤的TIL可用于治疗该同源肿瘤。
“个体”或“宿主”或“受试者”或“患者”是指需要诊断、治疗(treatment)或疗法(therapy)的任何哺乳动物受试者，特别是人。其他受试者可包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。
如本文所用，术语“分离的”，当在分离的化合物的上下文中使用时，是指在与化合物天然存在的环境不同的环境中的目的化合物。“分离的”意指包括在样品内的化合物，所述样品基本上富含目的化合物和/或其中目的化合物被部分或基本上纯化。
如本文所用，术语“基本上纯的”是指从其天然环境中移除，并且至少60％、75％或90％不含与其天然相关的其他组分的化合物。
用于测定核酸和氨基酸“序列同一性”的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。通常，“同一性”指两个多核苷酸或多肽序列分别的精确核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸对应性。可以通过确定它们的“同一性百分比”来比较两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)。无论是核酸还是氨基酸序列，两个序列的同一性百分比是两个比对序列之间精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似对比是由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics(应用数学进展)2：482-489(1981)的局部同源性算法提供的。这一算法可通过使用由Dayhoff，Atlas of ProteinSequences and Structure(蛋白序列和结构的地图)，M.O.Dayhoff编辑.，第5次增补3：353-358，National Biomedical Research Foundation，华盛顿特区，美国开发并由Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)标准化的评分矩阵而应用到氨基酸序列。
这一测定序列的同一性百分比的算法的实施示例是由Genetics Computer Group(麦迪逊，威斯康星州)在“BestFit”发明专利申请中提供的。这一方法的默认参数描述于Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual(Wisconsin序列分析程序包手册)，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group，麦迪逊，威斯康星州获得)。在本公开的背景下，建立同一性百分比的另一种方法是使用University of Edinburgh版权的JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok开发并由Intelli Genetics，Inc.(山景城，加利福尼亚州)发布的MPSRCH程序包。根据这一套程序包，Smith-Waterman算法可在默认参数被用于评分表时(例如空位开放罚分12、空位延伸罚分1和空位6)使用。根据所产生的数据，“匹配”值反映了序列同一性。用于计算序列间同一性百分比或相似性的其他的适合的程序一般是本领域已知的，例如，另一种比对程序是BLAST，以默认参数使用。例如，BLASTN和BLASTP可通过采用下列默认参数而使用：遗传密码＝标准、过滤器＝无、链＝两者、临界值＝60、预期值＝10、矩阵＝BLOSUM62、描述＝50个序列、分类依据＝高分、数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swis蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详细信息可在由http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.定位地址的因特网上找到。
可选地，在多核苷酸的情况下，可以通过在同源区域间形成稳定的双链体的条件下杂交多核苷酸，然后使用单链特异性核酸酶消化以及测定所消化片段的大小，来测定同源性。
如使用上述方法所测定的，当序列在确定长度的分子上显示出至少约80％-85％，至少约85％-90％，至少约90％-95％，或至少约95％-98％的序列同一性时，两个DNA或两个多肽序列是彼此“基本上同源”的。
如本文所用，基本上同源还指与指定的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中，在例如如针对该特定系统所确定的严格条件下识别。确定合适的杂交条件在本领域的技术范围内。参见，例如，Sambrook和Russel，分子克隆：实验室手册第三版，(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，纽约。
如果第一多核苷酸具有与第二多核苷酸的区域、其cDNA、其互补序列相同或基本相同的核苷酸序列，或者如果它显示如上所述的序列同一性，则第一多核苷酸“衍生自”第二多核苷酸。该术语并不意味着要求或暗示多核苷酸必须从所引用的来源获得(尽管包括这些)，而是可以通过任何合适的方法制造。
如果第一多肽(或肽)(i)由衍生自第二多核苷酸的第一多核苷酸编码，或(ii)显示与第二多肽如上所述的序列同一性，则该第一多肽(或肽)“衍生自”第二多肽(或肽)。该术语并不意味着要求或暗示多肽必须从所引用的来源获得(尽管包括这些)，而是可以通过任何合适的方法制备。
本文所用的术语“与......组合”是指例如如下的应用：在第二疗法的整个施用过程中施用第一疗法；其中第一疗法施用一段时间，该时间段与第二疗法的施用重叠，例如，其中第一疗法的施用在第二疗法施用之前开始，并且第一疗法的施用在第二疗法的施用结束之前结束；其中第二疗法的施用在第一疗法施用之前开始，并且第二疗法的施用在第一疗法的施用结束之前结束；其中第一疗法的施用在第二疗法开始施用之前开始，并且第二疗法的施用在第一疗法的施用结束之前结束；其中第二疗法的施用在第一疗法开始施用之前开始，并且第一疗法的施用在第二疗法的施用结束之前结束。因此，“组合”还可以指涉及施用两种以上疗法的方案。如本文所用，“与......组合”还指施用两种以上疗法，其可以以相同或不同的制剂、相同或不同的途径、相同或不同的剂型施用。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指获得期望的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言，该效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物(特别是人类)中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中，预防疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如，“治疗”包括递送可以在没有疾病病症的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如，就疫苗而言。
本文提及的任意和所有的出版物(包括专利和专利申请出版物)均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
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在阅读本公开时对于本领域技术人员显而易见的是，本文描述和示出的每个单独实施方案具有独立的组分和特征，其可以容易地与任何其他几个实施方式的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。任何引用的方法可以按照所引用事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
组合物
特异性结合PD-L1的蛋白质(例如抗体)
提供了特异性结合PD-L1的蛋白质(例如抗体)、编码蛋白质的核酸，以及包含主题蛋白质和/或编码主题蛋白质的核酸的细胞。在本公开全文中，包含如本文所述的抗原结合区的“特异性结合PD-L1的蛋白质”也称为“PD-L1结合蛋白”。
提供了两种新的重组抗体(本文称为“38A1”和“19H9”)，两者都与人类程序性死亡1配体(PD-L1)特异性结合。人PD-L1，NCBI登录号NP_054862(版本NP_054862.1GI：7661534)，是具有氨基酸序列的290aa蛋白质(其包括aa 1-18的推定信号肽(putativesignal peptide)和氨基酸19-238的胞外域)：
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET(SEQ ID NO：21)
PD-L1也称为CD274和B7-H1，并且在细胞表面(例如，肿瘤细胞表面)表达。
序列详细信息，包括CDR序列，以及与38A1和19H9抗体相关的其他信息如图7所示。因此，在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质具有抗原结合部分，所述抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 38A1的轻链CDR L1、L2和L3)，所述第二多肽包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 38A1的重链CDR H1、H2和H3)。在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质具有抗原结合部分，所述抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 38A1的轻链CDR L1、L2和L3)，所述第二多肽包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 38A1的重链CDR H1、H2和H3)，并且只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽相对于指定的SEQ ID编号可以包含一个以上的保守氨基酸替换。在一些情况下，只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽在对应于指定的SEQ ID编号的每个氨基酸段内可以包含两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。例如，这种主题蛋白质在某些情况下可以在每个CDR内包括两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。
在一些情况下，第一多肽包含SEQ ID NO：1(38A1轻链)中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：5(38A1重链)中所示的氨基酸序列(例如，见图7)。在一些情况下，第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，并且只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽对于指定的SEQ ID编号可以包含一个以上的保守氨基酸替换。在一些情况下，只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽在对应于指定的SEQ ID编号的每个氨基酸段内可以包含两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。例如，这种主题蛋白质在某些情况下可以在每个CDR内包括两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：2、3和4中描述的CDR，并且其中蛋白质特异性结合PD-L1。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO：6、7和8中描述的CDR，并且其中蛋白质特异性结合PD-L1。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。
轻链-抗体38A1
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGRKIVHWYQQRPGQAPVLVIYYDTDRPAGIPERFSGSN SGNMATLTISTVGAGDEADYYCQVWDTGSDHVVFGGGTKLTVL
(SEQ ID NO：1)
CDR1(CDR-L1)：NIGRKI(SEQ ID NO：2)
CDR2(CDR-L2)：YDT(SEQ ID NO：3)
CDR3(CDR-L3)：QVWDTGSDHVV(SEQ ID NO：4)
重链-抗体38A1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGTTYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAKDWFRSSSPDAFDIWGQGTTVTVSA
(SEQ ID NO：5)
CDR1(CDR-H1)：GFTFSNYA(SEQ ID NO：6)
CDR2(CDR-H2)：ISGSGGTT(SEQ ID NO：7)
CDR3(CDR-H3)：AKDWFRSSSPDAFDI(SEQ ID NO：8)
在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定来确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。
在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质具有抗原结合部分，所述抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 19H9的轻链CDR L1、L2和L3)，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 19H9的重链CDR H1、H2和H3)。在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质具有抗原结合部分，所述抗原结合部分包括第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 19H9的轻链CDR L1、L2和L3)，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列(分别为scFV 19H9的重链CDR H1、H2和H3)，并且只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽对于指定的SEQ ID编号可以包含一个以上的保守氨基酸替换。在一些情况下，只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽在对应于指定的SEQ ID编号的每个氨基酸段内可以包含两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。例如，这种主题蛋白质在某些情况下可以在每个CDR内包括两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：10、11和12中所述的CDR，并且其中蛋白质特异性结合PD-L1。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO：14、15和16中所述的CDR，并且其中蛋白质特异性结合PD-L1。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。
轻链-抗体19H9
NFMLTQPHSVSESLGKTVTISCTGSSGSIARKFVQWYQQRPGSSPTTVIYENNQRPSGVSDRFSG SIGSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNVVFGGGTKVTVL
(SEQ ID NO：9)
CDR1(CDR-L1)：SGSIARKF(SEQ ID NO：10)
CDR2(CDR-L2)：ENN(SEQ ID NO：11)
CDR3(CDR-L3)：QSYDSSNVV(SEQ ID NO：12)
重链-抗体19H9
QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSGINTAGDTHYPESVKG
RFTISRDNARNSLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRERVEREYSGYDAFDIWGQGTTVTVSA
(SEQ ID NO：13)
CDR1(CDR-H1)：GFTFSSYS(SEQ ID NO：14)
CDR2(CDR-H2)：INTAGDT(SEQ ID NO：15)
CDR3(CDR-H3)：VRERVEREYSGYDAFDI(SEQ ID NO：16)
在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO：9(19H9轻链)中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：13(19H9重链)中所示的氨基酸序列(例如，见图7)。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO：9(19H9轻链)中所示的氨基酸序列具有90％、95％或98％同一性的氨基酸序列，并且第二多肽包含与SEQ ID NO：13(19H9重链)中所示的氨基酸序列具有90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，并且只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽对于指定的SEQ ID编号可以包含一个以上的保守氨基酸替换。在一些情况下，只要所述蛋白质特异性结合PD-L1，第一多肽和/或第二多肽在对应于指定的SEQ ID编号的每个氨基酸段内可以包含两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。例如，这种主题蛋白质在某些情况下可以在每个CDR内包括两个以下(例如，一个或更少)的保守氨基酸替换。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的主题蛋白质是单链抗体(scFv)(如上所述)。因此，在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质是scFv，并且如上所述(例如在本部分中)，抗原结合部分的第一多肽和第二多肽彼此融合(因此是同一多肽的一部分)。合适的scFv的例子包括但不限于SEQ ID NO：17和19中所示的那些(参见图7)。在一些情况下，scFv的第一多肽和第二多肽通过接头(例如，柔性接头)彼此分开。对于本领域普通技术人员来说，各种接头是已知的，并且可以使用任何方便的接头。柔性接头可包括，例如，衍生自免疫球蛋白重链的铰链区的氨基酸序列。柔性接头可以位于例如抗体(例如scFv)的抗原结合部分(抗原结合结构域)和免疫球蛋白Fc结构域之间。本领域已知多种柔性接头，包括例如，包括一个或多个甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和/或天冬氨酸(Gly、Ser、Asn和/或Asp)氨基酸的柔性接头。在一些实施方案中，柔性接头是GGGGS。在一些实施方案中，柔性接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO：35)，其中n是1至10之间的整数。在一些实施方案中，柔性接头是GGGGS。在一些实施方案中，柔性接头是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：36)。在一些实施方案中，柔性接头是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：37)。在一些实施方案中，柔性接头是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：38)。在一些实施方案中，柔性接头是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：39)。在一些实施方案中，柔性接头包含c-末端Ala和Pro(AP)。在一些实施方案中，柔性接头是GGGSGG GGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：40)。
SEQ ID NO：17和19的scFv的柔性接头在图7中是粗体和下划线。在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质包括与SEQ ID NO：17和19(例如，参见图7)中任一个所示的氨基酸序列具有80％以上(例如，85％以上，90％以上，95％以上，98％以上，99％以上，或100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，scFv包含以下序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAKDWFRSSSPDAFDIWGQGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAPSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGRKIVHWYQQRPGQAPVLVIYYDTDRPAGIPERFSGSNSGNMATLTISTVGAGDEADYYCQVWDTGSDHVVFGGGTKLTVL
(SEQ ID NO：17).
在一些实施方案中，scFv包含以下序列：QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSGINTAGDTHYPESVKGRFTISRDNARNSLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRERVEREYSGYDAFDIWGQGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAPNFMLTQPHSVSESLGKTVTISCTGSSGSIARKFVQWYQQRPGSSPTTVIYENNQRPSGVSDRFSGSIGSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNVVFGGGTKVTVL
(SEQ ID NO：19).
在一些实施方案中，将特异性结合PD-L1的主题蛋白质(例如，scFv)直接或通过接头融合至Fc结构域(或其片段)(例如，IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、IgG4Fc或其片段)以提供大抗体。在一些情况下，Fc是IgG1Fc结构域。在某些情况下，IgG1FC结构域具有以下序列：
CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMetISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMetTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMetHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：22)
在一些实施方案中，Fc是IgG4Fc结构域。在某些情况下，IgG4Fc结构域具有以下序列：
CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMetISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMetTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMetHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：23)
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的主题蛋白质是人源化抗体。在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质是与Fc结构域(或其片段)融合的scFv(例如，如上所述)(例如IgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、IgG4Fc或其片段)。在一些情况下，特异性结合PD-L1的主题蛋白质包括与SEQ ID NO：18和20(例如，参见图7)中任一个所示的氨基酸序列具有80％以上(例如，85％以上，90％以上，95％以上，98％以上，99％以上，或100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的主题蛋白质包含：
MGSTAILALLLAVLQGVSAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAKDWFRSSSPDAFDIWGQGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAPSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGRKIVHWYQQRPGQAPVLVIYYDTDRPAGIPERFSGSNSGNMATLTISTVGAGDEADYYCQVWDTGSDHVVFGGGTKLTVLGPRANFVYKSGPRPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：18).
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的主题蛋白质包含：
MGSTAILALLLAVLQGVSAQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSGINTAGDTHYPESVKGRFTISRDNARNSLNLQMNSLRAEDTAVYYCVRERVEREYSGYDAFDIWGQGTTVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAPNFMLTQPHSVSESLGKTVTISCTGSSGSIARKFVQWYQQRPGSSPTTVIYENNQRPSGVSDRFSGSIGSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNVVFGGGTKVTVLGPRANFVYKSGPRPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：20).
可以将主题PD-L1结合蛋白(例如，scFV)与融合配偶体融合。用于主题PD-L1结合蛋白(例如，scFV)的融合配偶体的例子包括但不限于：(a)NK激活受体的配体(例如，胞外域ULBP1)，(b)任何人免疫球蛋白(例如，IgG4或IgG1)的Fc结构域及其变体(例如，单体铰链突变体，FcR结合突变体)，(c)自身二聚化蛋白(例如，亮氨酸拉链蛋白)，(d)人CD4结构域3和4(3/4)，和(e)人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。
上述融合配偶体的示例序列如下，并包括自身二聚化亮氨酸拉链蛋白，人CD4结构域3和4(3/4)，以及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)。
在一些实施方案中，自身二聚化亮氨酸拉链蛋白包含：
RSGSSRMetKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGTSSRG(SEQ ID NO：24)
在一些实施方案中，人CD4结构域3和4(3/4)包含
ASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMetGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMetRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMetLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMetWQCLLSDSGQVLLESNIKVL(SEQ ID NO：25)
在一些实施方案中，人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基末端肽(CTP)包括：
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：26)
PD-L1结合蛋白质性质和共组合物
在一些实施方案中，所述组合物和方法包括：以约100pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约90pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约80pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约70pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约60pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约50pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约40pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约30pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约20pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约10pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂、以约1pM以下的KD结合人PD-1的PD-1抑制剂。
在一些实施方案中，所述组合物和方法包括：以约7.5×105l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约7.5×105l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约8×105l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约8.5×105l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约9×105l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约9.5×105l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约1×106l/M·s以上的kassoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂。
在一些实施方案中，所述组合物和方法包括：以约2×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.1×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.2×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.3×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.4×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.5×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.6×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.7×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.8×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2.9×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约3×10-5l/s以下的kdissoc与人PD-1结合的PD-1抑制剂。
在一些实施方案中，所述组合物和方法包括：以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂、以约1nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1结合的PD-1抑制剂。
在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是PD-L1抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体是高亲和力抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体是人PD-L1抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体以5×10-8M以下的KD与人PD-1结合，PD-L1抗体以1×10-8M以下的KD与人PD-1结合，PD-L1抗体以5×10-9M以下的KD与人PD-1结合，或PD-L1抗体以1×10-8M至1×10-10M的KD与人PD-1结合。在一些实施方案中，PD-L1抗体以1×10-7M以下的KD与人PD-1结合。
编码主题蛋白质的核酸
核酸和载体
提供了编码(特异性结合PD-L1的)主题蛋白质的核酸。主题蛋白质可以由一种或多种核酸编码。例如，在抗原结合部分的第一多肽和第二多肽是不同的多肽(即，彼此不融合)的情况下，第一多肽和第二多肽可以在相同或不同的核酸上编码。在一些实施方案中，编码主题PD-L1结合蛋白(例如，抗体、scFv、大抗体等)的一种或多种核酸包括在表达载体中。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在相同载体上编码。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在不同载体上编码。在一些实施方案中，第一多肽在第一载体上编码。在一些实施方案中，第二多肽在第二载体上编码。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒(gammaretroviral)的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ IDNO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体与衍生自致癌逆转录病毒如鼠类白血病病毒的载体相比具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外的优势。
表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞(例如，引入细胞中)。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Sambrook等(2001，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约)，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种以上选择标记。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其递送至所需细胞。
本公开还提供了表达载体，其中插入了本公开的核酸构建体。在一些实施方案中，可以使用诱导型表达系统。在需要诱导型表达时，可获得许多促进这种诱导型表达的载体，包括但不限于：四环素和四环素类似物诱导型载体、他莫昔芬诱导型载体、以及本领域已知的其他诱导型转录系统载体。
核酸构建体可以与控制元件可操作地连接，所述控制元件指导核酸构建体在核苷酸序列中的体内转录或表达。此类控制元件可包含通常与所选基因相关的控制序列(例如，内源性细胞控制元件)。或者，可以使用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括衍生自编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于：SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、与目的基因异源的内源性细胞启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。另外，也可以使用衍生自非病毒基因的序列，例如鼠金属硫蛋白基因。这种启动子序列可从例如Stratagene(圣地亚哥，加利福尼亚州)商购获得。
在一些实施方案中，细胞类型特异性或组织特异性启动子可以与编码异源基因产物的核酸插入物可操作地连接，并允许选择性地或优先地在特定细胞类型或组织中产生基因产物，例如在细胞毒性淋巴细胞中表达。在一些实施方案中，诱导型启动子可以与异源核酸可操作地连接。
本文公开的载体还可以包括：以允许在用根据本发明产生的载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式，与核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)可操作地连接的常规控制元件。如本文所用，“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，以及反式或远距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。
表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，如剪接和聚腺苷酸化(poly A)信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及，当需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括选自天然，组成型，诱导型和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用的。
组成型启动子的实例包括但不限于：逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、鼠细胞病毒(MSCV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见例如，Boshart等，Cell，41：521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子，磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1启动子(Invitrogen)。诱导型启动子使得可以调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素(例如温度)、或存在的特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于Invitrogen、Clonetech和Ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的化合物调节的诱导型启动子的实例包括：锌诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国,93：3346-3351)、四环素可抑制系统(Gossen等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国,89：5547-5551)、四环素诱导系统(Gossen等，(1995)Science，268：1766-1769，也参见Harvey等，(1998)Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518)、RU486诱导系统(Wang等，(1997)Nat.Biotech.，15：239-243和Wang等，(1997)Gene Ther.，4：432-441)和雷帕霉素诱导系统(Magari等，(1997)J.Clin.Invest.，100：2865-2872)。在本文中有用的其他类型的诱导型启动子是由特定生理状态调节的启动子，例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。在一些实施方案中，利用含有鼠细胞病毒(MSCV)启动子或人延伸因子-1α(EF-1α)启动子的慢病毒载体，来表达编码如本文所述的主题PD-L1结合蛋白的核酸，例如，结合本文描述的任何实施方式。
在另一个实施方案中，将使用用于核酸插入物的天然启动子。当希望核酸插入物的表达应模拟天然表达时，天然启动子可能是优选的。当核酸插入物的表达必须在时间上或发育上，或以组织特异性方式，或以响应特定转录刺激方式被调节时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件，多腺苷酸化位点或Kozak共有序列也可用于模拟天然表达。
核酸的另一个实施方案包括可操作地连接组织特异性启动子的基因。例如，如果需要在T细胞和/或细胞毒性淋巴细胞中表达，则应使用在T细胞和/或细胞毒性淋巴细胞中有活性的启动子。
在各种实施方案中，携带一个以上核酸插入物的载体还包括选择标记或报告基因，例如其中的，编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性的序列等。选择报告基因或标记基因可用于指示细菌细胞中质粒/载体的存在，包括例如检查氨苄青霉素抗性。质粒的其他组分可包括复制起点。这些和其他启动子和载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列都是可获得的(参见例如Sambrook等，以及其中引用的参考文献)。
在一些情况下，主题核酸包括与编码主题PD-L1结合蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动子。合适的启动子包括组成型启动子(例如，CMV启动子，EF1α启动子、MSCV等)以及诱导型启动子(例如，四环素和四环素类似物诱导型启动子、他莫昔芬诱导型启动子等)和条件启动子(例如NR4A1启动子)。在一些实施方案中，载体包含转座子。
在一些实施方案中，载体是具有图10中提供的核苷酸序列的pLEV。在一些实施方案中，图11中提供了含有PD-L1结合蛋白的pLEV载体。在一些实施方案中，载体是SEQ IDNO：41(图11A)。在一些实施方案中，载体是SEQ ID NO：42(图11B)。在一些实施方案中，载体是图16A中所示的载体。在一些实施方案中，载体显示在图16B中。
在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。
在一些情况下，编码PD-L1结合蛋白的主题核酸包含在质粒中，例如用于在真核细胞中瞬时表达、用于真核细胞中表达盒(其包括编码与启动子可操作连接的PD-L1结合蛋白的核苷酸序列)的基因组整合、用于在细菌细胞中繁殖等。
细胞
本公开提供了包含特异性结合PD-L1的主题蛋白质的细胞，和/或包含编码蛋白质的核酸(例如，如上所述)的细胞。对于包含编码特异性结合PD-L1的主题蛋白的核酸的细胞，可以维持核酸游离(例如，可以是质粒)，或者可以将核酸整合到基因组中。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在相同核酸上编码。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在不同核酸上编码。在一些实施方案中，第一多肽在核酸上编码。在一些实施方案中，第二多肽在核酸上编码。在一些实施方案中，核酸是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，核酸编码PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％，95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
细胞可以是任何方便的细胞类型。例如，在一些情况下，主题细胞是原核细胞。例如，可以是用于繁殖编码主题蛋白质的核酸(例如质粒)的大肠杆菌细胞。在一些情况下，细胞是真核细胞(例如，哺乳动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、人细胞)。在某些情况下，细胞是细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞是细胞毒性淋巴细胞，并且可以称为经基因修饰以表达和分泌可溶性程序性死亡1配体(PD-L1)结合蛋白的细胞毒性淋巴细胞。在这种情况下，术语“基因修饰的”包括核酸被维持游离的情况以及核酸整合到细胞基因组中的情况。在一些情况下，细胞是细胞毒性淋巴细胞，其被基因修饰以表达和分泌可溶性程序性死亡1配体(PD-L1)结合蛋白，其中基因修饰是基因组修饰(即，编码主题蛋白的核酸被整合到细胞的基因组中)。
细胞毒性淋巴细胞(其可以被基因修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案)包括细胞毒性T(CTL)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞和天然杀伤(NK)细胞。细胞毒性淋巴细胞可包括，例如，由肿瘤相关抗原激活和/或用肿瘤特异性嵌合抗原受体或T细胞受体转导的外周血来源的αβTCR阳性或γδTCR阳性T细胞，以及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞已被修饰以表达和分泌选自38A1和19H9的主题PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞已被修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞已被修饰以表达和分泌19H9。
在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是CD4+T辅助细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是经修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白的CD8+T细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是经修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白的CD4+T辅助细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是经修饰以表达和分泌38A1的CD8+T细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是经修饰以表达和分泌19H9的CD4+T辅助细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是经修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白的CD8+T细胞。在一些实施方案中，根据本公开的细胞毒性T细胞是经修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白的CD4+T辅助细胞。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
细胞毒性淋巴细胞(其可以被基因修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案)可以表达一种以上活化抗原。例如，本发明的细胞毒性淋巴细胞可表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平增加。一种以上活化抗原可以选自，例如，CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ IDNO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞(其可以被基因修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案)包括或经基因修饰以包括对肿瘤相关抗原特异的受体，例如，待用本发明的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞治疗的受试者肿瘤的肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ IDNO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
细胞毒性淋巴细胞(其可以被基因修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案)可以从受试者的任何合适的组织或流体获得。例如，在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞可以从受试者的外周血中获得。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞(其可以被基因修饰以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案)是源自受试者肿瘤的TIL。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
可检测标记物
在一些实施方案中，如本文所述的特异性结合PD-L1的主题蛋白(即主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案)包括一个以上可检测标记物。本领域已知多种合适的可检测标记物，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能够在可检测范围内显示荧光的物质或其一部分。适合用作主题PD-L1结合蛋白的组分的可检测标记物的实例包括亲和标记物和荧光蛋白(例如，GFP、YFP、RFP、CFP等)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ IDNO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16的CDR(CDR-H3)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
术语“亲和标记物”在本文中用于表示肽片段，例如，异源肽片段，其可以结合到主题PD-L1结合蛋白中并使用结合亲和标记物并提供可检测信号的分子检测(例如，荧光化合物或蛋白质)。原则上，可获得抗体或其他特异性结合剂的任何肽或蛋白质可用作亲和标记物。适合使用的亲和标记物的实例包括但不限于单核细胞衔接蛋白(MONA)结合肽、T7结合肽、链霉亲和素结合肽、多组氨酸束(polyhistidine tract)、蛋白A(Nilsson等，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson等，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson，Gene 67：31(1988))、谷氨酸-谷氨酸(Glu-Glu)亲和标记物(Grussenmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国82：7952(1985))、物质P、FLAG肽(Hopp等，Biotechnology 6：1204(1988))或其他抗原表位或结合结构域。通常，参见Ford等，Protein Expression andPurification 2：95(1991)。编码亲和标记物的DNA分子可从商业供应商(例如，PharmaciaBiotech，皮斯卡塔韦，新泽西州)获得。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
本领域熟知的任何荧光多肽(在本文中也称为荧光标记物)适合直接或与亲和标记物结合，用作可检测标记物。合适的荧光多肽是可以在所需的宿主T细胞(hosT-cell)(例如，细菌细胞或哺乳动物细胞)中表达的荧光多肽，并且将容易地提供可以定性(阳性/阴性)和定量(例如，比较荧光度)评估的可检测信号。荧光多肽的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、GFP、mRFP、RFP(tdimer2)、HCRED等，或任何突变体(例如，荧光蛋白经过修饰以提供增强的荧光或移位的发射光谱)、其类似物或衍生物。其他合适的荧光多肽以及本文列出的那些的具体实例是本领域提供的并且是众所周知的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
基于生物素的标记物也可用于本文公开的主题PD-L1结合蛋白。分子和底物的生物素化是众所周知的，例如，已知大量生物素化剂，包括胺反应性试剂和硫醇反应性试剂，用于蛋白质、核酸、碳水化合物、羧酸的生物素化；参见，例如，第4章，分子探针目录(Molecular Probes Catalog)，Haugland，第6版，1996年，在此引入作为参考。可以通过结合可检测标记的生物素结合配偶体(例如抗生物素蛋白或链霉亲和素)来检测生物素化的底物。类似地，还已知大量的半抗原化试剂。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ IDNO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
方法
过继细胞转移
过继细胞转移(ACT)是一种非常有效的免疫治疗形式，涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到癌症患者体内。ACT是一种治疗方法，涉及体外识别具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞大量体外扩增，以及将其输注到患癌宿主中。用于过继转移的淋巴细胞可以来自切除肿瘤的基质(肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)。如果它们经基因工程改造以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，富含混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)，或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽克隆，则它们也可来源或来自血液。淋巴细胞来源于待输注的患癌宿主的ACT称为自体ACT。美国公开号2011/0052530涉及用于实施过继细胞疗法以促进癌症消退的方法，主要用于治疗患有转移性黑素瘤的患者，其通过引用整体并入这些方法。
在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以单剂量施用。这种施用可以通过注射，例如静脉内注射进行。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或大于六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次、或每隔一天一次。只要需要，可以继续施用TIL和/或细胞毒性淋巴细胞。
在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的有效剂量为约1×106、约2×106、约3×106、约4×106、约5×106、约6×106、约7×106、约8×106、约9×106、约1×107、约2×107、约3×107、约4×107、约5×107、约6×107、约7×107、约8×107、约9×107、约1×108、约2×108、约3×108、约4×108、约5×108、约6×108、约7×108、约8×108、约9×108、约1×109、约2×109、约3×109、约4×109、约5×109、约6×109、约7×109、约8×109、约9×109、约1×1010、约2×1010、约3×1010、约4×1010、约5×1010、约6×1010、约7×1010、约8×1010、约9×1010、约1×1011、约2×1011、约3×1011、约4×1011、约5×1011、约6×1011、约7×1011、约8×1011、约9×1011、约1×1012、约2×1012、约3×1012、约4×1012、约5×1012、约6×1012、约7×1012、约8×1012、约9×1012、约1×1013、约2×1013、约3×1013、约4×1013、约5×1013、约6×1013、约7×1013、约8×1013、和约9×1013。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的有效剂量为约1×106至约5×106、约5×106至约1×107、约1×107至约5×107、约5×107至约1×108、约1×108至约5×108、约5×108至约1×109、约1×109至约5×109、约5×109至约1×1010、约1×1010至约5×1010、约5×1010至约1×1011、约5×1011至约1×1012、约1×1012至约5×1012，以及约5×1012至约1×1013。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9或38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌来自pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)的19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌来自pLV4301GPDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)的38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用慢病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体或核酸上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同的载体或核酸上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体或核酸上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体或核酸上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
使细胞与主题蛋白质接触
提供了减少第一种细胞(例如，癌细胞，如肿瘤细胞)上的PD-L1与另一种细胞(例如，免疫细胞，如T细胞)上的PD-1之间的相互作用的方法。此类方法可包括使第一种细胞上的PD-L1与主题PD-L1结合蛋白(例如，抗PD-L1抗体，抗PD-L1scFV，抗PD-L1大抗体等)接触。在某些情况下，任何数量的减少都是有用的(取决于具体情况)。在一些情况下，PD-L1和PD-1之间的相互作用减少10％以上(例如，20％以上，30％以上，50％以上，60％以上，75％以上，80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，或100％)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
可以使用任何方便的测定来测量减少量，并且这种测定对于本领域普通技术人员来说是已知的。用于测量减少量的测定(例如，可以在存在与不存在主题PD-L1结合蛋白(例如抗PD-L1抗体、抗PD-L1 scFV、抗PD-L1大抗体等)的情况下进行测定)的例子可以包括但不限于：测量混合淋巴细胞反应测定中(MLR测定，例如，allo MLR测定)的细胞因子产生的抑制，测量肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和同源肿瘤之间的相互作用，测量细胞毒性(例如，细胞毒性测定，例如测量细胞毒性T细胞对表达PD-L1的细胞(如癌细胞)的活性的测定)，测量NFkB向细胞核的易位，以及测量PI3K/AKT/mTOR信号通路的信号传导活性/输出(例如，参见Wang等，Cancer Immunol Res.2014年9月；2(9)：846-56)。
接触可以在体外进行(例如，培养中的细胞)。在某些情况下，接触是体内的。例如，在一些情况下，接触包括向个体施用主题PD-L1结合蛋白。在这种情况下，该方法可以被认为是一种治疗方法(对于患有癌症的个体，对于患有实体瘤的个体，对于患有慢性感染的个体(例如，慢性病毒感染)等)。在一些情况下，接触包括向细胞(例如，表达PD-L1的细胞，表达PD-1的细胞或第三种细胞)中引入编码主题PD-L1结合蛋白的核酸，并且引入了核酸的细胞产生并分泌PD-L1结合蛋白。在将核酸引入第三种细胞的情况下，则可以利用第三种细胞通过分泌提供PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，在将核酸引入第三种细胞的情况下，则可以利用第三种细胞通过分泌向有需要的个体或受试者提供PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
通过将具有所需纯度的PD-L1结合蛋白与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以制备包含本公开的一种或多种PD-L1结合蛋白的治疗制剂，(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.Ed.(1980)))，以冻干制剂或水溶液的形式用于储存。PD-L1结合蛋白组合物可以以符合良好医学实践的方式配制、制剂和施用。在该情况下，考虑的因素包括：所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的原因、药剂的递送部位、施用方法、给药方案、以及医师所知的其他因素。待施用的PD-L1结合蛋白的“治疗有效量”可以通过这些考虑来控制，并且是治疗患者疾病(例如，癌症、慢性感染)所需的最小量。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ IDNO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
治疗剂量可以是至少0.01mg/kg体重、至少0.05mg/kg体重、至少0.1mg/kg体重、至少0.5mg/kg体重、至少1mg/kg体重、至少2mg/kg体重、至少2.5mg/kg体重、至少5mg/kg体重、至少7.5mg/kg体重、至少10mg/kg体重、至少15mg/kg体重、至少20mg/kg体重、至少25mg/kg体重、至少30mg/kg体重、至少35mg/kg体重、至少40mg/kg体重、至少45mg/kg体重、至少50mg/kg体重、至少55mg/kg体重、至少60mg/kg体重、至少65mg/kg体重、至少70mg/kg体重、至少75mg/kg体重、至少80mg/kg体重、至少85mg/kg体重、至少90mg/kg体重、至少95mg/kg体重、至少100mg/kg体重、至少110mg/kg体重、至少120mg/kg体重、至少130mg/kg体重、至少140mg/kg体重、至少150mg/kg体重、至少160mg/kg体重、至少170mg/kg体重、至少180mg/kg体重、至少190mg/kg体重、至少200mg/kg体重、至少210mg/kg体重、至少220mg/kg体重、至少230mg/kg体重、至少240mg/kg体重、至少250mg/kg体重、至少260mg/kg体重、至少270mg/kg体重、至少280mg/kg体重、至少290mg/kg体重、至少300mg/kg体重、至少310mg/kg体重、至少320mg/kg体重、至少330mg/kg体重、至少340mg/kg体重、至少350mg/kg体重、至少360mg/kg体重、至少370mg/kg体重、至少380mg/kg体重、至少390mg/kg体重、至少400mg/kg体重、至少410mg/kg体重、至少420mg/kg体重、至少430mg/kg体重、至少440mg/kg体重、至少450mg/kg体重、至少460mg/kg体重、至少470mg/kg体重、至少480mg/kg体重、至少490mg/kg体重以及至少500mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量不超过500mg/kg体重。本领域技术人员将理解，例如在应用抗体片段或应用抗体缀合物时，这些指导方针将根据活性剂的分子量进行调整。剂量也可以变化以进行局部施用，例如，鼻内、吸入等，或进行全身施用，例如，肌肉注射、腹腔注射、静脉注射等。在一些实施方案中，施用的抗体是19H9或38A1或其组合。在一些实施方案中，施用的抗体是19H9。在一些实施方案中，施用PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，施用的抗体是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ IDNO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ IDNO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
PD-L1结合蛋白不必需地，而是可选地与一种以上增强活性或者增加治疗效果的试剂一起配制。它们通常以与上文所用相同的剂量和施用途径使用，或者以上文使用的剂量的约1～99％使用。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标物记检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ IDNO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中所述轻链包含SEQ IDNO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ IDNO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸、如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子如钠；金属配合物(例如，锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的制剂可以是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地完成。
PD-L1结合蛋白(例如，抗PD-L1抗体、抗PD-L1大抗体、抗PD-L1 scFV等)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，PD-L1结合蛋白(例如，抗PD-L1抗体、抗PD-L1大抗体、抗PD-LI scFV等)适合通过脉冲输注施用，特别是剂量递减的结合蛋白。在一些情况下，全身施用(例如，静脉注射)主题PD-L1结合蛋白。在一些情况下，局部施用(例如，肿瘤内，例如通过注射)主题PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ IDNO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
为了预防或治疗疾病，PD-L1结合蛋白的合适剂量可取决于待治疗的如上定义的疾病类型、疾病的严重程度和病程、施用PD-L1结合蛋白是否是预防目的、既往治疗、患者的病史以及对PD-L1结合蛋白的反应，以及主治医师的判断。PD-L1结合蛋白可以一次性地或在一系列治疗中施用于患者。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
用经基因修饰以表达和分泌可溶性程序性死亡1配体(PD-L1)结合蛋白的细胞毒性淋巴细胞进行过继细胞转移的方法
表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白的细胞毒性淋巴细胞，例如，结合本文描述的任何实施方案，可用于过继细胞转移的方法，例如，在治疗癌症或慢性感染的情况下。
在一些实施方案中，根据本公开的合适方法包括，例如，从受试者(例如受试者的肿瘤或外周血)中分离如本文所述的细胞毒性淋巴细胞(例如，结合本文描述的任何实施方案)。
在一些实施方案中，根据本发明的合适方法包括，例如，通过将编码如本文所述的主题PD-L1结合蛋白(例如，结合本文描述的任何实施方案)的核酸引入细胞毒性淋巴细胞中，来基因修饰细胞毒性淋巴细胞，其中该基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文描述的任何实施方案。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，根据本公开的合适方法包括，例如，扩增基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，以提供基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9或38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌来自pLV4301G PDLV scFV19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)的19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌来自pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)的38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用慢病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体或核酸上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体或核酸上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体或核酸上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体或核酸上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，根据本公开的合适方法包括，例如，向受试者施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群，以治疗受试者的疾病或失调，例如，癌症或慢性感染。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9或38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌来自pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)的19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌来自pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)的38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用慢病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体或核酸上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体或核酸上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体或核酸上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体或核酸上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ IDNO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞
本领域已知许多从受试者(例如人受试者)中分离细胞毒性淋巴细胞的合适方法，并且可以使用任何方便的方法。例如，可以从新鲜的患者活检标本中分离如本文所述的肿瘤浸润淋巴细胞，例如，结合本文所述的任何实施方案。或者，细胞毒性淋巴细胞可以从受试者的外周血中获得。虽然本文所述的方法主要描述于用于ACT的自体细胞毒性淋巴细胞的背景下。应当注意，在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞可以从待治疗的受试者以外的来源获得或产生，如下面进一步详细讨论的。
基因修饰细胞毒性淋巴细胞
对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，以表达和分泌如本文所述的主题PD-L1结合蛋白，例如，结合本文所述的任何实施方案，可包括将编码主题PD-L1结合蛋白的核酸引入细胞毒性淋巴细胞中。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含第一多肽和第二多肽。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在相同载体上编码。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在不同载体上编码。在一些实施方案中，第一多肽在第一载体上编码。实现此目的的许多方法是本领域已知的，并且可以使用任何方便的方法(例如，使用任何方便的载体或载体组合，例如逆转录病毒载体，如慢病毒载体、腺病毒载体或其他载体，例如，与合适的包装和包膜质粒一起)。可以特异性地选择慢病毒载体的调节元件，例如启动子，用于在细胞毒性淋巴细胞中稳定表达。参见，例如，Jones等，Hum Gene Ther.2009年6月；20(6)：630–640描述了含有鼠细胞病毒(MSCV)启动子的慢病毒载体用于最低限度刺激和高度活化的淋巴细胞。在一些实施方案中，由载体编码的PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，由载体编码的PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，由载体编码的PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，由载体编码的PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，主题PD-L1结合蛋白基因可以是引入细胞毒性淋巴细胞中的较大基因表达盒的一部分，其允许主题PD-L1结合蛋白的诱导型表达，例如，使用激活驱动主题PD-L1基因的启动子元件的细胞膜渗透药物。撤回药物将关闭基因表达，从而使得可以调节主题PD-L1结合蛋白表达的开/关。可获得许多促进该诱导型表达的载体，包括但不限于四环素和四环素类似物诱导型载体、他莫昔芬诱导型载体，以及本领域已知的其他诱导型转录系统载体。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ IDNO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
图8中提供了编码诱导型启动子的表达载体(例如，慢病毒载体)的实例的示意图。基本设计包括两个启动子。一个启动子是组成型活性的并且驱动构象转录因子(CTF)的转录，构象转录因子(CTF)在与可溶性分子(SM)结合时改变构象。第二个启动子结合CTF并驱动目的基因。有两种可能性。在两种情况下，CTF与其启动子的结合介导转录。在第一种情况下，添加SM会从诱导型启动子释放CTF，从而阻止转录。在第二种情况下，添加SM诱导CTF与诱导型启动子结合和转录的起始。
图9中提供了表达载体(例如，慢病毒载体)的另一个实例的示意图，其示意性地描绘了编码构象阻遏蛋白的抑制表达载体。基本设计包括两个启动子。两个启动子都具有组成型活性。一个驱动构象阻遏蛋白(CRP)的转录，构象阻遏蛋白(CRP)在与可溶性分子(SM)结合时改变构象。CRP结合CRP结合位点(CRP-BS)并抑制驱动目的基因转录的第二组成型启动子的转录。可溶性分子的添加从CRP-BS“释放”目的基因的转录中释放CRP。
图16提供了用于本方法的示例性病毒载体的其他示意图，包括pLV4301G PDLVscFV 38A1和pLV4301G PDLV scFV 19H9。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLVscFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLVscFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。
如上所述与可诱导表达载体一起使用的可溶性分子可以是本领域已知的任何合适的分子，用于与这种诱导型表达载体一起使用，例如四环素(或其类似物)或他莫昔芬。这些可溶性分子可以根据本文所述的一种或多种方法施用于受试者，例如，在施用如本文所述的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞之前、同时或之后，例如，结合本文所述的任何实施方案，施用于受试者。或者/另外，可以使用表达载体，该表达载体包括响应在受试者中所需作用位点处存在的条件和/或分子(例如肿瘤微环境)的元件。例如，包括缺氧反应元件的表达载体可用于选择性诱导在实体瘤缺氧微环境中的表达。参见，例如，王等，Cancer GeneTher.2005年3月；12(3)：276-83。
可以适当地使用其他转染方法，其可以包括病毒和非病毒方法，以将编码主题PD-L1结合蛋白的核酸引入细胞毒性淋巴细胞中。可用于促进递送至细胞毒性淋巴细胞中的方法可包括，例如，电穿孔、粒子轰击(基因枪)、声孔、磁转染、流体递送、纳米粒子递送、脂质转染等。在一些实施方案中，编码的PD-L1结合蛋白是38A1或19H9。在一些实施方案中，编码的PD-L1结合蛋白是38A1。在一些实施方案中，编码的PD-L1结合蛋白是19H9。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是抗体或其片段，其中，轻链由第一载体编码，重链由第二载体编码。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，由一种或多种载体编码的PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
病毒制备
在一些实施方案中，使用本领域熟知的任何方法产生用于转染的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301GPDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301GPDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，使用如下方法制备病毒载体用于转染，包含：在含有5ml细胞培养基的10mm组织培养板中铺板5×106个phoenix细胞。在一些实施方案中，使用进一步包含如下的方法制备病毒用于转染：使用脂质体，用10μg含有抗PD-1 scFV的pLEV(慢病毒载体)和6μg pVSV-G转染细胞。在一些实施方案中，使用进一步包含如下的方法制备病毒用于转染：60分钟后收集上清液并用70μM过滤器过滤至15ml管中。在一些实施方案中，使用包括以下步骤的方法产生病毒用于转染：1)在含有5ml细胞培养基的10mm组织培养板中铺板5×106个phoenix细胞；2)使用脂质体，用10μg含有抗PD-1 scFV的pLEV(慢病毒载体)和6μgpVSV-G转染细胞；3)60小时后，收集上清液并用70μM过滤器过滤至15ml管中。
T细胞转导
在一些实施方案中，用病毒载体转导(即，用病毒载体基因修饰)T细胞(包括例如细胞毒性淋巴细胞)。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码PD-L1结合蛋白的基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，对T细胞、TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对T细胞、TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对T细胞、TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，使用如下方法转导T细胞，包含：在12孔板的2ml TIL培养基中，用浓度为300ng/ml的抗CD3激活1x106TIL。在一些实施方案中，转导方法还包括在48小时后将TIL分成两个孔，并将1ml上清液(来自病毒制备中的步骤3)与浓度为8μg/ml的聚凝胺一起加入每个孔中。在一些实施方案中，转导方法还包括在32℃下以800xg离心细胞30分钟。在一些实施方案中，转导方法还包括除去含有病毒的培养基并用2ml新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，并孵育细胞24小时。在一些实施方案中，转导方法还包括：使用下文提供的扩增基因修饰的细胞毒性淋巴细胞以及本领域已知的用于扩增TIL的任何其他方法来繁殖细胞，所述其他方法可用于扩增TIL群内的细胞毒性淋巴细胞。
肿瘤样品
在一些实施方案中，该方法包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品，其中肿瘤样品包含含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。肿瘤组织样品可以从许多来源获得，包括但不限于肿瘤活组织检查或尸检。肿瘤组织样品可以从任何癌症获得，包括但不限于本文描述的任意癌症。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。肿瘤组织样品可以从任何哺乳动物获得。在一些实施方案中，肿瘤组织样品由人获得。在一些实施方案中，肿瘤组织样品可以是肿瘤组织片段。肿瘤组织样品可以是片段化的，例如，通过解剖，提供肿瘤组织片段。在一些实施方案中，可选地或另外地，肿瘤组织样品可以可选地酶促或机械消化。用于使肿瘤组织样品片段化的合适的酶包括但不限于胶原酶。在一些实施方案中，肿瘤组织样品在不消化的情况下片段化。肿瘤组织片段可以是任何合适的尺寸。优选地，肿瘤组织片段的尺寸为约1mm3以下至约8mm3以上，约1mm3至约4mm3，约1mm3至约2mm3，或约1mm3。
通过公开的组合物和方法治疗的癌症在某些方面可以是可以产生TIL的任何实体瘤。癌症也可以是转移性和/或复发性的。癌症可以是任何癌症，包括任何急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、消化道癌、胃癌、胃肠道类癌、胶质瘤、肝胆癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌症、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和膀胱癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性黑素瘤。
如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物，例如兔。优选地，哺乳动物来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选地，哺乳动物来自偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，或奇蹄目(Perssodactyla)，包括马科动物(马)。最优选哺乳动物是灵长目(Primates)、Ceboids或Simoids(猴子)，或类人目(Anthropoids)(人和猿)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的一般扩增方法
含有细胞毒性淋巴细胞的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的制备通常是两步法：1)REP(快速扩增)前(pre-REP)阶段，在标准实验室培养基(如RPMI)中培养细胞，并用试剂如辐照的饲养细胞和抗CD3抗体处理TIL，以达到预期效果；2)REP阶段，以足够大的培养量扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL，以治疗患者。REP阶段需要cGMP(动态药品生产管理规范)级试剂和30～40L培养基。然而，REP前阶段可以使用实验室级试剂(假定实验室级试剂在REP阶段被稀释)，这使得更容易采用替代策略来改善TIL制备。因此，在一些实施方案中，所公开的TLR激动剂和/或肽或肽模拟物可以在REP前阶段期间被包含在培养基中。在一些实施方案中，REP前阶段的培养物可包括IL-2。
在一些实施方案中，ACT可以通过以下进行：(i)从哺乳动物获得含有细胞毒性淋巴细胞的自体TIL，(ii)培养(包括例如REP)含有细胞毒性淋巴细胞的自体TIL，以产生扩增的淋巴细胞，和(iii)将扩增的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL施用于哺乳动物。在一些实施方案中，含有细胞毒性淋巴细胞的TIL是肿瘤来源的，即，是含有细胞毒性的TIL，并且是从待治疗的哺乳动物中分离出来的，即自体转移。在一些实施方案中，含有细胞毒性淋巴细胞的自体TIL是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，对自体细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，自体淋巴细胞是用病毒载体进行基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，自体淋巴细胞在培养之前或之后但在施用于哺乳动物之前进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中，与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，如本文所述的自体ACT还可以通过以下进行：(i)培养含有细胞毒性淋巴细胞的自体TIL，以产生扩增的淋巴细胞；(ii)可选地，对哺乳动物进行非清髓性淋巴清除化疗；(iii)在可选地进行非清髓性淋巴清除化疗后，将扩增的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL施用于哺乳动物。自体TIL可以从切除的肿瘤的基质中获得。为此，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬浮液。单细胞悬浮液可以以任何合适的方式获得，例如，机械地(使用例如全自动组织单细胞分离器(gentleMACS.TM.Dissociator,Miltenyi Biotec,奥本,加利福利亚)解聚肿瘤)或酶促地(例如，胶原酶或DNA酶)。在一些实施方案中，对自体细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，自体淋巴细胞是用病毒载体进行基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，自体淋巴细胞在培养之前或之后但在施用于哺乳动物之前进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ IDNO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
淋巴细胞(包括肿瘤浸润淋巴细胞，例如T细胞)的扩增可以通过本领域已知的许多方法中的任何一种来完成，包括下文所述的那些方法。例如，在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21或其组合的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可以例如包括约30ng/ml的OKT3，即一种小鼠单克隆抗CD3抗体(购自Ortho-McNeilRTM,Raritan,新泽西州或Miltenyi Biotec,贝尔吉施格拉德巴赫，德国)。或者，在T细胞生长因子(例如约200-400μl/ml，例如300IU/ml IL-2或IL-15，优选IL-2)的存在下，通过用一种以上抗原(包括其抗原部分，例如表位或癌细胞，其可选地从载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如，约0.3μM MART-1：26-35(27L)或gp100：209-217(210M))体外刺激外周血单核细胞(PBMC)，可以快速扩增T细胞。体外诱导的T细胞通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的癌症的相同抗原再刺激而快速扩增。或者，可以用例如经辐射的自体淋巴细胞或用经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2，再刺激T细胞。参见，例如，国际专利公开WO 2015/143328，出于全部目的通过引用并入本文。
扩增的TIL的特异性肿瘤反应性可以通过本领域已知的任何方法测试，例如，通过在与肿瘤细胞共培养后，测量细胞因子释放(例如，干扰素-γ)。在一个实施方案中，自体ACT方法包括在细胞快速扩增之前富集培养的TIL用于CD8+T细胞。在IL-2中培养TIL后，T细胞耗尽CD4+细胞并使用例如CD8微珠分离(例如，使用CliniMACS+CD8微珠系统(MiltenyiBiotec))富集CD8+细胞。在一些实施方案中，促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子与自体T细胞同时或随后施用于哺乳动物。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的实例包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21，它们可以单独使用或以各种组合使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。在一些实施方案中，可以采用4-IBB共刺激增强来增加过继细胞疗法的活性TIL扩增。
扩增基因修饰的细胞毒性淋巴细胞
扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL和/或扩增(即REP)基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，以提供基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群，包括：离体培养含有细胞毒性淋巴细胞的TIL，以提供含有细胞毒性淋巴细胞的TIL群，例如，用于重新引入受试者(包括例如哺乳动物)。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞在合适的培养基中培养，所述培养基含有来自受试者或来自同种异体供体的用白细胞分离法分离的经辐照的外周血单核细胞(PBMC)(饲养细胞)，以及合适的试剂，例如白细胞介素2(IL-2)，例如人IL-2和OKT3(抗CD3抗体)。作为使用PBMC的替代方案，人工抗原呈递细胞可用于细胞毒性淋巴细胞的扩增，例如，K562细胞经过基因修饰以表达人Fc受体CD32和CD64，使K562细胞能够结合并呈递αCD3和αCD28单克隆抗体。这种人工抗原呈递细胞，包括表达多种共刺激分子的人工抗原呈递细胞，描述于例如Turtle和Riddell，Cancer J.2010年7月至8月；16(4)：374-381。
作为扩增步骤的一部分或作为另外的步骤，可以进行一个或多个选择步骤，例如，通过一种或多种免疫学实验以富集关注的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞(例如，表达一种以上肿瘤相关抗原的受体的细胞毒性淋巴细胞)。
除了TIL之外，细胞毒性淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞和天然杀伤(NK)细胞也可以从肿瘤组织样品中获得，如用于本文所述的TIL一样地培养和扩增。因此，该方法还可包括对哺乳动物施用巨噬细胞、单核细胞和天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述方法可用于扩增细胞毒性淋巴细胞，例如，包括REP扩增步骤。
在获得包含含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的肿瘤样品后，扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，增殖含有细胞毒性淋巴细胞的TIL和/或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的方法包括：(i)培养(即，REP前)含有细胞毒性淋巴细胞的TIL，包括使用IL-2；(ii)使用OKT3抗体、IL-2和饲养淋巴细胞扩增(即REP)培养的细胞毒性淋巴细胞，其中，在细胞毒性淋巴细胞扩增之前，富集培养的细胞毒性淋巴细胞的CD8+T细胞；(iii)可选地给予哺乳动物非清髓性淋巴清除化疗；(iv)在可选地给予非清髓性淋巴清除化疗后，向哺乳动物施用扩增的细胞毒性淋巴细胞，其中，施用于哺乳动物的细胞毒性淋巴细胞为约19至约35天的并且未进行特异性肿瘤反应性筛选，由此促进了哺乳动物中癌症的消退。在一些实施方案中，施用的细胞毒性淋巴细胞小于约35天，例如，大约19～26天。参见，例如美国专利No.8,383,099中描述的那些方法，以及本文提供的方法。
在一些实施方案中，在从哺乳动物获得肿瘤组织样品后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在培养含有细胞毒性淋巴细胞的TIL之前或之后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在使用OKT3抗体、IL-2和饲养淋巴细胞扩增培养的细胞毒性淋巴细胞之前或之后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中，在TIL和/或细胞毒性淋巴细胞扩增之前，富集培养的细胞毒性淋巴细胞的CD8+T细胞。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞在施用于哺乳动物之前进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，使用病毒载体对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在相同载体上编码。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽在不同载体上编码。在一些实施方案中，第一多肽在第一载体上编码。在一些实施方案中，第二多肽在第二载体上编码。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，据认为，与约44天以上的细胞毒性淋巴细胞相比，约19至约35天的细胞毒性淋巴细胞提供改善的体内增殖、存活和抗肿瘤活性。此外，在包括非清髓性淋巴清除化疗的实施方案中，本发明方法可有利地用于治疗不符合涉及全身照射(TBI)的治疗的患者，例如，治疗前已经经历清髓疗法(例如，放疗)的患者；有合并症的患者；以及低于2x106CD34+细胞/kg的患者。
在一些实施方案中，产生用于过继细胞疗法(ACT)的细胞毒性淋巴细胞所需的时间可以从平均约44天缩短至约19天至约35天(或小于约35天，例如，约19至约29天，或约19至约26天)。因此，可以在疾病负担进展到ACT的施用可能不再安全或不再可能的阶段之前治疗更多患者。在一些实施方案中，方法不需要在施用前体外测试特异性抗原反应性，本发明方法减少了与患者治疗相关的时间、费用和工作。另外，本发明的方法可以使用从大量培养中汇集的细胞毒性淋巴细胞，而不是来自微量培养的细胞毒性淋巴细胞。
该方法的一个实施方案包括培养自体细胞毒性淋巴细胞。从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬浮液。单细胞悬浮液可以以任何合适的方式获得，例如，机械地(使用例如全自动组织单细胞分离器(gentleMACS.TM.Dissociator,Miltenyi Biotec,奥本,加利福尼亚州)解聚肿瘤)或酶促地(例如，胶原酶或DNA酶)。肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液在白细胞介素-2(IL-2)中(例如，在多孔中)培养。培养细胞直至聚集(例如，约2×106个淋巴细胞)，例如，约5至约21天，优选约10至约14天。例如，细胞可以培养5天、5.5天、或5.8天至21天、21.5天或21.8天、优选10天、10.5天，或10.8天至14天、14.5天或14.8天。
在一些实施方案中，该方法包括扩增培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。合并培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL并快速扩增。快速扩增使抗原特异性T细胞的数量在约10天至约14天的期间(在一些实施方案中，约14天)内增加至少约50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多)。在一些实施方案中，快速扩增在约10天至约14天的期间(在一些实施方案中，约14天)内提供至少约200倍(例如，200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍)的增加。在一些实施方案中，快速扩增在约10天至约14天的期间(在一些实施方案中，约14天)内提供至少约1000倍的增加。在一些实施方案中，快速扩增在约14天内提供约1000倍的增加。在一些实施方案中，对培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，使用病毒载体对培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
扩增可以通过本领域已知的许多方法中的任何一种来完成。例如，可以在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在下(优选IL-2)，使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增细胞毒性淋巴细胞。非特异性T细胞受体刺激可以例如包括约30ng/ml的OKT3，即一种小鼠单克隆抗CD3抗体(购自Ortho-McNeilRTM,Raritan,新泽西州)。或者，在T细胞生长因子的存在下，例如300IU/ml IL-2或IL-15，通过用一种以上癌症抗原(包括其抗原部分，例如表位，或细胞)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)，可以快速扩增细胞毒性淋巴细胞，所述癌症抗原可选地从载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如，0.3μM MART-1：26-35(27L)或gp100：209-217(210M)。在一些实施方案中，T细胞生长因子优选是IL-2。体外诱导的细胞毒性淋巴细胞通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的癌症的相同抗原再刺激而快速扩增。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞可以用经辐照的自体淋巴细胞或经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。
在一些实施方案中，促进TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的生长和活化的T细胞生长因子与TIL同时或随后施用于哺乳动物。T细胞生长因子可以是促进TIL生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的实例包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独使用或以各种组合使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。优选T细胞生长因子是IL-2。
在一些实施方案中，进一步修饰TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以表达促进TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括，例如，上述任何一种。合适的修饰方法是本领域已知的。参见，例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版，Cold Spring Harbor Press，冷泉港，纽约，2001；以及Ausubel等，目前的分子生物学协议(Current Protocols inMolecular Biology)，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，纽约，1994。在一些实施方案中，修饰的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，例如IL-12的编码序列，在本领域中是容易获得的，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达。在一些实施方案中，可以修饰TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以表达IL-12，如世界知识产权组织专利申请公开号WO2010/126766中所述，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，两种细胞因子可以比单一细胞因子更有效。并且在一些实施方案中，三种细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)可以比任何两种细胞因子更有效。据认为，IL-15增强肿瘤特异性CD8+T细胞应答。在这方面，IL-15培养的细胞与IL-2的施用(例如快速浓注)可以是特别有效的。在一些实施方案中，经修饰以表达IL-15的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以与IL-2一起施用作为快速浓注。
T细胞生长因子可以通过任何合适的途径施用。在施用超过一种T细胞生长因子的实施方案中，它们可以以任何顺序并通过相同的途径或不同的途径，同时或顺序地施用。在一些实施方案中，静脉快速浓注施用T细胞生长因子(例如IL-2)。在一些实施方案中，T细胞生长因子(例如IL-2)的剂量是本领域普通技术人员认为高的剂量。在一些实施方案中，每天三次施用约720,000IU/kg剂量的IL-2直至耐受，特别是当癌症是黑素瘤时。在一些实施方案中，施用约5～15个剂量的IL-2，平均约8个剂量。
TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以识别由每个肿瘤细胞基因组编码的预计10,000个基因突变产生的任何独特的抗原。然而，抗原不必是独特的。TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以识别癌症的一种或多种抗原，包括一种或多种抗原的抗原部分，例如表位，或癌症细胞。“癌症抗原”和“该癌症抗原”旨在包括所有上述抗原。如果癌症是黑素瘤，例如转移性黑素瘤，则TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以识别MART-1(例如MART-1：26-35(27L))、gp100(例如gp100：209-217(210M))，或源自肿瘤编码突变的“独特的”或患者特异性抗原。可被TIL识别的其他合适的黑素瘤抗原可包括但不限于酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)1、TRP2和MAGE。TIL还可以识别抗原，例如NY-ESO-1、端粒酶、p53、HER2/neu、癌胚抗原或前列腺特异性抗原，用于治疗肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和类似癌。
在一些实施方案中，该方法包括：可选地对哺乳动物施用非清髓性淋巴清除化疗。非清髓性淋巴清除化疗可以是任何合适的此类疗法，其可以通过任何合适的途径施用。非清髓性淋巴清除化疗可以包括例如施用环磷酰胺和氟达拉滨，特别是如果癌症是黑素瘤，其可以是转移性的。在一些实施方案中，环磷酰胺和氟达拉滨的施用途径是静脉内。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。在一些实施方案中，施用约60mg/kg环磷酰胺两天，之后施用约25mg/m2氟达拉滨五天。在一些实施方案中，施用约60mg/kg环磷酰胺两天，之后施用约25mg/m2氟达拉滨五天，并且癌/肿瘤是黑素瘤。
在一些实施方案中，该方法包括，在可选地施用非清髓性淋巴清除化疗后，向哺乳动物施用扩增的细胞毒性淋巴细胞，其中，施用于哺乳动物的细胞毒性淋巴细胞为约19至约35天。例如，施用的细胞毒性淋巴细胞可以是19天、19.5天或19.8天至35天、35.5天或35.8天。在一些实施方案中，施用于哺乳动物的细胞毒性淋巴细胞为约19天至约29天，或约23天至约29天，或约26天。例如，施用的细胞毒性淋巴细胞可以是19天、19.5天或19.8天至29天、29.5天或29.8天；23天、23.5天或23.8天至29天、29.5天或29.8天；或26天、26.5天或26.8天。在一些实施方案中，施用于哺乳动物的细胞毒性淋巴细胞是“年轻”的细胞毒性淋巴细胞，即在19天至约29天之间，或约23天至约29天之间，或约26天最低限度培养的细胞毒性淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞。
根据本发明的一个实施方案向哺乳动物施用的年轻的细胞毒性淋巴细胞培养物有利地具有与体内持久性、增殖和抗肿瘤活性相关的特征。例如，年轻的细胞毒性淋巴细胞培养物比约44天的细胞毒性淋巴细胞具有更高的CD27和/或CD28表达。不受特定理论的束缚，据认为，CD27和CD28与细胞毒性淋巴细胞的增殖、体内持久性和低分化程度有关(虽然不受理论束缚，认为细胞毒性淋巴细胞的分化增加会对细胞毒性淋巴细胞在体内发挥功能的能力产生负面影响)。据认为，表达更高水平的CD27的细胞毒性淋巴细胞比CD27表达水平低的细胞具有更好的抗肿瘤活性。此外，年轻的细胞毒性淋巴细胞培养物(例如，19天至约29天，或约23天至约29天，或约26天)具有比约44天的细胞毒性淋巴细胞更高的CD4+细胞频率。
此外，年轻的细胞毒性淋巴细胞培养物的平均端粒长度大于约44天的细胞毒性淋巴细胞。不受特定理论束缚，据认为，在培养物中细胞毒性淋巴细胞的端粒长度每周估计减少0.8kb，并且年轻的细胞毒性淋巴细胞培养物的端粒比约44天的细胞毒性淋巴细胞长约1.4kb。不受特定理论的束缚，据认为，较长的端粒长度与受试者中的阳性客观临床反应和体内细胞的持久性相关。
在一些实施方案中，在施用于患者之前，未测试细胞毒性淋巴细胞的特异性肿瘤反应性以鉴定肿瘤反应性细胞毒性淋巴细胞。可以通过本领域已知的任何方法测试特异性肿瘤反应性，例如，通过在与肿瘤细胞共培养后，测量细胞因子释放(例如，干扰素-γ)。本发明的方法有利地通过向哺乳动物施用细胞毒性淋巴细胞来促进哺乳动物中癌症的消退，而无需事先筛选特异性肿瘤识别。如果需要，所述方法的实施方案可包括：在将细胞毒性淋巴细胞施用于哺乳动物之前，以非抗原特异性方式测试细胞毒性淋巴细胞的效力。在一些实施方案中，可以可选地测试细胞毒性淋巴细胞效力，例如通过测量OKT3刺激后细胞因子释放的非特异性效力测定。例如，如果干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则T细胞可被认为是强力的。该方法的较次的实施方案包括：测试扩增的细胞毒性淋巴细胞的特异性肿瘤反应性，以鉴定肿瘤反应性细胞毒性淋巴细胞。
在一些实施方案中，本发明提供促进哺乳动物中癌症消退的方法，包括：(i)培养(即，REP前)自体细胞毒性淋巴细胞和/或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞(在一些实施方案中，自体基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)，包括使用IL-2；(ii)使用OKT3抗体、IL-2和饲养淋巴细胞扩增培养的细胞毒性淋巴细胞，其中，在细胞毒性淋巴细胞扩增之前，富集培养的细胞毒性淋巴细胞的CD8+T细胞；(iii)可选地给予哺乳动物非清髓性淋巴清除化疗；(iv)在可选地给予非清髓性淋巴清除化疗后，向哺乳动物施用扩增的细胞毒性淋巴细胞，其中，施用于哺乳动物的细胞毒性淋巴细胞为约19天至约29天，或约23天至约29天，或约26天，由此促进了哺乳动物中癌症的消退。例如，施用于哺乳动物的细胞毒性淋巴细胞可以是19天至约29天或约23天至约29天。在一些实施方案中，约19天至约29天，或约23天至约29天，或约26天。在一些实施方案中，对培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，使用病毒载体对培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，在培养之前或之后对培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL进行基因修饰。在一些实施方案中，在使用OKT3抗体、IL-2和饲养淋巴细胞扩增培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL之前或之后，对培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL进行基因修饰，其中，在细胞毒性淋巴细胞扩增之前，富集培养的细胞毒性淋巴细胞的CD8+T细胞。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ IDNO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，该方法包括：培养(例如，REP前)如本文所述的自体T细胞约19天至约29天，或约23天至约29天，或约26天。该方法还包括：扩增(例如，REP)培养的细胞毒性淋巴细胞并可选地给予哺乳动物如本文所述的非清髓性淋巴清除化疗。在任选地给予非清髓性淋巴清除化疗后，该方法包括向哺乳动物施用如本文所述的扩增的细胞毒性淋巴细胞，由此促进哺乳动物中癌症的消退。在该方法的一些实施方案中，未筛选施用的细胞毒性淋巴细胞的特异性肿瘤反应性。在一些实施方案中，施用于哺乳动物的扩增的细胞毒性淋巴细胞为约19天至约29天，或约23天至约29天，或约26天。例如，施用的细胞毒性淋巴细胞可以是19天、19.5天或19.8天至29天、29.5天或29.8天；23天、23.5天或23.8天至29天、29.5天或29.8天；或26天、26.5天或26.8天。
在一些实施方案中，该方法包括在细胞快速扩增之前，富集培养的含有细胞毒性淋巴细胞的T细胞中的CD8+T细胞。在IL-2中培养含有细胞毒性淋巴细胞的TIL后，含有细胞毒性淋巴细胞的TIL耗尽CD4+细胞，并使用例如CD8微珠分离(例如，使用+CD8微珠系统(可从Miltenyi Biotec购得))富集CD8+细胞。在一些实施方案中，CD4+和CD25+调节性T细胞可以阻碍抗肿瘤反应。在一些实施方案中，富集培养的细胞毒性淋巴细胞的CD8+细胞毒性淋巴细胞以及减少或消除CD4+细胞，可以改善过继转移的抗肿瘤CD8+细胞的影响，改善患者的反应率，和/或降低CD4+细胞产生细胞因子导致的毒性。在一些实施方案中，一些T细胞培养物的CD8+富集表现出在大量培养中可能不明显的体外肿瘤识别，并改善了其他培养中肿瘤的体外识别。在一些实施方案中，富集的CD8+年轻的细胞毒性淋巴细胞在临床规模的快速扩增中比体T细胞(bulk T-cells)更可靠地且可预测地起作用。
使用透气性容器扩增基因修饰的细胞毒性淋巴细胞
本发明的一个实施方案提供一种促进哺乳动物癌症消退的方法，包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养(即REP前)肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得细胞毒性淋巴细胞；使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在其中含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增(即REP)细胞毒性淋巴细胞的数量；以及将扩增数量的细胞毒性淋巴细胞施用于哺乳动物。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞在从肿瘤组织样品中分离后、但在所述第一透气性容器中培养之前，进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞在所述第一透气性容器中培养后、但在所述第二透气性容器中培养之前，进行基因修饰。在一些实施方案中，在将扩增数量的细胞毒性淋巴细胞施用于哺乳动物之前，对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。参见，例如，美国专利公开2017/0152478中描述的方法，以及本文描述的那些。在一些实施方案中，使用载体对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ IDNO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，本方法使用已经使用透气性容器扩增的细胞毒性淋巴细胞和/或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞促进癌症消退，本方法更简单、劳动强度更低、使用更少的试剂，并且，与使用非透气性容器(例如，T型烧瓶或T-175烧瓶、袋子和多孔板)的方法相比，本方法可以使用更简单的设备来进行。另外，在一些实施方式中，与可以是“开放”系统的非透气性容器相比，透气性容器可以更有效地保护细胞免受微生物污染。另外，在一些实施方案中，与使用非透气性容器的方法相比，使用透气性容器的方法可以减少使用的容器的数量，从而减少了实施该方法所需的劳动量，并降低了微生物污染的风险。因此，在透气性容器中生产细胞可能更适合于符合例如III期临床试验所需的动态药品生产管理规范(cGMP)条件。在一些实施方案中，使用透气性容器的方法将最终培养体积减少至低于用非透气性容器获得的培养体积，这可以降低培养细胞所需的培养箱容量，减少培养细胞所需的试剂(例如细胞培养基和添加剂)的量，并简化浓缩和洗涤细胞的设备和/或程序。在一些实施方案中，与在非透气的容器中的饲养频率(例如，每隔一天)相比，在透气性容器中的细胞的饲养频率可以更低(例如，大约每三到四天)，特别是当细胞和/或肿瘤组织样品在透气性容器中被浸没在至少约1.3cm的细胞培养基中培养时。在一些实施方案中，透气性容器中的细胞可以比非透气性容器(例如袋子)中的细胞处理频率低，这可以最小化对肿瘤片段的干扰并提供更可重复的细胞毒性淋巴细胞生长。在一些实施方案中，该方法的各个部分，包括但不限于培养和/或扩增细胞毒性淋巴细胞，可以是自动化的。在一些实施方案中，使用透气性烧瓶使得可以产生足够数量的细胞毒性淋巴细胞，从而允许治疗之前尚未成功治疗的受试者，所述治疗未成功可能是因为：由于不使用透气性烧瓶的先前方法的技术和组织复杂性，未产生足够数量的细胞毒性淋巴细胞。
在一些实施方案中，该方法还包括：在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品。在一个实施方案中，肿瘤组织样品直接在透气性容器中的透气性材料上培养而不消化。在另一个实施方案中，可以直接在透气性材料上培养酶促或机械消化的肿瘤组织样品。可以使用任何合适的细胞培养基。细胞培养基可以进一步包含任何合适的T细胞生长因子，例如白细胞介素(IL)-2。细胞培养基可选地进一步包含人AB血清。在一些实施方案中，肿瘤组织样品可含有受试者自体的TIL。在一些实施方案中，培养肿瘤组织样品包括培养肿瘤样品中存在的TIL。
该方法还包括从肿瘤组织样品中获得TIL。肿瘤组织样品包含TIL。由于肿瘤组织样品在透气性容器中培养，例如，在容器中的透气性材料上，存在于肿瘤组织样品中的TIL也开始在透气性容器中生长，例如，在透气性材料上。可以以任何合适的方式从肿瘤组织样品中获得TIL。
在一些实施方案中，第一透气性容器可以是任何合适的透气性容器。在一些实施方案中，第一透气性容器包括底部、侧面和帽。在一些实施方案中，容器包含透气性载体和透气性材料，例如透气性膜。在一些实施方案中，容器的底部包括透气性载体和透气性材料，例如透气性膜。在一些实施方案中，透气性材料可以直接位于容器内部的透气性载体上，该透气性载体包括与环境气体流体连通的开口(例如，通道)，以促进容器内部与环境气体之间的气体交换。在一些实施方案中，帽可包括出口和/或端口(例如，接入端口)。在一些实施方案中，接入端口可具有大于约1mm至约1cm(例如，大于约1mm或大于约1cm)的开口。具有大于约1mm至约1cm的开口的接入端口可以有利地消除或降低TIL的干扰。在一些实施方案中，透气性容器包括出口或出口端口，其在容器中的温度在处理期间下降的情况下是有利的。在一些实施方案中，第一透气性容器是如美国专利申请公开No.2005/0106717中所述的透气性容器，其通过引用并入本文，并且第一透气性容器可从Wilson WolfManufacturing Corporation(例如，G-Rex10、GP200、G-Rex100、GP2000容器)(新布赖顿，明尼苏达州)商购获得。
在一些实施方案中，第一透气性容器具有任何合适的细胞培养基体积容量。例如，第一透气性容器可具有中等容量，约40mL以上；约200mL以上；约500mL以上；约2,000mL以上；或约5,000mL以上。尽管第一透气性容器可具有任何合适的中等容量，肿瘤组织样品和/或含有细胞毒性淋巴细胞的TIL可在任何合适体积的培养基中培养。在一些实施方案中，将肿瘤组织样品和/或含有细胞毒性淋巴细胞的TIL浸没在高度至少约1.3cm的细胞培养基中培养。在一些实施方案中，将肿瘤组织样品和/或含有细胞毒性淋巴细胞的TIL浸没在高度至少约2.0cm的细胞培养基中培养。有利地，在浸没在至少约1.3cm的高度或至少约2.0cm的高度的培养基的透气性材料上培养的肿瘤组织样品和/或TIL可以以较低频率处理和饲养。
在一些实施方案中，第一透气性容器可以为含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的生长提供任何合适的表面积。在一些实施方案中，透气性容器用于TIL生长的表面积可为约10cm2以上；约100cm2以上；或约650cm2以上。
在一些实施方案中，将肿瘤组织样品和/或含有细胞毒性淋巴细胞的TIL在第一透气性容器内培养，与透气性材料接触并浸没在合适体积的培养基中。培养与透气性材料接触的肿瘤组织样品和/或TIL促进细胞与环境空气之间的气体交换。促进细胞和环境空气之间的气体交换促进细胞的呼吸、生长和活力。在一些实施方案中，穿过透气性材料的气体交换可以(例如，通过对流和扩散)促进容器内培养基的循环，这有利于含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的饲养。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞在第一透气性容器中培养之前或之后进行基因修饰。在一些实施方案中，使用载体对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301GPDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301GPDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ IDNO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ IDNO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，该方法还包括使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中，扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的数量。在一些实施方案中，扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的数量所使用的比例为：约1个TIL相对至少约20个饲养细胞的比例，约1个TIL相对至少约25个饲养细胞的比例，约1个TIL相对至少约50个饲养细胞的比例，约1个TIL相对至少约100个饲养细胞的比例，约1个TIL相对至少约200个饲养细胞的比例，例如，TIL相对饲养细胞的比例为约1相对约20、约1相对约25、约1相对约50、约1相对约100、或约1相对约200。在一些实施方案中，第二透气性容器可以如第一透气性容器中所述那样。
在一些实施方案中，扩增培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。在一些实施方案中，快速扩增培养的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。快速扩增使含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的数量在约10天至约14天的期间(在一些实施方案中，约14天内)增加至少约50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多)。在一些实施方案中，快速扩增在约10天至约14天的期间(在一些实施方案中，约14天内)提供至少约200倍(或300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或更多)的增加。在一些实施方案中，快速扩增在约10天至约14天的期间(并且在一些实施方案中，约14天内)提供至少约1000倍的增加。在一些实施方案中，快速扩增在约14天的时间内提供约1000倍至约2000倍的增加，例如，约1000倍，约1500倍或约2,000倍。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞在扩增之前或之后进行基因修饰。在一些实施方案中，使用载体对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，可通过任何合适的方法在透气性容器中完成扩增(即REP)。例如，在饲养细胞(例如，经辐照的同种异体饲养细胞、经辐照的自体饲养细胞，和/或人工抗原呈递细胞(例如，用编码CD3和/或CD8的核酸转导的K562白血病细胞))和白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)(在一些实施方案中，IL-2)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。在一些实施方案中，使用约1x109至约4x109(优选约2x109至约3x109)个同种异体饲养细胞和/或自体饲养细胞，扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的数量。非特异性T细胞受体刺激可包括，例如，约30ng/ml的OKT3，即一种小鼠单克隆抗CD3抗体(购自Ortho-McNeilRTM,Raritan,新泽西州或Miltenyi Biotec,贝尔吉施格拉德巴赫，德国)。或者，可以在T细胞生长因子(例如300IU/ml IL-2或IL-15，在一些实施方案中，用IL-2)的存在下，例如通过用癌症抗原(一个或多个，包括其抗原部分，如表位或细胞)体外刺激含有细胞毒性淋巴细胞的TIL，来快速扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL，所述癌症抗原可以任选地从载体表达，例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如，约0.3μM MART-1：26-35(27L)或gp100：209-217(210M)。其他合适的抗原可包括，例如，NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原性部分。体外诱导的TIL通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的癌症的相同抗原再刺激而快速扩增。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2，再刺激TIL。
在一些实施方案中，扩增TIL的数量可包括：使用约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基，优选约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一个实施方案中，扩增TIL的数量使用不超过一种类型的细胞培养基。可以使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺，50μg/ml硫酸链霉素和10μg/ml硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen，卡尔斯巴德加州)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL数量所需的培养基量和培养基种类。
在一些实施方案中，扩增含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的数量可以包括：以不超过每隔三天或每隔四天的频率饲养细胞。透气性容器中的细胞数量的扩增通过降低扩增细胞所需的饲养频率而有利地简化了扩增细胞数量所需的程序。
在一些实施方案中，第一透气性容器和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。不受特定理论的束缚，据认为，在一些细胞培养基补充物(例如AB血清)中的微粒血清组分对TIL生长几乎没有或没有不利影响。使用未过滤的细胞培养基可以有利地简化扩增细胞数量所需的程序。
在一些实施方案中，第一透气性容器和/或第二透气性容器中的细胞培养基没有β-巯基乙醇(BME)。在一些实施方案中，细胞培养基缺乏BME可以有利地更符合cGMP(动态药品生产管理规范)，并因此，可以有利地使得更容易获得监管部门的批准。
在一些实施方案中，该方法的持续时间包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养(即REP前)肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得含有细胞毒性淋巴细胞的TIL；使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中可以扩增(即REP)含有细胞毒性淋巴细胞的TIL的数量约28至约42天(例如约28天)。在一些实施方案中，在培养之前或之后、在获得含细胞毒性淋巴细胞的TIL之前或之后、或在扩增之前或之后，对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，使用载体对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用扩增的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。含有细胞毒性淋巴细胞的TIL可以通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以动脉内或静脉内输注施用，其优选持续约30至约60分钟。施用途径的其他例子包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞在施用前进行基因修饰。在一些实施方案中，使用载体对细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，重链和轻链在相同载体上编码。在一些实施方案中，重链和轻链在不同载体上编码。在一些实施方案中，重链在第一载体上编码。在一些实施方案中，轻链在第二载体上编码。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
除了TIL之外，细胞毒性淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞和天然杀伤(NK)细胞也可以从肿瘤组织样品中获得，如用于本文所述的TIL一样地培养和扩增。因此，该方法还可包括向哺乳动物施用巨噬细胞、单核细胞和天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，该方法可用于扩增细胞毒性淋巴细胞。
在一些实施方案中，促进TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的生长和活化的T细胞生长因子与TIL同时或随后施用于哺乳动物。T细胞生长因子可以是促进TIL生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的实例包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独使用或以各种组合使用，例如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。优选T细胞生长因子是IL-2。
在一些实施方案中，修饰TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以表达促进TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括，例如，上述任何一种。合适的修饰方法是本领域已知的。参见，例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版，Cold Spring Harbor Press，冷泉港，纽约，2001；以及Ausubel等，目前的分子生物学协议，Greene Publishing Associatesand John Wiley&Sons，纽约，1994。在一些实施方案中，修饰的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，例如IL-12的编码序列，在本领域中是容易获得的，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接促进高水平表达。在一些实施方案中，可以修饰TIL和/或细胞毒性淋巴细胞以表达IL-12，如世界知识产权组织专利申请公开号WO2010/126766中所述，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，两种细胞因子可以比单一细胞因子更有效。并且在一些实施方案中，三种细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)可以比任何两种细胞因子更有效。据认为，IL-15增强肿瘤特异性CD8+T细胞应答。在这方面，IL-15培养的细胞与IL-2的施用(例如快速浓注)可以是特别有效的。在一些实施方案中，经修饰以表达IL-15的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以与IL-2一起施用作为快速浓注。
T细胞生长因子可以通过任何合适的途径施用。在施用超过一种T细胞生长因子的实施方案中，它们可以以任何顺序并通过相同的途径或不同的途径，同时或顺序地施用。在一些实施方案中，静脉快速浓注施用T细胞生长因子(例如IL-2)。在一些实施方案中，T细胞生长因子(例如IL-2)的剂量是本领域普通技术人员认为高的剂量。在一些实施方案中，每天三次施用约720,000IU/kg剂量的IL-2直至耐受，特别是当癌症是黑素瘤时。在一些实施方案中，施用约5～15个剂量的IL-2，平均约8个剂量。
TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以识别由每个肿瘤细胞基因组编码的预计10,000个基因突变产生的任何独特的抗原。然而，抗原不必是独特的。TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以识别癌症的一种或多种抗原，包括一种或多种抗原的抗原部分，例如表位，或癌症细胞。“癌症抗原”和“该癌症抗原”旨在包括所有上述抗原。如果癌症是黑素瘤，例如转移性黑素瘤，则TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以识别MART-1(例如MART-1：26-35(27L))、gp100(例如gp100：209-217(210M))，或源自肿瘤编码突变的“独特的”或患者特异性抗原。可被TIL识别的其他合适的黑素瘤抗原可包括但不限于酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)1、TRP2和MAGE。TIL还可以识别抗原，例如NY-ESO-1、端粒酶、p53、HER2/neu、癌胚抗原或前列腺特异性抗原，用于治疗肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和类似癌。
在一些实施方案中，提供的方法是从哺乳动物获得扩增数量的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞用于过继性细胞免疫疗法的方法，包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得TIL和/或细胞毒性淋巴细胞；使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，在从哺乳动物获得肿瘤组织样品后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养(即，REP前)肿瘤组织样品之前或之后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在从肿瘤组织样品中获得TIL和/或细胞毒性淋巴细胞后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增(即，REP)TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，该方法包括从哺乳动物获得肿瘤组织样品。可以如本文关于本发明的任何实施方案所述地获得肿瘤组织样品。
在一些实施方案中，该方法包括：在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品。肿瘤组织样品可以在第一透气性容器中培养，如本文关于本发明的任何实施方案所述。
在一些实施方案中，该方法包括：从肿瘤组织样品中获得含有细胞毒性淋巴细胞的TIL。含有细胞毒性淋巴细胞的TIL可以从肿瘤组织样品中获得，如本文关于本发明的任何实施方案所述。
在一些实施方案中，该方法包括：使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量。可以扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量，如本文关于本发明的任何实施方案所述。
在一些实施方案中，该方法涉及：获得扩增数量的来自哺乳动物的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞用于过继性细胞免疫疗法，其中，该方法包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得含有细胞毒性淋巴细胞的TIL；使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的透气性容器中扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量。在一些实施方案中，透气性容器是第一透气性容器。可以如本文关于本发明的任何实施方案所述地进行：从哺乳动物获得肿瘤组织样品，从肿瘤组织样品中获得TIL和/或细胞毒性淋巴细胞，以及使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ IDNO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ IDNO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，提供的方法是促进哺乳动物中癌症消退的方法，包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得含有细胞毒性淋巴细胞的TIL；使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第一透气性容器和第二透气性容器中，扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量；以及将扩增数量的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞施用于哺乳动物。在一些实施方案中，可以如本文关于本发明的任何实施方案所述地进行：从哺乳动物获得肿瘤组织样品，从肿瘤组织样品中获得TIL，使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的透气性容器中扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量，以及向哺乳动物施用扩增数量的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，该方法还包括：选择能够裂解癌细胞的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞。可以如本文关于本发明的任何实施方案所述地，选择TIL和/或细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ IDNO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，在从哺乳动物获得肿瘤组织样品后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在从肿瘤组织样品中分离含有细胞毒性淋巴细胞的TIL之前或之后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中扩增TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量之前或之后，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在向哺乳动物施用扩增数量的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞之前，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。
在一些实施方案中，在施用于患者之前，未测试细胞毒性淋巴细胞的特异性肿瘤反应性以鉴定肿瘤反应性细胞毒性淋巴细胞。可以通过本领域已知的任何方法测试特异性肿瘤反应性，例如，通过在与肿瘤细胞共培养后，测量细胞因子释放(例如，干扰素-γ)。本发明的方法有利地通过向哺乳动物施用细胞毒性淋巴细胞来促进哺乳动物中癌症的消退，而无需事先筛选特异性肿瘤识别。如果需要，所述方法的实施方案可包括：在将细胞毒性淋巴细胞施用于哺乳动物之前，以非抗原特异性方式测试细胞毒性淋巴细胞的效力。在一些实施方案中，可以可选地测试细胞毒性淋巴细胞效力，例如通过测量OKT3刺激后细胞因子释放的非特异性效力测定。例如，如果干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则T细胞可被认为是强力的。该方法的较次的实施方案包括：测试扩增的细胞毒性淋巴细胞的特异性肿瘤反应性，以鉴定肿瘤反应性细胞毒性淋巴细胞。
用于培养TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的其他方法
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：通过任何合适的方法培养肿瘤组织，所述方法有助于从肿瘤组织样品中获得TIL和/或细胞毒性淋巴细胞。在这方面，培养肿瘤组织可以包括建立多个独立的培养物，例如，微量培养物。例如，培养肿瘤组织可以包括在平板(例如，24孔板)中培养肿瘤片段。在一些实施方案中，在没有透气性容器的情况下培养肿瘤组织。
在一些实施方案中，该方法还包括：选择能够裂解癌细胞的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞，而在其他实施方案中，该方法不包括选择能够裂解癌细胞的TIL。可以通过识别具有与癌细胞裂解和/或癌症消退相关的任何合适特性的TIL，来选择能够裂解癌细胞的TIL。可用作选择TIL的基础的示例性合适的TIL特性可包括：在与自体肿瘤细胞共培养时，释放IFN-γ中的任何一种或多种；细胞表面表达CD8、CD27和CD28中的一种以上；以及端粒长度。不受特定理论的束缚，据认为，细胞表面表达CD8、CD27和CD28中的一种以上以及较长的端粒长度与患者中的阳性客观临床反应和体内细胞的持久性相关。优选地，特性是在与自体肿瘤细胞共培养时IFN-γ的释放。在本发明的一个实施方案中，选择的TIL在与肿瘤细胞共培养时释放约200pg/ml以上的IFN-γ。
在一些实施方案中，选择能够裂解癌细胞的TIL包括：测试各培养物中特性的存在并鉴定具有该特性的TIL。以下测试方法在本领域中是已知的：在与自体肿瘤细胞共培养时，测试培养物中是否存在任何一种或多种的IFN-γ释放；CD8、CD27和CD28中的一种以上的细胞表面表达；以及端粒长度(较长的端粒与癌症的消退相关)。
在一些实施方案中，可以选择任何数量的培养物。例如，可以选择一种、两种、三种、四种、五种或更多种培养物。在选择两种以上培养物的实施方案中，可以合并所选择的培养物和在一个(或多个)透气性容器中扩增TIL的数量。在选择两种以上培养物的实施方案中，每种选择的培养物在单独的容器中单独扩增，包括透气性容器(当使用这种容器时)。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括：如本文关于本发明的任何实施方案所述地，使用经辐照的同种异体饲养细胞和/或经辐照的自体饲养细胞，在含有细胞培养基的第二透气性容器中，扩增已鉴定的培养物中的TIL和/或细胞毒性淋巴细胞的数量。在一些实施方案中，在第二透气性容器中扩增的细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ IDNO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ IDNO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群
一旦扩增到合适的数量，可以施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群，例如，使用本领域已知的任何合适的方法和/或装置，将其输注到受试者。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ IDNO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ IDNO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
本公开的组合物，例如，本公开的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，可以单独施用，或与稀释剂和/或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合，作为药物组合物施用。简而言之，本公开的药物组合物可包括如本文所述的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群(例如，结合本文所述的任何实施方案)，与一种以上药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。优选本发明的组合物被配制为用于静脉内施用或在肿瘤部位注射。
本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或待预防)的疾病的方式施用。施用量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，但合适的剂量可通过临床试验确定。
当描述“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)病情的个体差异，确定待施用的本发明组合物的精确量。通常来说，包含本文所述的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的药物组合物的施用剂量可以是104～1011细胞/kg体重(例如，105～106、105～1010、105～1011、106～1010、106～1011、107～1011、107～1010、108～1011、108～1010、109～1011或109～1010细胞/kg体重)，包括这些范围内的所有整数值。基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可以使用免疫疗法中通常已知的输注技术，来施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病迹象，容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案，并相应地调整治疗。
本发明组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以全身或局部(例如，在肿瘤部位)施用于患者。本文所述的组合物可通过静脉内(i.v.)注射，皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内，或腹膜内施用于患者。在一些实施方案中，通过皮内或皮下注射，将本公开的组合物施用于患者。在一些情况下，本发明的组合物通过静脉内注射施用。可以将本公开的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一些实施方案中，通过公开的方法产生的扩增的含有细胞毒性淋巴细胞的TIL、细胞毒性淋巴细胞和/或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞以动脉内或静脉内输注形式施用。在一些实施方案中，施用持续约30～约60分钟。在一些实施方案中，施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。在一些实施方案中，在从哺乳动物获得肿瘤组织样品后，在扩增期间的任何时间，但在施用于哺乳动物之前，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，使用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ IDNO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ IDNO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
淋巴细胞清除方法
在一些实施方案中，在向哺乳动物施用从肿瘤浸润淋巴细胞获得的扩增的细胞毒性淋巴细胞之前，向哺乳动物施用非清髓性淋巴清除化疗。淋巴细胞清除的目的是为输注的淋巴细胞腾出空间，特别是通过清除竞争稳态细胞因子的调节性T细胞和其他非特异性T细胞。非清髓性淋巴清除化疗可以是任何合适的此类疗法，其可以通过技术人员已知的任何合适途径施用。非清髓性淋巴清除化疗可以包括例如环磷酰胺和氟达拉滨的施用，特别是当癌症是(可以是转移性的)黑素瘤时。在一些实施方案中，静脉内施用是环磷酰胺和氟达拉滨的施用途径。同样，可以施用任何合适剂量的环磷酰胺和氟达拉滨。优选地，施用约40～80mg/kg(例如，约60mg/kg)的环磷酰胺约2天后，施用约15～35mg/m2(例如，约25mg/m2)的氟达拉滨约5天，特别是当癌症是黑色素瘤时。
在一些实施方案中，在向哺乳动物施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞之前，向哺乳动物施用非清髓性淋巴清除化疗。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ IDNO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
联合疗法
在一些实施方案中，合适的疗法包括在施用本公开的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞之前，将受试者暴露于一种或多种淋巴清除措施。淋巴清除措施可采取化疗或放疗的形式。合适的化疗措施可包括，例如，用环磷酰胺和/或氟达拉滨治疗。
在本公开的一些实施方案中，使用本文所述的方法(例如，结合本文所述的任何实施方案)或本领域已知的其他方法(其中淋巴细胞扩增至治疗水平)扩增的细胞与任何数量的相关治疗方式一起(例如，在之前、同时地或在之后)施用于患者，所述相关治疗方式包括但不限于：用药物治疗，如抗病毒治疗、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)，或用于MS患者的那他珠单抗治疗，或用于牛皮癣患者的依法利珠单抗治疗，或用于PML患者的其他治疗。在另一个实施方案中，本发明的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞可以与以下一起使用：化疗，放射，免疫抑制剂如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体或其他免疫消融剂(immunoablative agent)如CAMPATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66：807-815，1991；Henderson等，Immun.73：316-321，1991；Bierer等，Curr.Opin,Immun.5：763-773，1993)。在另一个实施方案中，将本公开的细胞组合物与骨髓移植、使用化学治疗剂(如氟达拉滨、外照射放疗(XRT)、环磷酰胺等)或抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融治疗一起(例如，在之前，同时地或在之后)施用于患者。在另一个实施方案中，本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的试剂，如利妥昔单抗)后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可以接受高剂量化疗的标准疗法，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本公开的扩增的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的输注。在另外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
在一些实施方案中，在手术之前或之后施用的扩增细胞是基因修饰的。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ IDNO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ IDNO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ IDNO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞与标准抗癌药物或疗法同时施用。许多抗癌药物和疗法可与本发明的方法和组合物组合使用。以下是可与辐照联合使用的抗癌(抗肿瘤)药物的非详尽清单：阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁(AcrQnine)、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波毒素、乙酸阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安曲霉素、天冬酰胺酶、曲林霉素、阿扎胞苷、阿扎替派、含氮霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸必生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡普睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、亚硝脲氮芥、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉曲滨、克立那托甲磺酸盐、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎胍宁、地扎胍宁甲磺酸盐、地吖醌、多西他赛、阿霉素、盐酸阿霉素、屈洛昔芬、屈洛昔芬柠檬酸盐、屈他雄酮丙酸盐、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸盐钠、依他硝唑、乙碘油1131、依托泊甙、依托泊甙磷酸盐、氯苯乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、氟达拉滨磷酸盐、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、金Au198、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素I、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯基嘌呤、氨甲喋呤、氨甲喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米特卡辛、丝裂红素、米托洁林、丝裂马菌素、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、霉酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥马铂、奥昔舒仑、紫衫醇、培门冬酶、培利霉素、奈莫司汀、硫酸培洛霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、波尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素、盐酸嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、稀疏霉素、盐酸锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、链黑菌素、链佐星、氯化锶Sr 89、磺氯苯脲、他利霉素、紫杉烷类、紫杉烷、替可加兰钠、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酪、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、三胺硫磷、噻唑呋林、替拉扎明、盐酸拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、乙酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春立定、伏氯唑、折尼钼、净司他丁、盐酸佐柔比星。
适合治疗的受试者
适用所公开的方法和组合物治疗的受试者包括但不限于：患有(例如，被诊断为患有)癌症和/或慢性病毒感染的受试者或有患癌和/或慢性病毒感染风险的受试者。可通过本文公开的方法和组合物治疗的癌症类型包括但不限于转移性黑素瘤、淋巴瘤、白血病，以及胰腺或脑源的实体瘤。可通过本文公开的方法和组合物治疗的慢性病毒感染的类型包括但不限于：与艾巴氏病毒(EBV)感染、人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒和腺病毒感染相关的移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)。感染丙型肝炎和乙型肝炎病毒的受试者也可通过本文公开的方法和组合物进行治疗。
可以治疗的癌症包括：未血管化或尚未显著血管化的肿瘤，以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(例如血液肿瘤，如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本公开的方法和组合物治疗的癌症的类型包括但不限于：癌，胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤，例如肉瘤，癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
血液癌是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括：白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和成髓细胞、前突细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)，慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒细胞)白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，重链病，骨髓增生异常综合征，毛细胞白血病和骨髓增生异常。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤例如肉瘤和癌的例子包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也是称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤(Schwannoma craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在一些实施方案中，该方法促进癌症消退。促进哺乳动物中癌症的消退可包括治疗或预防哺乳动物中的癌症。如本文所用，术语“治疗”、“预防”和“消退”以及由此产生的词语并不一定意味着100％或完全消退。相反，存在不同程度的治疗、预防和消退，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明的方法可以在哺乳动物中提供任何量的任何水平的癌症治疗、预防或消退。此外，本发明方法提供的治疗、预防或消退可以包括治疗、预防或消退疾病(例如，癌症)的一种或多种病症或症状。此外，出于本文的目的，“治疗”、“预防”和“退化”可以包括延迟疾病的发作或其症状或病症。
在一些实施方案中，施用细胞毒性淋巴细胞作为治疗方案的一部分。在一些实施方案中，施用PD-L1结合蛋白作为治疗方案的一部分。在一些实施方案中，施用细胞毒性淋巴细胞与PD-L1结合蛋白的组合作为治疗方案的一部分。在一些实施方案中，施用基因修饰的细胞毒性淋巴细胞作为治疗方案的一部分。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ IDNO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
制备经基因修饰以表达和分泌可溶性程序性死亡1配体1(PD-L1)结合蛋白的细胞毒性淋巴细胞的方法
根据本发明的制备基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的方法可包括上述分离、基因修饰和扩增步骤的一种以上。
在一些实施方案中，对遗传细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，使用病毒载体对根据本发明制备的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ ID NO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ ID NO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对基因修饰的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对基因修饰的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ IDNO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ ID NO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
试剂盒
本公开还提供了包含一种以上本公开组合物的试剂盒，本公开组合物例如选自：(i)主题PD-L1结合蛋白(例如scFV，大抗体等)，例如，结合本文描述的任何实施方式，(ii)一种以上核酸(例如载体)，其包括编码根据本发明的主题PD-L1结合蛋白的核苷酸序列，例如，结合本文所述的任何实施方案，和(iii)根据本发明的一种以上基因修饰的细胞(例如，细胞毒性淋巴细胞)(例如，在包含一种以上药学上可接受的赋形剂的组合物中)，例如，结合本文描述的任何实施方式。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞包括在试剂盒中。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包括在试剂盒中。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞与PD-L1结合蛋白组合包括在试剂盒中。在一些实施方案中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞在试剂盒中。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞是基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞毒性淋巴细胞经基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，用病毒载体对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，病毒载体是基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 38A1(SEQ IDNO：37；图11A，图16A)。在一些实施方案中，病毒载体是pLV4301G PDLV scFV 19H9(SEQ IDNO：38；图11B，图16B)。在一些实施方案中，病毒载体是基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于γ逆转录病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是基于pMSCIV的载体。在一些实施方案中，病毒载体编码19H9。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码19H9的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体编码38A1。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于慢病毒的载体。在一些实施方案中，病毒载体是编码38A1的基于pLEV的病毒载体。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌19H9。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌38A1。在一些实施方案中，对TIL和/或细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰以表达和分泌PD-L1结合蛋白。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白包含抗原结合部分。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在黑素瘤中表现出更高或增强的结合能力。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)利用用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测的PD-L1结合蛋白，确定在流式细胞术测定中检测的PD-L1阳性细胞的百分比，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的PD-L1阳性细胞的数量与对照抗体或19H9进行比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术检测的PD-L1阳性细胞的百分比增加表明结合能力的增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，通过如下方法测量增加的结合能力：(i)通过流式细胞术测定，确定用PD-L1结合蛋白标记的PD-L1阳性细胞的平均荧光强度(MFI)，所述PD-L1结合蛋白用荧光标记物标记或可通过荧光标记物检测，和(ii)将用PD-L1结合蛋白获得的MFI与对照抗体比较或与19H9比较，其中与对照抗体或19H9相比，通过流式细胞术测得的用PD-L1结合蛋白的总细胞群的MFI增加表明结合能力增加(参见，例如，实施例3中的测定)。在一些实施方案中，与19H9相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，与19H9相比，38A1蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的生物学功能。在一些实施方案中，生物学功能包括阻断PD-1与PD-L1的相互作用。在一些实施方案中，生物学功能包括抑制PD-1和PD-L1信号通路。在一些实施方案中，与38A1相比，PD-L1结合蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，与38A1相比，19H9蛋白在Jurkat细胞中表现出更高或增强的分泌能力。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：2(CDR-L1)、SEQ ID NO：3(CDR-L2)和SEQ IDNO：4(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：6(CDR-H1)、SEQ ID NO：7(CDR-H2)和SEQ ID NO：8(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含重链和轻链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的抗体或其片段，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：10(CDR-L1)、SEQ ID NO：11(CDR-L2)和SEQ ID NO：12(CDR-L3)的CDR，并且所述重链包含SEQ ID NO：14(CDR-H1)、SEQ ID NO：15(CDR-H2)和SEQ ID NO：16(CDR-H3)的CDR。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：1具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：5具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQ ID NO：1，并且所述重链包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：17的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：18的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含与SEQ ID NO：9具有90％、95％或98％同一性的序列，并且所述重链包含与SEQ ID NO：13具有90％、95％或98％同一性的序列。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含轻链和重链的单链Fv(scFv)，其中，所述轻链包含SEQID NO：9，并且所述重链包含SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQID NO：19的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列(即，与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是单链Fv(scFv)，其进一步包含IgG1序列(即，与IgG1序列缀合)。在一些实施方案中，PD-L1结合蛋白是包含SEQ ID NO：20的单链Fv(scFv)。在一些实施方案中，缀合是直接的。在一些实施方案中，缀合是通过接头进行的。
在某些情况下，主题试剂盒包括合适的说明材料，例如，以结合本文描述的任何实施方式来实践如本文所述的方法。
公开的非限制性的例子
上述本发明主题的各方面(包括实施方案)可以单独或与一个或多个其他方面或实施方案组合起到有益效果。在不对前述描述进行限定的情况下，下面提供了编号为1－76的公开内容的某些非限制性方面。本领域技术人员阅读该公开内容后会明白，下述各编号的方面可以与前面或后面的各编号的方面一起组合使用。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：
1.一种蛋白质，其特异性结合PD-L1并包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽；或
(b)包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽，
并且所述第一多肽和/或所述第二多肽的3个CDR氨基酸序列各自对于指定的SEQ ID编号包含两个以下保守氨基酸替换。
2.1的蛋白质，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：6-8中所示的3个CDR氨基酸序列。
3.2的蛋白质，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
4.1的蛋白质，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16中所示的3个CDR氨基酸序列。
5.4的蛋白质，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列。
6.1-5中任一项的蛋白质，其中，所述第一多肽是轻链，所述第二多肽是重链。
7.1-6中任一项的蛋白质，其中，所述蛋白质是单链抗体(scFv)，并且所述第一多肽和所述第二多肽直接彼此融合或通过接头彼此融合。
8.7的蛋白质，其中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。
9.1-8中任一项的蛋白质，其中，所述蛋白质是包含免疫球蛋白Fc结构域的大抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过接头与抗原结合部分融合。
10.9的蛋白质，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG1Fc结构域。
11.10的蛋白质，其中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
12.9的蛋白质，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG4Fc结构域。
13.1-6中任一项的蛋白质，其中，所述蛋白质是人源化抗体。
14.一种核酸，其包含编码1-13中任一项的蛋白质的核苷酸序列。
15.14的核酸，其中，所述核酸包含与编码所述蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
16.15的核酸，其中，所述启动子是组成型启动子。
17.15的核酸，其中，所述启动子是诱导型启动子。
18.一种细胞，其包含14-17中任一项的核酸。
19.18的细胞，其中，所述核酸整合到细胞的基因组中。
20.18或19的细胞，其中，所述细胞是经基因修饰以表达和分泌所述蛋白质的细胞毒性淋巴细胞。
21.20的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
22.21的细胞，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
23.21的细胞，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
24.21的细胞，其中，所述T细胞来源于外周血。
25.20的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
26.25的细胞，其中，所述NK来源于外周血。
27.20的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是源自受试者的肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
28.27的细胞，其中，所述TIL包含对源自肿瘤的抗原有特异性的受体。
29.20-28中任一项的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。
30.29的细胞，其中，所述一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
31.29或30的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞包含对肿瘤相关的抗原有特异性的T细胞受体。
32.一种方法，包括：
通过向细胞毒性淋巴细胞中引入14-17中任一项的核酸，对从受试者肿瘤中分离的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质；
扩增所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，以产生基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群；以及，
将基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群施用于受试者以治疗肿瘤。
33.32的方法，其中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
34.32的方法，其中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
35.32-34中任一项的方法，其中，所述核酸整合到细胞毒性淋巴细胞的基因组中。
36.32-35中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
37.36的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
38.36的方法，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
39.32-35中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
40.32-39中任一项的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对源自肿瘤的抗原有特异性的受体。
41.32-40中任一项的方法，所述方法包括在基因修饰之前从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞。
42.32-41中任一项的方法，其中，所述蛋白质特异性结合PD-L1并且包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽；或
(b)包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽，
并且第一多肽和/或第二多肽的3个CDR氨基酸序列中的每一个对于指定的SEQ ID编号包含两个以下保守氨基酸替换。
43.42的方法，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：6-8中所示的3个CDR氨基酸序列。
44.43的方法，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
45.42的方法，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16中所示的3个CDR氨基酸序列。
46.45的方法，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列。
47.42-46中任一项的方法，其中，所述第一多肽是轻链，所述第二多肽是重链。
48.42-47中任一项的方法，其中，所述蛋白质是单链抗体(scFv)，并且所述第一多肽和所述第二多肽直接彼此融合或通过接头彼此融合。
49.48的方法，其中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。
50.42-49中任一项的方法，其中，所述蛋白质是包含免疫球蛋白Fc结构域的大抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过接头与抗原结合部分融合。
51.50的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG1Fc结构域。
52.51的方法，其中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
53.一种制备基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的方法，所述方法包括：
通过向细胞毒性淋巴细胞中引入14-17中任一项的核酸，对从患有或怀疑患有癌症的受试者中分离的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质。
54.53的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
55.53的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
56.53-55中任一项的方法，所述方法包括在体外扩增细胞毒性淋巴细胞，以提供扩增的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群。
57.53-56中任一项的方法，所述方法包括在基因修饰之前从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞。
58.57的方法，其中，所述分离包括从受试者的肿瘤中分离细胞毒性淋巴细胞。
59.57中任一项的方法，其中，所述分离包括从受试者的外周血中分离细胞毒性淋巴细胞。
60.53-59中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
61.60的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
62.60的方法，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
63.53-59中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
64.53-63中任一项的方法，其中，所述核酸整合到细胞毒性淋巴细胞的基因组中。
65.53-64中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。
66.65的方法，其中，所述一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
67.65或66的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对来自受试者肿瘤的抗原具有特异性的T细胞受体。
68.一种治疗患有或怀疑患有癌症的个体的方法，所述方法包括：
将1-13中任一项的特异性结合PD-L1的蛋白质施用于个体。
69.68的方法，其中，所述施用包括向受试者引入编码所述蛋白质的核酸。
70.68的方法，其中，所述施用包括向受试者引入表达和分泌所述蛋白质的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。
71.70的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达所述蛋白质。
72.71的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达所述蛋白质。
73.72的方法，所述方法包括诱导所述蛋白质的表达。
74.70-73中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
75.74的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
76.74的方法，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
77.70-73中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
78.70-77中任一项的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。
79.78的方法，其中，所述一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
80.78或79的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对来自受试者肿瘤的抗原具有特异性的T细胞受体。
81.一种降低第一种细胞上的PD-L1与第二种细胞上的PD-1之间相互作用的方法，所述方法包括：
使第一种细胞上的PD-L1与1-13中任一项的蛋白质接触。
82.81的方法，其中，第一种细胞和第二种细胞在个体中，并且，接触包括向个体施用1-13中任一项的蛋白质。
83.82的方法，其中，引入包括全身施用。
84.82的方法，其中，引入包括局部施用。
85.84的方法，其中，所述局部施用包括肿瘤内施用。
86.81-85中任一项的方法，其中，所述个体患有癌症。
87.87的方法，其中，所述个体患有实体瘤。
实施例
如从以上提供的公开内容可以理解的，本公开具有广泛的应用。因此，提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且，以下实施例不旨在限制本发明的范围，也不表示以下实验是全部或仅进行的实验。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相似结果的各种非关键参数。已经努力确保关于所使用的数字(例如量，温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差应该被考虑。除非另有说明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，微微升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；等。
实施例1：PD-L1结合蛋白与抗原结合部分
制备对PD-L1特异的重组抗体(与人IgG的人Fc结构域融合的抗PD-L1scFV)。使用scFV噬菌体展示文库(Viva Biotechnologies)，分离了几种对PD-L1特异的scFV。两个scFV与天然PD-L1结合，命名为38A1和19H9。将38A1-scFV、19H9-scFV和FMC63-scFV(抗CD19scFV阴性对照)与人IgG1的Fc结构域融合(38A1-scFV-Fc、19H9-scFV-Fc和FMC63-scFV-Fc)。使用多位点λ噬菌体“Gateway”重组，在慢病毒和逆转录病毒质粒中构建这些质粒(例如，参见图1)。每个scFV序列的侧翼是重组位点attL1和attR5，由Geneart(Life Technologies)合成并亚克隆到pMK中。IgG1Fc序列的侧翼是重组位点attL5和attL2，由Geneart(LifeTechnologies)合成并亚克隆到pMK中。在慢病毒质粒(pLVU3pIRESeGFP；图2)或逆转录病毒质粒(pMSCVIRESeGFP；图3)中，将每种scFV与IgG1-Fc重组。重组构建体由通过attB5重组位点与IgG1-Fc融合的scFV(38A1、19H9或FMC63)的融合体组成。
为了确定38Al-scFV-Fc(SEQ ID NO：17)和19H9-scFV-Fc(SEQ ID NO：19)大抗体对PD-L1的亲和力，使用293-PD-L1进行“基于细胞的ELISA”(使用12D10-scFV-Fc，即微管相关蛋白特异性试剂，作为阴性对照)。观察到，38Al-scFV-Fc(EC50＝0.1248)的亲和力比19H9-scFV-Fc的亲和力高3.2倍(EC50＝0.4039；图5)。
用编码38Al-scFV-Fc、19H9-scFV-Fc或FMC63-scFV-Fc的慢病毒转导Jurak T细胞。将293-PD-L1与Jurkat T细胞以1：1的比例共培养16小时，其中Jurkat T细胞稳定地分泌38A1-scFV-Fc、19H9-scFV-Fc或FMC63-scFV-Fc。我们发现，38A1-scFV-Fc、19H9-scFV-Fc而非FMC63-scFV-Fc与293-PD-L1结合。与19H9-scFV-Fc相比，我们观察到38A1-scFV-Fc与293-PD-L1的结合提高了超过1.5倍(图5)。该结果与38A1-scFV-Fc相比于19H9-scFV-Fc对PD-L1的更大亲和力一致。
用编码38A1-scFV-Fc、19H9-scFV-Fc或FMC63-scFV-Fc的慢病毒转导TIL的M1034系和M1015系。在分选eGFP共报告物并在体外扩增后，收集分泌FMC63-scFV-Fc和38A1-scFV-Fc的TIL的上清液，浓缩10倍并用于染色293-PD-L1。与阴性对照大抗体(FMC63-scFV-Fc)相比，我们观察到38A1-scFV-Fc与293-PD-L1的结合提高了超过50倍(图6)。
接下来，测试了38A1-scFV-Fc和19H9-scFV-Fc阻止PD-L1阻断抑制T细胞活性的能力。为此，将12D10-scFV-Fc(微管相关蛋白特异性阴性对照)、19H9-scFV-Fc和38A1-scFV-Fc添加至Jurkat T细胞的共培养物中，所述Jurkat T细胞在活化时产生萤火虫荧光素酶，并且如上所述，CHO细胞被工程化以活化T细胞，但也通过PD-L1的过表达抑制这种活化。向Jurkat/CHO共培养物中添加的38Al-scFV-Fc和19H9-scFV-Fc而非12D10-scFV-Fc导致生物发光活性增加。在两种情况下，PD-L1的“去抑制”是剂量依赖性的。38Al-scFV-Fc诱导生物发光活性的能力比19H9-scFV-Fc的大3.6倍，这与观察到的对PD-L1的亲和力的3.2倍差异一致(图7)。
实施例2：制备表达PD-L1 scFv的TIL
制备病毒
方法步骤：
1)在含有5ml细胞培养基的10mm组织培养板中培养5x106个phoenix细胞
2)使用脂质体，用含有抗PD-1 scFV的10μg pLEV(慢病毒载体)和6μg pVSV-G转染细胞。
3)60小时后，收集上清液并用70μM过滤器过滤至15ml管中。
T细胞转导
方法步骤：
1)在12孔板的2ml TIL培养基中，用浓度为300ng/ml的抗CD3激活1x106TIL。
2)48小时后，将TIL分成两个孔，并将1ml上清液(来自病毒生产中的步骤3)与浓度为8μg/ml的聚凝胺一起加入每个孔中。
3)在32℃下，以800xg离心细胞30分钟。
4)除去含有病毒的培养基，用2ml新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，并将细胞培养24小时。
5)使用快速扩增方案(Rapid Expansion Protocol)(REP)繁殖细胞。
实施例3：19H9和38A1的表征
19H9表现出更高的分泌能力
目标：比较过表达抗PD-L1 ScFV克隆19H9与38A1的Jurkat细胞的分泌能力
总体而言，19H9表现出更高的分泌能力。图12中提供了过表达抗PD-L1 ScFV克隆19H9与38A1的Jurkat细胞的分泌能力的比较。来自过表达抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的Jurkat细胞的上清液被收集并浓缩，用于IgG ELISA测定以确定抗PD-L1 ScFV浓度。发现与38A1相比，Jurkat细胞克隆19H9具有更大的分泌能力(9.82μg/细胞相对6.75μg/细胞)。
在过表达PD-L1的Jurkat细胞中，38A1表现出更高的结合能力
目标：利用EL4 PD-L1细胞，检测抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的结合亲和力。
总体而言，在过表达PD-L1的Jurkat细胞中，38A1表现出更高的结合能力。利用EL4PD-L1细胞检测了抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的结合亲和力(图13)。将EL4 PD-L1与浓度为1、3、10、30、100和300ng/ml的抗PD-L1 ScFV克隆19H9或38A1一起孵育，并用Amcyan和山羊抗人FITC染色。将细胞用FAC缓冲液洗涤并用流式细胞仪分析。在PD-L1阳性细胞的百分比(图13A)和荧光强度平均值(MFI)(图13B)中，在过表达PD-L1的Jurkat细胞中克隆38A1均表现出更大的结合能力。
在黑色素瘤细胞中，38A1表现出更高的结合能力
目标：验证抗PD-L1 ScFV在肿瘤细胞中的结合。
总体而言，在黑素瘤肿瘤细胞中，38A1表现出更高的结合能力。图14中提供了利用EL4 PD-L1细胞的抗PD-L1 ScFV克隆19H9和38A1的结合亲和力比较。将EL4 PD-L1与浓度为1、3、10、30、100和300ng/ml的抗PD-L1 ScFV克隆19H9或38A1一起孵育，并用Amcyan和山羊抗人FITC染色。将细胞用FAC缓冲液洗涤并用流式细胞仪分析。在PD-L1阳性细胞百分比(图14A)和荧光强度平均值(MFI)(图14B)中，在过表达PD-L1的Jurkat细胞中克隆38A1都表现出更高的结合能力。为了验证抗PD-L1 ScFV在肿瘤细胞中的结合，用IFN-γ(100ng/ml)处理三种黑素瘤肿瘤细胞以增强PD-L1表达。三天后，用细胞解离缓冲液收获细胞，与浓度为100ng/ml的抗PD-L1 ScFV克隆19H9或38A1一起孵育，并用山羊抗人FITC染色。将细胞用FAC缓冲液洗涤并用流式细胞仪分析。我们发现，在PD-L1阳性细胞百分比和MFI中，克隆38A1都表现出更大的结合亲和力。总之，与克隆19H9相比，克隆38A1具有更高的结合亲和力，但分泌能力略低。
38A1具有更高的生物学功能
目标：进一步表征两个抗PD-L1 ScFV克隆(19H9和38A1)的生物学功能。
总体而言，38A1表现出比19H9更高的生物学功能。为了进一步确定抗PD-L1 ScFV的两个克隆(19H9和38A1)的生物学功能，进行PD-L1阻断实验，该实验可用于确定抗PD-1或PD-L1抗体阻断PD-1和PD-L1参与相互作用的效力(图15)。该实验由两种基因工程细胞系组成：PD-1效应细胞(稳定表达人PD-1和NFAT诱导的荧光素酶的Jurkat T细胞)和PD-L1aAPC/CHO-K1细胞(稳定表达人PD-L1、具有活化同源TCR的细胞表面蛋白)。当这两种细胞类型共培养时，PD-1和PD-L1的相互作用抑制TCR信号传导并降低荧光素酶活性。添加抗-PD-1或PD-L1阻断抗体有助于释放被抑制的信号，导致TCR信号传导和NFAT介导的荧光素酶活性增强。与抗-PD1相比，当用抗-PD-L1阻断时，发现荧光素酶信号(RLU)更大，表明在这种情况下阻断PD-L1似乎比阻断PD-1更有效(图15A)。预期地，先前显示具有更高结合亲和力的抗PD-L1ScFV克隆38A1由于在纯化的ScFV(P)和未纯化的(NP)设置中荧光素酶信号都显著增加而提供了更高的生物学功能(图15B)。
前述仅阐述了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够想出各种安排，这些安排虽然未在本文中明确描述或示出，但体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文所述的所有实施例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理，本发明不限于这些具体叙述的实施例和条件。此外，这里叙述本发明的原理、方面和实施方式以及其具体实施例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，这些等同物旨在包括当前已知的等同物和将来发展的等同物，即，发展的表现相同功能的任何元件，而无论结构如何。因此，本发明的范围不旨在限于这里示出和描述的示例实施方式。相对地，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。
提供上述实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物、体系和方法的实施方案的完整公开和描述，并且不旨在限制发明所涵盖的范围。对于本领域技术人员显而易见的是，用于实施本发明的上述模式的变型旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献均以引用方式并入，其程度如同每篇参考文献已单独地通过引用整体并入。
所有标题和部分的名称仅用于清楚和参考目的，不应以任何方式视为限制。例如，本领域技术人员将理解，根据本文所述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和部分的各个方面的有用性。
本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体和单独地指出为了所有目的通过引用整体并入。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。这里描述的具体实施方式和实施例仅作为示例提供，并且本申请仅受所附权利要求项以及权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。

Claims (87)

1.一种蛋白质，其特异性结合PD-L1并包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽；或
(b)包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽，
所述第一多肽和/或所述第二多肽的3个CDR氨基酸序列各自对于指定的SEQ ID编号包含两个以下保守氨基酸替换。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO：6-8中所示的3个CDR氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16中所示的3个CDR氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白质，其中，所述第一多肽是轻链，所述第二多肽是重链。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是单链抗体(scFv)，并且所述第一多肽和所述第二多肽直接彼此融合或通过接头彼此融合。
8.根据权利要求7所述的蛋白质，其中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是包含免疫球蛋白Fc结构域的大抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过接头与抗原结合部分融合。
10.根据权利要求9所述的蛋白质，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域。
11.根据权利要求10所述的蛋白质，其中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求9所述的蛋白质，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域。
13.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是人源化抗体。
14.一种核酸，其包含编码权利要求1-13中任一项所述的蛋白质的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的核酸，其中，所述核酸包含与编码所述蛋白质的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中，所述启动子是组成型启动子。
17.根据权利要求15所述的核酸，其中，所述启动子是诱导型启动子。
18.一种细胞，其包含权利要求14-17中任一项所述的核酸。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中，所述核酸整合到细胞的基因组中。
20.根据权利要求18或19所述的细胞，其中，所述细胞是经基因修饰以表达和分泌所述蛋白质的细胞毒性淋巴细胞。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
23.根据权利要求21所述的细胞，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
24.根据权利要求21所述的细胞，其中，所述T细胞来源于外周血。
25.根据权利要求20所述的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中，所述NK来源于外周血。
27.根据权利要求20所述的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是源自受试者的肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
28.根据权利要求27所述的细胞，其中，所述TIL包含对源自肿瘤的抗原有特异性的受体。
29.根据权利要求20-28中任一项所述的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中，所述一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
31.根据权利要求29或30所述的细胞，其中，所述细胞毒性淋巴细胞包含对肿瘤相关的抗原有特异性的T细胞受体。
32.一种方法，包括：
通过向细胞毒性淋巴细胞中引入权利要求14-17中任一项所述的核酸，对从受试者肿瘤中分离的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质；
扩增所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，以产生基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群；以及，
将基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群施用于受试者以治疗肿瘤。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述核酸整合到细胞毒性淋巴细胞的基因组中。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
39.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
40.根据权利要求32-39中任一项所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对源自肿瘤的抗原有特异性的受体。
41.根据权利要求32-40中任一项所述的方法，所述方法包括在基因修饰之前从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞。
42.根据权利要求32-41中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质特异性结合PD-L1并且包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：2-4所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：6-8所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽；或
(b)包含SEQ ID NO：10-12所示的3个CDR氨基酸序列的第一多肽，和包含SEQ ID NO：14-16所示的3个CDR氨基酸序列的第二多肽，
第一多肽和/或第二多肽的3个CDR氨基酸序列各自对于指定的SEQ ID编号包含两个以下保守氨基酸替换。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：2-4中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO：6-8中所示的3个CDR氨基酸序列。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。
45.根据权利要求42所述的方法，其中，所述抗原结合部分包含：第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO：10-12中所示的3个CDR氨基酸序列；以及第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO：14-16中所示的3个CDR氨基酸序列。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中，所述第一多肽是轻链，所述第二多肽是重链。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是单链抗体(scFv)，并且所述第一多肽和所述第二多肽直接彼此融合或通过接头彼此融合。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，scFv包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是包含免疫球蛋白Fc结构域的大抗体，所述免疫球蛋白Fc结构域直接或通过接头与抗原结合部分融合。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG1Fc结构域。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
53.一种制备基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的方法，所述方法包括：
通过向细胞毒性淋巴细胞中引入权利要求14-17中任一项所述的核酸，对从患有或怀疑患有癌症的受试者中分离的细胞毒性淋巴细胞进行基因修饰，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞表达和分泌特异性结合PD-L1的蛋白质。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
55.根据权利要求53所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达特异性结合PD-L1的蛋白质。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，所述方法包括在体外扩增细胞毒性淋巴细胞，以提供扩增的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞群。
57.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，所述方法包括在基因修饰之前从受试者中分离细胞毒性淋巴细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述分离包括从受试者的肿瘤中分离细胞毒性淋巴细胞。
59.根据权利要求57中任一项所述的方法，其中，所述分离包括从受试者的外周血中分离细胞毒性淋巴细胞。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
62.根据权利要求60所述的方法，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
63.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
64.根据权利要求53-63中任一项所述的方法，其中，所述核酸整合到细胞毒性淋巴细胞的基因组中。
65.根据权利要求53-64中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对来自受试者肿瘤的抗原具有特异性的T细胞受体。
68.一种治疗患有或怀疑患有癌症的个体的方法，所述方法包括：
将权利要求1-13中任一项所述的特异性结合PD-L1的蛋白质施用于个体。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述施用包括向受试者引入编码所述蛋白质的核酸。
70.根据权利要求68所述的方法，其中，所述施用包括向受试者引入表达和分泌所述蛋白质的基因修饰的细胞毒性淋巴细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组成型表达所述蛋白质。
72.根据权利要求71所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞诱导型表达所述蛋白质。
73.根据权利要求72所述的方法，所述方法包括诱导所述蛋白质的表达。
74.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是T细胞。
75.根据权利要求74所述的方法，其中，所述T细胞是CD8+T细胞。
76.根据权利要求74所述的方法，其中，所述T细胞是CD4+T辅助细胞。
77.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞是天然杀伤(NK)细胞。
78.根据权利要求70-77中任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性淋巴细胞表现出一种以上与幼稚T细胞相关的活化抗原的表达水平的增加。
79.根据权利要求78所述的方法，其中，所述一种以上活化抗原选自CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40L、CD69、CD134、CD137、BTLA、PD-1、HVEM、LIGHT和HLA-DR。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中，所述基因修饰的细胞毒性淋巴细胞包含对来自受试者肿瘤的抗原具有特异性的T细胞受体。
81.一种降低第一种细胞上的PD-L1与第二种细胞上的PD-1之间相互作用的方法，所述方法包括：
使第一种细胞上的PD-L1与权利要求1-13中任一项所述的蛋白质接触。
82.根据权利要求81所述的方法，其中，第一细胞和第二细胞在个体中，并且，接触包括向个体施用权利要求1-13中任一项所述的蛋白质。
83.根据权利要求82所述的方法，其中，引入包括全身施用。
84.根据权利要求82所述的方法，其中，引入包括局部施用。
85.根据权利要求84所述的方法，其中，所述局部施用包括肿瘤内施用。
86.根据权利要求81-85中任一项所述的方法，其中，所述个体患有癌症。
87.根据权利要求87所述的方法，其中，所述个体患有实体瘤。
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ELOAH RABELLO SUAREZ ET AL: "Chimeric antigen receptor T cells secreting anti-PD-L1 antibodies more effectively regress renal cell carcinoma in a humanized mouse model", 《ONCOTARGET》 *

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