CN109790208A - 制备包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过固相肽合成制备赖氨酸侧链修饰的肽的方法。

Description

制备包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的肽的方法
技术领域
本发明涉及通过固相肽合成制备赖氨酸侧链修饰的肽的方法。
背景技术
感兴趣的化合物是包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的毒蜥外泌肽-4衍生物。毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO.3)是由吉拉毒蜥(Gila monster)(钝尾毒蜥(Heloderma suspectum))的唾液腺产生的39个氨基酸的肽(Eng,J.等,J.Biol.Chem.,267:7402-05,1992)。毒蜥外泌肽-4是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体的活化剂，而它不显著活化胰高血糖素受体。用脂肪酸酰化残基，特别是在第14位中的修饰(如例如WO2013/186240、WO2014/056872、WO2014/096145、WO2014/096148、WO2014/096149、WO2014/096150、WO2015/155139、WO2015/155140和WO2015/155141中所述)产生毒蜥外泌肽-4衍生物，所述毒蜥外泌肽-4衍生物在与相应的非酰化毒蜥外泌肽-4衍生物相比时不仅在GLP-1受体处具有高活性，而且在胰高血糖素受体处也具有高活性。
利拉鲁肽(Liraglutide)(SEQ ID NO.:4)是一种市售的化学修饰的GLP-1类似物，其中除了别的修饰以外，将脂肪酸与第20位的赖氨酸连接，从而导致延长的作用持续时间(Drucker DJ等,Nature Drug Disc.Rev.9,267-268,2010；Buse,J.B.等,Lancet,374:39-47,2009)。
EP 2 460 825A1公开了携带C端赖氨酸残基的GLP-1类似物，其通过式R1-(CH2)n-CO-的亲脂性取代基修饰，其中R1是甲基或羧基，并且n是8-25的整数。与本发明形成对比，如下合成EP 2 460 825A1的肽，从C-端赖氨酸开始，所述C-端赖氨酸在第一步中经亲脂性修饰；在添加亲脂性取代基后，经由SPPS添加期望的肽的剩余的氨基酸。此外，通过在用500ml二甲基甲酰胺(DMF)将干燥的残基膨胀30分钟后与1％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)温育一次来除去Mtt(4-甲基三苯甲基)赖氨酸保护基(参见实施例)。必须注意，剩余的DMF对1％TFA/DCM具有中和作用，因此使Mtt基团的切割变得不完全。
WO 2008/023050 A1涉及多种酰化的毒蜥外泌肽-4化合物。在此文件的实施例部分中，描述了要求保护的化合物的合成。根据WO 2008/023050 A1，使用2％TFA和2-3％三异丙基硅烷(TIS)的DCM溶液除去单甲氧基三苯甲基(Mmt)或Mtt保护，所述溶液比根据本发明使用的TFA的DCM溶液更复杂。此外，WO 2008/023050 A1就氨基酸序列的装配完成后树脂的预干燥而言是无记载的。
类似地，WO 2011/104378 A1(其涉及肽黑皮质素受体调节物)和WO 2013/167454A1(其涉及就野生型GLP-1(7-37)而言在26(K26)和37(K37)位的赖氨酸处酰化的双重酰化GLP-1衍生物)就氨基酸序列的装配后树脂的预干燥步骤而言是无记载的，并且未能公开或甚至提示如本申请要求保护的、用于除去Mmt-/Mtt-保护基团的切割溶液。在这两篇申请中，切割溶液是更复杂的。
WO 2015/155141 A1(其通过提述并入本文)涉及源自毒蜥外泌肽-4的肽双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂，其含有酰化赖氨酸。再一次，此文件没有公开或提示树脂的预干燥或在肽和亲脂部分之间的接头部分偶联之前中和树脂结合肽。
制备肽的优选方式是在合适的树脂上的固相合成，所述肽可含有非天然的氨基酸和(例如)赖氨酸的ε-氨基基团或鸟氨酸的δ-氨基基团或2,4-二氨基丁酸的γ-氨基基团或2,3-二氨基丙酸的β-氨基基团的侧链修饰。固相肽合成(SPPS)是用于肽的合成通路的得到证明的方法(Stewart和Young,Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Co.,Rockford,III.,1984中给出了实例)。
肽的固相合成一般以N端保护的氨基酸衍生物至携带固体支持物的接头开始。固体支持物可为与SPPS中使用的溶剂兼容并且允许氨基酸衍生物与其羧基基团偶联到树脂(例如当期望肽酸时的三苯甲基树脂、氯三苯甲基树脂、Wang树脂，或当必须通过使用Fmoc策略获得肽酰胺时的Rink树脂、Sieber树脂)上的任何聚合物。必须在用于肽合成期间的α-氨基基团的脱保护的条件下给予聚合物支持物的稳定性。
在已经将第一个N端保护的氨基酸偶联到接头-树脂构建体后，用碱(如用哌啶/二甲基甲酰胺混合物)切割N端保护基团(Fmoc-策略)。使用偶联试剂(如例如BOP(苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)-鏻鎓六氟磷酸盐)、HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐))以及叔碱(如DIPEA(二异丙基乙胺)或NMM(N-甲基吗啉))或可替换地用DIC(N,N′-二异丙基碳二亚胺)/HOBt水合物(1-羟基苯并三唑)使释放的氨基基团与Fmoc保护的氨基酸衍生物反应。将此过程重复直到获得期望的氨基酸序列。
通常用合适的保护基团封闭氨基酸衍生物的反应性侧链功能，所述保护基团在用于固相肽合成的条件下是稳定的。它们在固相上装配了肽之后与在相同条件下从树脂中切割期望的产物同时被除去。保护基团及其引入的步骤可参见Greene和Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,第3版,Wiley&Sons,New York,1999或Kocienski,Protecting Groups,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,New York,1994。
也有在SPPS中选择性除去侧链保护基团以修饰它们的可能性。用于除去此类保护基团的条件必须使得所有其它保护基团保持完整。可以用对肼的DMF溶液不稳定的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)-3-甲基-丁基(ivDde)或1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)-乙基(Dde)基团保护赖氨酸(参见Chhabra等,Tetrahedron Lett.39,1603,1998)。一旦N端保护基团以及所有侧链保护基团具有酸不稳定性保护基团，便可用肼的DMF溶液切割ivDde或Dde保护基团。此后可用(例如)其它Fmoc氨基酸或脂肪酸修饰从赖氨酸侧链释放的氨基基团。相同的方案可适用于鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸或2,3-二氨基丙酸。
最后，肽可通过使用含有三氟乙酸的混合物，例如King氏混合物(King等,Int.J.Peptide Protein Res.36,255-266,1990)与所有侧链保护基团同时从树脂中被切割，所述King氏混合物包含三氟乙酸(TFA)、酚、水、苯甲硫醚和1,2-乙二硫醇(EDT)。在某个反应时间后，将树脂过滤掉，并且在醚(例如二乙醚、甲基叔丁醚或二异丙基醚)中沉淀粗制肽。通过离心将沉淀物过滤掉或与溶液分开。
如果需要，可通过C18-柱上的制备型色谱纯化粗制肽。对于纯化，可能需要几次运行来给出>90％或甚至更多的纯度。最终运行通常会是成盐运行，其中会确定期望的抗衡离子，例如乙酸根。通过HPLC分析级分，并且根据定义的标准合并。例如，可通过蒸馏、冻干、喷雾干燥或其组合除去溶剂。最后获得纯化的肽。
发明内容
本文中提供了用于赖氨酸侧链修饰肽的固相合成的新方法。特别地，这些肽是毒蜥外泌肽-4衍生物，其中至少一个氨基酸，特别是第14位的甲硫氨酸替换为赖氨酸，该赖氨酸进一步取代为非极性亲脂性残基(例如任选与接头组合的脂肪酸)。
令人惊讶地发现，通过遵循特定的步骤顺序，可大大降低非期望的副产物的量，从而导致较高纯度的期望产物的产率增加。
因而，本发明涉及制备包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的分离的肽的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的所述肽的氨基酸序列，其中通过基于三苯甲基的保护基团，特别是单甲氧基三苯甲基(Mmt)或4-甲基三苯甲基(Mtt)保护要修饰的赖氨酸的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后干燥固相树脂；
(iii)用三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理几次以使要修饰的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)中和所述树脂；
(v)将至少一个活化的9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)结合的接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)使步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的末端官能团脱保护；
(vii)将活化的亲脂性部分(特别是活化的脂肪酸)与步骤(vi)中的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；和
(ix)从所述树脂中切割所述肽。
在某些实施方案中，分离的肽是具有30-44个，特别是38-40个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中优选地(i)在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％，和/或(ii)在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％，和/或(iii)所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链处于就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸而言的第14位(Lys(14))。在某些优选的实施方案中，分离的毒蜥外泌肽-4衍生物具有氨基酸序列H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2(SEQ ID NO.:1)。
在一些实施方案中，调节步骤(iii)中TFA/DCM处理的数目，使得步骤(ix)中的修饰的赖氨酸侧链的产率是至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％。产率以与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比的百分比给出(即，85％产率意指85％的肽具有修饰的赖氨酸侧链并且15％肽仍然具有未修饰的赖氨酸侧链)。
例如，在步骤(iii)中，可用约1％(v/v)TFA的DCM溶液将干燥的树脂处理至少7次达至少5分钟，特别是9次达至少10分钟或9次达至少15分钟。可使用直至约1.5％(v/v)的TFA。然而，2％(v/v)TFA及更高的浓度是不利的，因为然后降低切割的选择性；特别地，含有≥2％(v/v)TFA的溶液不仅切割感兴趣的赖氨酸侧链处的(例如)单甲氧基三苯甲基保护基团，而且还切割其它氨基酸残基处的(例如)Boc保护基团。这可在操纵的后续步骤中引起非期望的多次酰化。
在具体的实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；和
(viii-b)任选地重复步骤(iii)至(viii-a)，直至与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比，含有所述修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量是至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％。
在某些实施方案中，分析脱保护产率可包括：
(viii-a1)从总反应批次取出树脂的测试样品，并在与步骤(ix)中相同的条件下并且用相同的切割混合物从测试样品切割肽；和
(viii-a2)测定与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量，特别是通过高压液相色谱(HPLC)或HPLC和质谱(LC-MS)的组合进行。
在某些实施方案中，用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇的切割混合物进行步骤(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
在某些实施方案中，切割混合物进一步包含合适的吲哚化合物，特别是3-甲基吲哚。
在一些实施方案中，特别地，切割混合物由91-93％(v/v)三氟乙酸、1-6％(v/v)酚和1-8％(v/v)乙二硫醇构成。在其它实施方案中，切割混合物由96-98％(v/v)三氟乙酸和2-4％(v/v)乙二硫醇构成。
在又一些实施方案中，用包含至少80％(w/w)三氟乙酸和至少1％(w/w)1,2-乙二硫醇的切割混合物进行步骤(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
在某些实施方案中，切割混合物由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚构成。
例如，可在5-15℃、15-22℃和/或22-30℃，特别是在25℃进行步骤(ix)的切割。树脂上每克肽的切割混合物的体积可(例如)为9.5ml-5.5ml，特别是7.0ml-6.0ml。例如，可在搅拌的情况下将步骤(ix)的切割进行2-3小时，特别是在25℃进行2-3小时或2.0-2.5小时或在30℃进行1-1.5小时。
在某些实施方案中，在用脂肪族醇将树脂上的肽清洗至少一次并且用二烷基醚清洗至少一次后，可在室温在惰性气体(例如氮气)下进行步骤(ii)中的树脂干燥。
例如，步骤(iv)中的中和可通过如下进行：与1％-5％叔烷基胺于有机极性非质子溶剂中的溶液(例如二异丙基乙胺(DIPEA)的二氯甲烷溶液或N-甲基吗啉(NMM)的二氯甲烷溶液或三乙胺的二氯甲烷溶液)温育至少一次，达至少10分钟，任选地接着在中和步骤后确定溶剂混合物的pH，并且用所述溶剂将树脂上的肽清洗至少一次并且用另外的极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF))清洗至少一次。
在某些实施方案中，步骤(vi)中的脱保护可通过如下进行：用碱将树脂上的肽处理至少一次达至少5分钟，接着是至少一个清洗步骤。
在某些实施方案中，步骤(viii)中的树脂干燥可在清洗树脂上的肽后在真空下(特别是在≤70毫巴的真空下)进行。
根据一些实施方案，要求保护的方法进一步包括以下步骤：
(x)在切割后过滤肽溶液；
(xi)在真空下蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到包含二烷基醚和庚烷的抗溶剂中；
(xiii)搅拌沉淀的溶液；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)清洗沉淀物；和
(xvi)干燥湿的肽。
在步骤(x)后，在一些实施方案中，可用合适的漂洗溶液(例如TFA)将树脂滤饼漂洗至少一次，例如3次。
在步骤(xi)中，可(例如)通过在≤50毫巴的真空在≤30℃的温度进行蒸馏。
此外，在一些实施方案中，步骤(xii)中使用的抗溶剂可为由二异丙醚(DIPE)和正庚烷构成的混合物，特别是25:75(v/v)-35:65(v/v)比率的DIPE和正庚烷的混合物。
在步骤(xiii)中，例如，可在10-15℃将沉淀的溶液搅拌1-20小时。
在步骤(xv)中，在用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)漂洗后，可通过在合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)中重悬沉淀物，将所得的悬浮液搅拌(例如)30-60分钟，并且过滤掉有机溶剂而将滤器上的沉淀物清洗至少一次。根据一些实施方案，可用乙酸乙酯将此步骤重复1-5次，特别是2-4次，更特别是3-5次。
在一些实施方案中，在步骤(xvi)中在真空下(例如)在20-25℃，特别是在20-25℃在≤70毫巴的真空下和氮气剥离下干燥湿的肽。
在一些实施方案中，要求保护的方法包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的SEQ ID NO.:1的肽的氨基酸序列，其中通过单甲氧基三苯甲基(Mmt)保护赖氨酸14的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后在室温将固相树脂干燥至少5小时；
(iii)用1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理9次，每次10分钟，以使第14位处的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)用3％二异丙基乙胺(DIPEA)的DCM溶液中和所述树脂，直至所述溶液的pH保持于≥8；
(v)在碱性条件下将活化的Fmoc-Glu-OtBu接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)用20％哌啶/DMF切割步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的Fmoc基团；
(vii)将活化的棕榈酸与步骤(vi)的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；
(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量为至少85％；和
(ix)使用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇的切割混合物在25℃从所述树脂切割所述肽，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
在一些实施方案中，要求保护的方法包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的SEQ ID NO.:1的肽的氨基酸序列，其中通过单甲氧基三苯甲基(Mmt)保护赖氨酸14的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后在室温将固相树脂干燥至少5小时；
(iii)用中1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理9次，每次10分钟，以使第14位处的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)用3％二异丙基乙胺(DIPEA)的DCM溶液中和所述树脂，直至所述溶液的pH保持于≥8；
(v)在碱性条件下将活化的Fmoc-Glu-OtBu接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)用20％(v/v)哌啶/DMF切割步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的Fmoc基团；
(vii)将活化的棕榈酸与步骤(vi)的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；
(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量为至少85％；
(ix)使用由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-甲基吲哚构成的切割混合物从所述树脂切割所述肽；
(x)切割后在室温过滤肽溶液；
(xi)在真空下在≤30℃蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到抗溶剂中，所述抗溶剂由25:75(v/v)-35:65(v/v)比率的DIPE和正庚烷构成；
(xiii)在10-15℃将沉淀的溶液搅拌1-18小时；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)通过(xv-a)在乙酸乙酯中重悬沉淀物，(xv-b)将所得的悬浮液搅拌30-60分钟，和(xv-c)过滤掉乙酸乙酯，将所述沉淀物清洗4-5次；和
(xvi)在真空下干燥湿的肽。
具体实施方式
制备包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的分离的肽的上述发明方法包括至少9个步骤。
第一步(步骤(i))涉及经由固相肽合成(SPPS)合成感兴趣的肽。如上文提及，SPPS包括以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的肽的氨基酸序列。所述肽含有至少一个赖氨酸，所述赖氨酸的侧链要被修饰。通过基于三苯甲基的保护基保护此至少一个(例如1、2或3个)赖氨酸残基的侧链。在具体的实施方案中，所述肽仅含有一个修饰的赖氨酸侧链。本申请内具体使用的基于三苯甲基的保护基团是单甲氧基三苯甲基(Mmt)和4-甲基三苯甲基(Mtt)。在某些优选的实施方案中，仅使用Mmt作为要修饰的赖氨酸残基的基于三苯甲基的保护基团。
对于根据本申请的SPPS，特别地可以使用不同Rink-酰胺树脂，例如4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰氨基甲基树脂或4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧基乙酰氨基甲基树脂。加载的范围可为0.1-1mmol/g，特别是0.2-0.9mmol/g。在某些实施方案中，加载范围为0.25-0.6mmol/g。在其它实施方案中，加载范围为0.2-0.4mmol/g。虽然一般可以使用任何合成策略SPPS，但是在本发明的上下文中，优选9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)策略，其能够使用较温和的脱保护条件。使用合适的碱，例如哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，特别为20-50％的浓度来脱保护(即从Rink酰胺的受保护的氨基基团或在后来的阶段中从相应的氨基酸的α-氨基基团除去Fmoc基团)。根据标准条件，使用例如DMF中的1-羟基苯并三唑(HOBt)水合物和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)作为偶联试剂分别进行每个氨基酸与树脂或先前的氨基酸的偶联。每个氨基酸的偶联时间可变化，并且一般在2-22小时的范围内。
用于SPPS并且其侧链应当被修饰的Fmoc-赖氨酸衍生物特别是Fmoc-Lys(Mmt)-OH或Fmoc-Lys(Mtt)-OH。
优选地，通过叔丁基氧基羰基(Boc)基团保护N端氨基酸的α-氨基基团。在添加期望的肽的N端氨基酸后，清洗树脂上的肽。在进一步进行前实施至少1个且多至10个清洗步骤，特别是4、5、6、7或8个清洗步骤，更特别是6个清洗步骤。合适的清洗流体包含脂肪族醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇(IPA)，和/或二烷基醚，例如二乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙醚(DIPE)或二异丁醚。在某些实施方案中，用IPA和DIPE进行清洗。特别地，首先用IPA将树脂上的肽清洗至少一次，随后用DIPE清洗至少一次。在某些优选的实施方案中，首先用IPA将树脂上的肽清洗三次，随后用DIPE清洗三次。
在清洗后，将具有肽的固相树脂干燥(步骤(ii))。可以在惰性气体气氛(例如氮气)下，特别是在连续的氮气流(氮气剥离)下进行干燥。合适地，将干燥步骤(ii)进行至少1小时，特别是至少5小时、至少10小时、至少16小时且多至20小时(例如过夜)。在一些实施方案中，也可以将干燥步骤进行超过20小时。特别地，在室温(18-24℃)进行干燥。根据现有技术，不应在从树脂中切割Mmt或Mtt基团前干燥树脂上的肽。一般认为在整个合成过程中树脂应当被充分膨胀以确保肽的N端(在此情况下为赖氨酸的ε-氨基基团)的良好可及性。在根据本发明的方法的步骤(ii)的干燥期间，树脂显著地收缩，并且尚不能预见所有潜在的反应性位点仍然可自由接近以进行进一步的步骤。此外，技术人员会担心其他的缺点，因为额外的干燥步骤增加合成的持续时间，并且需要较高量的溶剂，从而增加了方法的成本。然而，令人惊讶地，发现此中间干燥步骤是有利的，并且胜过目前预期的缺陷。例如，预干燥步骤对于基于三苯甲基的赖氨酸保护基团的更完全除去是有益的。
然后，可用三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥且收缩的树脂直接处理几次，以使要修饰的赖氨酸侧链脱保护(步骤(iii))，或者可以在TFA/DCM处理前用(例如)二氯甲烷对其清洗。重要的是要注意到在应用TFA/DCM前不需要使收缩的树脂膨胀。发明人发现在合成最终肽的此阶段，存在提升效应，即当增加合成的摩尔规模时，未具有预期的赖氨酸修饰的非期望的副产物的量增加到高于平均值。令人惊讶地，此提升效应的负面影响可随步骤(iii)的重复数目而减轻。因而，在本发明的某些优选的实施方案中，用TFA的DCM溶液将树脂结合肽处理至少5次，特别是7、8、9或10次。每次处理的时间是至少5分钟，特别是至少10分钟。DCM中的TFA浓度是0.5-1.5％(v/v)，特别是约1％(v/v)，更特别是1％(v/v)。选择这些浓度具有某些有利效应，特别是对于合成含有超过一个赖氨酸残基的肽。凭借DCM中较高浓度的TFA，例如2％TFA，不仅切割Mmt或Mtt保护基团，而且还部分切割用于赖氨酸的其它保护基团，例如Boc，尤其是当进行几次(例如6-12次)重复时，由此引起肽链中的不同赖氨酸的非期望的多次酰化。这可通过将TFA浓度保持于0.5-1.5％(v/v)来避免。
在本发明的上下文中，“树脂结合肽”指与根据本发明的肽共价结合的适合于固相肽合成的树脂。
在某些优选的实施方案中，用约1％(v/v)TFA的DCM溶液将树脂结合肽处理至少7次达至少5分钟，特别是9次达至少10分钟或9次达至少15分钟。根据一个实施方案，用1％(v/v)TFA的DCM溶液进行处理9次达10分钟。
特别地，可根据合成规模选择用TFA的DCM溶液处理步骤的数目。例如，对于多至10mmol的规模，用约1％(v/v)TFA的DCM溶液的5次处理是足够的。对于≥50mmol的规模，可进行至少5次处理。对于≥100mmol的规模，可进行至少7次处理。对于≥500mmol的规模，可进行至少9次处理。举例而言，对于800mmol的规模，可用1％(v/v)TFA的DCM溶液进行9次处理达10分钟。
考虑到DCM的低沸点，将处理步骤期间的温度设置在此点以下。有利地，处理开始于冷却到约0℃，例如0-5℃的树脂结合肽。在TFA/DCM处理期间，温度可上升到25℃。在示例性的实施方案中，在0-5℃的温度范围进行第一处理步骤，在5-15℃的温度范围进行随后的处理步骤，并且在15-25℃的温度进行最终的处理步骤。例如，当用TFA/DCM进行9次处理时，可在0-5℃进行其中三次，在5-15℃进行三次，并且在15-25℃进行三次。
一旦完成了TFA/DCM处理，便可(例如)用DCM清洗树脂结合肽。随后，中和树脂结合肽(步骤(iv))。一旦达到pH≥7，特别是≥7.5，更特别是≥8.0，认为树脂结合肽被充分中和。
通过树脂结合肽与1％-5％叔烷基胺于有机极性非质子溶剂中的溶液的至少一次温育实现中和。用于本申请的合适的中和溶液是二异丙基乙胺(DIPEA)的二氯甲烷溶液或N-甲基吗啉(NMM)的二氯甲烷溶液或三乙胺的二氯甲烷溶液。特别地，可使用2％-4％，更特别是3％(v/v)DIPEA的DCM溶液。
将中和进行至少一次，特别是达至少10分钟，任选地接着在中和步骤后测定溶剂混合物的pH。令人惊讶地发现，中和是后续偶联反应(特别对于较大的规模)中的良好产率需要的。还令人惊讶地发现，在中和溶液中的一次温育的情况下，树脂中存在的残留的TFA通常未被充分中和。因此，若在第一次温育后的溶剂混合物的pH过酸，则再进行与中和溶液的至少一次温育。在某些实施方案中，进行树脂结合肽与中和溶液(例如与3％DIPEA的DCM溶液)的超过两次温育，例如3次温育，特别是5次温育。在一些实施方案中，进行与中和溶液(例如3％DIPEA的DCM溶液)的6次温育。
在示例性的实施方案中，在0-25℃的温度范围进行中和。可以将温度维持于特定的窄范围或者逐渐升高温度。例如，当进行超过一次中和步骤时，可在0-5℃的温度进行第一次中和，而在5-15℃或甚至15-25℃进行后续中和温育。
在中和后，以用于中和的有机极性非质子溶剂(不含碱)将树脂上的肽清洗至少一次，并且用另外的极性非质子溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)清洗至少一次。特别地，当后续偶联涉及使用HBTU和DIPEA时，使用DMF。特别地，将用另外的溶剂的清洗进行超过一次，例如3次。
在感兴趣的肽的接着的合成步骤中，根据标准操作将至少一个9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)结合的接头部分活化，并且与脱保护的赖氨酸侧链偶联(步骤(v))。
根据本发明的“接头部分”一般是具有官能团的线性短链分子，所述官能团适合于在一个末端结合脱保护的赖氨酸的游离的氨基侧链基团并且在另一末端结合亲脂部分的游离官能团(例如脂肪酸的羧基基团)。特别地，接头部分是含有末端官能团(即在每个末端的一个官能团)的C1-C10烷基链，所述末端官能团独立选自氨基和羧基，其中烷基链中的1、2或3个碳原子可以替换为氧。根据本发明的“接头部分”的非限制性实例是天然存在的和非天然存在的氨基酸，特别是所有立体异构形式的β-丙氨酸(β-Ala)、γ-谷氨酸(γE)、γ-氨基丁酸(GABA)、氨基-乙氧基-乙氧基乙酸(AEEAc)和ε-氨基己酸(EACA)。
赖氨酸侧链和亲脂基团之间的完整接头可由一个或多个此类接头部分构成，特别是1、2或3个相同或不同的接头部分。在某些实施方案中，完整的接头由独立选自以下的1、2或3个接头部分构成：β-Ala、γE、GABA、AEEAc和EACA。完整接头的具体实例是β-Ala、γE、GABA、AEEAc、EACA、β-Ala-β-Ala、γE-γE、γE-γE-γE、AEEAc-AEEAc-γE和AEEAc-AEEAc-AEEAc。在某些优选的实施方案中，接头是γE。
通过Fmoc保护要与亲脂部分偶联的接头的官能团(即不与赖氨酸侧链偶联的末端官能团)。在某些实施方案中，Fmoc结合的接头部分是Fmoc-Glu-OtBu。在一个示例性的实施方案中，用3当量的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HBTU)和6当量的DIPEA/DMF或O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)和6当量的DIPEA/DMF活化Fmoc-Glu-OtBu。
将偶联混合物添加到具有脱保护的赖氨酸侧链的树脂中，并且温育足够的时间量，例如3-4小时。特别地，在搅拌(例如30-100rpm)的情况下进行温育。在完成偶联后，从树脂除去偶联混合物，并且以用于偶联的溶剂(例如DMF)清洗树脂结合肽。若完整的接头由超过一个接头部分构成，则在第一接头部分的脱保护后重复偶联。
在后续步骤(vi)中，将步骤(v)中与赖氨酸侧链偶联的接头的末端官能团脱保护。用于Fmoc的脱保护条件一般是技术人员已知的。在某些实施方案中，步骤(vi)中的脱保护可通过如下进行：用碱将树脂上的肽处理至少一次达至少5分钟，接着是至少一次清洗步骤。在本发明的具体的实施方案中，可通过用合适的浓度的哌啶(例如20％哌啶/DMF)的至少一次处理进行Fmoc脱保护。特别地，在两个温育步骤(例如5和20分钟)使用20％哌啶/DMF进行脱保护。在完成脱保护后，在进一步进行前用溶剂将树脂结合肽清洗至少一次。
接着，活化亲脂部分以准备将其与脱保护的接头的偶联，例如通过与羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)和二异丙基碳二亚胺(DIC)的温育。在某些实施方案中，通过将要使用的亲脂部分与等当量的HOBt水合物和DIC在DMF中温育(例如)10分钟来完成活化。
根据本发明的合适的“亲脂部分”特别是脂肪酸。在脂肪酸中，特别是棕榈酸、硬脂酸和肉豆蔻酸可有利地用于本发明中。在具体的实施方案中，选择棕榈酸作为亲脂部分。在某些优选的实施方案中，经由γE将棕榈酸与树脂结合肽的Lys(14)偶联。
然后，将预活化的亲脂部分(特别是预活化的脂肪酸)添加到树脂结合肽中。活化的亲脂部分与接头的脱保护的末端官能团的偶联，即根据本发明的方法的步骤(vii)进行至少2小时，特别是4-22小时。在具体的实施方案中，将活化的脂肪酸(例如棕榈酸)添加到具有作为接头的末端官能团的脱保护的氨基基团的树脂结合肽中，并且使用HOBt水合物/DIC偶联。在某些优选的实施方案中，具有脱保护的氨基基团的接头是γE。
在完成偶联后，从树脂除去偶联溶液，并且用偶联步骤的溶剂将树脂清洗至少一次。也可用不同的溶剂再进行清洗。在具体的实施方案中，以用于偶联的溶剂(例如DMF)将树脂结合肽清洗至少一次，用脂肪族醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇(IPA))清洗至少一次，以及用二烷基醚(例如二乙醚、叔丁基甲醚、二异丙醚(DIPE)或二异丁醚)清洗至少一次。在一个示例性的实施方案中，进行随后的清洗：用DMF清洗两次、用IPA清洗三次、用DIPE清洗三次。在另外的示例性的实施方案中，进行随后的清洗：用DMF清洗三次、用IPA清洗三次、用DIPE清洗三次。
在接着的步骤(步骤(viii))中，干燥树脂上的清洗过的肽。在某些实施方案中，可在真空下进行树脂的干燥。在其它实施方案中，在惰性气体下(例如在连续的氮气流(剥离氮气)中)进行干燥。
在完成步骤(viii)后，准备好从树脂中切割肽，这在根据本发明的方法的步骤(ix)中完成。
为了确保足够百分比的肽携带期望的亲脂修饰，在某些实施方案中，不直接进行切割反应。相反，在这些实施方案中，完成“过程对照”。因而，在这些实施方案中，在本发明方法的步骤(viii)中干燥了树脂结合肽后，通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率(步骤(viii-a))。
在某些实施方案中，分析脱保护产率可包括：
(viii-a1)从总反应批次取出树脂的测试样品，并与在步骤(ix)中相同的条件下并且用相同的切割混合物从测试样品切割肽；和
(viii-a2)测定与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量，特别是通过高压液相色谱(HPLC)或HPLC和质谱(LC-MS)的组合进行。
与总反应批次相比，测试样品会是较小的。不超过0.1％的总反应批次的样品大小通常会是足够的。
根据步骤(viii-a)中的分析结果，任选地重复步骤(iii)-(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量是足够的。与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比，含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的足够含量可为至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％，或甚至>95％，例如96％、97％、98％或99％。例如，若第一测试切割显示50％的修饰的赖氨酸侧链的含量，则再处理(即重复步骤(iii)-(viii-a))对于增加产率是有利的。若在再处理后，修饰的赖氨酸侧链的含量(例如)高于85％，则可进行步骤(ix)，即从树脂切割本体肽。若在另一方面，再处理仅产生修饰的赖氨酸侧链含量增加到(例如)60％，则指示进一步再处理。通过引入与再处理组合的IPC，本发明的方法不依赖于提升效果，因为可重复或调节合成步骤以优化产物的产率和/或纯度。
因此，在本发明的某些优选的实施方案中，用1％TFA/DCM将Mmt切割进行9次达至少10分钟，在控制pH的情况下进行中和，并且进行再处理，特别是对于较大的规模。
发现增加具有修饰的赖氨酸侧链的期望肽的产率和/或纯度的一种具体的措施是调节本发明方法的步骤(iii)中用TFA/DCM处理的数目。若(例如)感兴趣的肽中的修饰的赖氨酸侧链的含量太低，则可增加TFA/DCM处理的数目。特别地，调节步骤(iii)中TFA/DCM的处理数目，使得步骤(ix)中的修饰的赖氨酸侧链的产率为至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％，或甚至>95％，例如96％、97％、98％或99％。
一旦测试切割给出期望的结果(即最小量的具有未修饰的赖氨酸侧链的副产物)或者在不进行测试切割的情况下，在步骤(viii)后直接进行从树脂切割肽。在本发明的上下文中，优选使用特别开发的切割混合物进行切割，所述切割混合物与常规使用的King氏混合物(King等,Int.J.Peptide Protein Res.36,255-266,1990)相比具有优点，所述King氏混合物含有三氟乙酸(TFA)、酚、水、苯甲硫醚和1,2-乙二硫醇(EDT)。
发现当使用不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚的切割混合物时可实现切割后的肽的较好的产率、较高的含量和较好的纯度。特别地，根据本发明的合适的切割混合物包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇，并且不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。本发明的另外的合适的切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚，并且包含至少80％(w/w)三氟乙酸和至少1％(w/w)1,2-乙二硫醇。在本发明的上下文中，已经进行了关于密度的计算，对于三氟乙酸，数值为1.53g/cm3(在20℃)以及对于1,2-乙二硫醇，数值为1.12g/cm3(在20℃)。例如，可使用这些数值来计算来自给定体积的TFA或EDT的质量(例如)以计算质量与质量(w/w)比。
在示例性的实施方案中，使用由91-93％(v/v)三氟乙酸、1-6％(v/v)酚和1-8％(v/v)乙二硫醇构成的切割混合物。在其它实施方案中，使用由96-98％(v/v)三氟乙酸和2-4％(v/v)乙二硫醇构成的切割混合物。
根据本发明的具体的示例性切割混合物是(i)由约92.2％(v/v)三氟乙酸、约5.1％(v/v)酚和约2.7％(v/v)乙二硫醇构成的溶液和(ii)由约97.1％(v/v)三氟乙酸和约2.9％(v/v)乙二硫醇构成的溶液。
另外，发明人已经发现使用合适的吲哚化合物作为补充清除剂可进一步改善要求保护的方法，因为它帮助有效阻抑特定的非期望的副产物的发生，所述副产物由从树脂切割肽期间Rink接头的降解产物和肽的色氨酸残基引起。Ogawa等(Chem.Pharm.Bull.26(10)3144-3149(1978))提到使用3-甲基吲哚阻抑用TFA处理Z(OMe)-Trp-OH或Boc-Trp-OH期间的副反应。然而，3-甲基吲哚仅与苯甲醚和EDT、苯甲硫醚和EDT或二甲硫醚和EDT一起用作清除剂系统的一部分。根据本发明的合适的吲哚化合物是那些充分清除上文提及的非期望的副产物的化合物。例如，合适的吲哚化合物可为在碳原子C3或氮原子处携带低级(C1-C3)烷基或低级酰基(C1-C3)取代基的吲哚，特别是N-乙酰基吲哚和3-甲基吲哚(也称为粪臭素)。在某些实施方案中，3-甲基吲哚用作吲哚化合物。
因而，本发明的另外的合适的切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚，并且包含至少90％(w/w)三氟乙酸、至少1％(w/w)1,2-乙二硫醇和至少0.5％(w/w)的合适的吲哚化合物，例如3-甲基吲哚。在另外的示例性的实施方案中，使用由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸(TFA)、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇(EDT)和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚(3-MI)构成的切割混合物，特别是由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-甲基吲哚构成的切割混合物。
根据本发明的另外的示例性切割混合物是(iii)由约97％(w/w)TFA、约2％(w/w)EDT和约1％3-MI构成的溶液和(iv)由约96.9％(w/w)TFA、约2.3％(w/w)EDT和约0.8％(w/w)3-MI构成的溶液。
可在相对较宽的温度范围内进行从树脂切割肽。特别的，可在5-15℃,15-22℃和/或22-30℃，特别在25℃进行切割。在某些实施方案中，在室温(18-24℃)进行切割。优选地，温育时间尽可能短。通常，温育约4小时，特别是在室温的4小时足以获得可接受的切割。然而，在本发明的某些优选的实施方案中，当在25℃进行切割反应时可将切割时间降低到仅2小时，这具有的优点在于显著地降低肽对TFA的暴露。令人惊讶地发现，尽管温度增加，但是非期望的异构体的形成没有显著增加。在示例性的实施方案中，在搅拌(例如30-100rpm)情况下将切割进行2-3小时，特别是在25℃进行2-3小时或2.0-2.5小时。在其它实施方案中，在搅拌(例如30-100rpm)情况下在30℃将切割进行1-1.5小时。
另外/或者，可调节每克树脂上的肽的切割混合物体积以便于后来的处理和纯化。令人惊讶地发现，与常规的方案相比，可将切割混合物的体积降低至少10％，特别是至少20％且多至30％。考虑到King氏混合物的标准体积为约9ml/g(例如9.2ml/g)，在示例性的实施方案中可将体积降低约24％。在定量规模上，这意味着每克树脂上的肽的切割混合物体积可(例如)为9.5ml-5.5ml，特别是7.0ml-6.0ml。
在某些实施方案中，使用以下进行根据本发明方法的步骤(ix)的切割：
(a)由91-93％(v/v)三氟乙酸、1-6％(v/v)酚和1-8％(v/v)乙二硫醇(例如约92.2％(v/v)TFA、约5.1％(v/v)酚和约2.7％EDT)构成的切割混合物，
(b)在25℃的升高温度温育时间2.0-2.5小时，和
(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml-6.0ml。
在某些优选的实施方案中，使用以下进行根据本发明方法的步骤(ix)的切割：
(a)由91-93％(v/v)三氟乙酸、1-6％(v/v)酚和1-8％(v/v)乙二硫醇(例如约92.2％(v/v)TFA、约5.1％(v/v)酚和约2.7％EDT)构成的切割混合物。
(b)在25℃的升高的温度温育时间仅2小时，和
(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml-6.0ml。
在其它实施方案中，使用以下进行根据本发明方法的步骤(ix)的切割：
(a)由96-98％(v/v)三氟乙酸和2-4％(v/v)乙二硫醇(例如约97.1％(v/v)TFA和约2.9％(v/v)EDT)构成的切割混合物，
(b)在25℃的升高的温度温育时间2.0-2.5小时，和
(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml-6.0ml。
在其它优选的实施方案中，使用以下进行根据本发明方法的步骤(ix)的切割：
(a)由96-98％(v/v)三氟乙酸和2-4％(v/v)乙二硫醇(例如约97.1％(v/v)TFA和约2.9％(v/v)EDT)构成的切割混合物，
(b)在25℃的升高的温度温育时间仅2小时，和
(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml-6.0ml。
在又一些其他优选的实施方案中，使用以下进行根据本发明方法的步骤(ix)的切割：
(a)由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚构成，特别是由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-MI(例如约97％(w/w)TFA，约2％(w/w)EDT和约1％3-MI)构成的切割混合物，
(b)在25℃的升高的温度温育时间仅2.0-2.5小时，和
(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml-6.0ml。
在一些实施方案中，本发明方法包括从树脂切割肽后的另外的步骤，即：
(x)在切割后过滤肽溶液；
(xi)在真空下蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到包含二烷基醚和庚烷的抗溶剂中；
(xiii)搅拌沉淀的溶液；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)清洗沉淀物；和
(xvi)干燥湿的肽。
这些步骤有助于进一步纯化感兴趣的肽。首先，步骤(ix)的切割产物的过滤(步骤(x))允许从固体支持物分开亲脂性修饰的肽。过滤通常在室温进行。用合适的漂洗溶液将剩余的滤饼漂洗至少一次以从固体支持物完全回收残留的肽。根据本发明的合适的漂洗溶液是三氟乙酸。用TFA将滤饼漂洗一至五次，特别是三次。
将收集的滤液级分(来自第一次过滤的滤液和来自漂洗滤饼的滤液)合并，并且在步骤(xi)中在真空下进行蒸馏以降低体积。在一些实施方案中，应用的真空是≤50毫巴，并且蒸馏温度是≤30℃。在一个示例性的实施方案中，将溶液蒸馏约1-约2.5小时，例如1.5-2小时。蒸馏将含有肽的溶液的体积减少到沉淀前体积的约三分之一。肽仍然在残留的级分中，馏出液主要含有TFA。
在蒸馏后，将浓缩的含有肽的溶液添加到含有二烷基醚和庚烷的抗溶剂中(步骤(xii))。在一些实施方案中，抗溶剂是由二异丙醚(DIPE)和正庚烷构成的混合物。DIPE与正庚烷的比率可在(例如)25:75-35:65(v/v)的范围内。在示例性的实施方案中，DIPE/正庚烷的比率是25:75(v/v)或30:70(v/v)或35:65(v/v)。
通常用合适的溶剂(例如TFA)将转移出经浓缩的含有肽的溶液的容器漂洗一次，以使产率最大化。
在某些实施方案中，将抗溶剂预冷却到约0-5℃。根据一些实施方案，在约20-约60分钟的时段内向此预冷却的抗溶剂添加含有肽的溶液。
需要抗溶剂从含肽溶液中沉淀感兴趣的肽。当仅使用二烷基醚时，也可进行沉淀。然而，本发明人惊讶地发现，抗溶剂(特别是含有正庚烷的抗溶剂)有利地影响后续过滤需要的时间。例如，与仅使用DIPE作为抗溶剂相比，通过使用25:75(v(v)-35:65(v/v)范围内的DIPE/正庚烷混合物，可将沉淀后的过滤时间降低多至约60倍(参见实施例)。
在完成向抗溶剂添加含有肽的溶液后，将所得的肽悬浮液调节到(例如)约10-15℃。随后，将沉淀化陈化(步骤(xiii))，即它以(例如)20-30rpm且于(例如)10-15℃的温度搅拌某个时间量。例如，将陈化进行1-20小时，例如2-18小时或10-20小时。
在完成陈化步骤(xiii)后，对沉淀的溶液进行过滤(步骤(xiv))以从母液分离期望的肽，即沉淀物，所述母液主要由DIPE、庚烷和TFA构成。然后，可用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)漂洗滤器上的沉淀物。
随后，将滤器上的沉淀物清洗至少一次(步骤(xv))。在某些实施方案中，清洗滤器上的沉淀物包括(xv-a)在合适的有机溶剂中重悬沉淀物，(xv-b)搅拌所得的悬浮液，和(xv-c)过滤掉有机溶剂。示例性的有机溶剂是乙酸乙酯。可将搅拌进行(例如)30-60分钟。在一些实施方案中，将沉淀物清洗至少两次或至少三次。在某些实施方案中，用乙酸乙酯将沉淀物清洗1-5次，特别是2-4次或3-5次或4-5次。
在过滤掉最后一次清洗的清洗溶液后，干燥沉淀物，即粗制的、湿的感兴趣的肽。可在真空下(例如)在20-25℃进行干燥。在一些实施方案中，在≤70毫巴的真空下在20-25℃和氮气剥离下进行干燥。
包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的根据本发明的分离的肽特别是具有30-44个，更特别是38-40个氨基酸，更特别是39个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中优选地(i)在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％，和/或(ii)在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％，和/或(iii)所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链是就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言的第14位(Lys(14))。
出于例示目的，野生型毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO.:3)的氨基酸位置的分配如下所示：
在与野生型(wt)毒蜥外泌肽-4的氨基酸1-13对应的区域中至少65％的同一性意味着与野生型毒蜥外泌肽-4相比取代最多4个氨基酸。特别地，适合于此区域中的突变的位置是第1、2、3、10、12和13位。在某些优选的实施方案中，与野生型(wt)毒蜥外泌肽-4的氨基酸1-13对应的区域含有第2和3位的突变。在某些优选的实施方案中，突变是Gly2D-Ser(即第2位从甘氨酸突变为D-丝氨酸)和Glu3Gln(即第3位从谷氨酸突变为谷氨酰胺)。
在与野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸22-39对应的区域中至少70％的同一性意味着与野生型毒蜥外泌肽-4相比取代最多5个氨基酸。特别地，根据本发明，适合于此区域中的突变的位置是第23、24、27、28、29和35位。在某些优选的实施方案中，与野生型(wt)毒蜥外泌肽-4的氨基酸22-39对应的区域含有第28位的突变。在某些优选的实施方案中，突变是Ala28Asn(即第28位从丙氨酸突变为天冬酰胺)。
在某些优选的实施方案中，分离的肽是毒蜥外泌肽-4衍生物，并且仅含有一个修饰的赖氨酸侧链。特别地，就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言，此单一修饰的赖氨酸位于第14位。
在具体的实施方案中，分离的肽具有39个氨基酸的长度，在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％，在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％，并且就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言，亲脂性修饰的赖氨酸侧链在第14位(Lys(14))。
在进一步的实施方案中，分离的肽具有39个氨基酸的长度，在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少80％(即含有不超过2个突变)，在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少90％(即含有不超过1个突变)，并且就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言，亲脂性修饰的赖氨酸侧链在第14位(Lys(14))。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的肽在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中含有正好2个突变，在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中含有正好1个突变，并且就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言，亲脂性修饰的赖氨酸侧链在第14位(Lys(14))。
在某些优选的实施方案中，分离的肽具有氨基酸序列H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2(SEQ IDNO.:1)。在本发明的上下文中，“γE-Palm”表示(S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰基部分，并且“dS”代表D-Ser。
通过以下实施例进一步例示本发明。
实施例
实施例1：使用Rink酰胺树脂的固相肽合成
在第一个实施例中，经由使用Rink酰胺树脂和Fmoc策略的SPPS合成SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
树脂的加载：固相合成开始于Rink酰胺树脂(4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧基乙酰氨基甲基树脂)，其用20％哌啶/DMF脱保护两次(5和20分钟)。树脂的加载范围可为0.2-0.9mmol/g。用DMF彻底清洗树脂。然后，使用以与Fmoc-氨基酸等摩尔量使用的偶联试剂HOBt水合物和DIC/DMF将Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联到Rink树脂上释放的氨基基团。偶联时间范围可为18-22小时。此后，用DMF将树脂再清洗几次。
直链的肽装配：在将第一个Fmoc-氨基酸偶联到树脂上后，用20％哌啶/DMF再除去Fmoc-基团(5和20分钟)，接着用DMF彻底清洗并且再次使用HOBt水合物和DIC/DMF作为偶联试剂偶联下一个Fmoc-氨基衍生物，其为Fmoc-Pro-OH。在重复循环中，合成线性序列，直至第2位，其中使用Fmoc-D-Ser(tBu)-OH。偶联时间范围为2-22小时，构建砌块和偶联试剂的当量范围为2-3.5。对于位置37/36，采用二肽Fmoc-Pro-Pro-OH。对于第1位，偶联Boc-His(Trt)-OH。可在10℃-40℃的温度范围中进行偶联和脱保护步骤以及清洗步骤。
应用以下的Fmoc-氨基酸衍生物：对于第39、33、32、16、11、8位为Fmoc-Ser(tBu)-OH；对于第38和31位为Fmoc-Pro-OH；对于第37和36位为Fmoc-Pro-Pro-OH；对于第35、19、18位为Fmoc-Ala-OH；对于第34、30、29、4位为Fmoc-Gly-OH；对于第27、17、12位为Fmoc-Lys(Boc)-OH；对于第26、10位为Fmoc-Leu-OH；对于第25位为Fmoc-Trp(Boc)-OH；对于第24、15位为Fmoc-Glu(OtBu)-OH；对于第23位为Fmoc-Ile-OH；对于第22、6位为Fmoc-Phe-OH；对于第21、9位为FmocAsp(OtBu)-OH；对于第20、13、3位为Fmoc-Gln(Trt)-OH；对于第14位为Fmoc-Lys(Mmt)-OH或可替换地为Fmoc-Lys(Mtt)-OH；对于第7、5位为Fmoc-Thr(tBu)-OH；对于第2位为Fmoc-D-Ser(tBu)-OH；对于第1位为Boc-His(Trt)-OH。
实施例2：Lys(14)侧链的修饰
在第14位处进一步修饰实施例1的肽，其中根据本发明，附着亲脂部分。令人惊讶地发现，观察到关于Mmt切割的提升效应。
用TFA/DCM处理树脂结合肽：从Lys(14)侧链选择性且完全除去Mmt基团(单甲氧基三苯甲基)是本说明书中的核心部分之一。在实验室规模(8mmol)上用1％TFA/二氯甲烷(DCM)进行切割。对于Mmt-基团的切割，用DCM清洗树脂，并且用1％TFA/DCM处理3次。此后，使用3当量(eq)HBTU和6eqDIPEA/DMF以3倍过量将Fmoc-Glu-OtBu偶联到释放的氨基基团上。在用DMF清洗几次后，切割Fmoc-基团，再次清洗树脂，并且使用HOBt水合物和DIC偶联棕榈酸。此后，用King氏混合物从树脂中切割肽，并且通过HPLC分析。发现期望的产物SEQ IDNO:1连同4.3％的SEQ ID NO:2，其中Lys(14)处的侧链是缺少的。
SEQ ID NO:2
H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
4.3％的SEQ ID NO:2的发生可通过Mmt-基团的不完全除去来解释。
用相同的方案在36mmol规模上重复固相合成，并且令人惊讶地发现，SEQ ID NO:2的量增加到12.6％。对于已进行中试规模(800mmol)的接下来的合成，应用5次1％TFA/DCM处理，并且检测到28.7％的SEQ ID NO:2。
这些出乎意料的结果是由于提升效应所致。
表1：非期望的副产物SEQ ID NO:2随反应规模而增加(提升效应)
采用几次进一步的尝试以改善Mmt-基团的切割效率。将切割步骤增加到7次处理，其导致SEQ ID NO:2的百分比为15.7％(规模＝800mmol)。
在接下来的试验中，在用1％TFA/DCM处理前干燥树脂。因此，用异丙醇将树脂上的线性肽清洗3次，并且用二异丙醚清洗3次，并且在氮气吹扫下干燥>16h。此后，用1％TFA/DCM将树脂直接处理7次，接着进行一次DCM清洗和中和步骤，所述中和步骤用3％DIPEA/DCM进行，直至pH>8。如已经描述的，进行Fmoc-Glu-OtBu和棕榈酸的偶联。在从树脂切割肽后，获得粗制产物，其中SEQ ID NO:2的百分比为12.5％(规模＝680mmol)。
此外，通过应用如上面提及的预干燥步骤将Mmt-基团的切割进行8次。在从树脂切割肽后，获得粗制产物，其中SEQ ID NO:2的百分比为8.4％(规模＝680mmol)。
接着，通过应用如上面提及的预干燥步骤将切割进行9次。在从树脂切割肽后，获得粗制产物，其中SEQ ID NO:2的百分比为3.6％(规模＝680mmol)。
表2：在进一步后处理前通过预干燥树脂(步骤(ii))，增加用TFA/DCM处理的数目(步骤(iii))，并且中和肽结合的树脂来降低提升效应
因而，在组合预干燥、TFA/DCM处理9次和随后的中和的情况下实现了最佳的结果。
再处理步骤：为了在进一步增加规模(即到>800mmol，可为4000-5000mmol)时独立于进一步的提升效应，可建立再处理步骤。因此，进行SEQ ID NO:1从树脂(1g)的测试切割，导致具有某个量的SEQ ID NO:2的粗制肽。根据SEQ ID NO:2的百分比，可进行再处理步骤。对此目的，用1％TFA/DCM将树脂上的干燥肽处理5次，用3％DIPEA/DCM中和，直至达到pH>8，用DCM清洗，并且用DMF清洗几次。然后，用偶联试剂HBTU(3eq)和DIPEA(6eq)进行Fmoc-Glu-OtBu(3eq)的偶联。在完成偶联后，如先前描述的，除去Fmoc-基团，并且使用HOBt水合物和DIC偶联棕榈酸。
以下工作流程显示了Mmt切割及随后偶联而无再处理的主要操作。
a)在偶联N端氨基酸(Boc-His(Trt)-OH)后用二甲基甲酰胺(DMF)将树脂清洗两次。
b)用异丙醇(IPA)和二异丙醚(DIPE)将树脂清洗3次，树脂收缩。
c)经由连续氮气流将树脂干燥几小时，优选过夜。
d)用TFA(DCM中浓度为1％)将树脂处理9次，每次10分钟
e)用DCM清洗树脂
f)通过用二异丙基乙胺(DIPEA，DCM中浓度为3％)处理树脂进行几次中和步骤，各10分钟，清洗溶液的pH控制，终点：pH>8
g)用DCM(1x)和DMF(3x)清洗
h)用3eq 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HBTU)和6eqDIPEA/DMF活化3eq Fmoc-Glu-OtBu。或者，可使用其他碱性偶联条件或甚至HOBt水合物和DIC。将偶联混合物添加到树脂中。偶联进行3-4小时。
i)从树脂除去偶联混合物。用DMF将树脂清洗两次。
j)通过用哌啶(DMF中的浓度为20％)处理2次达5和20分钟切割Fmoc-基团
k)从树脂清洗切割溶液，并且用DMF将树脂清洗6次
l)在DMF中用3-3.5eq羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)和3-3.5eq的二异丙基碳二亚胺(DIC)将3-3.5eq的棕榈酸活化10分钟。对树脂给予预活化的脂肪酸。偶联进行4-22小时。
m)从树脂除去偶联溶液。用DMF将树脂清洗两次，用IPA清洗3次，并且用DIPE清洗3次，并且在真空下干燥。
n)若测试切割仅显示最小量的SEQ ID NO:2，则树脂上的肽现准备好进行切割以获得粗制肽。
以下方案显示Mmt-切割以及随后偶联的主要操作。
以下工作流程显示了Mmt-切割以及随后的偶联的主要再处理操作。
a)用TFA(DCM中的浓度为1％)将干燥的树脂处理5-9次，各10分钟
b)用DCM清洗树脂
c)通过用二异丙基乙胺(DIPEA，DCM中的浓度为3％)处理树脂进行几次中和步骤，各10分钟，清洗溶液的pH控制，终点：pH>8
d)用DCM(1x)和DMF(3x)清洗
e)用3eq 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵六氟磷酸盐(HBTU)和6eqDIPEA/DMF活化3eq Fmoc-Glu-OtBu。或者，可使用其他碱性偶联条件或甚至HOBt水合物和DIC。将偶联混合物添加到树脂中。偶联进行3-4小时。
f)从树脂除去偶联混合物。用DMF将树脂清洗两次。
g)通过用哌啶(DMF中的浓度为20％)处理2次达5和20分钟切割Fmoc-基团
h)从树脂清洗切割溶液，并且用DMF将树脂清洗6次
i)在DMF中用3-3.5eq羟基苯并三唑水合物(HOBt水合物)和3-3.5eq的二异丙基碳二亚胺(DIC)将3-3.5eq的棕榈酸活化10分钟。对树脂给予预活化的脂肪酸。偶联进行4-22小时。
j)从树脂除去偶联溶液。用DMF将树脂清洗两次，用IPA清洗3次，并且用DIPE清洗3次，并且在真空下干燥。
k)树脂上的肽现准备好进行切割以获得粗制肽。
应用此新的Mmt切割操作，任选地连同再处理操作允许获得具有较低量的非期望的SEQ ID NO:2的粗制肽。
总之，可采用如下的关键步骤来实现较高的Lys(14)修饰率：以预干燥的树脂开始Mmt切割，用1％TFA/DCM进行9次Mmt切割，在pH控制的情况下进行中和步骤，若Mmt-切割是不完全的，则应用更大规模的再处理操作。
实施例3：从树脂切割肽
在完成了固相合成后，必须从树脂上切割肽，并且还必须除去酸不稳定性侧链保护基团。可以用King氏混合物进行这些伴随的反应，所述King氏混合物由82.5％三氟乙酸(TFA)、5％水、2.5％1,2-乙二硫醇(EDT)、5％苯甲硫醚和5％酚构成(King等,Int.J.Peptide Protein Res.36,255-266,1990)。在室温(20℃)将切割进行4小时。可针对每种肽优化条件，还可针对SEQ ID NO:1优化条件。然而，令人惊讶地发现，其它切割混合物提供了较好的结果，如下文详细阐述。
在第一组实验中，用不同切割混合物处理树脂上的肽的样品。对于1g样品，使用8.5ml TFA、0.5ml水、0.25ml EDT、0.5ml苯甲硫醚和0.5g酚作为参照，切割时间4小时，室温。在二异丙醚中沉淀所得的肽，并且离心。倾析二异丙醚。将得到的肽沉淀物与乙酸乙酯一起震荡并再次离心。在再次倾析后，将此操作重复3次。最后，在真空下干燥肽。对样品进行分析：经由HPLC得到的UV-纯度(％)、HPLC含量(％)、以g/g树脂上的肽计的产率(表3中的第1行)。以逐步方式，成分被一个接一个，然后两个及最终三个省略。下表(表3)显示了结果。
表3：比较用于从树脂上切割SEQ ID NO:1的不同切割混合物
若省略苯甲硫醚且若使用EDT，则获得最佳的结果。在第二组实验中，在20℃随时间研究了3种混合物：由TFA、酚、EDT、水构成的混合物1；由TFA、酚、EDT构成的混合物2；由TFA、EDT构成的混合物3。在表4中，描绘了结果。
表4：3种混合物在20℃随时间的比较
2小时 3小时 4小时 5小时
混合物(1) HPLC-UV(％) 68.8 70.1 70 67.5
HPLC含量(％) 40.7 40.8 41.1 32.2
以g/g树脂计的产率 0.17 0.18 0.18 0.15
混合物(2) HPLC-UV(％) 71.9 71.6 70.1
HPLC含量(％) 41.5 38.9 38
以g/g树脂计的产率 0.18 0.18 0.19
混合物(3) HPLC-UV(％) 72 71.1 69.7 68
HPLC含量(％) 41.9 39.3 29.3 25.9
以g/g树脂计的产率 0.18 0.19 0.16 0.12
混合物2和3的结果是同样良好的。从树脂完全切割肽不需要4小时。在25℃重复混合物2和3的实验，并且获得了表5中的结果。
表5：混合物2和3在25℃的比较
1.5小时 2小时 2.5小时 3小时 4小时
混合物(2) HPLC-UV(％) 68.1 67.6 66.3 65.5 63.1
HPLC含量(％) 43.8 42.1 41.9 38.2 38
以g/g树脂计的产率 0.18 0.18 0.19 0.17 0.17
混合物(3) HPLC-UV(％) 68 67.1 66.2 64.9 65
HPLC含量(％) 43.1 42.3 41.7 37.8 35
以g/g树脂计的产率 0.18 0.19 0.19 0.18 0.15
混合物2和3的切割给出可比较的结果。在25℃，切割时间可降低到2小时。
此外，测试了混合物的体积是否可以降低20％和30％。表6显示了25℃随时间的结果。
表6：切割混合物2和3的体积降低20％和30％
1.5小时 2小时 2.5小时 3小时 4小时
混合物(2) HPLC-UV(％) 67.8 67.1 65.6 66 63.1
-20％ HPLC含量(％) 44.4 43.6 42 38.9 27.1
以g/g树脂计的产率 0.19 0.19 0.19 0.18 0.13
混合物(2) HPLC-UV(％) 67.4 66.9 66.6 65.6 63.5
-30％ HPLC含量(％) 44.8 43.2 42.1 42.3 38.2
以g/g树脂计的产率 0.19 0.19 0.19 0.2 0.18
混合物(3) HPLC-UV(％) 67.9 67 66.4 65.2 63.5
-20％ HPLC含量(％) 44.2 43.2 41.9 39.9 31.9
以g/g树脂计的产率 0.2 0.2 0.2 0.19 0.16
混合物(3) HPLC-UV(％) 67.9 66.7 65.6 64.7 63.1
-30％ HPLC含量(％) 43.7 43.1 41.6 40.1 31.9
以g/g树脂计的产率 0.2 0.2 0.2 0.19 0.17
如可在表6中看出，没有遇到显著的差异。在切割混合物体积降低70％期间，由于悬浮液的粘度，在切割反应期间几乎不能维持搅拌。
为了确认，在10g规模的树脂上的肽上重复用King氏混合物、用混合物2和3的切割。在二异丙基醚中沉淀肽之前通过蒸馏降低切割混合物的体积。
King氏混合物：通过使用5g酚、5ml苯甲硫醚、2.6ml EDT、79.2ml TFA和5ml水混合混合物。向预冷却的混合物(10-15℃)给予10g树脂上的肽。将浆料在17-23℃搅拌4小时。过滤掉树脂，并且每次用10.1ml TFA清洗4次。在温度<30℃在减压下蒸馏组合溶液以获得60ml的剩余体积。在0-5℃在30-60分钟内对276ml二异丙醚给予此溶液。用3.4ml TFA清洗烧瓶，所述TFA也添加到二异丙醚中。将获得的浆料在10-15℃搅拌至少10小时。通过离心分离沉淀物。在倾析后，在66.2ml乙酸乙酯中悬浮沉淀物，并且再次离心。将此操作再重复三次。最后，获得4.20g粗制肽，纯度为54.9％并且含量为33.45％。
混合物2：通过使用4g酚、2ml EDT和68ml TFA混合混合物。对预冷却的混合物(10℃)给予10g树脂上的肽。将浆料在25℃搅拌2小时。过滤掉树脂，并且每次用8ml TFA清洗4次。在减压在<30℃的温度蒸馏组合的溶液以获得35ml的剩余体积。在3℃在10分钟内向276ml二异丙醚给予此溶液。用3.4ml TFA清洗烧瓶，所述TFA也添加到二异丙醚中。将获得的浆料在15℃搅拌至少1小时。通过离心分离沉淀物。在倾析后，在66.2ml乙酸乙酯中悬浮沉淀物，并且再次离心。将此操作再重复三次。最后，获得4.88g粗制肽，纯度为64.2％并且含量为37.1％。
混合物3：通过使用2ml EDT和68ml TFA混合混合物。对预冷却的混合物(10℃)给予10g树脂上的肽。将浆料在25℃搅拌2小时。过滤掉树脂，并且每次用8ml TFA清洗4次。在减压在<30℃的温度蒸馏组合的溶液以获得37ml的剩余体积。在3℃在10分钟内向276ml二异丙醚给予此溶液。用3.4ml TFA清洗烧瓶，所述TFA也添加到二异丙醚中。将获得的浆料在15℃搅拌至少1小时。通过离心分离沉淀物。在倾析后，在66.2ml乙酸乙酯中悬浮沉淀物，并且再次离心。将此操作再重复三次。最后，获得5.10g粗制肽，纯度为64.2％并且含量为36.4％。
表7：在10g规模用不同混合物的切割的比较结果
HPLC-UV(％) HPLC-含量(％) 产率(g)
King氏混合物 54.9 33.4 4.20
混合物(2) 64.2 37.1 4.88
混合物(3) 64.2 36.4 5.10
如表7中所示，发现了与King氏混合物的应用相比，混合物2和3的应用在纯度、含量和产率方面给出更好的结果。
在生产规模上，使用混合物3处理7.6kg树脂上的肽，这是由于它给予最高产率和HPLC-UV-纯度的事实(表7)。获得总共3.26kg SEQ ID NO:1，纯度为68.7％。
总之，可采取以下关键步骤：替换使用复杂的King氏混合物，而仅使用TFA和EDT从树脂切割肽，在25℃将切割进行2小时，降低每克树脂上的肽的切割混合物的体积。
实施例4：从树脂切割肽
进行进一步的实验以优化从树脂切割肽。这些实验的特定重点是保持非期望的副产物的发生，所述副产物可以在切割步骤期间在肽的色氨酸部分和来自Rink树脂接头的降解产物之间以可容忍的最小值形成。在下文中，此特定的副产物也称为“SP1”。明显可形成非期望的副产物，直至感兴趣的肽(例如SEQ ID NO.:1)被沉淀(步骤(xii))。例如，当使用King氏混合物进行切割时，根据UV纯度(HPLC)测量，副产物可积累多至百分之几。
实施例4.1：EDT比例的变化
在第一组实验中，用由TFA和EDT构成的切割混合物处理树脂上的肽(SEQ ID NO.:1)的样品，其中EDT比例是变化的。在25℃将切割进行2小时，并且在环境温度将每个样品再温育2小时。在2或4小时后，经由HPLC分析样品。
表8：切割混合物中EDT比例的变化
EDT比例* 0.0 1.0 2.0 3.1 6.2 9.3
副产物SP1**,2小时 0.9 1.2 1.6 1.3 1.3 1.2
SEQ ID NO.:1**,2小时 63.3 62.7 71.7 74.2 74.5 74.9
副产物SP1**,4小时 1.3 2 3.3 3 2.8 2.6
SEQ ID NO.:1**,4小时 60.8 57.7 66.1 69.5 70.5 70.4
*以％(v/v)切割混合物计
**以％UV纯度(HPLC)计
如可从表8中看出，增加EDT比例对副产物(SP1)的形成仅具有很小的影响。
实施例4.2：添加另外的清除剂化合物
实施与实施例4.1中相似的一组实验，其中将EDT比例保持在恒定的3.1％(v/v)切割混合物，并且添加苯甲硫醚或3-甲基吲哚作为另外的清除剂化合物。温育和经由HPLC的分析如实施例4.1中所述。
表9：将苯甲硫醚添加到切割混合物中
*以％(v/v)切割混合物计
**以％UV纯度(HPLC)计
表10：将3-甲基吲哚添加到切割混合物中
*以％(v/v)切割混合物计
**以％(v/v)()切割混合物计；注意：在使用的温度3-甲基吲哚为固体；因此，基于1.22g/cm3的密度(文献中已知)计算假设体积以能够给出％(v/v)值
***以％UV纯度(HPLC)计
上述切割混合物的(w/w)比率将是95.57％(w/w)TFA、2.36％(w/w)EDT和2.07％(w/w)3-MI。如表9和10中可看出，苯甲硫醚的添加对副产物SP1的发生几乎没有任何影响，而通过添加3-甲基吲哚，可将副产物保持于低水平，即使在总共4小时温育时间后。
实施例4.3：吲哚化合物的比较
在与实施例4.1相似的另外的一组实验中，分析了别的吲哚化合物N-乙酰基吲哚与3-甲基吲哚的效应相比是否对副产物显示相似的抑制效应。将EDT的比例在3.1％(v/v)切割混合物保持恒定，并且不添加别的化合物(对照)、3.1％(v/v)N-乙酰基吲哚(N-乙酰基吲哚是粘性液体)或3.1％(v/v)3-甲基吲哚(计算％(v/v)，如表10中的记录中所述)。温育和经由HPLC的分析如实施例4.1中所述。
表11：切割混合物中N-乙酰基吲哚和3-甲基吲哚的比较
如表11中显示，3-甲基吲哚和N-乙酰基吲哚都有效减少非期望的副产物SP1的形成。
实施例4.4：3-甲基吲哚比例的变化
在与实施例4.1相似的另外一组实验中，改变对切割混合物添加的3-甲基吲哚的量以确定最合适的浓度。将EDT比例在3.1％(v/v)切割混合物保持恒定。温育和经由HPLC的分析如实施例4.1中所述。
表12：3-甲基吲哚比例的变化
*计算％(v/v)，如表10的记录中所述
如表12中可看出，0.8％(v/v)3-甲基吲哚的量已经足以阻抑不可忍受量的副产物的形成。
总之，发明人惊讶地发现将非期望的副产物的发生降低到可容忍量的可能性。通过添加合适的吲哚化合物，特别是N-乙酰基吲哚或3-甲基吲哚，可将粗制的非期望的产物中非期望的副产物的量减少到仅1.0-1.3％UV纯度(HPLC)的。尤其在清洗沉淀的肽溶液期间从期望的肽除去吲哚化合物(例如3-甲基吲哚)以及清除剂分子和保护基团的加合物。
实施例5：测试SEQ ID NO.:1从树脂的切割(千克规模)
在25℃用76.13kg三氟乙酸(TFA)、1.8kg 1,2-乙二硫醇和0.656kg 3-甲基吲哚的混合物将6.5-7.5kg树脂结合肽处理2-2.5小时。过滤掉树脂，并且每次用17.5kg TFA清洗三次。将组合的TFA相蒸发到其初始体积的1/3。在0-5℃将蒸馏残留物给到203L二异丙醚和正庚烷(30:70(v/v))混合物上以沉淀肽。将悬浮液在10-15℃搅拌10-20小时，接着通过过滤分开肽。每次用50L乙酸乙酯将所得的滤饼清洗5次。最后，在真空下干燥滤器上的肽，并且获得2.5-3.2kg粗制肽。
在具体的实验中，对7.24kg树脂上的SEQ ID NO.:1进行切割和进一步清洗和分离步骤，如下文列出，并且获得2.55kg干的粗制肽。产物是白色至浅黄色粉末，HPLC纯度为68.2％且Rink接头的非期望的降解产物和肽的色氨酸残基的含量为1.2％：为了实现这些结果，在23-25℃用73.2kg TFA、1.73kg 1,2-乙二硫醇和0.63kg 3-甲基吲哚的混合物将7.24kg SEQ ID NO.:1处理2.15小时。然后，过滤掉树脂，并且每次用17.4kg TFA清洗3次。将组合的TFA相(切割混合物和TFA清洗物)转移以蒸馏。在≤50毫巴和≤30℃温度在1小时内进行蒸馏，直至获得29L体积。在0-5℃在35分钟内将剩余部分添加至60.9L DIPE和142.1L正庚烷的混合物，获得悬浮液。将悬浮液在10-15℃搅拌约17小时。在2.5小时内过滤掉粗制肽，接着每次用49.4L乙酸乙酯对粗制肽清洗5次(添加乙酸乙酯，搅拌30-60分钟，除去溶剂)。在20-25℃在真空(<100毫巴)下用剥离氮气将湿的肽干燥>96小时。最后，获得2.55kg粗制肽。
实施例6：在切割后浓缩肽溶液对过滤时间的影响
在各使用10克树脂的小批次实验中，如本文所述经由SPPS合成感兴趣的肽(SEQID NO.:1)，并且在25℃使用67.8ml TFA和2.26ml EDT从树脂切割感兴趣的肽2小时。
过滤肽溶液以除去树脂，并通过≤80毫巴和≤30℃的真空蒸馏浓缩肽溶液到其体积的约三分之一，之后沉淀或直接沉淀(在不浓缩的情况下)。使用二异丙醚作为抗溶剂。用乙酸乙酯清洗沉淀物三次。记录沉淀后和每次乙酸乙酯清洗后过滤需要的时间。
表13：在有或没有预先浓缩肽溶液的情况下在DIPE中的过滤时间
n.d＝未确定
可见当进行浓缩步骤时，可强烈减少过滤(特别是在初始沉淀后)需要的时间。
实施例7：在DIPE和正庚烷的混合物中沉淀粗制肽
本发明人惊讶地发现二异丙醚(DIPE)和正庚烷的混合物可强烈减少过滤和随后用乙酸乙酯清洗需要的时间。
为了优化DIPE和正庚烷的比率，使用10克树脂进行小批次实验。如本文中所述经由SPPS合成肽，并且在25℃使用67.2ml TFA、2.1ml EDT和0.86g 3-MI从树脂切割该肽2小时。
然后，过滤肽溶液以除去树脂，并且通过≤80毫巴和≤30℃的真空蒸馏浓缩肽溶液到其体积的约三分之一。随后，仅用DIPE或用DIPE和正庚烷的混合物沉淀浓缩的肽溶液并过滤。用乙酸乙酯清洗沉淀物三次。记录沉淀后和每次乙酸乙酯清洗后过滤需要的时间。
表14：DIPE和DIPE/正庚烷混合物中的过滤时间
n/a＝不适用
如表14中的结果所示，过滤时间随混合物中正庚烷的量增加而减少。然而，在高于25:75的DIPE:正庚烷比率时，观察到肽在过滤玻料(frit)上“熔化/溶解(melt)”。在低于40:60的DIPE:正庚烷比率时，时间减少效应不太明显。
通过HPLC进一步分析样品显示用乙酸乙酯的第三次清洗后，不再检出清除剂化合物或清除剂和保护基团的加合物。
实施例8：测试使用DIPE/正庚烷作为抗溶剂纯化粗制肽(实验室规模)
20g树脂上的肽(肽：SEQ ID NO.:1)通过在25℃与切割混合物(198.8gTFA,4.7gEDT,1.72g 3-MI)温育3小时而被切割。经由玻料吸出切割的肽，并且每次用16ml TFA将玻料上剩余的树脂清洗4次。
于30℃在旋转蒸发器中浓缩滤液，并且将剩余的溶液添加到560mlDIPE/正庚烷(30:70)中，将其预冷至5-10℃。肽沉淀，并且于8℃控制1小时。然后，通过D4-玻料吸出悬浮液，这需要3.6分钟。将粗制产物在520ml乙酸乙酯中悬浮，搅拌，并且经由相同的D4玻料吸出。将此清洗步骤再重复两次。随后，在真空下干燥粗制产物。这产生8.36g粗制产物，纯度为66.6％。
本发明通过以下项进一步表征。
1.一种制备包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的分离的肽的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的所述肽的氨基酸序列，其中通过基于三苯甲基的保护基团，特别是单甲氧基三苯甲基(Mmt)或4-甲基三苯甲基(Mtt)保护要修饰的赖氨酸的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后干燥固相树脂；
(iii)用三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理几次以使要修饰的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)中和所述树脂；
(v)将至少一个活化的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)结合的接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)使步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的末端官能团脱保护；
(vii)将活化的亲脂性部分(特别是活化的脂肪酸)与步骤(vi)中的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；和
(ix)从所述树脂中切割所述肽。
2.项1的方法，其中所述分离的肽是具有30-44个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，且其中在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％。
3.项1或2的方法，其中所述分离的肽是具有30-44个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，且其中在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％。
4.项1-3中任一项的方法，其中所述分离的肽是具有30-44个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，且其中所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链是就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言的第14位(Lys(14))。
5.前述项中任一项的方法，其中所述分离的肽是具有30-44个氨基酸的长度的的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％，在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％，且其中所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链是就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言的第14位(Lys(14))。
6.前述项中任一项的方法，其中所述分离的肽是具有38-40个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物。
7.前述项中任一项的方法，其中所述分离的肽是具有39个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物。
8.前述项中任一项的方法，其中所述分离的肽是具有39个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中与野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸1-13对应的区域中的序列含有不超过2个突变，与野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸22-39对应的区域中的序列含有不超过1个突变，且其中所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言在第14位(Lys(14))。
9.前述项中任一项的方法，其中所述分离的肽是具有39个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中与野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸1-13对应的区域中的序列含有第2和3位的突变，与野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸22-39对应的区域中的序列含有第28位的突变，且其中所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言在第14位(Lys(14))。
10.前述项中任一项的方法，其中调节步骤(iii)中TFA/DCM处理的数目，使得步骤(ix)中的修饰的赖氨酸侧链的产率是至少85％，或至少90％，或至少95％。
11.前述项中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，用约1％(v/v)TFA的DCM溶液将干燥的树脂处理至少7次达至少5分钟。
12.前述项中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，用约1％(v/v)TFA的DCM溶液将干燥的树脂处理至少9次达至少10分钟。
13.前述项中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，用约1％(v/v)TFA的DCM溶液将干燥的树脂处理至少9次达至少15分钟。
14.前述项中任一项的方法，其中在步骤(iv)中，一旦达到pH≥7，特别是≥7.5，更特别是≥8.0，认为肽被充分中和。
15.前述项中任一项的方法，其中在步骤(iv)中，一旦达到>8.0，认为肽被充分中和。
16.前述项中任一项的方法，其还包括以下步骤：(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率。
17.前述项中任一项的方法，其还包括以下步骤：(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比，含有所述修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量是至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％。
18.项16的方法，其中分析测试样品中的步骤(iii)的脱保护产率包括以下步骤：
(viii-a1)从总反应批次取出树脂的测试样品，并在与步骤(ix)中相同的条件下并且用相同的切割混合物从测试样品切割肽；和
(viii-a2)测定与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量，特别是通过高压液相色谱(HPLC)或HPLC和质谱(LC-MS)的组合进行。
19.前述项中任一项的方法，其中所述分离的肽具有氨基酸序列
H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2(SEQ ID NO.:1)。
20.前述项中任一项的方法，其中用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇的切割混合物进行步骤(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
21.项20的方法，其中所述切割混合物进一步包含合适的吲哚化合物，例如N-乙酰基吲哚或3-甲基吲哚或其混合物。
22.项21的方法，其中所述合适的吲哚化合物是3-甲基吲哚。
23.项20的方法，其中所述切割混合物由91-93％(v/v)三氟乙酸、1-6％(v/v)酚和1-8％(v/v)乙二硫醇构成或由96-98％(v/v)三氟乙酸和2-4％(v/v)乙二硫醇构成。
24.项1-19中任一项的方法，其中用包含至少80％(w/w)三氟乙酸和至少1％(w/w)1,2-乙二硫醇的切割混合物进行步骤(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
25.项24的方法，其中所述切割混合物还包含合适的吲哚化合物，例如N-乙酰基吲哚或3-甲基吲哚或其混合物。
26.项25的方法，其中所述合适的吲哚化合物是3-甲基吲哚。
27.项24-26中任一项的方法，其中所述切割混合物由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸(TFA)、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇(EDT)和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚(3-MI)构成。
28.项24-27中任一项的方法，其中所述切割混合物由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-MI构成。
29.项24-28中任一项的方法，其中所述切割混合物由约97％(w/w)TFA、约2％(w/w)EDT和约1％(w/w)3-MI构成。
30.项24-29中任一项的方法，其中所述切割混合物由约96.9％(w/w)TFA、约2.3％(w/w)EDT和约0.8％(w/w)3-MI构成。
31.项20-30中任一项的方法，其中所述切割在5-15℃、15-22℃和/或22-30℃，特别是25℃进行。
32.项20-31中任一项的方法，其中每克树脂上的肽的切割混合物体积是9.5ml至5.5ml，特别是7.0ml至6.0ml。
33.项20-32中任一项的方法，其中在搅拌的情况下将所述切割进行2-3小时，特别是2.0-2.5小时。
34.项20-33中任一项的方法，其中在25℃在搅拌的情况下将所述切割进行2-3小时，特别是2.0-2.5小时。
35.项20-33中任一项的方法，其中在30℃在搅拌的情况下将所述切割进行1-1.5小时。
36.项20-35中任一项的方法，其中使用以下进行切割：(a)由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚构成，特别是由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-MI(例如约97％(w/w)TFA、约2％(w/w)EDT和约1％3-MI)构成的切割混合物，(b)在25℃的升高的温度温育时间仅2小时，和(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml至6.0ml。
37.项20-36中任一项的方法,其中使用以下进行切割：(a)由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚构成，特别是由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-MI(例如约97％(w/w)TFA、约2％(w/w)EDT和约1％3-MI)构成的切割混合物，(b)在25℃的升高的温度温育时间仅2小时，和(c)每克树脂上的肽的降低的切割混合物体积，例如7.0ml至6.0ml，且其中所述肽具有SEQID NO.:1的氨基酸序列。
38.前述项中任一项的方法，其中在用脂肪族醇将树脂上的肽清洗至少一次并且用二烷基醚清洗至少一次后，在室温在惰性气体(例如氮气)下进行步骤(ii)中的树脂干燥。
39.项38的方法,其中所述脂肪族醇是异丙醇并且所述二烷基醚是二异丙醚。
40.前述项中任一项的方法，其中步骤(iv)中的中和通过如下进行：与1％-5％叔烷基胺于有机极性非质子溶剂中的溶液温育至少一次，达至少10分钟，任选地接着在中和步骤后确定溶剂混合物的pH，并且用所述溶剂将树脂上的肽清洗至少一次并且用另外的极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF))清洗至少一次。
41.项40的方法，其中所述叔烷基胺是二异丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基吗啉(NMM)或三乙胺，且其中所述有机极性非质子溶剂是二氯甲烷。
42.项40或41的方法，接着在中和步骤后确定溶剂混合物的pH，并且用所述溶剂将树脂上的肽清洗至少一次并且用另外的极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺(DMF))清洗至少一次。
43.前述项中任一项的方法，其中步骤(vi)中的脱保护通过如下进行：用碱将树脂上的肽处理至少一次达至少5分钟，接着是至少一个清洗步骤。
44.项43的方法，其中所述碱是20％(v/v)哌啶/DMF。
45.前述项中任一项的方法，其中在清洗树脂上的肽后，在真空下，特别是在≤70毫巴的真空下进行步骤(viii)的树脂干燥。
46.前述项中任一项的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的SEQ ID NO.:1的肽的氨基酸序列，其中通过单甲氧基三苯甲基(Mmt)保护赖氨酸14的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后在室温将固相树脂干燥至少5小时；
(iii)用1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理9次，每次10分钟，以使第14位处的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)用3％二异丙基乙胺(DIPEA)的DCM溶液中和所述树脂，直至所述溶液的pH保持于≥8；
(v)在碱性条件下将活化的Fmoc-Glu-OtBu接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)用20％(v/v)哌啶/DMF切割步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的Fmoc基团；
(vii)将活化的棕榈酸与步骤(vi)的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；和
(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量为至少85％；
(ix)使用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)1,2-乙二硫醇的切割混合物在25℃从所述树脂切割所述肽，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
47.前述项中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
(x)在切割后过滤肽溶液；
(xi)在真空下蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到包含二烷基醚和庚烷的抗溶剂中；
(xiii)搅拌沉淀的溶液；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)清洗沉淀物；和
(xvi)干燥湿的肽。
48.前述项中任一项的方法，其中在步骤(x)后，用合适的漂洗溶液(例如TFA)将滤饼漂洗至少一次，例如3次。
49.前述项中任一项的方法，其中在步骤(xi)中，通过在≤50毫巴的真空在≤30℃的温度进行蒸馏。
50.前述项中任一项的方法，其中在步骤(xii)中，抗溶剂是由二异丙醚(DIPE)和正庚烷构成的混合物，特别是25:75(v/v)-35:65(v/v)比率的DIPE和正庚烷的混合物。
51.项50的方法，其中DIPE和正庚烷之间的比率是30:70(v/v)。
52.前述项中任一项的方法，其中在步骤(xiii)中，在10-15℃将沉淀的溶液搅拌1-20小时。
53.前述项中任一项的方法，其中在步骤(xv)中，在用合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)漂洗后，通过在合适的有机溶剂(例如乙酸乙酯)中重悬沉淀物，将所得的悬浮液搅拌(例如)30-60分钟，并且过滤掉有机溶剂而将滤器上的沉淀物清洗至少一次。
54.项53的方法，其中用乙酸乙酯将所述沉淀物清洗1-5次，特别是2-4次或3-5次或4-5次。
55.前述项中任一项的方法，其中在步骤(xvi)中在真空下，例如在20-25℃，特别是在20-25℃在≤70毫巴的真空下和氮气流(剥离氮气)下干燥湿的肽。
56.前述项中任一项的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的SEQ ID NO.:1的肽的氨基酸序列，其中通过单甲氧基三苯甲基(Mmt)保护赖氨酸14的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后在室温将固相树脂干燥至少5小时；
(iii)用1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理9次，每次10分钟，以使第14位处的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)用3％二异丙基乙胺(DIPEA)的DCM溶液中和所述树脂，直至所述溶液的pH保持于≥8；
(v)在碱性条件下将活化的Fmoc-Glu-OtBu接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)用20％哌啶/DMF切割步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的Fmoc基团；
(vii)将活化的棕榈酸与步骤(vi)的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；
(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量为至少85％；
(ix)使用由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-甲基吲哚构成的切割混合物从所述树脂切割所述肽；
(x)在切割后在室温过滤肽溶液；
(xi)在真空下在≤30℃蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到抗溶剂中，所述抗溶剂由25:75-35:65比率的DIPE和正庚烷构成；
(xiii)在10-15℃将沉淀的溶液搅拌1-18小时；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)通过(xv-a)在乙酸乙酯中重悬沉淀物，(xv-b)将所得的悬浮液搅拌30-60分钟，和(xv-c)过滤掉乙酸乙酯，将所述沉淀物清洗4-5次；和
(xvi)在真空下干燥湿的肽。
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<400> 1
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 毒蜥外泌肽-4类似物(副产物)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是D-Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser用NH2基团修饰
<400> 2
His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 钝尾毒蜥(Heloderma suspectum)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (39)..(39)
<223> Ser用NH2基团修饰
<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> Arg用NH2基团修饰
<400> 4
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 5
<211> 29
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利拉鲁肽(Liraglutide)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys在氨基酸侧链基团处官能化为Lys((S)-4-羧基-4-十六酰氨基丁酰基)
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30

Claims (13)

1.一种制备包含亲脂性修饰的赖氨酸侧链的分离的肽的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的所述肽的氨基酸序列，其中通过基于三苯甲基的保护基团，特别是单甲氧基三苯甲基(Mmt)或4-甲基三苯甲基(Mtt)保护要修饰的赖氨酸的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后干燥固相树脂；
(iii)用二氯甲烷(DCM)中的三氟乙酸(TFA)溶液将干燥的树脂处理几次以使要修饰的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)中和所述树脂；
(v)将至少一个活化的9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)结合的接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)使步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的末端官能团脱保护；
(vii)将活化的亲脂性部分，特别是活化的脂肪酸，与步骤(vi)中的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；和
(ix)从所述树脂中切割所述肽。
2.权利要求1的方法，其中所述分离的肽是具有30-44个，特别是38-40个氨基酸的长度的毒蜥外泌肽-4衍生物，其中
(i)在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸1-13对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少65％，和/或
(ii)在与野生型毒蜥外泌肽的氨基酸22-39对应的区域中与野生型毒蜥外泌肽-4的序列同一性是至少70％，和/或
(iii)所述亲脂性修饰的赖氨酸侧链是就野生型毒蜥外泌肽-4的氨基酸位置而言的第14位(Lys(14))。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(iii)中，用约1％(v/v)TFA的DCM溶液将所述干燥的树脂处理至少7次达至少5分钟，特别是9次达至少10分钟或9次达至少15分钟。
4.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；和
(viii-b)任选地重复步骤(iii)至(viii-a)，直至与不含修饰的赖氨酸侧链的肽相比，含有所述修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量是至少85％，特别是至少90％，更特别是至少95％。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离的肽具有以下氨基酸序列
H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2(SEQ ID NO.:1)。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇的切割混合物进行步骤(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
7.权利要求8的方法，其中所述切割混合物进一步包含合适的吲哚化合物，特别是3-甲基吲哚。
8.权利要求1-5中任一项的方法，其中用包含至少80％(w/w)三氟乙酸和至少1％(w/w)1,2-乙二硫醇的切割混合物进行步骤(ix)的切割，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
9.权利要求8的方法，其中所述切割混合物由88.2-98.3％(w/w)三氟乙酸、1-4.3％(w/w)1,2-乙二硫醇和0.7-7.5％(w/w)3-甲基吲哚构成。
10.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括以下步骤：
(x)在切割后过滤肽溶液；
(xi)在真空下蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到包含二烷基醚和庚烷的抗溶剂中；
(xiii)搅拌沉淀的溶液；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)清洗沉淀物；和
(xvi)干燥湿的肽。
11.权利要求10的方法，其中在步骤(xii)中，所述抗溶剂是由二异丙醚(DIPE)和正庚烷构成的混合物，特别是25:75(v/v)-35:65(v/v)比率的DIPE和正庚烷的混合物。
12.前述权利要求中任一项的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的SEQID NO.:1的肽的氨基酸序列，其中通过单甲氧基三苯甲基(Mmt)保护赖氨酸14的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后在室温将固相树脂干燥至少5小时；
(iii)用1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理9次，每次10分钟，以使第14位处的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)用3％二异丙基乙胺(DIPEA)的DCM溶液中和所述树脂，直至所述溶液的pH保持于≥8；
(v)在碱性条件下将活化的Fmoc-Glu-OtBu接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)用20％(v/v)哌啶/DMF切割步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的Fmoc基团；
(vii)将活化的棕榈酸与步骤(vi)的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；
(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量为至少85％；和
(ix)使用包含至少90％(v/v)三氟乙酸和至少1％(v/v)乙二硫醇的切割混合物在25℃从所述树脂切割所述肽，所述切割混合物不含苯甲硫醚和乙基甲基硫醚。
13.前述权利要求中任一项的方法，其包括以下步骤：
(i)使用固相肽合成(SPPS)以逐步方式装配侧链中具有受保护的反应性官能团的SEQID NO.:1的肽的氨基酸序列，其中通过单甲氧基三苯甲基(Mmt)保护赖氨酸14的侧链；
(ii)在完成了所述氨基酸序列的装配后在室温将固相树脂干燥至少5小时；
(iii)用1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将干燥的树脂处理9次，每次10分钟，以使第14位处的赖氨酸侧链脱保护；
(iv)用3％二异丙基乙胺(DIPEA)的DCM溶液中和所述树脂，直至所述溶液的pH保持于≥8；
(v)在碱性条件下将活化的Fmoc-Glu-OtBu接头部分与脱保护的赖氨酸侧链偶联；
(vi)用20％(v/v)哌啶/DMF切割步骤(v)中与所述赖氨酸侧链偶联的所述接头的Fmoc基团；
(vii)将活化的棕榈酸与步骤(vi)的所述接头的脱保护的末端官能团偶联；
(viii)干燥所述树脂；
(viii-a)通过切割树脂结合肽的测试样品分析步骤(iii)的脱保护产率；
(viii-b)重复步骤(iii)至(viii-a)，直至含有修饰的赖氨酸侧链的切割肽的含量为至少85％；
(ix)使用由96.0-97.5％(w/w)TFA、1.7-2.6％(w/w)EDT和0.7-1.5％(w/w)3-甲基吲哚构成的切割混合物从所述树脂切割所述肽；
(x)在切割后在室温过滤肽溶液；
(xi)在真空下在≤30℃蒸馏过滤的肽溶液；
(xii)将来自蒸馏的残留级分添加到抗溶剂中，所述抗溶剂由25:75(v/v)-35:65(v/v)比率的DIPE和正庚烷构成；
(xiii)在10-15℃将沉淀的溶液搅拌1-18小时；
(xiv)过滤沉淀的溶液；
(xv)通过(xv-a)在乙酸乙酯中重悬沉淀物，(xv-b)将所得的悬浮液搅拌30-60分钟，和(xv-c)过滤掉乙酸乙酯，将所述沉淀物清洗4-5次；和
(xvi)在真空下干燥湿的肽。
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