RU2019113729A - Способ получения пептидов, содержащих липофильно модифицированную боковую цепь лизина - Google Patents

Claims (64)

1. Способ получения выделенного пептида, содержащего липофильно модифицированную боковую цепь лизина, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности указанного пептида с защищенными реакционноспособными функциональными группами в боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина, подлежащей модификации, с помощью защитной группы на основе тритила, в частности, монометокситритила (Mmt) или 4–метилтритила (Mtt);

(ii) высушивания твердофазной смолы после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы несколько раз с помощью раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина, подлежащей модификации;

(iv) нейтрализации смолы;

(v) связывания по меньшей мере одного активированного линкерного фрагмента, связанного с 9–флуоренилметилоксикарбонилом (Fmoc), с боковой цепью лизина без защитной группы;

(vi) удаления защитной группы с концевой функциональной группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v);

(vii) связывания активированного липофильного фрагмента, в частности активированной жирной кислоты, с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы и

(ix) отщепления пептида от смолы.

2. Способ по п. 1, где выделенный пептид представляет собой производное эксендина–4, имеющее длину от 30 до 44, в частности от 38 до 40 аминокислот, где

(i) идентичность последовательности с эксендином–4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 1–13 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 65%, и/или

(ii) идентичность последовательности с эксендином–4 дикого типа в области, соответствующей аминокислотам 22–39 эксендина дикого типа, составляет по меньшей мере 70%, и/или

(iii) липофильно модифицированная боковая цепь лизина находится в положении 14 (Lys(14)) по отношению к аминокислотным положениям эксендина–4 дикого типа.

3. Способ по п. 1 или 2, где на стадии (iii) высушенную смолу обрабатывают по меньшей мере семь раз в течение по меньшей мере 5 минут, в частности, девять раз в течение по меньшей мере 10 минут или девять раз в течение по меньшей мере 15 мин. с помощью раствора приблизительно 1% (об./об.) TFA в DCM.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадии:

(viii–a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) посредством отщепления тестового образца связанного со смолой пептида и

(viii–b) необязательно повторения стадий (iii)–(viii–a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%, в частности по меньшей мере 90%, более конкретно по меньшей мере 95% по сравнению с пептидом без модифицированной боковой цепи лизина.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где выделенный пептид имеет аминокислотную последовательность

H–dS–Q–G–T–F–T–S–D–L–S–K–Q–K(γE–Palm)–E–S–K–A–A–Q–D–F–I–E–W–L–K–A–G–G–P–S–S–G–A–P–P–P–S–NH₂ (SEQ ID NO: 1).

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

7. Способ по п. 8, где смесь для отщепления дополнительно содержит подходящее индольное соединение, в частности 3–метилиндол.

8. Способ по любому из пп. 1–5, где отщепление на стадии (ix) проводят с помощью смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 80% (вес/вес) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (вес/вес) 1,2–этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

9. Способ по п. 8, где смесь для отщепления состоит из 88,2–98,3% (вес/вес) трифторуксусной кислоты, 1–4,3% (вес/вес) 1,2–этандитиола и 0,7–7,5% (вес/вес) 3–метилиндола.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий стадии:

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, содержащий диалкиловый эфир и гептан;

(xiii) перемешивания раствора с осадком;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка и

(xvi) высушивания влажного пептида.

11. Способ по п. 10, где на стадии (xii) антирастворитель представляет собой смесь, состоящую из диизопропилового эфира (DIPE) и н–гептана, в частности, смесь DIPE и н–гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.).

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc–Glu–OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc–группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% (об./об.) пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii–a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii–b) повторения стадий (iii)–(viii–a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%; и

(ix) отщепления пептида от смолы при 25°C с применением смеси для отщепления, содержащей по меньшей мере 90% (об./об.) трифторуксусной кислоты и по меньшей мере 1% (об./об.) этандитиола, которая не содержит тиоанизола и этилметилсульфида.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, включающий стадии:

(i) осуществления сборки аминокислотной последовательности пептида под SEQ ID NO: 1 с защищенными реакционноспособными функциональными группами на боковых цепях поэтапным образом с применением твердофазного синтеза пептидов (SPPS), при этом обеспечивают защиту боковой цепи лизина 14 с помощью монометокситритила (Mmt);

(ii) высушивания твердофазной смолы в течение по меньшей мере 5 часов при комнатной температуре после завершения сборки аминокислотной последовательности;

(iii) обработки высушенной смолы девять раз в течение 10 минут каждый раз с помощью раствора 1% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с целью удаления защитной группы с боковой цепи лизина в положении 14;

(iv) нейтрализации смолы с помощью раствора 3% диизопропилэтиламина (DIPEA) в DCM до тех пор, пока значение pH раствора не останется на уровне ≥8;

(v) связывания активированного Fmoc–Glu–OtBu линкерного фрагмента с боковой цепью лизина без защитной группы в основных условиях;

(vi) отщепления Fmoc–группы линкера, связанного с боковой цепью лизина на стадии (v), с помощью 20% (об./об.) пиперидина в DMF;

(vii) связывания активированной пальмитиновой кислоты с концевой функциональной группой линкера без защитной группы из стадии (vi);

(viii) высушивания смолы;

(viii–a) осуществления анализа выхода удаления защитной группы на стадии (iii) путем отщепления тестового образца связанного со смолой пептида;

(viii–b) повторения стадий (iii)–(viii–a) до тех пор, пока содержание отщепленного пептида, содержащего модифицированную боковую цепь лизина, не составит по меньшей мере 85%;

(ix) отщепления пептида от смолы с применением смеси для отщепления, состоящей из 96,0–97,5% (вес/вес) TFA, 1,7–2,6% (вес/вес) EDT и 0,7–1,5% (вес/вес) 3–метилиндола;

(x) фильтрации раствора пептида после отщепления при комнатной температуре;

(xi) перегонки отфильтрованного раствора пептида под вакуумом при ≤30°C;

(xii) добавления остаточной фракции после перегонки в антирастворитель, состоящий из DIPE и н–гептана в соотношении от 25:75 (об./об.) до 35:65 (об./об.);

(xiii) перемешивания раствора с осадком при 10–15°C в течение 1–18 часов;

(xiv) фильтрации раствора с осадком;

(xv) промывания осадка 4–5 раз посредством (xv–a) повторного суспендирования осадка в этилацетате, (xv–b) перемешивания полученной суспензии в течение 30–60 минут, и (xv–c) отфильтровывания этилацетата, и

(xvi) высушивания влажного пептида под вакуумом.