KR20190059321A

KR20190059321A - 친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 펩티드의 제조 방법

Info

Publication number: KR20190059321A
Application number: KR1020197013154A
Authority: KR
Inventors: 베른트 헨켈; 노르베르트 플로이쓰; 롤프-루드비히 회를라인
Original assignee: 사노피
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2019-05-30
Also published as: AR109914A1; RU2019113729A3; TW201821434A; RU2755543C2; AU2017341951A1; SG11201903100TA; CA3039752A1; US11021512B2; EP3523324A1; RU2019113729A; WO2018069295A1; EP3523324B1; MX2019004116A; CN109790208A; JP2019533666A; BR112019007063A2; US20200024304A1; IL265888A; AU2017341951B2

Abstract

본 발명은 고상 펩티드 합성에 의한 라이신 측쇄 변형된 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 펩티드의 제조 방법

본 발명은 고상 펩티드 합성에 의한 라이신 측쇄 변형된 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다,

관심 화합물은 친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 엑센딘-4 유도체이다. 엑센딘-4 (서열 번호 3)는 힐라 몬스터 (Gila monster) (헬로더마 서스펙텀 (Heloderma suspectum))의 침샘에 의해 생성되는 39개 아미노산 펩티드이다 (문헌[Eng, J. et al., J. Biol. Chem., 267:7402-05, 1992]). 엑센딘-4는 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 수용체의 활성인자이지만, 글루카곤 수용체를 유의하게 활성화시키는 것은 아니다. 예를 들어, 국제 공개 제WO2013/186240호, 국제 공개 제WO2014/056872호, 국제 공개 제WO2014/096145호, 국제 공개 제WO2014/096148호, 국제 공개 제WO2014/096149호, 국제 공개 제WO2014/096150호, 국제 공개 제WO2015/155139호, 국제 공개 제WO2015/155140호, 및 국제 공개 제WO2015/155141호에 기술된 바와 같은 특히 위치 14에서 지방산 아실화 잔기에 의한 변형은 상응하는 비-아실화 엑센딘-4 유도체와 비교할 경우 GLP-1 수용체에서뿐만 아니라 글루카곤 수용체에서도 높은 활성을 갖는 엑센딘-4 유도체를 야기한다.

리라글루티드 (Liraglutide) (서열 번호 4)는 여러 변형 중에서도 특히 지방산이 위치 20의 라이신에 연결되어 연장된 작용 기간을 초래하는, 시판되는 화학적으로 변형된 GLP-1 유사체이다 (문헌[Drucker DJ et al., Nature Drug Disc. Rev. 9, 267-268, 2010]; 문헌[Buse, J. B. et al., Lancet, 374:39-47, 2009]).

유럽 특허 제EP2 460 825 A1호에는 화학식 R₁-(CH₂)_n-CO-의 친유성 치환기로 변형된 C-말단 라이신 잔기를 갖는 GLP-1 유사체가 개시되어 있으며, 여기서, R₁은 메틸 또는 카복실이고, n은 8 내지 25의 정수이다. 본 발명과는 대조적으로, 유럽 특허 제EP2 460 825 A1호의 펩티드는 제1 단계에서 친유성으로 변형된 C-말단 라이신으로부터 출발하여 합성되며; 친유성 치환기의 부가 후, 원하는 펩티드의 나머지 아미노산들이 SPPS를 통하여 부가된다. 또한, Mtt (4-메틸트리틸) 라이신 보호기는, 건조된 잔사를 500 ml의 디메틸 포름아미드 (DMF)로 30분 동안 팽창시킨 후 1% 트리플루오로아세트산 (TFA)/디클로로메탄 (DCM)과 함께 1회 인큐베이션함으로써 제거된다 (실시예 참조). 잔존 DMF는 DCM 중 1% TFA에 대하여 중화 효과를 가짐으로써 Mtt 기의 절단을 불완전하게 만든다는 것이 주지되어야 한다.

국제 공개 제WO2008/023050 A1호는 다양한 아실화 엑센딘-4 화합물에 관한 것이다. 이 문서의 실시예 섹션에서, 청구된 화합물의 합성이 기술되어 있다. 국제 공개 제WO2008/023050 A1호에 따르면, 모노메톡시트리틸 (Mmt)- 또는 Mtt-보호부는 2% TFA 및 2 내지 3% 트리이소프로필실란 (TIS) (DCM 중)의 용액을 사용하여 제거되는데, 상기 용액은 본 발명에 따라 사용되는 DCM 중 TFA의 용액보다 더 복합적(complex)이다. 또한, 국제 공개 제WO2008/023050 A1호는 아미노산 서열의 어셈블리 (assembly)가 완료된 후 수지를 예비건조시키는 것에 관해서는 언급이 없다.

이와 유사하게, 펩티드성 멜라노코르틴 수용체 조절제에 관한 것인 국제 공개 제WO2011/104378 A1호, 및 야생형 GLP-1(7-37)과 관련하여 위치 26 (K26) 및 37 (K37)의 라이신에서 아실화된 이중-아실화 GLP-1 유도체에 관한 것인 국제 공개 제WO2013/167454 A1호는 아미노산 서열의 어셈블리 후 수지의 예비건조 단계에 관하여 언급이 없고, 현재 청구된 바와 같은 Mmt-/Mtt-보호기의 제거를 위한 절단 용액을 개시하지 않고 심지어 제안하지도 않는다. 상기 둘 다의 출원에서, 절단 용액은 더 복합적이다.

본원에 참고로 포함된 국제 공개 제WO2015/155141 A1호는 아실화 라이신을 포함하는, 엑센딘-4로부터 유도된 펩티드성 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제에 관한 것이다. 또한, 이 국제 공개는 펩티드와 친유성 모이어티 사이의 링커 모이어티의 커플링 전 수지-결합된 펩티드의 중화 또는 수지의 예비건조를 개시하지 않거나 제안하지 않는다.

비천연 아미노산, 및 예를 들어, 라이신의 ε-아미노기 또는 오르니틴의 δ-아미노기 또는 2,4-디아미노부티르산의 γ-아미노기 또는 2,3-디아미노프로피온산의 β-아미노기의 측쇄 변형을 포함할 수 있는 펩티드의 바람직한 제조 방법으로는 적합한 수지 상에서의 고상 합성법이 있다. 고상 펩티드 합성 (SPPS)은 입증된 펩티드로의 합성 접근 방법이다 (이의 예가 문헌[Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III., 1984]에 주어져 있다).

일반적으로 펩티드의 고상 합성은 고체 지지체-함유 링커에의 N-말단 보호된 아미노산 유도체로 시작된다. 고체 지지체는 SPPS에서 사용되는 용매와 상용성이고 수지 (예를 들어, 트리틸 수지, 클로로트리틸 수지, 왕 (Wang)-수지 (펩티드 산을 원할 때), 또는 링크 (Rink)-수지, 시이버 (Sieber)-수지 (펩티드 아미드가 Fmoc-전략을 이용하여 수득되어야 할 때) 상에의 카복시 기와의 아미노산 유도체의 커플링을 허용하는 임의의 중합체일 수 있다. 중합체 지지체의 안정성이, 펩티드 합성 동안 α-아미노기를 탈보호시키는데 이용되는 조건하에서 제공되어야 한다.

첫 번째의 N-말단 보호된 아미노산이 링커-수지 작제물 상에 커플링된 후, N-말단 보호기는 염기, 예컨대 피페리딘/디메틸포름아미드 혼합물 (Fmoc-전략)을 이용하여 절단된다. 유리된 아미노기는 커플링 시약, 예를 들어, BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)를 3차 염기, 예컨대 DIPEA (디이소프로필 에틸아민) 또는 NMM (N-메틸모르폴린)과 함께 또는 대안적으로 DIC (N,N'-디이소프로필 카보디이미드) / HOBt 수화물 (1-하이드록시벤조트리아졸)과 함께 사용하여 Fmoc-보호된 아미노산 유도체와 반응시킨다. 이 공정은 원하는 아미노산 서열이 수득될 때까지 반복된다.

대개 아미노산 유도체의 반응성 측쇄 작용기는 고상 펩티드 합성에 사용되는 조건하에서 안정한 적합한 보호기로 차단된다. 보호기는 펩티드가 고상에서 어셈블링된 후 동일 조건하에서의 수지로부터의 원하는 생성물의 절단과 동시에 제거된다. 보호기 및 이의 도입 절차는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd ed., Wiley & Sons, New York, 1999] 또는 문헌[Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1994]에서 발견될 수 있다.

SPPS에서 측쇄 보호기를 임의로 제거하여 상기 측쇄 보호기를 변형시키는 가능성도 있다. 그러한 보호기의 제거 조건은 모든 다른 보호기가 온전하게 남아 있도록 하는 것이어야 한다. 라이신은 DMF 중 하이드라진 용액에 불안정한 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-3-메틸-부틸 (ivDde) 또는 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-에틸 (Dde) 기로 보호될 수 있다 (문헌[Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, 1603, 1998] 참조). 일단 N-말단 보호기 뿐만 아니라, 모든 측쇄 보호기가 산 불안정성 보호기를 포함하면, ivDde- 또는 Dde-보호기는 DMF 중 하이드라진으로 절단될 수 있다. 라이신 측쇄로부터 유리된 아미노기는 그 후에 예를 들어, 다른 Fmoc-아미노산 또는 지방산으로 변형될 수 있다. 상기 절차는 오르니틴, 2,4-디아미노 부티르산 또는 2,3-디아미노 프로피온산에 적용될 수 있다.

마지막으로 펩티드는 트리플루오로아세트산 함유 칵테일, 예를 들어, 킹 칵테일 (King's cocktail) (문헌[King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990]) (트리플루오로아세트산 (TFA), 페놀, 물, 티오아니솔 및 1,2-에탄디티올 (EDT)을 포함함)을 이용하여 모든 측쇄 보호기와 동시에 수지로부터 절단될 수 있다. 특정한 반응 시간 후, 수지를 여과 제거하고, 조 펩티드를 에테르, 예를 들어, 디에틸 에테르, 메틸 3급-부틸 에테르 또는 디이소프로필 에테르에서 침전시킨다. 침전물을 여과 제거하거나, 원심분리에 의해 용액으로부터 분리할 수 있다.

필요할 경우, 조 펩티드를 C18-컬럼에서의 분취용 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 정제를 위하여, 수 회의 작동 (run)이 90% 초과의 순도 또는 이보다 훨씬 더 큰 순도의 제공에 필요할 수 있다. 대개 최종 작동은 염화 작동이며, 여기서, 원하는 반대 이온, 예를 들어, 아세테이트가 결정될 것이다. 분획은 HPLC에 의해 분석되고, 규정된 기준에 따라 풀링된다 (pooled). 용매는 예를 들어, 증류, 동결건조, 분무 건조 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 마침내, 정제된 펩티드가 수득된다.

발명의 간단한 요지

라이신 측쇄 변형된 펩티드의 고상 합성을 위한 신규한 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 펩티드는 특히 엑센딘-4 유도체이며, 여기서, 적어도 하나의 아미노산, 특히 위치 14에서 메티오닌은 라이신으로 대체되며, 상기 라이신은 무극성, 친유성 잔기 (예를 들어, 링커와 임의로 결합된 지방산)로 추가로 치환된다.

놀랍게도, 특정 시퀀스 (sequence)의 단계를 따름으로써, 원하지 않는 부산물의 양을 크게 감소시켜서 더 높은 순도로 원하는 생성물의 수율을 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 단리된 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이며, 이는 다음의 단계를 포함한다:

(i) 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 상기 펩티드의 아미노산 서열을 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 이용하여 단계적 방식으로 어셈블링하는 단계 (여기서, 변형될 라이신의 측쇄는 트리틸계 보호기, 특히 모노메톡시트리틸 (Mmt) 또는 4-메틸트리틸 (Mtt)로 보호됨);

(ii) 상기 아미노산 서열의 어셈블링이 완료된 후 상기 고상 수지를 건조시키는 단계;

(iii) 상기 건조된 수지를 디클로로메탄 (DCM) 중 트리플루오로아세트산 (TFA)의 용액으로 수 회 처리하여 변형될 라이신 측쇄를 탈보호하는 단계;

(iv) 수지를 중화시키는 단계;

(v) 적어도 하나의 활성화된 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc)-결합된 링커 모이어티를 상기 탈보호된 라이신 측쇄에 커플링시키는 단계;

(vi) 단계 (v)에서 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 말단 작용기를 탈보호시키는 단계;

(vii) 활성화된 친유성 모이어티, 특히 활성화된 지방산을 단계 (vi)의 링커의 탈보호된 말단 작용기에 커플링시키는 단계;

(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계; 및

(ix) 상기 펩티드를 상기 수지로부터 절단하는 단계.

특정한 실시형태에서, 단리된 펩티드는 길이가 30 내지 44개, 특히 38개 내지 40개 아미노산인 엑센딘-4 유도체이며, 여기서, 바람직하게는 (i) 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 65%이고/이거나 (ii) 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 70%이고/이거나 (iii) 상기 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있다. 바람직한 특정 실시형태에서, 단리된 엑센딘-4 유도체는 아미노산 서열 H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂ (서열 번호 1)를 갖는다.

일부 실시형태에서, 단계 (iii)에서의 DCM 중 TFA의 처리 횟수는 단계　(ix)에서의 변형된 라이신 측쇄의 수율이 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 더 구체적으로 적어도 95%이도록 조정된다. 수율은 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교할 경우의 퍼센트로 주어진다 (즉, 85%의 수율은 펩티드의 85%가 변형된 라이신 측쇄를 갖고 펩티드의 15%가 비변형된 라이신 측쇄를 가진 채로 남아 있음을 의미한다).

예를 들어, 단계 (iii)에서, 건조된 수지는 DCM 중 약 1% (v/v)의 TFA의 용액을 이용하여 적어도 5분 동안 적어도 7회, 특히 적어도 10분 동안 9회 또는 적어도 15분 동안 9회 처리될 수 있다. TFA를 약 1.5% (v/v)까지 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 2% (v/v) 이상의 TFA의 농도는, 절단 선택성이 감소되기 때문에 불리하며; 특히 2% (v/v) 이상의 TFA를 함유하는 용액은 예를 들어, 관심 라이신 측쇄에서의 모노메톡시트리틸 보호기를 절단할 뿐만 아니라 예를 들어, 다른 아미노산 잔기에서의 Boc 보호기도 절단한다. 이것은 이 절차의 후속 단계들에서 원하지 않는 다수의 아실화를 야기할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다:

(viii-a) 상기 수지 결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계; 및

(viii-b) 임의로, 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이, 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 더 구체적으로 적어도 95%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계.

특정한 실시형태에서, 탈보호 수율을 분석하는 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(viii-a1) 수지의 테스트 샘플을 전체 반응 배치 (batch)로부터 제거하고, 단계 (ix)에서와 동일한 조건하에, 그리고 단계 (ix)에서와 동일한 절단 칵테일을 이용하여 펩티드를 테스트 샘플로부터 절단하는 단계; 및

(viii-a2) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량을, 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 특히 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 HPLC와 질량 분광법의 조합 (LC-MS)에 의해 결정하는 단계.

특정한 실시형태에서, 단계 (ix)의 절단은 적어도 90% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (v/v)의 에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 수행되는데, 상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없다.

특정한 실시형태에서, 절단 칵테일은 적합한 인돌 화합물, 특히 3-메틸인돌을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 절단 칵테일은 특히 91 내지 93% (v/v)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 6% (v/v)의 페놀 및 1 내지 8%　(v/v)의 에탄디티올로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 절단 칵테일은 96 내지 98% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 2 내지 4% (v/v)의 에탄디티올로 이루어진다.

다른 추가 실시형태에서, 단계 (ix)의 절단은 적어도 80% (w/w)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (w/w)의 1,2-에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 수행되는데, 상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없다.

특정한 실시형태에서, 절단 칵테일은 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진다.

단계 (ix)의 절단은 예를 들어, 5 내지 15℃, 15 내지 22℃ 및/또는 22 내지 30℃, 특히 25℃에서 수행될 수 있다. 수지 상에서의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 부피는 예를 들어, 9.5 ml 내지 5.5 ml, 특히 7.0 ml 내지 6.0 ml일 수 있다. 단계 (ix)의 절단은 예를 들어, 2 내지 3시간, 특히 25℃에서 2 내지 3시간 또는 2.0 내지 2.5시간 동안 또는 30℃에서 1 내지 1.5시간 동안, 교반을 이용하여 수행될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 단계 (ii)에서의 수지의 건조는, 수지 상의 펩티드를 지방족 알코올을 이용하여 적어도 1회 및 디알킬 에테르를 이용하여 적어도 1회 세척함에 후속하여, 불활성 가스, 예를 들어, 질소 하에, 실온에서 수행될 수 있다.

단계　(iv)에서의 중화는 예를 들어, 유기 극성 비양성자성 용매 중 3차 알킬아민, 예를 들어, 디클로로메탄 중 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA) 또는 디클로로메탄 중 N-메틸모르폴린 (NMM) 또는 디클로로메탄 중 트리에틸아민의 1% 내지 5% 용액과 함께 적어도 10분 동안 적어도 1회 인큐베이션하고, 이어서 임의로, 중화 단계 후 용매 혼합물의 pH를 결정하고, 수지 상의 펩티드를 상기 용매로 적어도 1회, 및 추가의 극성 비양성자성 용매, 예를 들어, 디메틸포름아미드 (DMF)로 적어도 1회 세척함으로써 수행될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 단계 (vi)에서의 탈보호는 수지 상의 펩티드를 염기를 이용하여 적어도 5분 동안 적어도 1회 처리함에 의해, 이어서 적어도 1회의 세척 단계에 의해 수행될 수 있다.

특정한 실시형태에서, 단계 (viii)에서의 수지의 건조는, 수지 상의 펩티드의 세척에 후속하여 진공하에, 특히 70 mbar 이하의 진공하에 수행될 수 있다.

일부 실시형태에 따르면, 청구된 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다:

(x) 절단 후 상기 펩티드 용액을 여과시키는 단계;

(xi) 상기 여과된 펩티드 용액을 진공하에 증류시키는 단계;

(xii) 상기 증류로부터의 잔존 분획을 디알킬 에테르 및 헵탄을 포함하는 항용매(antisolvent)에 첨가하는 단계;

(xiii) 상기 침전된 용액을 교반시키는 단계;

(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;

(xv) 상기 침전물을 세척하는 단계; 및

(xvi) 상기 습윤 펩티드를 건조시키는 단계.

일부 실시형태에서, 단계 (x)에 후속하여, 수지 필터 케이크는 적합한 헹굼 용액, 예를 들어, TFA를 이용하여 적어도 1회, 예를 들어, 3회 헹굴 수 있다.

단계 (xi)에서, 증류는 예를 들어, 50 mbar 이하의 진공에서 30℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있다.

또한, 일부 실시형태에서, 단계 (xii)에서 사용되는 항용매는 디이소프로필 에테르 (DIPE)와 n-헵탄으로 이루어진 혼합물, 특히 25:75 (v/v) 내지 35:65 (v/v)의 비의 DIPE 및 n-헵탄의 혼합물일 수 있다.

단계 (xiii)에서, 침전된 용액은 예를 들어, 10 내지 15℃에서 1 내지 20시간 동안 교반될 수 있다.

단계 (xv)에서, 필터 상의 침전물은 적합한 유기 용매, 예를 들어, 에틸 아세테이트로 헹굼에 후속하여, 침전물을 적합한 유기 용매, 예를 들어, 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, 생성된 현탁물을 예를 들어, 30 내지 60분 동안 교반시키고, 유기 용매를 여과 제거함으로써 적어도 1회 세척될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 이 절차는 에틸 아세테이트를 이용하여 1 내지 5회, 특히 2 내지 4회, 더 구체적으로 3 내지 5회 반복될 수 있다.

일부 실시형태에서, 습윤 펩티드는 단계 (xvi)에서 진공하에, 예를 들어, 20 내지 25℃에서, 특히 70 mbar 이하의 진공하에 20 내지 25℃에서 질소 스트립핑 (stripping)에서 건조된다.

일부 실시형태에서, 청구된 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(i) 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 서열 번호 1의 펩티드의 아미노산 서열을, 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 이용하여 단계적 방식으로 어셈블리하는 단계 (여기서, 라이신 14의 측쇄는 모노메톡시트리틸 (Mmt)로 보호됨);

(ii) 상기 아미노산 서열의 어셈블링이 완료된 후 상기 고상 수지를 실온에서 적어도 5시간 동안 건조시키는 단계;

(iii) 상기 건조된 수지를 디클로로메탄 (DCM) 중 1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)의 용액으로 각각 10분 동안 9회 처리하여 위치 14의 라이신 측쇄를 탈보호하는 단계;

(iv) 상기 수지를 DCM 중 3% 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA)의 용액을 이용하여, 상기 용액의 pH가 8 이상에서 유지될 때까지 중화시키는 단계;

(v) 활성화된 Fmoc-Glu-OtBu 링커 모이어티를 염기성 조건하에 상기 탈보호된 라이신 측쇄에 커플링시키는 단계;

(vi) 단계 (v)에서 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘으로 절단하는 단계;

(vii) 활성화된 팔미트산을 단계 (vi)의 링커의 탈보호된 말단 작용기에 커플링시키는 단계;

(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계;

(viii-a) 상기 수지 결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계;

(viii-b) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이 적어도 85%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계; 및

(ix) 상기 펩티드를 25℃에서 적어도 90% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (v/v)의 에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 상기 수지로부터 절단하는 단계 (상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없음).

(i) 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 서열 번호 1의 펩티드의 아미노산 서열을, 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 이용하여 단계적 방식으로 어셈블링하는 단계 (여기서, 라이신 14의 측쇄는 모노메톡시트리틸 (Mmt)로 보호됨);

(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계;

(viii-b) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이 적어도 85%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계;

(ix) 상기 펩티드를 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진 절단 칵테일을 이용하여 상기 수지로부터 절단하는 단계;

(x) 실온에서의 절단 후 상기 펩티드 용액을 여과시키는 단계;

(xi) 상기 여과된 펩티드 용액을 진공하에 30℃ 이하에서 증류시키는 단계;

(xii) 25:75 (v/v) 내지 35:65 (v/v)의 비의 DIPE 및 n-헵탄으로 이루어진 항용매에 상기 증류로부터의 잔존 분획을 첨가하는 단계;

(xiii) 상기 침전된 용액을 10 내지 15℃에서 1 내지 18시간 동안 교반시키는 단계;

(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;

(xv) (xv-a) 상기 침전물을 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, (xv-b) 상기 생성된 현탁물을 30 내지 60분 동안 교반시키고, (xv-c) 에틸 아세테이트를 여과 제거함으로써 상기 침전물을 4 내지 5회 세척하는 단계; 및

(xvi) 상기 습윤 펩티드를 진공하에 건조시키는 단계.

친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 단리된 펩티드의 상기 본 발명의 제조 방법은 적어도 9개의 단계를 포함한다.

제1 단계 (단계 (i))는 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 통한 관심 펩티드의 합성에 관한 것이다. 상기한 바와 같이, SPPS는 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 펩티드의 아미노산 서열을 단계적 방식으로 어셈블링하는 것을 포함한다. 펩티드는 적어도 하나의 라이신을 함유하며, 이의 측쇄는 변형된다. 이러한 적어도 하나의 (예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의) 라이신 잔기의 측쇄는 트리틸계 보호기로 보호된다. 특정 실시형태에서, 펩티드는 단지 하나의 변형된 라이신 측쇄를 함유한다. 본 출원 내에서의 특정 용도의 트리틸계 보호기로는 모노메톡시트리틸 (Mmt) 및 4-메틸트리틸 (Mtt)이 있다. 바람직한 특정 실시형태에서, 단지 Mmt가 변형될 라이신 잔기(들)를 위한 트리틸계 보호기로서 사용된다.

본 발명에 따른 SPPS에 있어서, 특히, 상이한 링크-아미드 수지들, 예를 들어, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지 또는 4-[(2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸]페녹시 아세트아미도 메틸 수지를 사용하는 것이 가능하다. 로딩(loading)은 0.1 내지 1 mmol/g, 특히 0.2 내지 0.9 mmol/g의 범위일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 로딩은 0.25 내지 0.6 mmol/g의 범위이다. 다른 실시형태에서, 로딩은 0.2 내지 0.4 mmol/g의 범위이다. 임의의 합성 전략 SPPS를 사용하는 것이 일반적으로 가능하지만, 본 발명의 맥락에서 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc) 전략 (더 온화한 탈보호 조건의 사용을 가능하게 함)이 바람직하다. 디메틸포름아미드 (DMF) 중 적합한 염기, 예를 들어, 특히 20 내지 50%의 농도의 피페리딘이 탈보호 (즉, 링크 아미드의 보호 아미노기로부터의, 또는 더 이후의 단계에서, 각각의 아미노산의 α-아미노기로부터의 Fmoc 기의 제거)에 사용된다. 각각의 아미노산을 각각 수지 또는 이전의 아미노산에 커플링시키는 것은 표준 조건에 따라, 예를 들어, 커플링 시약으로서 DMF 중 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) 수화물 및 N,N'-디이소프로필 카보디이미드 (DIC)를 사용하여 수행된다. 각각의 아미노산에 있어서의 커플링 시간은 변할 수 있으며, 일반적으로 2 내지 22시간의 범위 내에 있다.

SPPS에 사용되며 측쇄가 변형될 Fmoc-라이신 유도체는 특히 Fmoc-Lys(Mmt)-OH 또는 Fmoc-Lys(Mtt)-OH이다.

N-말단 아미노산의 α-아미노기는 바람직하게는 3급-부틸옥시카보닐 (Boc) 기로 보호된다. 원하는 펩티드의 N-말단 아미노산의 부가에 후속하여, 수지 상의 펩티드는 세척된다. 더 진행되기 전에 1개 이상, 10개 이하, 특히 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 세척 단계, 더 구체적으로 6개의 세척 단계가 실시된다. 적합한 세척 유체는 지방족 알코올, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올 또는 이소프로판올 (IPA), 및/또는 디알킬 에테르, 예를 들어, 디에틸 에테르, 3급-부틸메틸 에테르, 디이소프로필 에테르 (DIPE) 또는 디이소부틸 에테르를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 세척은 IPA 및 DIPE를 이용하여 수행된다. 특히, 수지 상의 펩티드는 먼저 IPA를 이용하여 적어도 1회 세척되며, 후속적으로 DIPE를 이용하여 적어도 1회 세척된다. 바람직한 특정 실시형태에서, 수지 상의 펩티드는 먼저 IPA를 이용하여 3회 세척되며, 후속적으로 DIPE를 이용하여 3회 세척된다.

세척 후, 펩티드를 포함하는 고상 수지는 건조된다 (단계 (ii)). 건조는 불활성 가스 분위기, 예를 들어, 질소 하에, 특히 계속적인 질소 스트림 (질소 스트립핑) 하에 수행될 수 있다. 적합하게는, 건조 단계 (ii)는 적어도 1시간, 특히 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 16시간, 그리고 최대 20시간 (예를 들어, 밤새) 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 건조 단계를 20시간 초과의 시간 동안 수행하는 것이 또한 가능하다. 특히, 건조는 실온 (18 내지 24℃)에서 수행된다. 종래 기술에 따르면, 수지 상의 펩티드는 Mmt- 또는 Mtt-기가 수지로부터 절단되기 전에는 건조되어서는 안 된다. 일반적으로, 수지는 펩티드의 N-말단, 이 경우 라이신의 ε-아미노기의 양호한 접근성을 보장하기 위하여 전체 합성 내내 잘 팽창될 것으로 믿어진다. 본 발명의 방법의 단계 (ii)에 따른 건조 동안, 수지는 상당히 수축되며, 모든 잠재적인 반응성 부위는 추가 단계를 위하여 여전히 자유롭게 접근가능하다는 것이 예측될 수 없었다. 게다가, 추가 건조 단계는 합성 지속 기간을 증가시키고, 더 많은 양의 용매가 요구되어서 이 절차의 비용을 증가시킴에 따라, 당업자는 추가적인 약점을 걱정했을 것이다. 그러나, 놀랍게도, 이러한 중간 건조 단계는 유리하였고, 상기 예상된 약점을 훨씬 능가함이 밝혀졌다. 예를 들어, 예비건조 단계는 트리틸계 라이신 보호기의 더 완전한 제거에 유익하다.

그 후, 건조되고 수축된 수지는 변형될 라이신 측쇄의 탈보호 (단계 (iii))를 위하여 디클로로메탄 (DCM) 중 트리플루오로아세트산 (TFA)의 용액으로 직접적으로 수 회 처리될 수 있거나, 상기 수지는 TFA/DCM 처리 전에 예를 들어, 디클로로메탄으로 세척될 수 있다. TFA/DCM의 적용 전에 수축된 수지를 팽창시킬 필요가 없음을 주지하는 것이 중요하다. 본 발명자는, 최종 펩티드의 합성의 이러한 단계에서, 규모확대 효과가 있음을, 즉, 합성의 몰 규모가 증가될 때, 의도된 라이신 변형을 갖지 않는 원하지 않는 부산물의 양이 평균보다 많이 증가됨을 밝혀냈다. 놀랍게도, 이러한 규모확대 효과의 부정적인 영향은 단계 (iii)의 반복 횟수에 따라 저하될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 특정 실시형태에서, 수지-결합된 펩티드는 DCM 중 TFA의 용액으로 적어도 5회, 특히 7, 8, 9 또는 10회 처리된다. 각각의 처리의 시간은 적어도 5분, 특히 적어도 10분이다. DCM 중 TFA의 농도는 0.5 내지 1.5% (v/v), 특히 약 1% (v/v), 더 구체적으로 1% (v/v)이다. 이러한 농도의 선택은, 특히 하나 초과의 라이신 잔기를 함유하는 펩티드의 합성에 있어서 특정한 유리한 효과를 갖는다. 더 높은 농도의 TFA, 예를 들어, DCM 중 2% TFA를 이용하면, Mmt- 또는 Mtt-보호기가 절단될 뿐만 아니라 부분적으로 라이신에 사용되는 다른 보호기, 예를 들어, Boc도 절단되며, 특히 수 회 (예를 들어, 6 내지 12회) 반복하여 수행할 때, 이에 의해 펩티드 쇄에서의 상이한 라이신들의 원하지 않는 다수의 아실화가 야기된다. TFA 농도를 0.5 내지 1.5% (v/v)로 유지함으로써 이를 피할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 "수지-결합된 펩티드"는 고상 펩티드 합성에 적합한 수지를 지칭하는데, 본 발명에 따른 펩티드가 상기 수지에 공유 결합된다.

바람직한 특정 실시형태에서, 수지-결합된 펩티드는 DCM 중 약 1% (v/v)의 TFA의 용액을 이용하여 적어도 5분 동안 적어도 7회, 특히 적어도 10분 동안 9회 또는 적어도 15분 동안 9회 처리된다. 일 실시형태에 따르면, 상기 처리는 DCM 중 1% (v/v)의 TFA를 이용하여 9회 (10분 동안) 수행된다.

DCM 중 TFA를 이용한 처리 단계들의 수는 특히 합성 규모에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 10 mmol까지의 규모에 있어서, DCM 중 약 1%의 TFA를 이용한 5회의 처리가 충분하다. 50 mmol 이상의 규모에 있어서, 적어도 5회의 처리가 실시될 수 있다. 100 mmol 이상의 규모에 있어서, 적어도 7회의 처리가 실시될 수 있다. 500 mmol 이상의 규모에 있어서, 적어도 9회의 처리가 실시될 수 있다. 예로서, 800 mmol의 규모에 있어서, DCM 중 1% (v/v)의 TFA를 이용한 10분 동안 9회의 처리가 수행될 수 있다.

DCM의 낮은 비점을 고려하여, 처리 단계 동안의 온도는 이 비점 미만으로 설정된다. 유리하게는, 처리는 약 0℃, 예를 들어, 0 내지 5℃까지 냉각된 수지-결합된 펩티드로 시작된다. TFA/DCM 처리 동안, 온도는 25℃까지 상승할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 제1 처리 단계는 0 내지 5℃의 온도 범위에서 실시되며, 이후의 처리 단계는 5 내지 15℃의 온도에서 실시되며, 최종 처리 단계는 15 내지 25℃의 온도에서 실시된다. 예를 들어, TFA/DCM을 이용한 9회의 처리 단계가 실시될 때, 이들 중 세 번은 0 내지 5℃, 세 번은 5 내지 15℃, 그리고 세 번은 15 내지 25℃에서 수행될 수 있다.

일단 TFA/DCM 처리가 완료되면, 수지-결합된 펩티드는 예를 들어, DCM으로 세척될 수 있다. 후속적으로, 수지-결합된 펩티드는 중화된다 (단계 (iv)). 수지-결합된 펩티드는 일단 7 이상, 특히 7.5 이상, 더 구체적으로 8.0 이상의 pH에 도달하면 충분히 중화된 것으로 간주된다.

중화는 수지-결합된 펩티드를 유기 극성 비양성자성 용매 중 3차 알킬아민의 1% 내지 5% 용액과 함께 적어도 1회 인큐베이션시킴으로서 달성된다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 중화 용액으로는 디클로로메탄 중 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA), 디클로로메탄 중 N-메틸모르폴린 (NMM), 또는 디클로로메탄 중 트리에틸아민이 있다. 특히, DCM 중 DIPEA의 2% 내지 4%, 더 구체적으로 3% (v/v) 용액이 사용될 수 있다.

중화는 적어도 1회, 특히 적어도 10분 동안 실시되며, 이어서 임의로, 중화 단계 후 용매 혼합물의 pH가 결정된다. 놀랍게도, 중화는 특히 더 큰 규모에 있어서 후속 커플링 반응에서 양호한 수율에 요구됨이 밝혀졌다. 또한 놀랍게도, 수지에 존재하는 잔존 TFA는 대개 중화 용액에서의 1회의 인큐베이션에 의해서는 충분히 중화되지 않음이 밝혀졌다. 따라서, 제1 인큐베이션 후 용매 혼합물의 pH가 너무 산성인 경우, 중화 용액을 이용한 적어도 1회의 추가 인큐베이션이 실시된다. 특정한 실시형태에서, 중화 용액을 이용한 수지-결합된 펩티드의 2회 초과의 인큐베이션, 예를 들어, DCM 중 3% DIPEA를 이용한, 예를 들어, 3회의 인큐베이션, 특히 5회의 인큐베이션이 수행된다. 일부 실시형태에서, 중화 용액, 예를 들어, DCM 중 3% DIPEA를 이용한 6회의 인큐베이션이 수행된다.

예시적인 실시형태에서, 중화는 0 내지 25℃의 온도 범위에서 실시된다. 온도를 특정한 좁은 범위에서 유지하거나 온도를 점진적으로 증가시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 1회 초과의 중화 단계가 실시될 때, 제1 중화는 0 내지 5℃의 온도에서 수행될 수 있는 반면에, 후속적인 중화 인큐베이션은 5 내지 15℃ 또는 심지어 15 내지 25℃의 온도에서 실시된다.

중화 후, 수지 상의 펩티드는 (염기 없이) 중화에서 사용되는 유기 극성 비양성자성 용매를 이용하여 적어도 1회 및 추가의 극성 비양성자성 용매, 예를 들어, 디메틸포름아미드 (DMF)를 이용하여 적어도 1회 세척된다. 특히 DMF는 후속적인 커플링이 HBTU 및 DIPEA의 사용을 포함할 때 사용된다. 추가 용매를 이용한 세척은 특히 1회보다 많이, 예를 들어, 3회 수행된다.

관심 펩티드의 다음 합성 단계에서, 적어도 하나의 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc)-결합된 링커 모이어티가 표준 절차에 따라 활성화되며, 탈보호된 라이신 측쇄에 커플링된다 (단계 (v)).

일반적으로 본 발명에 따른 "링커 모이어티"는 하나의 말단에서 탈보호 라이신의 자유 아미노 측쇄 기에 결합하고 다른 하나의 말단에서 친유성 모이어티의 자유 작용기 (예를 들어, 지방산의 카복시 기)에 결합하기에 적합한 작용기를 갖는 선형 단쇄 분자이다. 특히, 링커 모이어티는 아미노 및 카복시로부터 독립적으로 선택되는 말단 작용기 (즉, 각 말단의 하나의 작용기)를 함유하는 C₁-C₁₀ 알킬 쇄이며, 여기서, 알킬 쇄에서의 탄소 원자들 중 1개, 2개 또는 3개의 탄소 원자는 산소로 대체될 수 있다. 본 발명에 따른 "링커 모이어티"의 비제한적 예로는 천연 발생 및 비-천연 발생 아미노산, 특히 β-알라닌 (β-Ala), γ-글루탐산 (γE), γ-아미노부티르산 (GABA), 아미노-에톡시-에톡시 아세트산 (AEEAc) 및 ε-아미노헥산산 (EACA) (모두 그의 입체이성질체 형태)이 있다.

라이신 측쇄와 친유성 기 사이의 완전한 링커는 그러한 링커 모이어티들 중 하나 이상, 특히, 1개, 2개 또는 3개의 동일하거나 상이한 링커 모이어티로 이루어질 수 있다. 특정한 실시형태에서, 상기 완전한 링커는 β-Ala, γE, GABA, AEEAc 및 EACA로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 링커 모이어티로 이루어진다. 완전한 링커의 구체적인 예로는 β-Ala, γE, GABA, AEEAc, EACA, β-Ala-β-Ala, γE-γE, γE-γE-γE, AEEAc-AEEAc-γE, 및 AEEAc-AEEAc-AEEAc가 있다. 바람직한 특정 실시형태에서, 링커는 γE이다.

친유성 모이어티가 커플링되는 링커의 작용기 (즉, 라이신 측쇄에 커플링되는 것이 아닌 말단 작용기)는 Fmoc로 보호된다. 특정한 실시형태에서, Fmoc-결합된 링커 모이어티는 Fmoc-Glu-OtBu이다. 예시적인 실시형태에서, Fmoc-Glu-OtBu는 3 당량의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 6 당량의 DIPEA (DMF 또는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오르포스페이트 (HATU) 중) 및 6 당량의 DIPEA (DMF 중)로 활성화된다.

커플링 혼합물은 탈보호된 라이신 측쇄를 갖는 수지에 첨가되며, 충분한 양의 시간, 예를 들어, 3 내지 4시간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션은 특히 교반 (예를 들어, 30 내지 100 rpm에서)을 이용하여 실시된다. 커플링의 완료 후, 커플링 혼합물은 수지로부터 제거되며, 수지-결합된 펩티드는 커플링에 사용되는 용매, 예를 들어, DMF로 세척된다. 완전한 링커가 하나 초과의 링커 모이어티로 이루어진 경우, 커플링은 제1 링커 모이어티의 탈보호 후 반복된다.

후속적인 단계 (vi)에서, 단계 (v)에서의 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 말단 작용기는 탈보호된다. Fmoc에 대한 탈보호 조건은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 특정한 실시형태에서, 단계 (vi)에서의 탈보호는 수지 상의 펩티드를 염기를 이용하여 적어도 5분 동안 적어도 1회 처리함에 의해, 이어서 적어도 1회의 세척 단계에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, Fmoc-탈보호는 적합한 농도의 피페리딘, 예를 들어, DMF 중 20% 피페리딘을 이용한 적어도 1회의 처리에 의해 실시될 수 있다. 특히, 탈보호는 DMF 중 20% 피페리딘를 이용하여 두 인큐베이션 단계에서, 예를 들어, 5분 및 20분간 수행된다. 탈보호의 완료 후, 수지-결합된 펩티드는 더 진행되기 전에 용매를 이용하여 적어도 1회 세척된다.

다음, 친유성 모이어티는 예를 들어, 하이드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt 수화물) 및 디이소프로필 카보디이미드 (DIC)와 함께 인큐베이션시킴으로써 탈보호 링커에의 그의 커플링을 준비하도록 활성화된다. 특정한 실시형태에서, 활성화는 사용되는 친유성 모이어티를 예를 들어, DMF에서 10분 동안 당량의 HOBt 수화물 및 DIC와 함께 인큐베이션함으로써 행해진다.

본 발명에 따른 적합한 "친유성 모이어티"는 특히 지방산이다. 지방산 중에서, 특히 팔미트산, 스테아르산 및 미리스트산이 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 팔미트산이 친유성 모이어티로서 선택된다. 바람직한 특정 실시형태에서, 팔미트산은 γE를 통하여 수지-결합된 펩티드의 Lys(14)에 커플링된다.

그 후 예비활성화된 친유성 모이어티, 특히 예비활성화된 지방산이 수지-결합된 펩티드에 부가된다. 링커의 탈보호된 말단 작용기에의 활성화된 친유성 모이어티의 커플링, 즉, 본 발명에 따른 방법의 단계 (vii)은 적어도 2시간, 특히 4시간 내지 22시간 동안 진행된다. 특정 실시형태에서, 활성화된 지방산, 예를 들어, 팔미트산이 링커의 말단 작용기로서 탈보호된 아미노기를 갖는 수지-결합된 펩티드에 부가되며, HOBt 수화물/DIC를 이용하여 커플링된다. 바람직한 특정 실시형태에서, 탈보호된 아미노기를 갖는 링커는 γE이다.

커플링의 완료 후, 커플링 용액은 수지로부터 제거되며, 수지는 커플링 단계의 용매로 적어도 1회 세척된다. 상이한 용매들을 이용한 추가 세척이 또한 실시될 수 있다. 특정 실시형태에서, 수지-결합된 펩티드는 커플링에 사용되는 용매, 예를 들어, DMF로 적어도 1회, 지방족 알코올, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올 또는 이소프로판올 (IPA)로 적어도 1회, 및 디알킬 에테르, 예를 들어, 디에틸 에테르, 3급-부틸메틸 에테르, 디이소프로필 에테르 (DIPE) 또는 디이소부틸 에테르로 적어도 1회 세척된다. 예시적인 실시형태에서, 하기 세척이 실시된다: DMF로 2회, IPA로 3회, DIPE로 3회. 추가의 예시적인 실시형태에서, 하기 세척이 실시된다: DMF로 3회, IPA로 3회, DIPE로 3회.

세척된 수지 상의 펩티드는 다음 단계 (단계 (viii))에서 건조된다. 특정한 실시형태에서, 수지의 건조는 진공하에 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 건조는 불활성 가스 하에서, 예를 들어, 계속적인 질소 스트림 (스트립핑 질소)에서 수행된다.

단계 (viii)의 완료 후, 펩티드는 수지로부터 절단될 준비가 되며, 이는 본 발명에 따른 방법의 단계 (ix)에서 행해진다.

특정한 실시형태에서, 충분한 백분율의 펩티드가 원하는 친유성 변형을 갖는 것을 확실히 하기 위하여, 이것은 절단 반응까지 직접적으로 진행되는 것이 아니다. 오히려, 이러한 실시형태에서, "공정 중 관리(in process control)"가 행해진다. 따라서, 이러한 실시형태들에서, 수지-결합된 펩티드가 본 발명의 방법의 단계 (viii)에서 건조된 후, 단계 (iii)의 탈보호 수율은 수지-결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 분석된다 (단계 (viii-a)).

(viii-a1) 수지의 테스트 샘플을 전체 반응 배치로부터 제거하고, 단계 (ix)에서와 동일한 조건하에, 그리고 단계 (ix)에서와 동일한 절단 칵테일을 이용하여 펩티드를 테스트 샘플로부터 절단하는 단계; 및

테스트 샘플은 전체 반응 배치와 비교하여 작을 것이다. 대개 전체 반응 배치의 0.1% 이하의 샘플 크기가 충분할 것이다.

단계 (viii-a)에서의 분석 결과에 따라, 단계 (iii) 내지 (viii-a)는 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이 충분해질 때까지 임의로 반복된다. 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 충분한 함량은, 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 더 구체적으로 적어도 95%, 또는 심지어 >95%, 예를 들어, 96, 97, 98 또는 99%일 수 있다. 예를 들어, 제1 테스트 절단이 50%의 변형된 라이신 측쇄 함량을 나타내는 경우, 수율을 증가시키기 위하여 재프로세싱 (즉, 단계 (iii) 내지 (viii-a)의 반복)이 유리하다. 재프로세싱 후, 변형된 라이신 측쇄의 함량이 예를 들어, 85%보다 많다면, 단계 (ix), 즉, 수지로부터의 벌크 펩티드의 절단을 진행하는 것이 가능하다. 반면에, 재프로세싱 수율이 예를 들어, 60%까지의 변형된 라이신 측쇄 함량 증가만을 생성할 경우, 추가의 재프로세싱이 지시된다. IPC가 재프로세싱과 조합된 것을 도입함으로써, 본 발명의 방법은 규모확대 효과와는 관계가 없게 되며, 그 이유는 합성 단계들이 생성물의 수율 및/또는 순도를 최적화하기 위하여 반복되거나 조정될 수 있기 때문이다.

따라서, 본 발명의 바람직한 특정 실시형태에서, Mmt 절단은 DCM 중 1% TFA를 이용하여 적어도 10분 동안 9회 수행되며, 중화는 pH 제어를 이용하여 수행되며, 특히 더 큰 규모를 위한 재프로세싱이 적용된다.

변형된 라이신 측쇄를 갖는 원하는 펩티드의 수율 및/또는 순도를 증가시키는 하나의 특정한 수단은 본 발명의 방법의 단계 (iii)에서의 DCM 중 TFA를 이용한 처리의 횟수의 조정임이 밝혀졌다. 예를 들어, 관심 펩티드에서의 변형된 라이신 측쇄의 함량이 너무 낮을 경우, TFA/DCM-처리 횟수는 증가될 수 있다. 특히 단계 (iii)에서의 DCM 중 TFA의 처리 횟수는 단계　(ix)에서의 변형된 라이신 측쇄의 수율이 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 더 구체적으로 적어도 95%, 또는 심지어 >95%, 예를 들어, 96, 97, 98 또는 99%이도록 조정된다.

일단 테스트 절단이 원하는 결과 (즉, 단지 최소의 양의, 비변형된 라이신 측쇄를 갖는 부산물)를 제공하면, 또는 테스트 절단이 수행되지 않는 경우, 단계 (viii) 직후 수지로부터의 펩티드의 절단이 실시된다. 본 발명의 맥락에서, 바람직하게는 절단은 특정하게 개발된 절단 칵테일을 이용하여 실시되는데, 상기 칵테일은 종래에 사용된 킹 칵테일 (문헌[King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990]) (트리플루오로아세트산 (TFA), 페놀, 물, 티오아니솔 및 1,2-에탄디티올 (EDT)을 포함함)과 비교하여 장점을 갖는다.

절단된 펩티드의 더 양호한 수율, 더 높은 함량 및 더 양호한 순도는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없는 절단 칵테일을 사용할 때 달성될 수 있음이 밝혀졌다. 특히, 본 발명에 따른 적합한 절단 칵테일은 적어도 90% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (v/v)의 에탄디티올을 포함하며, 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없다. 본 발명의 추가의 적합한 절단 칵테일은 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없고 적어도 80% (w/w)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (w/w)의 1,2-에탄디티올을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 밀도에 관한 계산은 트리플루오로아세트산의 경우 1.53 g/cm³ (20℃에서) 및 1,2-에탄디티올의 경우 1.12 g/cm³ (20℃에서)의 값을 이용하여 실시되었다. 예를 들어, 이러한 값들은 TFA 또는 EDT의 질량을 주어진 부피로부터 계산하는데, 예를 들어, 중량:중량 (w/w) 비를 계산하는데 사용될 수 있다.

예시적인 실시형태에서, 91 내지 93% (v/v)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 6% (v/v)의 페놀 및 1 내지 8%　(v/v)의 에탄디티올로 이루어진 절단 칵테일이 사용된다. 다른 실시형태에서, 96 내지 98% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 2 내지 4% (v/v)의 에탄디티올로 이루어진 절단 칵테일이 사용된다.

본 발명에 따른 특정한 예시적 절단 칵테일로는 (i) 약 92.2% (v/v)의 트리플루오로아세트산, 약 5.1% (v/v)의 페놀 및 약 2.7% (v/v)의 에탄디티올로 이루어진 용액 및 (ii) 약 97.1% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 약 2.9% (v/v)의 에탄디티올로 이루어진 용액이 있다.

게다가, 보조 스캐빈저로서의 적합한 인돌 화합물의 사용은, 이것이 수지로부터의 펩티드의 절단 동안 펩티드의 트립토판 잔기 및 링크 링커의 분해 생성물에 의해 형성되는 특정한 원하지 않는 부산물의 발생의 효율적인 억제를 돕기 때문에, 청구된 방법을 추가로 개선시킬 수 있음이 본 발명자에 의해 밝혀졌다. 오가와 (Ogawa) 등(문헌[Chem. Pharm. Bull. 26(10) 3144-3149 (1978)])은 TFA를 이용한 Z(OMe)-Trp-OH 또는 Boc-Trp-OH의 처리 동안 부반응을 억제하기 위한 3-메틸인돌의 사용을 언급하고 있다. 그러나, 3-메틸인돌은 단지 스캐빈저 시스템의 일부로서 아니솔 및 EDT, 티오아니솔 및 EDT 또는 디메틸술피드 및 EDT와 함께 사용된다. 본 발명에 따른 적합한 인돌 화합물은 상기 원하지 않는 부생성물을 효율적으로 제거하는 것이다. 예를 들어, 적합한 인돌 화합물은 탄소 원자 C3 또는 질소 원자에서 저급 (C₁-C₃) 알킬 또는 저급 아실 (C₁-C₃) 치환기를 지닌 인돌, 특히 N-아세틸인돌 및 3-메틸인돌 (스카톨로도 공지됨)일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 3-메틸인돌이 인돌 화합물로서 사용된다.

따라서, 본 발명의 추가의 적합한 절단 칵테일은 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없고 적어도 90% (w/w)의 트리플루오로아세트산, 적어도 1% (w/w)의 1,2-에탄디티올 및 적어도 0.5% (w/w)의 적합한 인돌 화합물, 예를 들어, 3-메틸인돌을 포함한다. 추가의 예시적인 실시형태에서, 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산 (TFA), 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 (EDT) 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌 (3-MI)로 이루어진, 특히 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진 절단 칵테일이 사용된다.

본 발명에 따른 추가의 예시적인 절단 칵테일로는 (iii) 약 97% (w/w)의 TFA, 약 2% (w/w)의 EDT 및 약 1%의 3-MI로 이루어진 용액 및 (iv) 약 96.9% (w/w)의 TFA, 약 2.3% (w/w)의 EDT 및 약 0.8% (w/w)의 3-MI로 이루어진 용액이 있다.

수지로부터의 펩티드의 절단은 상대적으로 넓은 온도 범위에 걸쳐 실시될 수 있다. 특히, 절단은 5 내지 15℃, 15 내지 22℃ 및/또는 22 내지 30℃에서, 특히 25℃에서 수행될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 절단은 실온 (18 내지 24℃)에서 수행된다. 인큐베이션 시간은 바람직하게는 가능한 한 짧다. 대개, 약 4시간, 특히 실온에서의 4시간의 인큐베이션이 허용가능한 절단의 수득에 충분하다. 그러나, 본 발명의 바람직한 특정 실시형태에서, 절단 시간은, 절단 반응을 25℃에서 수행할 경우 단지 2시간까지 감소될 수 있는데, 이는 TFA에의 펩티드 노출이 상당히 감소된다는 장점을 갖는다. 놀랍게도, 온도의 증가에도 불구하고, 원하지 않는 이성질체의 형성이 유의하게 증가되는 것은 아님이 밝혀졌다. 예시적인 실시형태에서, 절단은 교반 (예를 들어, 30 내지 100 rpm에서)을 이용하여, 2 내지 3시간 동안, 특히 25℃에서 2 내지 3시간 또는 2.0 내지 2.5시간 동안 수행된다. 다른 실시형태에서, 절단은 교반 (예를 들어, 30 내지 100 rpm에서)을 이용하여 30℃에서 1 내지 1.5시간 동안 수행된다.

이에 더하여, 또는 대안적으로, 수지상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 부피는 이후의 프로세싱 및 정제를 용이하게 하기 위하여 조정될 수 있다. 놀랍게도, 절단 칵테일의 부피를 종래의 절차와 비교하여 10% 이상, 특히 20% 이상, 30% 이하만큼 감소시키는 것이 가능함이 밝혀졌다. 예시적인 실시형태에서 상기 부피는, 약 9 ml/g, 예를 들어, 9.2 ml/g의 킹 칵테일의 표준 부피를 고려하면, 약 24%만큼 감소될 수 있다. 정량적 규모에서, 이것은 수지 상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 부피가 예를 들어, 9.5 ml 내지 5.5 ml, 특히 7.0 ml 내지 6.0 ml일 수 있음을 의미한다.

특정한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (ix)에 따른 절단은 다음을 이용하여 수행된다:

(a) 91 내지 93% (v/v)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 6% (v/v)의 페놀 및 1 내지 8%　(v/v)의 에탄디티올, 예를 들어, 약 92.2% (v/v)의 TFA, 약 5.1% (v/v)의 페놀 및 약 2.7%의 EDT로 이루어진 절단 칵테일,

(b) 25℃의 승온에서의 2.0 내지 2.5시간의 인큐베이션 시간, 및

(c) 수지 상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 부피의 감소, 예를 들어, 7.0 ml 내지 6.0 ml.

바람직한 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (ix)에 따른 절단은 다음을 이용하여 수행된다:

(b) 25℃의 승온에서의 단지 2시간의 인큐베이션 시간, 및

다른 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (ix)에 따른 절단은 다음을 이용하여 수행된다:

(a) 96 내지 98% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 2 내지 4% (v/v)의 에탄디티올, 예를 들어, 약 97.1% (v/v)의 TFA 및 약 2.9% (v/v)의 EDT로 이루어진 절단 칵테일,

다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (ix)에 따른 절단은 다음을 이용하여 수행된다:

(b) 25℃의 승온에서의 단지 2시간의 인큐베이션 시간, 및

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 (ix)에 따른 절단은 다음을 이용하여 수행된다:

(a) 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진, 특히 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-MI, 예를 들어, 약 97% (w/w) TFA, 약 2% (w/w) EDT 및 약 1% 3-MI로 이루어진 절단 칵테일,

(b) 25℃의 승온에서의 단지 2.0 내지 2.5시간의 인큐베이션 시간, 및

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 수지로부터의 펩티드의 절단 후 추가 단계, 즉 다음의 단계를 포함한다:

(x) 절단 후 상기 펩티드 용액을 여과시키는 단계;

(xi) 상기 여과된 펩티드 용액을 진공하에 증류시키는 단계;

(xii) 상기 증류로부터의 잔존 분획을 디알킬 에테르 및 헵탄을 포함하는 항용매에 첨가하는 단계;

(xiii) 상기 침전된 용액을 교반시키는 단계;

(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;

(xv) 상기 침전물을 세척하는 단계; 및

(xvi) 상기 습윤 펩티드를 건조시키는 단계.

이러한 단계들은 관심 펩티드의 추가 정제를 돕는다. 우선, 단계 (ix)의 절단 생성물의 여과 (단계 (x))는 친유성으로 변형된 펩티드가 고체 지지체로부터 분리되게 한다. 대개 여과는 실온에서 실시된다. 남아 있는 필터 케이크를 적합한 헹굼 용액으로 적어도 1회 헹구어서 잔존 펩티드를 고체 지지체로부터 완전히 회수한다. 본 발명에 따른 적합한 헹굼 용액으로는 트리플루오로아세트산이 있다. 필터 케이크는 TFA로 1회 내지 5회, 특히 3회 헹구어질 수 있다.

수집된 여과액 분획 (제1 여과로부터의 여과액 및 필터 케이크의 헹굼으로부터의 여과액들)을 풀링하고, 부피 감소를 위하여 단계 (xi)에서 진공하에 증류시킨다. 일부 실시형태에서, 적용되는 진공은 50 mbar 이하이며, 증류 온도는 30℃ 이하이다. 예시적인 실시형태에서, 용액은 약 1 내지 약 2.5시간, 예를 들어, 1.5 내지 2시간 동안 증류된다. 증류는 펩티드-함유 용액의 부피를 침전 전 부피의 약 1/3까지 감소시킨다. 펩티드는 잔존 분획 내에 남아 있으며, 증류물은 주로 TFA를 함유한다.

증류에 후속하여, 농축된 펩티드-함유 용액은 디알킬 에테르 및 헵탄을 포함하는 항용매에 첨가된다 (단계 (xii)). 일부 실시형태에서, 항용매는 디이소프로필 에테르 (DIPE) 및 n-헵탄으로 이루어진 혼합물이다. DIPE 대 n-헵탄의 비는 예를 들어, 25:75 내지 35:65 (v/v)의 범위일 수 있다. 예시적인 실시형태에서, DIPE/n-헵탄의 비는 25:75 (v/v) 또는 30:70 (v/v) 또는 35:65 (v/v)이다.

용기 (이로부터 농축된 펩티드-함유 용액이 옮겨짐)를 대개 적합한 용매, 예를 들어, TFA로 1회 헹구어서 수율을 최대화한다.

특정한 실시형태에서, 항용매는 약 0 내지 5℃까지 예비냉각된다. 일부 실시형태에 따르면, 이러한 예비냉각된 항용매에 펩티드-함유 용액이 약 20 내지 약 60분의 기간에 걸쳐 첨가된다.

항용매는 펩티드-함유 용액으로부터의 관심 펩티드의 침전에 요구된다. 또한 침전은 단지 디알킬 에테르를 사용할 때 가능하다. 그러나, 본 발명자는 놀랍게도, 특히 n-헵탄을 함유하는 항용매가 후속적인 여과에 요구되는 시간에 유리하게 영향을 줌을 밝혀냈다. 예를 들어, 25:75 (v/v) 내지 35:65 (v/v)의 범위의 DIPE/n-헵탄의 혼합물을 사용함으로써, 침전 후 여과 시간은 항용매로서 DIPE 단독을 사용하는 경우와 비교하여 최대 약 60배만큼 감소될 수 있다 (실시예 참조).

펩티드-함유 용액을 항용매에 첨가하는 것이 완료된 후, 생성된 펩티드 현탁물은 예를 들어, 약 10 내지 15℃까지 조절된다. 후속적으로, 침전물은 에이징되며 (단계 (xiii)), 즉, 이것은 예를 들어, 20 내지 30 rpm 및 예를 들어, 10 내지 15℃의 온도에서 특정한 양의 시간 동안 교반된다. 예를 들어, 에이징은 1 내지 20시간, 예를 들어, 2 내지 18시간 또는 10 내지 20시간 동안 실시된다.

에이징 단계 (xiii)의 완료시에, 침전된 용액은 주로 DIPE, 헵탄 및 TFA로 이루어진 모액으로부터 원하는 펩티드, 즉 침전물을 분리하기 위하여 여과된다 (단계 (xiv)). 그 후 필터 상의 침전물은 적합한 유기 용매, 예를 들어, 에틸 아세테이트로 헹구어질 수 있다.

후속적으로, 필터 상의 침전물은 적어도 1회 세척된다 (단계 (xv)). 특정한 실시형태에서, 필터 상의 침전물의 세척은 (xv-a) 침전물을 적합한 유기 용매에 재현탁시키는 것, (xv-b) 생성된 현탁물을 교반시키는 것, 및 (xv-c) 유기 용매를 여과 제거하는 것을 포함한다. 예시적인 유기 용매로는 에틸 아세테이트가 있다. 교반은 예를 들어, 30 내지 60분 동안 실시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 침전물은 적어도 2회, 또는 적어도 3회 세척된다. 특정한 실시형태에서, 침전물은 에틸 아세테이트로 1 내지 5회, 특히 2 내지 4회 또는 3 내지 5회 또는 4 내지 5회 세척된다.

마지막 세척의 세척 용액을 여과 제거한 후, 침전물, 즉, 관심 있는 습윤 조 펩티드를 건조시킨다. 건조는 진공하에, 예를 들어, 20 내지 25℃에서 실시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조는 70 mbar 이하의 진공하에 20 내지 25℃ 및 질소 스트립핑에서 실시된다.

친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 특히 30 내지 44개, 더 구체적으로 38 내지 40개 아미노산, 더 구체적으로 39개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 여기서, 바람직하게는 (i) 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 65%이고/이거나 (ii) 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 70%이고/이거나 (iii) 상기 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있다.

예시 목적을 위하여, 야생형 엑센딘-4 (서열 번호 3)의 아미노산 위치의 할당은 하기와 같이 제공된다:

야생형 (wt) 엑센딘-4의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 적어도 65%의 동일성은 야생형 엑센딘-4와 비교하여 최대 4개의 아미노산이 치환됨을 의미한다. 특히, 이 영역에서의 돌연변이에 적합한 위치는 위치 1, 2, 3, 10, 12 및 13이다. 바람직한 특정 실시형태에서, 야생형 (wt) 엑센딘-4의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역은 위치 2 및 3에서의 돌연변이를 함유한다. 바람직한 특정 실시형태에서, 돌연변이는 Gly2D-Ser (즉, 위치 2에서 글리신으로부터 D-세린으로의 돌연변이) 및 Glu3Gln (즉, 위치 3에서 글루타메이트로부터 글루타민으로의 돌연변이)이다.

야생형 엑센딘-4의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 적어도 70%의 동일성은 야생형 엑센딘-4와 비교하여 최대 5개의 아미노산이 치환됨을 의미한다. 특히, 본 발명에 따르면 이 영역에서의 돌연변이에 적합한 위치는 위치 23, 24, 27, 28, 29 및 35이다. 바람직한 특정 실시형태에서, 야생형 (wt) 엑센딘-4의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역은 위치 28에서의 돌연변이를 함유한다. 바람직한 특정 실시형태에서, 돌연변이는 Ala28Asn (즉, 위치 28에서 알라닌으로부터 아스파라긴으로의 돌연변이)이다.

바람직한 특정 실시형태에서, 단리된 펩티드는 엑센딘-4 유도체이며, 단지 하나의 변형된 라이신 측쇄를 함유한다. 이러한 단일 변형 라이신은 특히 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14에 위치한다.

특정 실시형태에서, 단리된 펩티드는 39개 아미노산의 길이를 가지며, 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 65%이며, 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 70%이며, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있다.

추가 실시형태에서, 단리된 펩티드는 39개 아미노산의 길이를 가지며, 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 80%이며 (즉, 2개 이하의 돌연변이를 함유함), 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 90%이며 (즉, 1개 이하의 돌연변이를 함유함), 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있다. 바람직한 특정 실시형태에서, 본 발명의 단리된 펩티드는 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서 정확하게 2개의 돌연변이를 함유하며, 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서 정확하게 1개의 돌연변이를 함유하며, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 위치 14 (Lys(14))에 있으며, 이들 각각은 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련된다.

바람직한 특정 실시형태에서, 단리된 펩티드는 아미노산 서열 H-dS-Q-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-K(γE-Palm)-E-S-K-A-A-Q-D-F-I-E-W-L-K-A-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH₂ (서열 번호 1)를 갖는다. 본 발명의 맥락에서 "γE-Palm"은 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일 아미노부티릴 모이어티를 나타내며, "dS"는 D-Ser을 나타낸다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시한다.

실시예

실시예 1: 링크 아미드 수지를 이용한 고상 펩티드 합성

제1 실시예에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 링크 아미드 수지 및 Fmoc 전략을 사용하여 SPPS를 통하여 합성하였다.

수지의 로딩: 고상 합성을 DMF 중 20% 피페리딘으로 2회 (5분 및 20분) 탈보호한 링크 아미드 수지 (4-[(2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸]페녹시 아세트아미도 메틸 수지)로 시작하였다. 상기 수지의 로딩은 0.2 내지 0.9 mmol/g의 범위일 수 있다. 상기 수지를 DMF로 철저히 세척하였다. 그 후, Fmoc-Ser(tBu)-OH를 커플링 시약인 DMF 중 HOBt 수화물 및 DIC (이들은 Fmoc-아미노산에 대하여 등몰의 양으로 사용함)를 사용하여 링크-수지 상의 유리된 아미노기에 커플링시켰다. 커플링 시간은 18 내지 22시간의 범위일 수 있다. 그 후, 수지를 다시 DMF로 수 회 세척하였다.

선형 쇄의 펩티드 어셈블리: 제1 Fmoc-아미노산을 수지에 커플링시킨 후, Fmoc-기를 다시 DMF 중 20% 피페리딘으로 제거하고 (5분 및 20분), 이어서 DMF로 철저히 세척하고, 다시 커플링 시약으로서 DMF 중 HOBt 수화물 및 DIC를 사용하여 Fmoc-Pro-OH인 다음의 Fmoc-아미노 유도체를 커플링시켰다. 반복적인 사이클에서, 선형 서열을 위치 2까지 합성하였으며, 여기서 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH를 사용한다. 커플링 시간은 2 내지 22시간의 범위이며, 빌딩 블록 및 커플링 시약의 당량은 2 내지 3.5의 범위이다. 위치 37/36에 있어서 디펩티드 Fmoc-Pro-Pro-OH를 이용하였다. 위치 1에 있어서, Boc-His(Trt)-OH를 커플링시켰다. 커플링 및 탈보호 단계 뿐만 아니라, 세척 단계를 10℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 수행할 수 있다.

하기 Fmoc-아미노산 유도체를 적용하였다: 위치 39, 33, 32, 16, 11, 8에 있어서 Fmoc-Ser(tBu)-OH; 위치 38 및 31에 있어서 Fmoc-Pro-OH; 위치 37 및 36에 있어서 Fmoc-Pro-Pro-OH; 위치 35, 19, 18에 있어서 Fmoc-Ala-OH; 위치 34, 30, 29, 4에 있어서 Fmoc-Gly-OH; 위치 27, 17, 12에 있어서 Fmoc-Lys(Boc)-OH; 위치 26, 10에 있어서 Fmoc-Leu-OH; 위치 25에 있어서 Fmoc-Trp(Boc)-OH; 위치 24, 15에 있어서 Fmoc-Glu(OtBu)-OH; 위치 23에 있어서 Fmoc-Ile-OH; 위치 22, 6에 있어서 Fmoc-Phe-OH; 위치 21, 9에 있어서 FmocAsp(OtBu)-OH; 위치 20, 13, 3에 있어서 Fmoc-Gln(Trt)-OH; 위치 14에 있어서 Fmoc-Lys(Mmt)-OH 또는 대안적으로 Fmoc-Lys(Mtt)-OH; 위치 7, 5에 있어서 Fmoc-Thr(tBu)-OH; 위치 2에 있어서 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH; 위치 1에 있어서 Boc-His(Trt)-OH.

실시예 2 Lys (14) 측쇄의 변형

실시예 1의 펩티드를 위치 14에서 추가로 변형시켰으며, 여기서, 본 발명에 따르면 친유성 모이어티가 부착된다. 놀랍게도, 규모확대 효과가 Mmt 절단과 관련하여 관찰됨이 밝혀졌다.

TFA / DCM 을 이용한 수지- 결합된 펩티드의 처리: Lys(14)의 측쇄로부터의 Mmt-기 (모노메톡시트리틸)의 선택적이고 완전한 제거는 이 설명에서 핵심적인 부분 중 하나이다. 절단을 실험실 규모 (8 mmol)로 디클로로메탄 (DCM) 중 1% TFA를 이용하여 수행하였다. Mmt-기의 절단을 위하여, 수지를 DCM으로 세척하고, DCM 중 1% TFA로 3회 처리하였다. 그 후, Fmoc-Glu-OtBu를 3 당량 (eq)의 HBTU 및 6 당량의 DIPEA (DMF 중)를 사용하여 3배 과량의 유리된 아미노기에 커플링시켰다. DMF를 이용한 수 회 세척 후, Fmoc-기를 절단하고, 수지를 다시 세척하고, 팔미트산을 HOBt 수화물 및 DIC를 이용하여 커플링시켰다. 그 후, 펩티드를 킹 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단시키고, HPLC로 분석하였다. 원하는 생성물인 서열 번호 1은 4.3%의 서열 번호 2 (여기서, Lys(14)에서의 측쇄가 누락됨)와 함께 발견되었다.

서열 번호 2

4.3%의 서열 번호 2의 발생은 Mmt-기의 불완전한 제거에 의해 설명될 수 있다.

고상 합성을 상기 프로토콜을 이용하여 36 mmol 규모로 반복하였으며, 놀랍게도, 서열 번호 2의 양이 12.6%까지 증가함이 밝혀졌다. 이미 파일럿 (pilot) 규모 (800 mmol)인 다음 합성을 위하여, DCM 중 1% TFA를 이용한 5회 처리를 적용하였고, 28.7%의 서열 번호 2를 검출하였다.

이러한 예기치 않은 결과는 규모확대 효과로 인한 것이다.

[표 1]

Mmt-기의 절단 효율을 향상시키기 위하여 수 회의 추가 시도를 하였다. 절단 단계를 7회의 처리까지 증가시켰으며, 이는 15.7%의 서열 번호 2의 백분율을 초래하였다 (규모 = 800 mmol).

다음 시험에서, 수지를 건조시킨 후 DCM 중 1% TFA로 처리하였다. 따라서, 수지 상의 선형 펩티드를 이소프로판올로 3회 및 디이소프로필 에테르로 3회 세척하고, 질소 퍼지 하에 16시간 초과의 시간 동안 건조시켰다. 그 후, 수지를 직접적으로 DCM 중 1% TFA로 7회 처리하였으며, 1회의 DCM-세척 및 중화 단계들 (pH>8이 될 때까지 DCM 중 3% DIPEA를 이용하여 수행함)이 이어졌다. Fmoc-Glu-OtBu 및 팔미트산의 커플링을 이미 설명된 바와 같이 수행하였다. 펩티드를 수지로부터 절단한 후 조 생성물을 수득하였으며, 여기서, 서열 번호 2의 백분율은 12.5%였다 (규모 = 680 mmol).

더욱이, Mmt-기의 절단을 이전에 언급된 바와 같이 예비건조 단계를 적용하여 8회 수행하였다. 펩티드를 수지로부터 절단한 후 조 생성물을 수득하였으며, 여기서, 서열 번호 2의 백분율은 8.4%였다 (규모 = 680 mmol).

다음, 절단을 9회 수행하였으며, 여기서, 이전에 언급된 바와 같이 예비건조 단계를 적용하였다. 펩티드를 수지로부터 절단한 후 조 생성물을 수득하였으며, 여기서, 서열 번호 2의 백분율은 3.6%였다 (규모 = 680 mmol).

[표 2]

따라서, 예비건조, TFA/DCM을 이용한 9회의 처리 및 후속적인 중화의 조합을 이용하여 최상의 결과를 달성하였다.

재프로세싱 단계: 추가 규모확대 효과와 관계가 없게 하기 위하여, 규모를 더 증가시킬 경우 (즉, >800 mmol까지, 아마 4000 내지 5000 mmol), 재프로세싱 단계를 확립할 수 있었다. 따라서, 수지 (1 g)로부터의 서열 번호 1의 테스트 절단을 실행하여 특정한 양의 서열 번호 2를 갖는 조 펩티드를 초래한다. 서열 번호 2의 백분율에 따라, 재프로세싱 단계를 수행할 수 있다. 이를 위하여, 건조된 수지 상의 펩티드를 DCM 중 1% TFA로 5회 처리하고, pH>8에 도달할 때까지 DCM 중 3% DIPEA로 중화시키고, DCM으로 세척하고 DMF로 수 회 세척하였다. 그 후, Fmoc-Glu-OtBu (3 당량)의 커플링을 커플링 시약인 HBTU (3 당량) 및 DIPEA (6 당량)를 이용하여 실시하였다. 커플링이 완료된 후, Fmoc-기를 이전에 설명된 바와 같이 제거하고, 팔미트산을 HOBt 수화물 및 DIC를 이용하여 커플링시켰다.

하기 작업 흐름은 재프로세싱 없이 후속적인 커플링을 이용한 Mmt-절단의 주요한 절차를 보여준다.

a) N-말단 아미노산 (Boc-His(Trt)-OH)의 커플링 후, 수지를 디메틸포름아미드 (DMF)로 2회 세척함.

b) 수지를 이소프로판올 (IPA) 및 디이소프로필 에테르 (DIPE)로 3회 세척하며, 수지는 수축됨.

c) 수지를 수 시간 동안, 바람직하게는 밤새, 계속적인 질소 스트림을 통하여 건조시킴.

d) 수지를 각각 10분 동안 TFA (DCM 중 1%)로 9회 처리함.

e) 수지를 DCM으로 세척함.

f) 수지를 각각 10분 동안 디이소프로필에틸 아민 (DIPEA, DCM 중 3%)으로 처리함에 의한 수 회의 중화 단계 (세척 용액의 pH-제어, 종점: pH>8)

g) DCM (1x) 및 DMF (3x)를 이용한 세척

h) 3 당량의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 6 당량의 DIPEA (DMF 중)를 이용한 3 당량의 Fmoc-Glu-OtBu의 활성화. 대안적으로, 다른 염기성 커플링 조건, 또는 심지어 HOBt 수화물 및 DIC를 사용할 수 있음. 커플링 혼합물을 수지에 첨가함. 커플링을 3 내지 4시간 동안 진행시킴.

i) 커플링 혼합물을 수지로부터 제거함. 수지를 DMF로 2회 세척함.

j) Fmoc-기를 피페리딘 (DMF 중 20%)으로 5분 및 20분 동안 2회 처리하여 절단함.

k) 절단 용액을 수지로부터 세척하고, 수지를 DMF로 6회 세척함.

l) 3 내지 3.5 당량의 팔미트산을 3 내지 3.5 당량의 하이드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt 수화물) 및 3 내지 3.5 당량의 디이소프로필 카보디이미드 (DIC)를 이용하여 DMF에서 10분 동안 활성화시킴. 예비활성화된 지방산을 수지에 제공함. 커플링을 4 내지 22시간 동안 진행시킴.

m) 커플링 용액을 수지로부터 제거함. 수지를 DMF로 2회, IPA로 3회 및 DIPE로 3회 세척하고, 진공하에 건조시킴.

n) 이제 수지 상의 펩티드는, 테스트 절단이 단지 최소의 양의 서열 번호 2를 나타내는 경우 조 펩티드를 수득하기 위한 절단에 대해 준비가 됨.

하기 도식은 후속적인 커플링을 이용한 Mmt-절단의 주요한 절차를 보여준다.

하기 작업 흐름은 후속적인 커플링을 이용한 Mmt-절단의 주요한 재프로세싱 절차를 보여준다.

a) 건조된 수지를 각각 10분 동안 TFA (DCM 중 1%)로 5 내지 9회 처리함.

b) 수지를 DCM으로 세척함.

c) 수지를 각각 10분 동안 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA, DCM 중 3%)으로 처리함에 의한 수 회의 중화 단계 (세척 용액의 pH-제어, 종점: pH>8)

d) DCM (1x) 및 DMF (3x)를 이용한 세척

e) 3 당량의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 6 당량의 DIPEA (DMF 중)를 이용한 3 당량의 Fmoc-Glu-OtBu의 활성화. 대안적으로, 다른 염기성 커플링 조건, 또는 심지어 HOBt 수화물 및 DIC를 사용할 수 있음. 커플링 혼합물을 수지에 첨가함. 커플링을 3 내지 4시간 동안 진행시킴.

f) 커플링 혼합물을 수지로부터 제거함. 수지를 DMF로 2회 세척함.

g) Fmoc-기를 피페리딘 (DMF 중 20%)으로 5분 및 20분 동안 2회 처리하여 절단함.

h) 절단 용액을 수지로부터 세척하고, 수지를 DMF로 6회 세척함.

i) 3 내지 3.5 당량의 팔미트산을 3 내지 3.5 당량의 하이드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBt 수화물) 및 3 내지 3.5 당량의 디이소프로필 카보디이미드 (DIC)를 이용하여 DMF에서 10분 동안 활성화시킴. 예비활성화된 지방산을 수지에 제공함. 커플링을 4 내지 22시간 동안 진행시킴.

j) 커플링 용액을 수지로부터 제거함. 수지를 DMF로 2회, IPA로 3회 및 DIPE로 3회 세척하고, 진공하에 건조시킴.

k) 이제 수지 상의 펩티드는 조 펩티드를 수득하기 위한 절단에 대해 준비가 됨.

이러한 신규 Mmt-절단 절차의 적용 (임의로 재프로세싱 절차와 함께)은 원하지 않는 서열 번호 2의 양이 적은 조 펩티드에의 접근을 허용한다.

요컨대, 하기 핵심 단계를 취하여 높은 비율의 Lys(14) 변형을 달성할 수 있다: 예비건조된 수지를 이용하여 Mmt-절단을 시작하고, DCM 중 1% TFA (9회)를 이용하여 Mmt-절단을 수행하고, pH를 제어하면서 중화 단계를 수행하고, Mmt-절단이 완전하지 않을 경우 더 큰 규모를 위한 재프로세싱 절차를 적용한다.

실시예 3: 수지로부터의 펩티드의 절단

고상 합성을 끝낸 후, 펩티드를 수지로부터 절단해야 하고, 또한 산-불안정성 측쇄 보호기를 제거해야 한다. 이러한 수반 반응들은 82.5%의 트리플루오로아세트산 (TFA), 5%의 물, 2.5%의 1,2-에탄디티올 (EDT), 5%의 티오아니솔 및 5%의 페놀로 이루어진 킹 칵테일을 이용하여 수행할 수 있다 (문헌[King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990]). 절단을 실온 (20℃)에서 4시간 동안 수행한다. 조건을 모든 펩티드에 대하여, 또한 서열 번호 1에 대하여 최적화할 수 있다. 그러나, 놀랍게도, 다른 절단 칵테일이 더 양호한 결과를 제공함이 밝혀졌으며, 이는 하기에 상세하게 기재된 바와 같다.

제1 세트의 실험에서 수지 상의 펩티드의 샘플을 상이한 절단 칵테일들로 처리하였다. 1 g 샘플에 있어서, 8.5 ml의 TFA, 0.5 ml의 물, 0.25 ml의 EDT, 0.5 ml의 티오아니솔 및 0.5 g의 페놀을 기준물로서 사용하고, 절단 시간은 4시간이고, 실온이었다. 생성된 펩티드를 디이소프로필 에테르에서 침전시키고, 원심분리하였다. 디이소프로필 에테르를 경사 분리시켰다. 수득된 펩티드 펠렛을 에틸 아세테이트를 이용하여 진탕시키고, 다시 원심분리하였다. 추가 경사 분리 후, 이 절차를 3회 반복하였다. 마지막으로, 펩티드를 진공하에 건조시켰다. 샘플에 대한 분석을 수행하였다: HPLC를 통한 UV-순도 (%), HPLC 함량 (%), 수지 상의 펩티드의 수율 (g/g) (표 3에서 첫 번째 줄). 단계적 방식으로 하나의 성분을 잇따라 누락시키고, 그 후 2가지, 그리고 마지막으로 3가지를 누락시켰다. 다음의 표 (표 3)는 그 결과를 나타낸다.

[표 3]

티오아니솔을 누락시킬 경우, 그리고 EDT를 사용할 경우, 최상의 결과를 얻었다. 제2 군의 실험에서, 다음의 3가지의 칵테일을 20℃에서 시간이 지남에 따라 조사하였다: TFA, 페놀, EDT, 물로 이루어진 칵테일 1; TFA, 페놀, EDT로 이루어진 칵테일 2; TFA, EDT로 이루어진 칵테일 3. 표 4에 그 결과가 서술되어 있다.

[표 4]

칵테일 2 및 칵테일 3에 대한 결과는 동일하게 양호하다. 수지로부터의 펩티드의 완전한 절단에는 4시간이 필요하지 않다. 칵테일 2 및 칵테일 3에 대한 실험을 25℃에서 반복하였고, 표 5에서의 결과를 얻었다.

[표 5]

칵테일 2 및 칵테일 3을 이용한 절단은 비슷한 결과들을 제공한다. 절단 시간은 25℃에서 2시간까지 감소될 수 있었다.

더욱이, 상기 칵테일들의 부피를 20% 및 30% 감소시킬 수 있는지를 테스트하였다. 표 6은 25℃에서의 시간이 지남에 따른 결과를 나타낸다.

[표 6]

표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 유의한 차이에는 직면하지 않는다. 70%의 절단 칵테일의 부피의 감소 동안, 슬러리의 점도 때문에 교반은 절단 반응 동안 거의 유지될 수 없었다.

확인을 위하여, 킹 칵테일, 칵테일 2 및 칵테일 3을 이용한 절단을 10 g의 규모의 수지 상의 펩티드에서 반복하였다. 절단 칵테일들의 부피는 펩티드를 디이소프로필 에테르에서 침전시키기 전에 증류에 의해 감소시켰다.

킹 칵테일: 5 g의 페놀, 5 ml의 티오아니솔, 2.6 ml의 EDT, 79.2 ml의 TFA 및 5 ml의 물을 사용하여 칵테일을 혼합하였다. 수지 상의 펩티드 10 g을 예비냉각 혼합물 (10 내지 15℃)에 제공하였다. 슬러리를 17 내지 23℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 수지를 여과 제거하고, 각각 10.1 ml의 TFA로 4회 세척하였다. 조합된 용액들을 30℃ 미만의 온도에서 감압에서 증류시켜 60 ml의 잔존 부피를 수득하였다. 이 용액을 0 내지 5℃에서 30 내지 60분 내에 276 ml의 디이소프로필 에테르에 제공하였다. 플라스크를 3.4 ml의 TFA로 세척하고, 이를 또한 디이소프로필 에테르에 첨가하였다. 수득된 슬러리를 10 내지 15℃에서 적어도 10시간 동안 교반시켰다. 침전물을 원심분리로 단리하였다. 경사 분리 후, 펠렛을 66.2 ml의 에틸 아세테이트에 현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 이 절차를 3회 더 반복하였다. 마지막으로, 4.20 g의 조 펩티드를 수득하였으며, 이때 순도는 54.9%이고 함량은 33.4%였다.

칵테일 2: 4 g의 페놀, 2 ml의 EDT 및 68 ml의 TFA를 사용하여 칵테일을 혼합하였다. 수지 상의 펩티드 10 g을 예비냉각 혼합물 (10℃)에 제공하였다. 슬러리를 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 수지를 여과 제거하고, 각각 8 ml의 TFA로 4회 세척하였다. 조합된 용액들을 30℃ 미만의 온도에서 감압에서 증류시켜 35 ml의 잔존 부피를 수득하였다. 이 용액을 3℃에서 10분 내에 276 ml의 디이소프로필 에테르에 제공하였다. 플라스크를 3.4 ml의 TFA로 세척하고, 이를 또한 디이소프로필 에테르에 첨가하였다. 수득된 슬러리를 15℃에서 적어도 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 원심분리로 단리하였다. 경사 분리 후, 펠렛을 66.2 ml의 에틸 아세테이트에 현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 이 절차를 3회 더 반복하였다. 마지막으로, 4.88 g의 조 펩티드를 수득하였으며, 이때 순도는 64.2%이고 함량은 37.1%였다.

칵테일 3: 2 ml의 EDT 및 68 ml의 TFA를 사용하여 칵테일을 혼합하였다. 수지 상의 펩티드 10 g을 예비냉각 혼합물 (10℃)에 제공하였다. 슬러리를 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 수지를 여과 제거하고, 각각 8 ml의 TFA로 4회 세척하였다. 조합된 용액들을 30℃ 미만의 온도에서 감압에서 증류시켜 37 ml의 잔존 부피를 수득하였다. 이 용액을 3℃에서 10분 내에 276 ml의 디이소프로필 에테르에 제공하였다. 플라스크를 3.4 ml의 TFA로 세척하고, 이를 또한 디이소프로필 에테르에 첨가하였다. 수득된 슬러리를 15℃에서 적어도 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 원심분리로 단리하였다. 경사 분리 후, 펠렛을 66.2 ml의 에틸 아세테이트에 현탁시키고, 다시 원심분리하였다. 이 절차를 3회 더 반복하였다. 마지막으로, 5.10 g의 조 펩티드를 수득하였으며, 이때 순도는 64.2%이고 함량은 36.4%였다.

[표 7]

표 7에 서술된 바와 같이 칵테일 2 및 칵테일 3의 적용은 킹 칵테일의 적용과 비교하여 순도, 함량 및 수율 면에서 훨씬 더 양호한 결과를 제공함이 밝혀졌다.

칵테일 3이 최고 수율 및 HPLC-UV-순도를 제공한다는 사실로 인하여, 칵테일 3을 이용하여 생산 규모로 수지 상의 펩티드 7.6 kg을 처리하였다 (표 7). 총 3.26 kg의 서열 번호 1을 68.7%의 순도로 수득하였다.

요약하면, 하기 핵심 단계들을 취할 수 있다: 수지로부터의 펩티드의 절단을 위하여 복합 킹 칵테일을 사용하는 대신, 단지 TFA 및 EDT를 사용하고, 절단을 25℃에서 2시간 동안 수행하고, 수지 상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 부피를 감소시킨다.

실시예 4 수지로부터의 펩티드의 절단

추가 실험을 실시하여 수지로부터의 펩티드의 절단을 최적화하였다. 이러한 실험의 특정한 초점은 링크 수지 링커로부터의 분해 생성물 및 펩티드의 트립토판 모이어티들 사이의 절단 단계 동안 형성될 수 있는 원하지 않는 부산물의 발생을 허용가능한 최소치로 유지하는 것이었다. 하기에서, 이러한 특정한 부산물은 "SP1"로도 지칭된다. 원하지 않는 부산물은 명백하게 관심 펩티드, 예를 들어, 서열 번호 1이 침전될 때까지 형성될 수 있다 (단계 (xii)). 예를 들어, 절단을 위하여 킹 칵테일을 사용할 때, 부산물은 UV 순도 (HPLC) 측정을 기반으로 하면 수 퍼센트까지 축적될 수 있다.

실시예 4.1: EDT의 비율의 변화

제1 세트의 실험에서 수지 상의 펩티드 (서열 번호 1)의 샘플을 TFA 및 EDT로 이루어진 절단 칵테일로 처리하였으며, 여기서, EDT 비율을 변화시켰다. 절단을 25℃에서 2시간 동안 수행하고, 각각의 샘플을 주위 온도에서 추가 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 또는 4시간 후, 샘플을 HPLC를 통하여 분석하였다.

[표 8]

표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, EDT의 비율의 증가는 부산물 (SP1)의 형성에 대하여 단지 적은 영향을 준다.

실시예 4.2: 추가의 스캐빈저 화합물의 첨가

실시예 4.1에서와 유사한 세트의 실험을 실시하였으며, 여기서, EDT의 비율을 절단 칵테일의 3.1% (v/v)로 일정하게 유지하고, 티오아니솔 또는 3-메틸인돌 중 어느 하나를 추가의 스캐빈저 화합물로서 첨가하였다. 인큐베이션 및 HPLC를 통한 분석은 실시예 4.1에서 설명한 바와 같았다.

[표 9]

[표 10]

상기 절단 칵테일의 비 (w/w)는 95.57% (w/w)의 TFA, 2.36% (w/w)의 EDT 및 2.07% (w/w)의 3-MI이다. 표 9 및 표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 티오아니솔의 첨가는 부산물 SP1의 발생에 거의 영향을 주지 않았으며, 반면에 3-메틸인돌의 첨가에 의해서는 심지어 총 4시간의 인큐베이션 시간 후에도 부산물이 낮은 수준으로 유지될 수 있었다.

실시예 4.3: 인돌 화합물들의 비교

실시예 4.1과 유사한 추가 세트의 실험에서, 추가 인돌 화합물, N-아세틸인돌이 부산물에 대하여 유사한 억제 효과를 나타내는지를 3-메틸인돌의 것과 비교하여 분석하였다. EDT의 비율을 절단 칵테일의 3.1% (v/v)에서 일정하게 유지하고, 추가 화합물이 없는 것 (대조군), 3.1% (v/v)의 N-아세틸인돌 (N-아세틸인돌은 점성 액체임) 또는 3.1% (v/v)의 3-메틸인돌 (표 10에서 주에서 설명한 바와 같은 계산 % (v/v)) 중 어느 하나를 첨가하였다. 인큐베이션 및 HPLC를 통한 분석은 실시예 4.1에서 설명한 바와 같았다.

[표 11]

표 11에 나타낸 바와 같이, 3-메틸인돌 및 N-아세틸인돌 둘 다는 원하지 않는 부산물 SP1의 형성의 감소에 효과적이다.

실시예 4.4: 3- 메틸인돌의 비율의 변화

실시예 4.1과 유사한 추가 세트의 실험에서, 절단 칵테일에 첨가되는 3-메틸인돌의 양을 변화시켜 가장 적합한 농도를 결정하였다. EDT의 비율을 절단 칵테일의 3.1% (v/v)로 일정하게 유지하였다. 인큐베이션 및 HPLC를 통한 분석은 실시예 4.1에서 설명한 바와 같았다.

[표 12]

표 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 0.8% (v/v)의 3-메틸인돌의 양은 허용가능하지 않은 양의 부산물의 형성을 억제하기에 이미 충분하다.

종합해 보면, 본 발명자는 놀랍게도, 원하지 않는 부산물의 발생을 허용가능한 양까지 감소시킬 가능성을 찾아냈다. 적합한 인돌 화합물, 특히 N-아세틸인돌 또는 3-메틸인돌을 첨가함으로써, 원하지 않는 부산물의 양은 원하는 조 생성물에 있어서 단지 1.0 내지 1.3%의 UV 순도 (HPLC)까지 감소시킬 수 있었다. 인돌 화합물, 예를 들어, 3-메틸인돌 뿐만 아니라, 스캐빈저 분자의 부가물 및 보호기를 특히 침전 펩티드 용액의 세척 동안 원하는 펩티드로부터 제거한다.

실시예 5: 수지로부터의 서열 번호 1의 테스트 절단 (킬로그램 규모)

6.5 내지 7.5 kg의 수지-결합된 펩티드를 76.13 kg의 트리플루오로아세트산 (TFA), 1.8 kg의 1,2-에탄디티올 및 0.656 kg의 3-메틸인돌의 혼합물로 25℃에서 2 내지 2.5시간 동안 처리한다. 수지를 여과 제거하고, 각각 17.5 kg의 TFA로 3회 세척한다. 조합된 TFA 상들을 그의 원래 부피의 1/3까지 증발시킨다. 증류 잔사를 펩티드의 침전을 위하여 0 내지 5℃에서 디이소프로필 에테르와 n-헵탄의 혼합물 (30:70 (v/v)) 203 L에 제공한다. 현탁물을 10 내지 15℃에서 10 내지 20시간 동안 교반시키고, 이어서 펩티드를 여과로 분리한다. 생성된 필터 케이크를 각각 50 L의 에틸 아세테이트로 5회 세척한다. 마지막으로, 필터 상의 펩티드를 진공하에 건조시키고, 2.5 내지 3.2 kg의 조 펩티드를 수득한다.

특정 실험에서, 수지 상의 서열 번호 1 7.24 kg은 하기에 열거된 바와 같이 절단 및 추가 세척 및 단리 단계를 수행하였으며, 2.55 kg의 건조 조 펩티드를 수득하였다. 생성물은 백색 내지 약간 누르스름한 분말이었으며, 이때 HPLC-순도는 68.2%이고, 펩티드의 트립토판 잔기 및 링크 링커의 원하지 않는 분해 생성물의 함량은 1.2%였다: 이러한 결과를 달성하기 위하여, 7.24 kg의 서열 번호 1을 73.2 kg의 TFA, 1.73 kg의 1,2-에탄디티올 및 0.63 kg의 3-메틸인돌의 혼합물로 23 내지 25℃에서 2.15시간 동안 처리하였다. 그 후 수지를 여과 제거하고, 각각 17.4 kg의 TFA로 3회 세척하였다. 조합된 TFA 상들 (절단 혼합물 및 TFA-세척물)을 증류로 전달하였다. 29 L의 부피가 1시간 내에 얻어질 때까지 증류를 50 mbar 이하 및 30℃ 이하의 온도에서 수행하였다. 나머지를 0 내지 5℃에서 35분 내에 60.9 L의 DIPE와 142.1 L의 n-헵탄의 혼합물에 제공하고, 현탁물을 수득하였다. 상기 현탁물을 10 내지 15℃에서 약 17시간 동안 교반시켰다. 조 펩티드를 2.5시간 내에 여과 제거하고, 이어서 조 펩티드를 각각 49.4 L의 에틸 아세테이트로 5회 세척하였다 (에틸 아세테이트의 첨가, 30 내지 60분의 교반, 용매의 제거). 습윤 펩티드를 스트립핑 질소를 이용하여 진공 (< 100 mbar) 하에 20 내지 25℃에서 96시간 초과의 시간 동안 건조시켰다. 마지막으로, 2.55 kg의 조 펩티드를 수득하였다.

실시예 6: 여과 시간에 대한 절단 후 펩티드 용액의 농축의 영향

각각 10 g의 수지를 이용하는 작은 배치의 실험에서, 관심 펩티드 (서열 번호 1)를 본원에 기술된 바와 같은 SPPS를 통하여 합성하고, 67.8 ml의 TFA 및 2.26 ml의 EDT를 이용하여 25℃에서 2시간 동안 수지로부터 절단하였다.

펩티드 용액을 여과하여 수지를 제거하고, 그 후 80 mbar 이하 및 30℃ 이하의 온도에서 진공 증류에 의해 그의 부피의 약 1/3까지 농축시킨 후 침전시키거나 직접적으로 침전시켰다 (농축 없이). 디이소프로필 에테르를 항용매로 사용하였다. 침전물을 에틸 아세테이트로 3회 세척하였다. 침전 후 및 각각의 에틸 아세테이트 세척 후 여과에 요구되는 시간을 기록하였다.

[표 13]

농축 단계를 수행할 때, 여과에 요구되는 시간 (특히 처음 침전 후)은 두드러지게 감소될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 7: DIPE 와 n-헵탄의 혼합물에서의 조 펩티드의 침전

놀랍게도 본 발명자는 디이소프로필 에테르 (DIPE)와 n-헵탄의 혼합물이 여과 및 에틸 아세테이트를 이용한 후속적인 세척에 요구되는 시간을 두드러지게 감소시킬 수 있음을 밝혀냈다.

DIPE와 n-헵탄의 비를 최적화하기 위하여, 10 g의 수지를 이용한 작은 배치의 실험을 수행하였다. 펩티드를 본원에 기술된 바와 같은 SPPS를 통하여 합성하고, 67.2 ml의 TFA, 2.1 ml의 EDT 및 0.86 g의 3-MI를 이용하여 25℃에서 2시간 동안 수지로부터 절단하였다.

그 후 펩티드 용액을 여과하여 수지를 제거하고, 80 mbar 이하 및 30℃ 이하의 온도에서 진공 증류에 의해 그의 부피의 약 1/3까지 농축시켰다. 후속적으로, 농축된 펩티드 용액을 DIPE 단독을 이용하여 또는 DIPE와 n-헵탄의 혼합물을 이용하여 침전시키고, 여과시켰다. 침전물을 에틸 아세테이트로 3회 세척하였다. 침전 후 및 각각의 에틸 아세테이트 세척 후 여과에 요구되는 시간을 기록하였다.

[표 14]

표 14에서의 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 여과 시간은 혼합물 중 n-헵탄의 양이 증가함에 따라 감소한다. 그러나, 25:75 초과의 DIPE:n-헵탄의 비에서, 펩티드가 여과 프릿에서 "용융된다"는 것이 관찰되었다. 40:60 미만의 DIPE:n-헵탄의 비에서, 시간 감소 효과는 덜 현저하다.

HPLC에 의한 샘플의 추가 분석은, 에틸 아세테이트를 이용한 제3 세척 후, 스캐빈저 화합물 또는 스캐빈저의 부가물 및 보호기는 더 이상 검출가능하지 않음을 보여주었다.

실시예 8: 항용매로서 DIPE /n-헵탄을 사용한 조 펩티드의 테스트 정제 (실험실 규모)

수지 상의 펩티드 (펩티드:서열 번호 1) 20 g을 절단 칵테일 (198.8 g TFA, 4.7 g EDT, 1.72 g 3-MI)과 함께 25℃에서 3시간 동안 인큐베이션함으로써 절단하였다. 절단된 펩티드를 프릿을 통하여 흡인하고, 프릿 상에 남아 있는 수지를 각각 16 ml의 TFA로 4회 세척하였다.

여과액을 회전 증발기에서 30℃에서 농축시키고, 잔존 용액을 560 ml의 DIPE/n-헵탄 (30:70)에 첨가하였는데, 이는 5 내지 10℃까지 사전 냉각시킨 것이었다. 펩티드를 침전시키고, 8℃에서 1시간 동안 스티어링하였다 (steered). 그 후 현탁물을 D4-프릿에서 흡인하였는데, 이는 3.6분을 필요로 하였다. 조 생성물을 520 ml의 에틸 아세테이트에 현탁시키고, 교반시키고, 상기 D4 프릿을 통하여 흡인하였다. 이러한 세척 단계를 2회 더 반복하였다. 후속적으로, 조 생성물을 진공하에 건조시켰다. 이것은 순도가 66.6%인 8.36 g의 조 생성물을 생성하였다.

본 발명은 하기 항목에 의해 추가로 특성화된다.

1. 다음의 단계를 포함하는, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 단리된 펩티드를 제조하는 방법:

(iv) 상기 수지를 중화시키는 단계;

(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계; 및

(ix) 상기 펩티드를 상기 수지로부터 절단하는 단계.

2. 단리된 펩티드는 30 내지 44개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성이 적어도 65%인, 항목 1의 방법.

3. 단리된 펩티드는 30 내지 44개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성이 적어도 70%인, 항목 1 또는 2의 방법.

4. 단리된 펩티드는 30 내지 44개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있는, 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 방법.

5. 단리된 펩티드는 30 내지 44개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 65%이며, 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성은 적어도 70%이며, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

6. 단리된 펩티드는 38 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체인, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

7. 단리된 펩티드는 39개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체인, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

8. 단리된 펩티드는 39개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 야생형 엑센딘-4의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 서열은 2개 이하의 돌연변이를 함유하며, 야생형 엑센딘-4의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역은 1개 이하의 돌연변이를 함유하며, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

9. 단리된 펩티드는 39개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며, 야생형 엑센딘-4의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역은 위치 2 및 3에서의 돌연변이를 함유하며, 야생형 엑센딘-4의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역은 위치 28에서의 돌연변이를 함유하며, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄는 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

10. 단계 (iii)에서의 DCM 중 TFA의 처리 횟수는 단계　(ix)에서의 변형된 라이신 측쇄의 수율이 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%이도록 조정되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

11. 단계 (iii)에서, 건조된 수지를 DCM 중 약 1% (v/v)의 TFA의 용액을 이용하여 적어도 7회, 적어도 5분 동안 처리하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

12. 단계 (iii)에서, 건조된 수지를 DCM 중 약 1% (v/v)의 TFA의 용액을 이용하여 9회, 적어도 10분 동안 처리하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

13. 단계 (iii)에서, 건조된 수지를 DCM 중 약 1% (v/v)의 TFA의 용액을 이용하여 9회, 적어도 15분 동안 처리하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

14. 단계 (iv)에서, 펩티드는 일단 7 이상, 특히 7.5 이상, 더 구체적으로 8.0 이상의 pH에 도달하면 충분히 중화된 것으로 간주되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

15. 단계 (iv)에서, 펩티드는 일단 8.0 초과에 도달하면 충분히 중화된 것으로 간주되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

16. 다음의 단계를 추가로 포함하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법: (viii-a) 상기 수지 결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계.

17. 다음의 단계를 추가로 포함하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법: (viii-b) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이, 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 더 구체적으로 적어도 95%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계.

18. 테스트 샘플에서 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계는 다음의 단계를 포함하는, 항목 16의 방법:

(viii-a2) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량을, 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 특히 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 고압 액체 크로마토그래피와 질량 분광법의 조합 (LC-MS)에 의해 결정하는 단계.

19. 단리된 펩티드는 하기 아미노산 서열을 갖는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법:

20. 단계 (ix)의 절단은 적어도 90% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (v/v)의 에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 수행되며, 상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

21. 절단 칵테일은 적합한 인돌 화합물, 예를 들어, N-아세틸인돌 또는 3-메틸인돌 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는, 항목 20의 방법.

22. 적합한 인돌 화합물은 3-메틸인돌인, 항목 21의 방법.

23. 절단 칵테일은 91 내지 93% (v/v)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 6% (v/v)의 페놀 및 1 내지 8%　(v/v)의 에탄디티올로 이루어지거나, 96 내지 98% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 2 내지 4% (v/v)의 에탄디티올로 이루어진, 항목 20의 방법.

24. 단계 (ix)의 절단은 적어도 80% (w/w)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (w/w)의 1,2-에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 수행되며, 상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없는, 항목 1 내지 19 중 어느 하나의 방법.

25. 절단 칵테일은 적합한 인돌 화합물, 예를 들어, N-아세틸인돌 또는 3-메틸인돌 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는, 항목 24의 방법.

26. 적합한 인돌 화합물은 3-메틸인돌인, 항목 25의 방법.

27. 절단 칵테일은 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산 (TFA), 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 (EDT) 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌 (3-MI)로 이루어진, 항목 24 내지 26 중 어느 하나의 방법.

28. 절단 칵테일은 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-MI로 이루어진, 항목 24 내지 27 중 어느 하나의 방법.

29. 절단 칵테일은 약 97% (w/w)의 TFA, 약 2% (w/w)의 EDT 및 약 1% (w/w)의 3-MI로 이루어진, 항목 24 내지 28 중 어느 하나의 방법.

30. 절단 칵테일은 약 96.9% (w/w)의 TFA, 약 2.3% (w/w)의 EDT 및 약 0.8% (w/w)의 3-MI로 이루어진, 항목 24 내지 29 중 어느 하나의 방법.

31. 절단은 5 내지 15℃, 15 내지 22℃ 및/또는 22 내지 30℃, 특히 25℃에서 수행되는, 항목 20 내지 30 중 어느 하나의 방법.

32. 수지 상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 부피는 9.5 ml 내지 5.5 ml, 특히 7.0 ml 내지 6.0 ml인, 항목 20 내지 31 중 어느 하나의 방법.

33. 절단은 교반을 이용하여 2 내지 3시간, 특히 2.0 내지 2.5시간 동안 수행되는, 항목 20 내지 32 중 어느 하나의 방법.

34. 절단은 교반을 이용하여 25℃에서 2 내지 3시간, 특히 2.0 내지 2.5시간 동안 수행되는, 항목 20 내지 33 중 어느 하나의 방법.

35. 절단은 교반을 이용하여 30℃에서 1 내지 1.5시간 동안 수행되는, 항목 20 내지 33 중 어느 하나의 방법.

36. 절단은 (a) 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진, 특히 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-MI, 예를 들어, 약 97% (w/w)의 TFA, 약 2% (w/w)의 EDT 및 약 1%의 3-MI로 이루어진 절단 칵테일, (b) 25℃의 승온에서 단지 2시간의 인큐베이션 시간, 및 (c) 수지 상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 감소된 부피, 예를 들어, 7.0 ml 내지 6.0 ml을 이용하여 수행되는, 항목 20 내지 35 중 어느 하나의 방법.

37. 절단은 (a) 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진, 특히 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-MI, 예를 들어, 약 97% (w/w)의 TFA, 약 2% (w/w)의 EDT 및 약 1%의 3-MI로 이루어진 절단 칵테일, (b) 25℃의 승온에서 단지 2시간의 인큐베이션 시간, 및 (c) 수지 상의 펩티드 1 g당 절단 칵테일의 감소된 부피, 예를 들어, 7.0 ml 내지 6.0 ml을 이용하여 수행되며, 여기서, 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 항목 20 내지 36 중 어느 하나의 방법.

38. 단계 (ii)에서의 수지의 건조는, 수지 상의 펩티드를 지방족 알코올을 이용하여 적어도 1회 및 디알킬 에테르를 이용하여 적어도 1회 세척에 후속하여, 불활성 가스, 예를 들어, 질소 하에, 실온에서 수행되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

39. 지방족 알코올은 이소프로판올이며, 디알킬 에테르는 디이소프로필 에테르인, 항목 38의 방법.

40. 단계 (iv)에서의 중화는 유기 극성 비양성자성 용매 중 3차 알킬아민의 1% 내지 5% 용액과 함께 적어도 10분 동안 적어도 1회 인큐베이션하고, 이어서 임의로, 중화 단계 후 용매 혼합물의 pH를 결정하고, 수지 상의 펩티드를 상기 용매로 적어도 1회, 및 추가의 극성 비양성자성 용매, 예를 들어, 디메틸포름아미드 (DMF)로 적어도 1회 세척함으로써 수행되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

41. 3차 알킬아민은 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA) 또는 N-메틸모르폴린 (NMM) 또는 트리에틸아민이며, 유기 극성 비양성자성 용매는 디클로로메탄인, 항목 40의 방법.

42. 중화 단계 후 용매 혼합물의 pH를 결정하는 것, 및 수지 상의 펩티드를 상기 용매로 적어도 1회, 및 추가의 극성 비양성자성 용매, 예를 들어, 디메틸포름아미드 (DMF)로 적어도 1회 세척하는 것이 이어지는, 항목 40 또는 41의 방법.

43. 단계 (vi)에서의 탈보호는 수지 상의 펩티드를 염기를 이용하여 적어도 5분 동안 적어도 1회 처리함에 의해, 이어서 적어도 1회의 세척 단계에 의해 수행되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

44. 염기는 DMF 중 20% (v/v)의 피페리딘인, 항목 43의 방법.

45. 단계 (viii)에서의 수지의 건조는 수지 상의 펩티드의 세척에 후속하여, 진공하에, 특히 70 mbar 이하의 진공하에 수행되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

46. 다음의 단계를 포함하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법:

(vi) 단계 (v)에서 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 Fmoc 기를 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘으로 절단하는 단계;

(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계;

(ix) 상기 펩티드를 25℃에서 적어도 90% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (v/v)의 1,2-에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 상기 수지로부터 절단하는 단계 (상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없음).

47. 다음의 단계를 추가로 포함하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법:

(x) 절단 후 상기 펩티드 용액을 여과시키는 단계;

(xi) 상기 여과된 펩티드 용액을 진공하에 증류시키는 단계;

(xiii) 상기 침전된 용액을 교반시키는 단계;

(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;

(xv) 상기 침전물을 세척하는 단계; 및

(xvi) 상기 습윤 펩티드를 건조시키는 단계.

48. 단계 (x) 후에, 필터 케이크를 적합한 헹굼 용액, 예를 들어, TFA를 이용하여 적어도 1회, 예를 들어, 3회 헹구는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

49. 단계 (xi)에서, 증류는 30℃ 이하의 온도에서 50 mbar 이하의 진공에서 수행되는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

50. 단계 (xii)에서 항용매는 디이소프로필 에테르 (DIPE)와 n-헵탄으로 이루어진 혼합물, 특히 25:75 (v/v) 내지 35:65 (v/v)의 비의 DIPE와 n-헵탄의 혼합물인, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

51. DIPE와 n-헵탄 사이의 비는 30:70 (v/v)인, 항목 50의 방법.

52. 단계 (xiii)에서, 침전된 용액을 10 내지 15℃에서 1 내지 20시간 동안 교반시키는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

53. 단계 (xv)에서, 필터 상의 침전물을 적합한 유기 용매, 예를 들어, 에틸 아세테이트로 헹굼에 후속하여, 침전물을 적합한 유기 용매, 예를 들어, 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, 상기 생성된 현탁물을 예를 들어, 30 내지 60분 동안 교반시키고, 유기 용매를 여과 제거함으로써 적어도 1회 세척하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

54. 침전물을 에틸 아세테이트로 1 내지 5회, 특히 2 내지 4회 또는 3 내지 5회 또는 4 내지 5회 세척하는, 항목 53의 방법.

55. 단계 (xvi)에서, 습윤 펩티드를 진공하에, 예를 들어, 20 내지 25℃에서, 특히 70 mbar 이하의 진공하에 20 내지 25℃ 및 질소 스트림 (스트립핑 질소)에서 건조시키는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법.

56. 다음의 단계를 포함하는, 상기 선행 항목 중 어느 하나의 방법:

(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계;

(xii) 25:75 내지 35:65의 비의 DIPE 및 n-헵탄으로 이루어진 항용매에 상기 증류로부터의 잔존 분획을 첨가하는 단계;

(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;

(xvi) 상기 습윤 펩티드를 진공하에 건조시키는 단계.

SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> METHOD OF PREPARING PEPTIDES COMPRISING A LIPOPHILICALLY MODIFIED LYSINE SIDE CHAIN <130> 62509P WO / DE2016/059 WO PCT <150> EP 16 306 332.4 <151> 2016-10-10 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 analogue <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is a D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser is modified with an NH2 group <400> 1 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 analogue (side product) <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is a D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser is modified with an NH2-group <400> 2 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser is modified with an NH2 group <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Arg is modified with an NH2 group <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Liraglutide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl) <400> 6 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30

Claims

친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 단리된 펩티드를 제조하는 방법으로서:
(i) 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 상기 펩티드의 아미노산 서열을 고상 펩티드 합성 (solid phase peptide synthesis; SPPS)을 이용하여 단계적 방식으로 어셈블링하는 단계 (여기서, 변형될 라이신의 측쇄는 트리틸계 보호기, 특히 모노메톡시트리틸 (Mmt) 또는 4-메틸트리틸 (Mtt)로 보호됨);
(ii) 상기 아미노산 서열의 어셈블링이 완료된 후 상기 고상 수지를 건조시키는 단계;
(iii) 상기 건조된 수지를 디클로로메탄 (DCM) 중 트리플루오로아세트산 (TFA)의 용액으로 수 회 처리하여 변형될 라이신 측쇄를 탈보호하는 단계;
(iv) 상기 수지를 중화시키는 단계;
(v) 하나 이상의 활성화된 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc)-결합된 링커 모이어티(moiety)를 상기 탈보호된 라이신 측쇄에 커플링시키는 단계;
(vi) 단계 (v)에서 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 말단 작용기를 탈보호시키는 단계;
(vii) 활성화된 친유성 모이어티, 특히 활성화된 지방산을 단계 (vi)의 링커의 탈보호된 말단 작용기에 커플링시키는 단계;
(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계; 및
(ix) 상기 펩티드를 상기 수지로부터 절단하는 단계
를 포함하는, 친유성으로 변형된 라이신 측쇄를 포함하는 단리된 펩티드를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단리된 펩티드가 30 내지 44개, 특히 38 내지 40개 아미노산의 길이를 갖는 엑센딘-4 유도체이며,
(i) 야생형 엑센딘의 아미노산 1 내지 13에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성(sequence identity)이 65% 이상이고/이거나,
(ii) 야생형 엑센딘의 아미노산 22 내지 39에 상응하는 영역에서의 야생형 엑센딘-4에 대한 서열 동일성이 70% 이상이고/이거나,
(iii) 상기 친유성으로 변형된 라이신 측쇄가 야생형 엑센딘-4의 아미노산 위치와 관련하여 위치 14 (Lys(14))에 있는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (iii)에서, 상기 건조된 수지를 DCM 중 약 1% (v/v)의 TFA의 용액을 이용하여 적어도 5분 동안 적어도 7회, 특히 적어도 10분 동안 9회 또는 적어도 15분 동안 9회 처리하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(viii-a) 상기 수지 결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계; 및
(viii-b) 임의로, 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이, 변형된 라이신 측쇄를 갖지 않는 펩티드와 비교하여, 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 더 구체적으로 적어도 95%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 펩티드가 하기 아미노산 서열을 갖는 방법:
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ix)의 절단을 90% (v/v) 이상의 트리플루오로아세트산 및 1% (v/v) 이상의 에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 수행하며, 상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 절단 칵테일이 적합한 인돌 화합물, 특히 3-메틸인돌을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ix)의 절단을 80% (w/w) 이상의 트리플루오로아세트산 및 1% (w/w) 이상의 1,2-에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 수행하며, 상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 절단 칵테일이 88.2 내지 98.3% (w/w)의 트리플루오로아세트산, 1 내지 4.3% (w/w)의 1,2-에탄디티올 및 0.7 내지 7.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어지는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(x) 절단 후 상기 펩티드 용액을 여과시키는 단계;
(xi) 상기 여과된 펩티드 용액을 진공하에 증류시키는 단계;
(xii) 상기 증류로부터의 잔존 분획을 디알킬 에테르 및 헵탄을 포함하는 항용매(antisolvent)에 첨가하는 단계;
(xiii) 상기 침전된 용액을 교반시키는 단계;
(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;
(xv) 상기 침전물을 세척하는 단계; 및
(xvi) 상기 습윤 펩티드를 건조시키는 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 단계 (xii)에서 항용매가 디이소프로필 에테르 (DIPE)와 n-헵탄으로 이루어진 혼합물, 특히 25:75 (v/v) 내지 35:65 (v/v)의 비의 DIPE와 n-헵탄의 혼합물인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 서열 번호 1의 펩티드의 아미노산 서열을, 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 이용하여 단계적 방식으로 어셈블링하는 단계 (여기서, 라이신 14의 측쇄는 모노메톡시트리틸 (Mmt)로 보호됨);
(ii) 상기 아미노산 서열의 어셈블링이 완료된 후 상기 고상 수지를 실온에서 적어도 5시간 동안 건조시키는 단계;
(iii) 상기 건조된 수지를 디클로로메탄 (DCM) 중 1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)의 용액으로 각각 10분 동안 9회 처리하여 위치 14의 라이신 측쇄를 탈보호하는 단계;
(iv) 상기 수지를 DCM 중 3% 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA)의 용액을 이용하여, 상기 용액의 pH가 8 이상에서 유지될 때까지 중화시키는 단계;
(v) 활성화된 Fmoc-Glu-OtBu 링커 모이어티를 염기성 조건하에 상기 탈보호된 라이신 측쇄에 커플링시키는 단계;
(vi) 단계 (v)에서 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 Fmoc 기를 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘으로 절단하는 단계;
(vii) 활성화된 팔미트산을 단계 (vi)의 링커의 탈보호된 말단 작용기에 커플링시키는 단계;
(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계;
(viii-a) 상기 수지 결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계;
(viii-b) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이 적어도 85%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계; 및
(ix) 상기 펩티드를 25℃에서 적어도 90% (v/v)의 트리플루오로아세트산 및 적어도 1% (v/v)의 에탄디티올을 포함하는 절단 칵테일을 이용하여 상기 수지로부터 절단하는 단계 (상기 칵테일에는 티오아니솔 및 에틸메틸술피드가 없음)
를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 측쇄 내에 보호된 반응성 작용기를 갖는 서열 번호 1의 펩티드의 아미노산 서열을, 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 이용하여 단계적 방식으로 어셈블링하는 단계 (여기서, 라이신 14의 측쇄는 모노메톡시트리틸 (Mmt)로 보호됨);
(ii) 상기 아미노산 서열의 어셈블링이 완료된 후 상기 고상 수지를 실온에서 적어도 5시간 동안 건조시키는 단계;
(iii) 상기 건조된 수지를 디클로로메탄 (DCM) 중 1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)의 용액으로 각각 10분 동안 9회 처리하여 위치 14의 라이신 측쇄를 탈보호하는 단계;
(iv) 상기 수지를 DCM 중 3% 디이소프로필 에틸아민 (DIPEA)의 용액을 이용하여, 상기 용액의 pH가 8 이상에서 유지될 때까지 중화시키는 단계;
(v) 활성화된 Fmoc-Glu-OtBu 링커 모이어티를 염기성 조건하에 상기 탈보호된 라이신 측쇄에 커플링시키는 단계;
(vi) 단계 (v)에서 라이신 측쇄에 커플링된 링커의 Fmoc 기를 DMF 중 20% (v/v) 피페리딘으로 절단하는 단계;
(vii) 활성화된 팔미트산을 단계 (vi)의 링커의 탈보호된 말단 작용기에 커플링시키는 단계;
(viii) 상기 수지를 건조시키는 단계;
(viii-a) 상기 수지 결합된 펩티드의 테스트 샘플을 절단함으로써 단계 (iii)의 탈보호 수율을 분석하는 단계;
(viii-b) 상기 변형된 라이신 측쇄를 함유하는 절단된 펩티드의 함량이 적어도 85%가 될 때까지 단계 (iii) 내지 (viii-a)를 반복하는 단계;
(ix) 상기 펩티드를 96.0 내지 97.5% (w/w)의 TFA, 1.7 내지 2.6% (w/w)의 EDT 및 0.7 내지 1.5% (w/w)의 3-메틸인돌로 이루어진 절단 칵테일을 이용하여 상기 수지로부터 절단하는 단계;
(x) 실온에서의 절단 후 상기 펩티드 용액을 여과시키는 단계;
(xi) 상기 여과된 펩티드 용액을 진공하에 30℃ 이하에서 증류시키는 단계;
(xii) 25:75 (v/v) 내지 35:65 (v/v)의 비의 DIPE 및 n-헵탄으로 이루어진 항용매에 상기 증류로부터의 잔존 분획을 첨가하는 단계;
(xiii) 상기 침전된 용액을 10 내지 15℃에서 1 내지 18시간 동안 교반시키는 단계;
(xiv) 상기 침전된 용액을 여과시키는 단계;
(xv) (xv-a) 상기 침전물을 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, (xv-b) 상기 생성된 현탁물을 30 내지 60분 동안 교반시키고, (xv-c) 에틸 아세테이트를 여과 제거함으로써 상기 침전물을 4 내지 5회 세척하는 단계; 및
(xvi) 상기 습윤 펩티드를 진공하에 건조시키는 단계
를 포함하는, 방법.