KR101996700B1 - 치료 펩티드의 합성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시이버 아미드 수지를 사용하며, 고체-상 Fmoc-화학을 포함하는, 치료 펩티드의 대규모 합성 방법에 관한 것이다.

Description

치료 펩티드의 합성 방법 {PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF THERAPEUTIC PEPTIDES}
본 발명은 비천연 또는 인조(man-made) 아미노산을 함유하는 치료 펩티드의 신규한 대규모 합성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대규모 부피로 확장가능하며, 고-순도 펩티드의 비용 효과적인 제조를 가능케 한다.
고체-상 펩티드 합성 (SPPS)은 1963년에 메리필드(Merrifield)에 의해 처음 도입된 매우 성공적인 방법이다 (문헌 [Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85:2149-54]). 그 이후로, 수많은 펩티드들이 이 기술을 사용하여 합성되어 왔다. 펩티드 및 단백질을 화학적으로 합성하기 위하여 선행 기술에서 사용되는 방법들에 대해서는 문헌 [Kent, S.B.H., Ann. Rev. Biochem., 1988, 57:957-89]에 고찰되어 있다. 고체-상 합성은 박테리아에서는 발현하기가 어려운 천연 펩티드의 합성, 비천연 또는 합성 아미노산의 도입, 펩티드 백본 변형, 및 D-아미노산을 함유하는 D-단백질의 합성을 가능케 한다.
고체-상 합성에 의한 펩티드 사슬의 조립에는 하기 2종의 전략이 사용되어 왔다: 1) 단계적 고체-상 합성, 및 2) 고체-상 단편 축합. 단계적 SPPS에서는, N-α-보호되며 필요에 따라서는 측쇄-보호되는 반응성 유도체 형태의 C-말단 아미노산이 직접 또는 적합한 링커에 의한 것 중 어느 하나에 의해 "고체"-지지체, 예컨대 통상적으로 유기 용매 중에서 팽윤된 중합체 수지에 공유결합으로 커플링된다. N-α-보호기는 제거되며, 이후 보호된 아미노산이 단계적 방식으로 첨가된다. 원하는 펩티드 사슬 길이가 수득되면, 측쇄 보호기가 제거되고, 펩티드가 수지로부터 절단된다. 상기 절단/탈보호 과정은 별도의 단계로 또는 동시에 수행될 수 있다. 고체-상 단편 축합에서는, 단계적 SPPS에 의해 제조된 보호된 단편들을 사용한 고체 지지체 상에서의 단편들의 연속적인 축합에 의해 목표 서열이 조립된다.
한 형태의 SPPS는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (또는 "Fmoc")에 의존하여 일시적으로 α-아미노 기를 보호한다. 이와 같은 방법에 있어서, Fmoc 기는 아미노 기에 공유결합됨으로써 그의 친핵성을 억제한다. C-말단 아미노산은 링커를 통하여 수지에 공유결합된다. 다음에는, Fmoc 기가 피페리딘과 같은 염기를 사용하여 제거된다. 이는 이후 활성화된 아미노산과의 반응에 이용가능한 아미노 기를 유리시킨다. 반응은 과량 (통상적으로 2- 내지 4-배)의 활성화된 아미노산의 사용에 의해 완료시까지 진행된다. 각 탈보호 및 커플링 단계 후에는, 과량의 시약을 제거하기 위하여 1회 이상의 세척이 수행된다. 측쇄 보호기의 제거에 의한 수지로부터의 펩티드의 절단은 트리플루오로아세트산 (TFA)과 같은 산성 용액을 사용한 산첨가분해(acidolysis)에 의해 달성가능하다. 절단 혼합물 중 산이, 유리된 측쇄 보호기와 반응함으로써, 해당 유리 기가 절단된 펩티드에 재-부착하는 것을 방지하도록 하는 "스캐빈저(scavenger)"로 표시되는 추가적인 화학물질들, 예컨대 트리이소프로필실란 (TIPS), 트리에틸실란 (TES), 페놀, 아니솔, 티오아니솔, 물, 1,2-에탄디티올 (EDT), 1-도데칸티올, 디티오트레이톨 (DTT) 및 인돌을 첨가하는 것이 일반적인 관행이다.
아미노산은 N- 및 C-말단에 반응성 모이어티를 가지는데, 그것은 합성시 아미노산 커플링을 촉진한다. 또한, 대부분의 아미노산에서 발견되는 반응성 측쇄 관능기는 합성 및 펩티드 연장시 자유로운 말단 또는 다른 측쇄 기와 상호작용할 수 있어서, 수율 및 순도에 부정적인 영향을 준다. 최소한의 측쇄 반응성을 사용하는 적정한 아미노산 합성을 촉진하기 위하여, 특정 아미노산 관능기에 결합하여 비특이적 반응으로부터 관능기를 "차단" 또는 "보호"하는 "보호기"로 지칭되는 화학 기가 사용된다. 측쇄 보호기는 영구 또는 반-영구 보호기로 알려져 있는데, 그것이 합성 동안의 다수의 화학 처리 주기를 견딜 수 있으며, 일반적으로 펩티드 합성이 완료된 후 강산을 사용한 처리시에만 제거되기 때문이다.
상기 언급된 현행 전략은 상업적 규모의 치료 펩티드 제조에는 바람직하지 않은데, 그에 사용되는 수지가 중합체 수지로부터의 펩티드의 절단에 고농도의 산을 사용하여 펩티드가 제거될 것을 요하기 때문이다. 다량의 극히 부식성인 물질을 대규모로 사용하는 것에 대한 안전성 우려 이외에도, 그의 사용을 가능케 하는 데에는, 대규모의 특별한 장비가 필요할 수 있다. 또한, 펩티드를 절단하고 탈보호시키기 위한 농도로 농축된 강산의 사용은 원하는 펩티드의 상당한 분해를 초래함으로써, 대규모로 절단 및 후처리를 수행하는 데에 필요한 시간 기간 동안의 강산에 대한 펩티드 노출의 결과로서의 낮은 수율 및/또는 새로운 불순물의 생성을 초래할 수 있다. 그와 같은 불순물에는 펩티드에 대한 수지-링커의 전부 또는 일부의 부착과 관련된 탈수되거나 산화된 종 또는 불순물이 포함될 수 있는데 - 이러한 불순물은 이후에 제거하기가 어려울 수 있다. 따라서, 치료 펩티드의 효율적인 대규모 제조 방법을 개발할 필요성이 존재한다.
이전에 언급된 바와 같이, 고체-상 펩티드 합성은 "고체" 지지체 또는 앵커(anchor) 상에서 개시된다. 이러한 "지지체"는 당업계에서 "수지"로 지칭된다. 수지는 폴리스티렌 또는 다른 중합체 재료, 예컨대 에틸렌 옥시드의 중합체, 예를 들어 PEG 기재 수지, 또는 양자의 혼합물, 예를 들어 "하이브리드(hybrid)" 또는 PEG-폴리스티렌 수지로 제조될 수 있다. Fmoc SPPS 경로에 의한 펩티드 아미드의 제조에 통상적으로 사용되는 수지에는 고농도의 산을 사용한 처리시 완전히 탈보호된 펩티드 아미드를 방출하는 데에 적합한 링커와 조합된 폴리스티렌-기재 수지가 포함된다. 통상적으로 사용되는 수지에는 링크 아미드(Rink Amide) 수지, 예를 들어 링크 아미드 수지, 링크 아미드 MBHA 수지 및 링크 아미드 AM 수지가 포함된다. 절단 칵테일 중 고도 백분율 v/v의 산 - 예를 들어 80-95% v/v의 트리플루오로아세트산 (TFA)이 통상적으로 사용됨 -을 사용하여 처리될 때, 링크 아미드 수지는 완전히 탈보호된 펩티드 아미드를 수지로부터 방출한다.
1987년에, 시이버(Sieber)에 의해 C-말단 아미드의 고체-상 합성을 위한 새로운 산-불안정성 수지가 발견되었다 (문헌 [Tetrahedon Lett., 1987, 28(19):2107-10]). 이 수지는 산 불안정성을 증가시키기 위하여 해당 크산테닐 기와 폴리스티렌 사이에 도입된 -OCH2- 기를 가지는 9-크산테닐 기를 이용한다. 이와 같은 수지로부터의 펩티드 아미드의 절단은 매우 약한 산첨가분해에 의해 수행된다. 상기 논문은 이와 같은 수지에서의 2종의 펩티드 - 첫 번째는 측쇄 보호기 (Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH2)가 없는 것으로써, 0.5 g 규모에서의 수지로부터의 절단이 유리 칼럼 내 수지를 통하여 산성 절단 혼합물 (TFA:1,2-디클로로에탄 2:98 v/v)을 펌핑하는 것에 의해 수행되며; 측쇄-보호기 (tert-부틸, Trt, Mtr 및 Boc)를 포함하는 13개 아미노산 펩티드인 두 번째 펩티드 (α-MSH)는 수지를 포함하는 칼럼을 통하여 산성 절단 혼합물 (TFA/1,2-디클로로에탄-/1,2-에탄디티올 2:98:0.1)을 펌핑하는 것에 의해 수지로부터 절단됨 -의 합성에 대해 기술하고 있다. 모든 측쇄 보호기를 제거하기 위해서는, 고농도의 산 및 가열을 사용하는 2종의 추가적인 단계 (30℃에서 TFA/물 9:1 후 이어지는 50℃에서의 스캐빈저를 포함하는 95% TFA)를 필요로 한다.
상기 논문에서는 함축적으로 언급되지 않았지만, (크산테닐 수지가 알려지게 됨에 따른) 시이버 아미드 수지의 주 유용성은 이후의 단편 축합 반응에서 사용하기 위한 완전히 측쇄 보호된 펩티드를 제조하는 것이었다. 이는 절단 칵테일에서의 낮은 백분율 v/v의 산 사용 - 통상적으로 1-5% v/v -을 통하여 달성가능하다. 시중의 공급자에 따르면 (노바바이오켐(Novabiochem)®, 머크(Merck) KGaA)), 시이버 수지는 "약한 1% TFA 절단을 통한 보호된 펩티드 아미드의 FMOC SPPS를 위한 초고도 산-불안정성 링커 (수지)"이다.
Fmoc 화학, 및 특정 농도의 트리플루오로아세트산 (TFA) (예를 들어 10% v/v 초과)을 사용하는 절단 용액과 조합된 시이버 아미드 수지를 사용하는 것이 완전히 탈보호된 펩티드 아미드를 실용적이고도 대규모로 (kg 규모) 합성하는 데에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 링크 아미드 수지를 사용하는 것과 비교할 때, 이는 완전히 탈보호된 펩티드 아미드를 제조함에 있어서 더 뛰어난 방법인데, 하기 때문이다:
(i) 본 방법을 사용하면, 더 큰 제조 수율을 달성하는 것이 가능해 짐.
(ii) 본 방법을 사용하면, 더 용이한 하류 정제를 가능케 하므로, 더 높은 펩티드 순도를 달성하는 것이 가능해 짐.
(iii) 원료 및 용매 소비의 감소를 촉진하므로, 더 비용-효과적인 제조 방법임.
(iv) 강력하며 소규모부터 대규모까지 재현가능한 방법이므로, 용이한 공정 규모조정을 가능케 함.
본 발명은 단계적인 고체-상 Fmoc-화학을 포함하는, 치료 펩티드의 신규한 대규모 합성 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 하기의 연속 단계들을 포함하는 치료 펩티드의 합성 방법을 제공한다:
(a) 쌍극성 비양성자성 용매(dipolar aprotic solvent) 중에서 Fmoc-시이버 수지 (시이버 아미드 수지 또는 Fmoc 시이버 아미드 수지로도 지칭됨)를 팽윤시키는 단계;
(b) 쌍극성 비양성자성 용매 중에서 피페리딘 용액을 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
(c) Fmoc 탈보호 후 쌍극성 비양성자성 용매를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
(d) 쌍극성 비양성자성 용매 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시킨 다음 염기를 첨가하고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
(e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
(f) 쌍극성 비양성자성 용매 중에서 염기와 함께 커플링 시약으로서 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여, 활성화된 Fmoc-아미노산을 커플링시키는 단계;
(g) 각 Fmoc-아미노산 커플링 후 수지를 세척하는 단계;
(h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
(i) 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계;
(j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계; 및
(k) 여과물을 증발시킨 후, 유기 용매를 사용하여 농축 용액으로부터 조 생성물을 침전시키고 부분적으로 정제함으로써, 부분적으로 정제된 펩티드를 산출하는 단계.
상기에서 정의된 바와 같은 방법의 단계 (a), (b), (c) 및 (f)에 따르면, 쌍극성 비양성자성 용매가 사용된다. 그와 같은 쌍극성 비양성자성 용매는 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA) 또는 N-메틸피롤리돈 (NMP), 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, DMF가 쌍극성 비양성자성 용매로 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 연속 단계들을 포함하는 치료 펩티드의 합성 방법을 제공한다:
(a) 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 Fmoc-시이버 수지 (시이버 아미드 수지 또는 Fmoc 시이버 아미드 수지로도 지칭됨)를 팽윤시키는 단계;
(b) DMF 중에서 피페리딘 용액을 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
(c) Fmoc 탈보호 후 DMF를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
(d) DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시킨 다음 염기를 첨가하고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
(e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
(f) DMF 중에서 염기와 함께 커플링 시약으로서 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여, 활성화된 Fmoc-아미노산을 커플링시키는 단계;
(g) 각 Fmoc-아미노산 커플링 후 수지를 세척하는 단계;
(h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
(i) 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계;
(j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계; 및
(k) 여과물을 증발시킨 후, 유기 용매를 사용하여 농축 용액으로부터 조 생성물을 침전시키고 부분적으로 정제함으로써, 부분적으로 정제된 펩티드를 산출하는 단계.
상기에서 정의된 바와 같은 본 발명 방법의 단계 (d)에 따르면, 염기가 사용된다. 상기 염기는 3급 아민 염기 또는 그의 혼합물이며, N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA), 트리에틸아민 (TEA), N-메틸모르폴린 (NMM), 2,4,6-트리메틸피리니딘 (TMP, 콜리딘으로도 알려져 있음), 2,3,5,6-테트라메틸피리딘 (TEMP), 2,6-디-tert-부틸-4-디메틸아미노피리딘 (DBDMAP) 또는 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)으로부터 선택될 수 있다. 직전 본 발명 측면의 바람직한 실시양태는 단계 (d)에서 사용되는 염기가 3급 아민이라는 것, 그리고 더욱 바람직한 실시양태에서 상기 염기는 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)이라는 것을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 치료 펩티드의 합성 방법을 제공한다:
(a) 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 Fmoc-시이버 수지 (시이버 아미드 수지 또는 Fmoc 시이버 아미드 수지로도 지칭됨)를 팽윤시키는 단계;
(b) DMF 중에서 피페리딘 용액을 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
(c) Fmoc 탈보호 후 DMF를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
(d) DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시킨 다음 염기를 첨가하고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
(e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
(f) DMF 중에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)과 함께 커플링 시약으로서 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여, 활성화된 Fmoc-아미노산을 커플링시키는 단계;
(g) 각 Fmoc-아미노산 커플링 후 수지를 세척하는 단계;
(h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
(i) 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계;
(j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계; 및
(k) 여과물을 증발시킨 후, 유기 역-용매를 사용하여 농축 용액으로부터 조 생성물을 침전시키고 부분적으로 정제함으로써, 부분적으로 정제된 펩티드를 산출하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 연속 단계들을 포함하는 치료 펩티드의 합성 방법을 제공한다:
(a) 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 Fmoc-시이버 수지 (시이버 아미드 수지 또는 Fmoc 시이버 아미드 수지로도 지칭됨)를 팽윤시키는 단계;
(b) DMF 중에서 피페리딘 용액을 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
(c) Fmoc 탈보호 후 DMF를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
(d) DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시킨 다음 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 첨가하고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
(e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
(f) DMF 중에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)과 함께 커플링 시약으로서 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여, 활성화된 Fmoc-아미노산을 커플링시키는 단계;
(g) 각 Fmoc-아미노산 커플링 후 수지를 세척하는 단계;
(h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
(i) 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계;
(j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계; 및
(k) 여과물을 증발시킨 후, 유기 용매를 사용하여 농축 용액으로부터 조 생성물을 침전시키고 부분적으로 정제함으로써, 부분적으로 정제된 펩티드를 산출하는 단계.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 상기에서 정의된 바와 같은 방법의 단계 (i)에서 사용되는 상기 절단 칵테일이 TFA, 1종 이상의 스캐빈저 및 DCM으로 구성되며, 여기서 상기 스캐빈저는 트리이소프로필실란 (TIPS), 트리에틸실란 (TES), 페놀, 아니솔, 티오아니솔, 물, 1,2-에탄디티올 (EDT), 1-도데칸티올, 디티오트레이톨 (DTT) 및 인돌로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 상기 절단 칵테일 중 TFA의 백분율이 25%를 초과하지 않는 것을 특징으로 한다.
직전 본 발명 측면의 바람직한 실시양태는 상기 스캐빈저가 TIPS, TES, 아니솔 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 상기에서 정의된 바와 같은 단계 (i)에서 사용되는 상기 절단 칵테일이 TFA, 1종 이상의 스캐빈저 및 DCM으로 구성되며, 여기서 상기 스캐빈저는 TIPS, TES, 아니솔 및 물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 단 상기 절단 칵테일 중 TFA의 백분율이 25%를 초과하지 않는 것을 특징으로 한다.
Boc 및 tBu 측쇄 보호기만이 제거될 필요가 있는 펩티드의 경우, 본 발명의 바람직한 실시양태는 상기 절단 칵테일이 2.5 내지 12% v/v의 TIPS 및 62.5 내지 82.5% v/v의 DCM과 함께 15 내지 25% v/v의 TFA로 이루어지는 것; 더욱 더 바람직하게는 상기 절단 칵테일이 10% v/v의 TIPS 및 70% v/v의 DCM과 함께 20% v/v의 TFA로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
Boc 및 tBu 측쇄 보호기만이 제거될 필요가 있는 펩티드의 경우, 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 하기를 특징으로 한다:
상기에서 정의된 바와 같은 단계 (i)에서 사용되는 상기 절단 칵테일이 2.5 내지 12% v/v의 TIPS와 함께 15 내지 25% v/v의 TFA로 이루어지며, 나머지 절단 칵테일이 100%까지 DCM으로 구성되는 것;
더욱 더 바람직하게는 상기에서 정의된 바와 같은 단계 (i)에서 사용되는 상기 절단 칵테일이 대략 10% v/v의 TIPS 및 70% v/v의 DCM과 함께 대략 20% v/v의 TFA로 이루어지는 것.
단계 (a) 내지 (k)를 사용하는 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명 방법의 다른 바람직한 실시양태는 생성되는 펩티드가 측쇄 보호기의 탈보호와 동시에 시이버 아미드 수지로부터 절단되는 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 먼저 Fmoc 기가 DMF 중에서 피페리딘을 사용하여 수지로부터 제거되는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 먼저 Fmoc 기는 DMF 중에서 피페리딘을 사용하여 수지로부터 제거되며, 여기서 DMF 중 상기 피페리딘의 농도는 20% (v/v) 미만, 더욱 바람직하게는 약 15% (v/v)이다.
상기에서 정의된 바와 같은 본 발명 방법의 단계 (f)에 따르면, 활성화된 Fmoc-아미노산의 커플링은 DMF와 같은 쌍극성 비양성자성 용매 중에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)과 같은 염기와 함께 단독 또는 조합으로써의 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여 수행된다. 전기한 본 발명 측면들 중 어느 하나의 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기는 TBTU/HOBt/DIEA, HBTU/HOBt/DIEA, HATU/DIEA, HCTU/DIEA, DIC/HOBt, DIC/HOAt, HATU/HOBt/DIEA 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 HCTU/DIEA 및 TBTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 "커플링 시약 조합"을 사용하여 커플링된다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (a)에서, 먼저 Fmoc-시이버-아미드 수지가 1시간 이하 동안의 7 내지 12 부피의 DMF 1 내지 3회 처리, 더욱 더 바람직하게는 처리 당 10 내지 30분 지속되는 10 부피의 DMF 3회 처리를 사용하여 팽윤되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (b)에서, 시이버 수지 상의 Fmoc 기가 5 내지 20분 지속되는 DMF 중 피페리딘의 용액 (10-20% v/v)을 사용한 1 내지 2회 처리, 더욱 더 바람직하게는 10분 지속되는 DMF 중 15% v/v 피페리딘의 2회 처리를 사용하여 탈보호되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (c)에서, 탈보호된 수지가 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 3 내지 5회 세척되며 각 세척은 5분 이하 지속되고, 더욱 더 바람직하게는 10 부피의 DMF를 사용하여 3회 세척되며 각 세척은 5분 이하 지속되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (d)에서, DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시키고 DIEA를 첨가하여 5분 이하 동안 교반함으로써, 1.2-2.0 몰 당량 (수지-배치 규모에 비례)의 Fmoc-아미노산이 커플링을 위하여 활성화되며; 더욱 바람직하게는 DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시키고 DIEA를 첨가하여 1 내지 2분 동안 교반함으로써, 1.5 몰 당량 (수지-배치 규모에 비례)의 Fmoc-아미노산이 커플링을 위하여 활성화되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (f)에서, 주위 온도에서 30 내지 120분 동안 4 내지 10 부피의 DMF 중에서 1.5 내지 2.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 DIEA와 함께 0.5 내지 1.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 커플링 시약(들)이 사용되며; 더욱 바람직하게는 15 내지 30℃에서 60분 동안 5 내지 7 부피의 DMF 중에서 1.5 내지 2.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 DIEA와 함께 0.5 내지 1.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 커플링 시약(들)이 사용되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (g)에서, 각 커플링 후 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 5분 이하 동안 2 내지 4회 수지가 세척되며; 더욱 바람직한 실시양태에서는 각 커플링 후 10 부피의 DMF를 사용하여 5분 이하 동안 2회 수지가 세척되는 것을 특징으로 한다.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (i)에서 하기를 특징으로 한다:
- 주위 온도에서 수지가 절단 칵테일에 침지된 후 2 내지 3시간 동안 교반되며, 더욱 바람직하게는 수지가 침지된 후 2.5시간 동안 교반되는 것, 및
- 수지/절단 칵테일 용액이 질소 기체를 사용하여 간헐적으로 스파징되는(sparged) 것.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (j)에서 하기를 특징으로 한다:
- 적은 부피의 새로운 절단 칵테일 또는 TFA/DCM (20:80 v/v) 중 어느 하나를 사용하여 1 내지 2회 폐 수지가 세척되는 것;
- 임의로, 적은 부피의 MeOH를 사용하여 폐 수지가 세척되는 것.
상기에서 정의된 바와 같은 연속 단계 (a) 내지 (j)를 사용하는 본 발명 방법의 바람직한 실시양태는 단계 (k)에서, 여과물을 합쳐 조합물을 증발시킨 후 하기를 특징으로 한다:
- 5 내지 15 부피의 MtBE를 사용하여 조 펩티드가 침전 분리되는 것;
- 침전된 펩티드가 필요한 건조 수준으로 건조되는 것;
- 하류의 크로마토그래피 정제에서 사용될 묽은 산 또는 유기 개질제를 포함하는 묽은 산을 사용하여 침전된 펩티드가 용해되는 것;
- 펩티드가 정제되고, 역-상 정제용 크로마토그래피를 사용하는 염 교환 단계가 수행되는 것.
본 발명 방법의 또 다른 바람직한 실시양태는 하기의 연속 단계 (a) 내지 (j)를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 1시간 이하 동안의 7 내지 12 부피의 DMF 1 내지 3회 처리, 더욱 더 바람직하게는 처리 당 10 내지 30분 지속되는 10 부피의 DMF 3회 처리를 사용하여 Fmoc-시이버-아미드 수지를 팽윤시키는 단계;
(b) 5 내지 20분 지속되는 DMF 중 피페리딘의 용액 (10-20% v/v)을 사용한 1 내지 2회 처리, 더욱 더 바람직하게는 10분 지속되는 DMF 중 15% v/v 피페리딘의 2회 처리를 사용하여 시이버 수지 상의 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
(c) 각 세척을 5분 이하 지속하면서 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 3 내지 5회, 더욱 더 바람직하게는 각 세척을 5분 이하 지속하면서 10 부피의 DMF를 사용하여 3회 탈보호된 수지를 세척하는 단계;
(d) DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시키고 DIEA를 첨가하여 1 내지 2분 동안 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 1.2-2.0 몰 당량 (수지-배치 규모에 비례)의 Fmoc-아미노산을 활성화시키며; 더욱 바람직하게는 DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시키고 DIEA를 첨가하여 1 내지 2분 동안 교반함으로써, 커플링시키기 위한 1.5 몰 당량 (수지-배치 규모에 비례)의 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
(e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
(f) 주위 온도에서 30-120분 동안 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 사용하여 탈보호된 수지를 침지시키고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 Fmoc-아미노산을 커플링시키며; 상기 활성화된 Fmoc-아미노산 용액은 주위 온도에서 4 내지 10 부피의 DMF 중에 1.5 내지 2.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 DIEA와 0.5 내지 1.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 커플링 시약(들)과 함께 상기 (d)에서 기술된 바와 같은 Fmoc-아미노산으로 구성되는 단계 (더욱 바람직하게는 15 내지 30℃에서 60분 동안 5 내지 7 부피의 DMF 중에 1.5 내지 2.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 DIEA와 0.5 내지 1.5 몰 당량 (Fmoc 아미노산에 비례)의 커플링 시약(들)임);
(g) 각 커플링 후 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 5분 이하 동안 2 내지 4회; 더욱 바람직하게는 10 부피의 DMF를 사용하여 5분 이하 동안 2회 수지를 세척하는 단계;
(h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
(i) 하기에 의한, 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계:
- 주위 온도에서 수지를 절단 칵테일에 침지한 후 2 내지 3시간 동안 교반하며, 더욱 바람직하게는 침지한 후 2.5시간 동안 교반하는 것, 및
- 질소 기체를 사용하여 간헐적으로 수지/절단 칵테일 혼합물을 스파징하는 것;
(j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과한 다음, 하기를 실시하는 단계:
- 적은 부피의 새로운 절단 칵테일 또는 TFA/DCM (20:80 v/v) 중 어느 하나를 사용하여 1 내지 2회 폐 수지를 세척하는 것; 및
- 임의로, 적은 부피의 MeOH를 사용하여 폐 수지를 세척하는 것;
(k) 여과물을 합쳐 세척하고, 조합물을 증발시킨 다음, 하기를 실시하는 단계:
- 조합된 증발 여과물으로부터 조 펩티드를 침전시키고, 5 내지 15 부피의 MtBE를 사용하여 세척하는 것;
- 침전된 펩티드를 필요한 건조 수준으로 건조하는 것;
- 하류의 크로마토그래피 정제에서 사용될 묽은 산 또는 유기 개질제를 포함하는 묽은 산을 사용하여 침전된 펩티드를 용해시키는 것;
- 펩티드를 정제하고, 역-상 정제용 크로마토그래피를 사용하는 염 교환 단계를 수행하는 것.
직전 본 발명 측면들 중 어느 하나의 바람직한 실시양태는 단계 (a) 내지 (j) (새로운 하위단계는 -#로 표시됨)가 하기와 같이 추가적으로 정의되는 것을 특징으로 한다:
(a) 먼저 1시간 이하 동안의 7 내지 12 부피의 DMF 1 내지 3회 처리, 더욱 더 바람직하게는 처리 당 10 내지 30분 지속되는 10 부피의 DMF 3회 처리를 사용하여 Fmoc-시이버-아미드 수지를 팽윤시키는 단계;
(b) 5 내지 20분 지속되는 DMF 중 피페리딘의 용액 (10-20% v/v)을 사용한 1 내지 2회 처리, 더욱 더 바람직하게는 10분 지속되는 DMF 중 15% v/v 피페리딘의 2회 처리를 사용하여 시이버 수지 상의 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
(c) 각 세척을 5분 이하 지속하면서 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 3 내지 5회, 더욱 더 바람직하게는 각 세척을 5분 이하 지속하면서 10 부피의 DMF를 사용하여 3회 탈보호된 수지를 세척하는 단계;
(d) DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시키고 DIEA를 첨가하여 5분 이하 동안, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 2분 동안 교반함으로써, 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산 (수지-배치 규모에 비례하여 1.2-2.0 몰 당량, 더욱 바람직하게는 1.5 몰 당량)을 활성화시키는 단계;
(e) 반응기 내 수지에 커플링 용액을 충전하는 단계;
(f) 주위 온도에서 30 내지 120분 동안 4 내지 10 부피의 DMF 중에 Fmoc 아미노산에 비례하는 1.5 내지 2.5 몰 당량의 DIEA와 함께 Fmoc 아미노산에 비례하는 0.5 내지 1.5 몰 당량의 커플링 시약(들)을 사용하며, 더욱 더 바람직하게는 15 내지 30℃에서 60분 동안 5 내지 7 부피의 DMF를 사용하는 단계;
(g) 각 커플링 후 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 5분 이하 동안 2 내지 4회; 더욱 바람직하게는 10 부피의 DMF를 사용하여 5분 이하 동안 2회 수지를 세척하는 단계;
(h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
(i) 주위 온도에서 수지를 절단 칵테일에 침지한 후 2 내지 3시간 동안 교반하며, 더욱 바람직하게는 수지를 침지한 후 2.5시간 동안 교반하는 단계;
(i-1) 질소 기체를 사용하여 간헐적으로 수지/절단 칵테일 용액을 스파징하는 단계;
(j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계:
(j-1) 적은 부피의 새로운 절단 칵테일 또는 TFA/DCM (20:80 v/v) 중 어느 하나를 사용하여 1 내지 2회 폐 수지를 세척하는 단계;
(j-2) 적은 부피의 MeOH를 사용하여 폐 수지를 세척하는 단계;
(k) 여과물을 합치고, 조합물을 증발시키는 단계:
(k-1) 5 내지 15 부피의 MtBE를 사용하여 조 펩티드를 침전 분리하는 단계;
(k-2) 침전된 펩티드를 필요한 건조 수준으로 건조하는 단계;
(k-3) 하류의 크로마토그래피 정제에서 사용될 묽은 산 또는 유기 개질제를 포함하는 묽은 산을 사용하여 침전된 펩티드를 용해시키는 단계;
(k-4) 펩티드를 정제하고, 역-상 정제용 크로마토그래피를 사용하는 염 교환 단계를 수행하는 단계.
일부 보호기 (예컨대 아르기닌의 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐 (Pbf) 측쇄 보호)는 실용적인 기간 이내의 측쇄 보호기 제거에 통상적으로 50-80%인 더 높은 백분율의 산을 필요로 하게 되나, 본 발명의 다른 모든 측면은 동일하게 유지되는 것으로 알려져 있다. 고려되는 다른 측쇄 보호기에는 메톡시트리메틸벤젠 술포닐 (Mtr), 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-술포닐 클로라이드 (Pmc), 4,4-디메틸옥시벤히드릴 (Mbh) 및 2,4,6-트리메톡시벤질 (Tmob)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 절단 동안 및 후에 특정 측쇄 보호기를 유지하는 것이 바람직한 상황도 제공한다. 예를 들어, 완전한 펩티드가 그의 선형 형태로 정제되고, 그 이후 보호기가 제거되어 2개의 Cys 잔기 사이에 디술피드 가교가 형성될 때 고리화될 수 있도록, Cys 상에서는 아세트아미도메틸 (Acm) 측쇄 보호기를 유지하는 것이 중요하다.
도 1: 유사한 합성 절차하에서의 링크 아미드 수지를 사용하여 합성된 펩티드 대 시이버 아미드 수지를 사용하여 합성된 것의 맞비교를 도시하는 그래프. 본원에서 기술되는 절차에 따라 5개 아미노산에서 30개 아미노산까지 가변 길이의 펩티드를 제조하고, 합성 수율을 측정하였다. 각 펩티드 길이 (그래프의 y-축에 기재되어 있음)에 대하여, 링크 아미드 수지를 사용한 % 수율 (x-축으로 표시되어 있음)을 상부 막대로 나타내고, 시이버 아미드 수지를 사용한 % 수율을 하부 막대로 나타내었다. 합성된 각 펩티드, 즉 5개 아미노산 서열, 2종의 8개 아미노산 서열, 1개 이상의 도파민 모이어티를 사용하여 변형된 8개 아미노산 서열, 및 30개 아미노산 서열에 있어서, 시이버 아미드 수지의 사용이 더 높은 % 수율을 초래하였다.
도 2: 5개 아미노산 펩티드의 합성에 시이버 아미드 수지를 사용한 경우 2 g 내지 2200 g 규모에서의 합성 수율 재현성을 도시하는 그래프. 기록되어 있는 바와 같이, 모든 규모에서 약 80%의 합성 수율이 일관되게 달성되었다.
도 3: 링크 아미드 수지 대 시이버 아미드 수지를 사용한 8개 아미노산 펩티드 및 30개 아미노산 펩티드의 합성에 사용되는 재료를 기준으로 한 상대적 비용을 도시하는 그래프. 8개 아미노산 펩티드 및 30개 아미노산 펩티드용으로 링크 아미드 수지를 사용하여 합성되는 펩티드에 사용되는 재료를 기준으로 한 상대적 비용은 상부 막대로 나타낸 반면, 시이버 아미드 수지를 사용하는 동일합 펩티드의 상대적 비용은 각 펩티드에 대하여 하부 막대로 나타내었다. 기록되어 있는 바와 같이, 시이버 아미드 수지를 사용하는 경우의 상대적 비용이 링크 아미드 수지의 경우 미만이다.
대부분의 단계적 고체-상 합성은 펩티드 아미드의 합성에 폴리스티렌 수지의 사용을 필요로 한다. Fmoc-보호된 아미노산을 이용하여 펩티드 아미드를 제조하기 위한 고체 상 펩티드 합성에는 링크 아미드 수지가 사용된다. 첫 번째 아미노산의 커플링은 통상적인 아미드 결합 형성 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 링크 아미드 수지 상에서 염기성 또는 중성 조건하에 펩티드 서열이 조립된 다음, 완성된 펩티드가 산 조건하에 수지로부터 절단된다. 통상적으로, 펩티드는 80%를 초과하는 TFA v/v를 사용하여 링크 아미드 수지로부터 절단된다 (문헌 [Stathopoulos, P.; Papas, S.; and Tsikaris, V., J. Pept. Sci., 2006, 12:227-37]). 때로는 더 강한 산 또는 더 고농도의 TFA가 링크 링커 중 일부를 폴리스티렌 지지체로부터 절단하고, 절단된 생성물에 착색된 불순물을 도입한다. 따라서, 일부 펩티드의 경우, 링크 아미드 수지를 사용한 합성 수율은 통상적으로 낮다. 링크 수지의 예는 하기이다:
Figure 112014067595450-pct00001
Figure 112014067595450-pct00002
Figure 112014067595450-pct00003
저농도의 산에 대한 "초 산-감수성" 또는 "초고도 산-감수성" 수지 링커의 불안정성은 완전히 보호된 펩티드가 수지로부터 방출되는 것을 가능케 한다. 통상적으로, 펩티드 절단에는 1-5% v/v의 TFA가 요구된다. 절단에 요구되는 산 강도의 감소 이외에는, 이러한 수지는 링크 아미드 수지와 유사한데, 다시 말하자면 이들은 유사한 적재 용량을 가지는 유사한 비드 크기의 폴리스티렌 매트릭스이다. 따라서, 이러한 수지는 첫 번째 잔기의 적재 및 이후 잔기들의 커플링과 관련하여 동일한 Fmoc 화학을 사용하는 수렴적(convergent) 합성에 유용하다.
절단 칵테일 중 저농도의 트리플루오로아세트산 (TFA) (1-5% v/v)과 함께 사용될 경우, "초 산-감수성" 수지의 예인 시이버 아미드 수지 (문헌 [Sieber, P., Tetrahedron Lett., 1987, 28(19):2107-10])는 비제한적으로 tert-부틸옥시카르보닐 (Boc) 및 tert-부틸 에테르 (tBu)를 포함한 측쇄 보호기를 보유하는 펩티드 아미드의 합성에 주로 사용된다.
시이버 아미드 수지가 통상적으로 Fmoc 고체-상 합성에 사용되기 때문에, 아미노산은 Fmoc-보호될 필요가 있다. 따라서, 펩티드 합성 완료 후 남아있는 보호기는 절단될 필요가 있다. 남아있는 보호기의 절단은 5% 이하의 에탄디올 및 5% 이하의 4-(메틸메르캅토)페놀을 함유하는 95% 이하의 TFA와 같은 고도의 산첨가분해 조건을 필요로 한다 (문헌 [Sieber, P., Tetahedron Lett., 1987, 28(19):2107-10]).
Figure 112014067595450-pct00004
본 발명자들은 시이버 아미드 수지를 사용한 산 감수성 8개-잔기 펩티드 아미드의 합성을 시도하였다. Fmoc 화학과 함께 시이버 아미드 수지를 사용하면, 선형 SPPS가 수행될 수 있다는 것이 발견되었다. 본 발명자들은 조건을 조정하면, 시이버 수지로부터의 최종 생성물의 절단에 고농도의 산, 즉 TFA가 요구되지 않는다는 것을 발견하였다. 또한, "중간" 농도의 TFA/TIPS/DCM 절단 칵테일이 사용되는 경우, 측쇄 보호기가 시이버 아미드 수지로부터의 생성 펩티드의 절단과 동시에 제거될 수 있다는 것이 발견되었다. 몇몇 최적화를 통하여, 본 발명자들은 특히 Boc, tBu 및/또는 Trt 보호기를 가지는 것들인 보호된 아미노산을 사용하여 전체-길이 펩티드를 합성한 다음, 펩티드 분해를 최소화하면서 수지로부터 완전히 탈보호된 펩티드 아미드를 방출하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 5 내지 30개 아미노산 길이의 다른 펩티드, 그리고 비천연 아미노산은 물론 트립토판, 시스테인 및 아르기닌과 같은 문제가 있는 자연-발생 아미노산을 함유하는 펩티드를 합성하는 데에 시이버 아미드 수지를 사용하는 시도를 하였다. 본 발명자들은 절단시 중간 TFA 농도와 함께 시이버 아미드 수지를 사용하면, 비천연 또는 문제가 있는 아미노산을 함유하는 펩티드가 합성될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 특히 술포닐 측쇄 보호기가 존재하는 경우 절단시 더 높은 TFA 농도가 필요하기는 하지만, 시이버 아미드 수지를 사용하면, 아르기닌을 함유하는 펩티드가 합성될 수 있다는 것이 발견되었다.
놀랍게도, 문헌에 개시되어 있는 것과 반대되는 방식으로 사용될 경우, 시이버 아미드 수지는 더 순수한 조 생성물의 더 높은 수율을 초래하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 WO 2004/014415에 보고되어 있는 바와 같은 그렐린 유사체 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2의 제조에 시이버 아미드 수지가 사용되는 경우, 합성 수율이 링크 아미드 수지가 사용되는 경우의 18-30%에서 78-83%로 증가된다는 것을 발견하였다. 도파민-소마토스타틴 키메라와 같은 다른 펩티드에 대하여, 본 발명자들은 동일한 조건하에서 13 내지 71%를 산출하는 링크 아미드 계열의 수지 (예컨대 링크 아미드 MBHA 수지, 링크 아미드 AM 수지, 링크 아미드 수지)와 같은 통상적으로 사용되는 수지와 비교할 때, 시이버 아미드 수지를 사용한 합성 수율이 72.6 내지 80.8%라는 것을 보고하였다. 본 발명자들은 시이버 아미드 수지를 사용하는 것이 링크 아미드 수지를 사용하는 것에 비해 평균 50%까지 수율을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 또한, 수율은 배치들 사이에, 그리고 2 g으로부터 2.2 kg까지의 규모-확장시에 재현가능하였다. 가변 길이, 즉 5개 아미노산 길이 내지 30개 아미노산 길이의 펩티드를 합성하기 위한 동일 조건 하에서의 링크 아미드 사용 대 시이버 아미드 수지 사용의 비교 수율을 도 1에 보고하였다. 각 비교에서, 70% 대 10%로써, 시이버 아미드 수지의 사용이 더 높은 합성 수율을 초래하였다. 결과적으로, 도 3에서, 펩티드 길이를 기준으로 한 상대적 비용 백분율은 통상적인 링크 아미드 수지 대신 시이버 아미드 수지가 사용된 경우에 더 작았다. 도 2에서, 본 발명자들은 시이버 아미드 수지를 사용한 합성 수율의 재현성도 입증하였다.
또한, 통상적으로 사용되는 링크 아미드 수지는 수지로부터의 최종 펩티드의 절단에 보통 80-95% v/v인 고농도의 TFA를 필요로 한다. 본 발명자들은 시이버 아미드 수지를 사용함으로써, 겨우 10-25%의 TFA가 요구된다는 것을 발견하였다. 전기에서 언급된 바와 같이, 더 높은 농도의 TFA는 시간 경과에 따른 심각한 펩티드의 분해는 물론, 펩티드에 대한 수지 링커의 전부 또는 일부의 부착으로부터 유래하는 것들과 같은 차후에 제거하기가 어려울 수 있는 불순물의 존재도 초래할 수 있다. 또한, 최종 절단시 산이 덜 필요하기 때문에, 본 청구 방법을 사용하면, 절단 후의 후처리가 더 빠르다.
또한, 시이버 아미드 수지를 사용하면, 제조되는 펩티드의 수율 또는 순도에 영향을 주지 않으면서도 Fmoc-아미노산, 커플링 시약 및 용매의 양을 감소시키는 것이 가능하다는 것이 발견되었다.
본 발명의 화합물에 존재하는 특정 아미노산들은 본원에서 하기와 같이 표시된다:
A3c 1-아미노-1-시클로프로판카르복실산
A4c 1-아미노-1-시클로부탄카르복실산
A5c 1-아미노-1-시클로펜탄카르복실산
A6c 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산
Abu α-아미노부티르산
Acc 1-아미노-1-시클로(C3-C9)알킬 카르복실산
Act 4-아미노-4-카르복시테트라히드로피란, 즉
Figure 112014067595450-pct00005
Aepa 하기의 구조로 표시되는 4-(2-아미노에틸)-1-카르복시메틸-피페라진
Figure 112014067595450-pct00006
Aib α-아미노이소부티르산
Ala 또는 A 알라닌
β-Ala 베타-알라닌
Apc 아미노 피페리디닐카르복실산, 즉
Figure 112014067595450-pct00007
Arg 또는 R 아르기닌
hArg 호모아르기닌
Asn 또는 N 아스파라긴
Asp 또는 D 아스파르트산
Bal 3-벤조티에닐알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00008
Bip 4,4'-비페닐알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00009
Bpa 4-벤조일페닐알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00010
Caeg 하기의 구조로 표시되는 N-(2-아미노에틸)-N-(2-시토시닐-1-옥소-에틸)-글리신
Figure 112014067595450-pct00011
Cha β-시클로헥실알라닌
Cys 또는 C 시스테인
Dab 2,4-디아미노부티르산, (α,γ-디아미노부티르산)
Dap 2,3-디아미노프로피온산, (α,β-디아미노프로피온산)
Dip β,β-디페닐알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00012
Dhp 3,4-데히드로프롤린
Dmt 5,5-디메틸티아졸리딘-4-카르복실산
2-Fua β-(2-푸릴)-알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00013
Gln 또는 Q 글루타민
Glu 또는 E 글루탐산
Gly 또는 G 글리신
His 또는 H 히스티딘
3-Hyp 트랜스-3-히드록시-L-프롤린, 즉 (2S,3S)-3-히드록시피롤리딘-2-카르복실산
4-Hyp 4-히드록시프롤린, 즉 (2S,4R)-4-히드록시피롤리딘-2-카르복실산
Ile 또는 I 이소류신
Inc 인돌린-2-카르복실산
Inp 이소니페코트산, 즉
Figure 112014067595450-pct00014
Ktp 4-케토프롤린
Leu 또는 L 류신
hLeu 호모류신
Lys 또는 K 리신
Lys(Ac) 리신(아세틸)
Met 또는 M 메티오닌
1-Nal β-(1-나프틸)알라닌
2-Nal β-(2-나프틸)알라닌
Nle 노르류신
Nva 노르발린
Oic 옥타히드로인돌-2-카르복실산
Orn 오르니틴
2-Pal β-(2-피리딜)-알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00015
3-Pal β-(3-피리딜)-알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00016
4-Pal β-(4-피리딜)-알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00017
Pff 펜타플루오로페닐알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00018
Phe 또는 F 페닐알라닌
hPhe 호모페닐알라닌
Pim 2'-(4-페닐)이미다졸릴, 즉
Figure 112014067595450-pct00019
Pip 피페콜산
Pro 또는 P 프롤린
Ser 또는 S 세린
Ser(Bzl) 세린(O-벤질)
Taz β-(4-티아졸릴)알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00020
2-Thi β-(2-티에닐)알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00021
3-Thi β-(3-티에닐)알라닌, 즉
Figure 112014067595450-pct00022
Thr 또는 T 트레오닌
Thr(Bzl) 트레오닌(O-벤질)
Thz 티아졸리딘-4-카르복실산
Tic 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산
Tle tert-류신
Trp 또는 W 트립토판
(N-Me)D-Trp Nα-메틸-D-트립토판
Tyr 또는 Y 티로신
3-I-Tyr 3-아이오도-티로신
Val 또는 V 발린.
"Dop1"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00023
"Dop2"는 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00024
"Dop3"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00025
"Dop4"는 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00026
"Dop5"는 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00027
"Dop6"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00028
"Dop7"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00029
"Dop8"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00030
"Dop9"는 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00031
"Dop10"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00032
"Dop11"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00033
"Dop12"는 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00034
"Dop13"은 하기의 구조를 가지는 화합물을 의미한다:
Figure 112014067595450-pct00035
Lys(Dop2)는 하기의 구조를 가진다:
Figure 112014067595450-pct00036
Dop2-Lys(Dop2)는 하기의 구조를 가진다:
Figure 112014067595450-pct00037
Lys(Dop5)는 하기의 구조를 가진다:
Figure 112014067595450-pct00038
Dop5-Lys(Dop5)는 하기의 구조를 가진다:
Figure 112014067595450-pct00039
그리스 문자 싸이 "Ψ"는 본원에서 펩티드 결합이 슈도펩티드 결합으로 대체되었음을 표시하는 데에 사용된다. 아미노산 서열 명칭에서, Ψ라는 용어의 포맷은 A1-Ψ-(X-X')A2로써, 여기서 A1은 그의 카르보닐 기가 X로 변형되어 있는 아미노 아실 라디칼이며, A2는 그의 α-아미노 기가 X'로 변형되어 있는 아미노 아실 라디칼이다. X 및 X'는 결합에 의해 분리되어 있는 일련의 원소 기호들, 예를 들어 Tyr-Ψ-(CH2-NH)Gly로 나타낸다.
본 출원은 하기의 약어들을 사용한다:
Ac 아세틸
ACN 아세토니트릴
Acm 아세트아미도메틸
AM 아미노메틸
Boc tert-부틸옥시카르보닐
DCE 디클로로에탄
DCM 디클로로메탄
DIC N,N'-디이소프로필카르보디이미드
DIEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
DTT 디티오트레이톨
EDT 에탄디티올
Fmoc 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (또는 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일-메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드)
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (또는 N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)-(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드)
HCTU 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (또는 N-[(1H-6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드)
HOAt 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt 1-히드록시벤조트리아졸
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
LOD 건조 손실
Mbh 4,4-디메틸옥시벤즈히드릴
MBHA 4-메틸벤즈히드릴아민
MtBE 메틸 tert-부틸 에테르
Mtr 메톡시트리메틸벤젠 술포닐
OtBu tert-부틸 에스테르
Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
PEG 폴리에틸렌 글리콜
Pmc 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐 클로라이드
TBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (또는 N-[(1H-벤조트리아졸-1-일)-(디메틸아미노)메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 테트라플루오로보레이트 N-옥시드)
tBu tert-부틸 에테르
TES 트리에틸실란
TFA 트리플루오로아세트산
TIPS 트리이소프로필실란
Tmob 2,4,6-트리메톡시벤질
Trt 트리틸 또는 트리페닐메틸
다르게 표시되지 않는 한, 본원 발명을 기술하는 데에 사용되는 다양한 용어들의 의미 및 범위를 설명하고 정의하기 위하여, 하기의 정의들이 제시된다.
본원에서 사용될 때의 "절단 칵테일"이라는 용어는 조립된 펩티드를 수지로부터 제거 도는 절단하는 데에 사용되는 시약들의 혼합물을 지칭한다. 또한, 절단 칵테일은 모든 측쇄 보호기 및 N-말단 보호기를 제거하는 데에도 사용된다.
파라미터 또는 양과 관련하여 본원에서 사용될 때의 "약" (또는 "대략")이라는 용어는 파라미터 또는 양이 언급된 파라미터 또는 양의 ±5% 이내라는 것을 의미한다. 예를 들어 , "약 20%"는 (20±0.1)%와 동일한 (20±20*0.05)%를 의미한다.
이하에서 사용될 때의 "수지"라는 용어는 1종 이상의 아미노산이 부착되어 있는 Fmoc-시이버 아미드 수지 또는 시이버 아미드 수지 중 어느 하나를 지칭한다.
"실온" (또는 주위 온도)라는 용어는 15-30℃의 온도 범위를 의미한다.
하기의 실시예는 본 발명의 방법을 예시할 목적으로 기술되는 것으로써, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.
본 발명은 단계적 고체-상 화학을 포함하는, 신규한 펩티드 합성 방법에 대해 기술한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 소마토스타틴, 봄베신, VIP, PACAP, GHRH, 글루카곤, 칼시토닌, 펩티드 YY, 뉴로메딘 B, PTH, PTHrP, PTH2, GLP-1, 우로텐신-II, 그렐린, 멜라노코르틴, MIS, LHRH, 아드로핀, GIP, 뉴로펩티드 Y, IGF-1, 도파민-소마토스타틴 키메라 및 ACTH의 유사체로부터 선택된다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 그렐린 또는 도파민-소마토스타틴 키메라의 유사체로부터 선택된다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 그렐린의 유사체로부터 선택된다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 하기 화학식 I의 그렐린 유사체로부터 선택되고
<화학식 I>
Figure 112014067595450-pct00040
(상기 식에서,
A1은 Aib, Apc 또는 Inp이고;
A2는 D-Bal, D-Bip, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal, D-Ser(Bzl) 또는 D-Trp이고;
A3은 D-Bal, D-Bip, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal, D-Ser(Bzl) 또는 D-Trp이고;
A4는 2Fua, Orn, 2Pal, 3Pal, 4Pal, Pff, Phe, Pim, Taz, 2Thi, 3Thi, Thr(Bzl)이고;
A5는 Apc, Dab, Dap, Lys, Orn이거나 또는 결실되고;
R1은 수소이고;
R2는 OH 또는 NH이고;
단, A5가 Dab, Dap, Lys 또는 Orn인 경우라면,
A2가 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
A3이 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
A4가 2Thi, 3Thi, Taz, 2Fua, 2Pal, 3Pal, 4Pal, Orn, Thr(Bzl) 또는 Pff이고;
A5가 결실되는 경우라면,
A3이 D-Bip, D-Bpa 또는 D-Dip이거나; 또는
A4가 2Fua, Pff, Taz 또는 Thr(Bzl)이거나; 또는
A1이 Apc이고,
A2가 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
A3이 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
A4가 2Thi, 3Thi, Orn, 2Pal, 3Pal 또는 4Pal임),
더욱 특히는
A1이 Aib, Apc 또는 lnp이고;
A2가 D-Bal, D-Bip, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal, D-Ser(Bzl) 또는 D-Trp이고;
A3이 D-Bal, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal 또는 D-Trp이고;
A4가 Orn, 3Pal, 4Pal, Pff, Phe, Pim, Taz, 2Thi 또는 Thr(Bzl)이고;
A5가 Apc, Lys이거나, 또는 결실된 것
인 화학식 I의 화합물로부터 선택된다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 상기에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 그렐린 유사체이며, 상기 식에서
A1은 Apc 또는 lnp이고;
A2는 D-Bal, D-Bip, D-1Nal 또는 D-2Nal이고;
A3은 D-Bal, D-1Nal, D-2Nal 또는 D-Trp이고;
A4는 3Pal, 4Pal, Pff, Phe, Pim, Taz, 2Thi 또는 Thr(Bzl)이고;
A5는 Apc 또는 Lys이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2, H-Inp-D-2Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2, H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH2 및 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH2로부터 선택되는 그렐린의 유사체, 더욱 특히는 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 도파민-소마토스타틴 키메라의 유사체, 즉 소마토스타틴 또는 그의 유사체 및 1종 이상의 도파민 모이어티를 포함하는 키메라 분자이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 DopA 또는 DopA-Lys(DopA)의 구조를 포함한 도파민-소마토스타틴 키메라의 유사체이며, 여기서 Lys는 명시적으로 D-Lys로 지정되지 않는 한 L-리신이고, A는 1-13인, 예를 들어 Dop1, Dop2, Dop3, Dop4, Dop5, Dop6, Dop7, Dop8, Dop9, Dop10, Dop11, Dop12, Dop13이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 치료 펩티드의 합성 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 DopA-Lys(DopA)의 구조를 포함한 도파민-소마토스타틴 키메라의 유사체 및 화합물 Dop2-D-Lys(Dop2)-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH2이다.
본 발명의 방법에 따른 완전히 탈보호된 치료 펩티드 아미드의 합성을 위한 일반적인 절차를 하기에 예시한다.
각각 약 10-30분 지속되는 3회 처리가 바람직하기는 하지만, 7 내지 12 부피 (10 부피가 바람직함)의 DMF (삼성(Samsung), 대한민국 소재), 그리고 1시간 이하 동안의 1 내지 3회 처리를 사용하여, 먼저 Fmoc-시이버 아미드 수지 (머크 케미칼즈(Merck Chemicals), 독일 다름슈타트 소재)를 팽윤시킨다.
각각 10분 지속되는 2회 처리가 바람직하기는 하지만, 5 내지 20분 지속되는 DMF 중 피페리딘의 용액 (약 10-20% v/v, 15% v/v가 바람직함)의 1 내지 2회 처리를 사용하여, 시이버 아미드 수지의 Fmoc 탈보호를 수행한다.
각 세척 당 5분 이하 지속되는 10 부피의 DMF 3회 세척이 바람직하기는 하지만, 5분 이하 동안 지속되는 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 3 내지 5회 탈보호된 수지를 세척한다.
DMF 중에 커플링 시약(들)과 함께 Fmoc-아미노산을 용해시킨 후, DIEA (SAFC, 영국 길링햄 소재)와 같은 염기를 첨가하고, 5분 이하 (1-2분이 바람직함) 동안 교반함으로써, 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키고, 반응기에서 수지에 충전한다.
주위 온도 (바람직하게는 15 내지 30℃)에서 30 내지 120분 (커플링되는 아미노산에 따라 기간이 달라지기는 하지만, 대부분의 아미노산에서 60분이 바람직함) 지속하여, DMF (4 내지 10 부피, 5 내지 7 부피가 바람직함) 중에서, 수지에 비례하여 약 1.2 내지 2.0 몰 당량 (1.5 몰 당량이 바람직함)의 Fmoc-아미노산을 사용하고, 염기 바람직하게는 DIEA (특정 아미노산에 대하여 특정 당량이 바람직하기는 하지만, Fmoc-아미노산에 비례하여 약 1.5 내지 3.5 몰 당량)와 함께 HCTU (머크 케미칼즈) 또는 TBTU/HOBt (Fmoc 아미노산에 비례하여 0.5 내지 2.0 몰 당량) (TBTU 및 HOBt 모두 SAFC에서 입수)를 사용하여, Fmoc-아미노산 커플링을 수행한다. 커플링되는 아미노산에 따라, HCTU (Fmoc-아미노산에 비례하여 1.2 당량) 또는 HOBt를 포함하는 TBTU (0.98 몰 당량) 중 어느 하나가 바람직하다.
각 Fmoc-아미노산 커플링 후, 7 내지 12 부피의 DMF를 사용하여 2 내지 4회 수지를 세척하는데 (10 부피의 DMF 2회 세척이 바람직함), 각 세척은 5분 이하 지속된다.
스캐빈저로 사용되는 약 2.5 내지 12% v/v의 TIPS (SAFC, 영국 길링햄 소재) (그러나 5-10% v/v가 바람직하며, 약 10% v/v가 더욱 바람직함)와 함께 약 15 내지 25% v/v의 TFA (로디아(Rhodia), 프랑스 리용 소재) (그러나 15 내지 20% v/v가 바람직하며, 대략 20% v/v가 더욱 바람직함)으로 이루어지며, 나머지는 62.5 내지 82.5% v/v의 DCM (INEOS 클로르(Chlor), 영국 룬코른 소재) (사용되는 TFA 및 TIPS의 백분율에 따름)을 포함하는 절단 칵테일을 사용하여, 원하는 펩티드를 수지로부터 절단하고, 임의의 측쇄 보호기를 "탈보호"시킨다. 대략 주위 온도 (약 15 내지 30℃)에서 절단 칵테일을 사용하여 2 내지 3시간 (2.5시간이 바람직함) 동안 수지를 침지하고 교반한다. 질소 기체를 사용한 간헐적인 스파징, 또는 질소 기체를 사용한 절단 반응 혼합물의 피복(blanketing)을 도입한다. 원하는 펩티드 및 "폐" 수지를 함유하는 절단 혼합물을 여과한다. 적은 부피의 새로운 절단 칵테일 또는 TFA/DCM (15-20:80-85 v/v) 혼합물 중 어느 하나를 사용하여 "폐" 수지를 세척한다 (수지 중량에 따라 1 내지 2부피를 사용하여 1 내지 2회). 적은 부피의 MeOH (유니바르(Univar), 아일랜드 더블린 소재)를 사용한 임의의 세척 (수지 중량에 따라 약 1 내지 2 부피를 사용하여 1 내지 2회)이 후속할 수 있다.
펩티드-풍부 여과물을 조합하고, 원래 여과물 중량의 < 20%로 증발시킨다 (< 15%가 바람직함). MtBE (유니바르, 아일랜드 더블린 소재) (약 5 내지 15 부피, 바람직하게는 6.5 내지 10 부피)와 같은 유기 역-용매에 의해 농축 용액으로부터 조 펩티드를 침전시키고, 여과한 후, 적은 부피의 동일한 유기 역-용매를 사용하여 세척한다 (약 1 내지 2 부피를 사용하여 3회까지). 침전된 펩티드는 건조될 수 있다. 차후의 정제를 위한 건조 또는 반-습윤 펩티드 침전물의 용해는 ACN (INEOS 니트릴스, 스위스 롤레 소재) (펩티드의 용해도 및 크로마토그래피 정제시 그것이 용리하는 %에 따른 대략적 % v/v)와 같은 유기 용매와 함께 아세트산과 같은 묽은 산을 사용하여 수행된다.
당업자라면, 역상 정제용 HPLC (C18 또는 C8 실리카, 또는 다른 적합한 충전물 상에서)에 의해 염 교환 (예컨대 TFA로부터 아세테이트염으로)과 조합된 매우 높은 순도 (≥ 99%)까지의 펩티드의 정제가 달성가능하다. 당업자라면, 용액으로부터의 펩티드 분말의 동결건조 또는 다른 단리 방법들 (예컨대 분무-건조, 침전 또는 결정화 후 이어지는 건조)에 의한 정제된 펩티드의 단리가 가능하다.
도파민-소마토스타틴 키메라와 같은 키메라 화합물의 합성에서는, 상기 방법이 추가적인 단계들을 포함한다. 이러한 추가적인 단계들의 일반적인 절차는 하기와 같이 예시될 수 있다: 단계 (i) 전에,
단계 h-1: DMF 중 HCTU 및 HOBt에서의 용해에 의해 커플링을 위하여 도파민을 활성화시키는 단계;
단계 h-2: 단계 (h-1)의 용액에 염기를 첨가하는 단계;
단계 h-3: 단계 (h-2)의 용액을 1분 동안 교반한 다음, 상기 수지를 약 1.5시간 동안 교반하는 단계;
단계 h-4: 생성되는 수지를 DMF로 세척하는 단계; 및
단계 h-5: 1-3 부피의 MeOH를 사용하여 수지를 추가적으로 세척하는 단계.
수지로부터 펩티드를 절단하고, 동시에 아미노산으로부터 측쇄 보호기를 제거하는 데에는 TFA, TIPS 및 DCM의 혼합물이 사용되는데, 바람직하게는 TFA:TIPS:DCM의 비는 15:5:80이다. 다음에, MtBE를 사용하여 침전물을 세척한다. 최종적으로, 침전물을 고리화한다.
실험 부분
실시예 1: 그렐린 유사체 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2의 합성 (그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 WO 2004/014415에 기술되어 있는 바와 같음). 하기하는 바와 같은 방법에서, 모든 당량은 수지-배치 규모에 비례한다.
50-리터 필터 반응기 (부치(Buchi), 스위스 플라윌 소재)에서 표제 펩티드를 합성하였다.
합성은 1.04 몰 규모로 수행하였다 (1.4 kg 투입 수지).
DMF를 사용하여 (3회 10 부피), 대략 1.41 kg의 Fmoc-시이버 아미드 수지를 팽윤시켰다. DMF 중 피페리딘 (바스프(BASF), 독일 슈바르하이데 소재)의 15% v/v 용액 (2×10 부피, 각각 10분)의 2회 처리에 의해 Fmoc 기를 탈보호시켰다. 다음에, 수지를 DMF (3×10 부피)로 세척하였다.
사용된 Fmoc 아미노산들 중 일부 (Apc, D-Trp)는 Boc-보호된 측쇄를 필요로 하였으며, 다른 것들 (Phe, D-Bal, Inp)은 측쇄 보호를 필요로 하지 않았다.
DMF (6 부피) 중 1.8 당량의 HCTU 및 3 당량의 DIEA를 사용하여 예비-활성화된 Fmoc-Apc(Boc)-OH 1.5 당량의 용액을 반응기에 도입하였다. 용액 및 수지를 대략 90분 동안 교반하였다. 수지를 배출하고, DMF (2×10 부피)를 사용하여 세척하였다. 상기에서 개괄한 바와 같이 Fmoc 기를 탈보호시키고, Fmoc-Apc(Boc)-OH에 대하여 개괄한 것과 동일한 조건을 사용하여 두 번째 아미노산인 Fmoc-Phe-OH를 커플링시켰다. Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, Fmoc-D-Bal-OH 및 Fmoc-Inp-OH에 대하여, DMF (6-7 부피) 중 1.45 당량의 TBTU, 1.45 당량의 HOBt 및 2.25 당량의 DIEA를 이용하는 Fmoc-아미노산 커플링 단계를 사용하여, Fmoc 탈보호, 세척, 그리고 Fmoc-아미노산 커플링 및 세척의 주기를 반복하였다. 커플링 시간은 60분이었다.
시이버 아미드 수지 상에서의 펩티드 조립 완료시에는, DMF를 사용하여 수지를 세척한 다음, 10 리터의 메탄올을 사용하여 2회 추가 세척한 후, 건조하였다.
펩티드를 수지로부터 절단하고, TFA/TIPS/DCM (20/10/70% v/v)로 구성되는 절단 칵테일 10 부피를 사용하여 2.5시간 동안 그의 측쇄-보호기를 제거하였다. 펩티드-함유 여과물을 감압하에서 증발시키고, 침전시켜, MtBE를 사용하여 세척한 후, 차후의 정제를 위하여 묽은 아세트산 및 아세토니트릴 중에 용해시켰다. 합성 수율은 80.8%, HPLC에 의한 순도는 90.0%이었다.
C18 고정 상 (EKA 케미칼즈(Chemicals) AB, 스웨덴 보후스 소재)이 패킹된 역-상 정제용 HPLC 칼럼 (노바세프(Novasep), 프랑스 폼페이 소재)을 사용하여 펩티드를 정제하였다. 유기 개질제로서의 아세토니트릴과 함께 암모늄 아세테이트 및 아세트산 완충제를 사용하는 구배 용리하에서 정제 및 염 교환을 수행하였다.
실시예 2: 하기 화학식을 가지는 도파민-소마토스타틴 키메라의 합성:
Figure 112014067595450-pct00041
(즉 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 WO 2004/091490에 기술되어 있는 바와 같은 Dop2-D-Lys(Dop2)-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys]-Thr-NH2).
하기하는 바와 같은 방법에서, 모든 당량은 수지-배치 규모에 비례한다.
50-리터 필터에서 표제 펩티드를 합성하였다.
합성은 0.72 몰 규모로 수행하였다 (1.2 kg 투입 수지).
본원에서 사용된 보호된 아미노산들은 미국 오레곤 알바니 소재 신테테크, 인크.(Synthetech, Inc.), 또는 스위스 디엘스도르프 소재 센 케미칼즈(Senn Chemicals)에서 입수될 수 있다.
반응기에서 DMF (3×10 부피)를 사용하여 약 1.2 kg의 Fmoc-시이버 아미드 수지를 팽윤시키고, DMF 중 피페리딘 15% v/v 용액의 2회 처리 (10분 기간 지속되는 처리 당 10 부피)를 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시켰다. DMF (4×10 부피)를 사용하여 수지를 세척하였다.
수지에 커플링될 첫 번째 아미노산인 Fmoc-Thr(tBu)-OH (2.0 당량), TBTU (1.96 당량), HOBt (1.96 당량) 및 DIEA (DMF (5.5 부피) 중 3.0 당량)를 수지와 함께 60분 동안 교반하였다. 수지를 배출하고, DMF (2.8 부피) 중에서 60분 동안 Fmoc-Thr(tBu)-OH (1.0 당량), TBTU (0.98 당량), HOBt (0.98 당량) 및 DIEA (1.5 당량)을 사용하여 Fmoc-Thr(tBu)-OH를 재-커플링시켰다.
DMF (4×10 부피)를 사용하여 수지를 세척하였다.
상기에서 개괄된 바와 같이 Fmoc 기를 탈보호시키고, Fmoc-Thr(tBu)-OH에 대하여 개괄된 것과 동일한 조건을 사용하여 두 번째 아미노산인 Fmoc-Cys(Acm)-OH를 커플링시켰다. Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH 및 Fmoc-D-Lys(Fmoc)-OH에 대하여, 그 순서대로 Fmoc 탈보호, 세척, Fmoc-아미노산 커플링 및 세척의 주기를 반복하였다. DMF (5.8-7 부피) 중에서 60분 동안 TBTU (1.96 당량), HOBt (1.96 당량) 및 DIEA (3.0 당량)를 사용하여 Fmoc-아미노산 커플링 단계를 수행하였다.
DMF (수지 그램 당 12.3 부피) 중 HCTU (2.79 당량) 및 HOBt (3.3 당량)에 그것 (수지에 비례하여 2.75 몰 당량)을 용해시킴으로써, 표제 분자의 도파민 부분 (즉, 하기 화학식) (바이오메져, 인크.(Biomeasure, Inc.), 미국 매사추세츠 밀포드 소재)를 커플링을 위하여 활성화시키고, DIEA (6.27 당량)을 첨가하여, 1분 동안 교반한 후, 수지와 함께 1.5시간 동안 교반하였다:
Figure 112014067595450-pct00042
DMF를 사용한 펩티드 수지의 최종 세척 후, MeOH (2×10 부피)를 사용하여 수지를 추가 세척하고, 건조하였다.
TFA:TIPS:DCM (15:5:80, 12 부피, 34.3 L)을 사용하여 2.0시간 동안 하나의 용기에서, 수지로부터의 펩티드 키메라의 절단 및 측쇄 보호기의 제거를 수행하였다. 질소 기체를 사용한 절단 반응 혼합물의 간헐적인 스파징을 사용하였다 (30분마다 1-2분의 기간 동안). 수지로부터의 절단 혼합물 (원하는 펩티드를 함유하고 있음)의 여과 후, TFA/DCM (15:85) 혼합물을 사용하여 (수지 중량에 따라 1.3 부피, 3회) "폐" 수지를 세척하였다. 펩티드-풍부 여과물을 조합하고, 원래 여과물 중량의 10.4% (6.2 Kg)까지 증발시켰다. 교반 MtBE에 대한 첨가 (증발 후 잔류 중량에 따른 6.5 부피, 40 L)에 의해 농축 용액으로부터 조 펩티드를 침전시키고, 여과한 후, MtBE를 사용하여 (증발 후 잔류 중량에 따른 1 부피, 6.2 L, 1회) 세척하였다. ACN (30% v/v)과 함께 수지 중량에 따른 38 부피 (45 L)의 0.1% v/v TFA/물을 사용하여, 차후의 고리화를 위한 반-건조 펩티드 침전물의 용해를 수행하였다.
합성/절단 수율은 72.6%이었으며, HPLC에 의한 순도는 79.1%이었다.
본원에서 기술되는 신규한 방법을 사용하여 합성될 수 있는 치료 펩티드의 예에는 하기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
Figure 112014067595450-pct00043
Figure 112014067595450-pct00044
Figure 112014067595450-pct00045
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Figure 112014067595450-pct00057
본 청구 방법을 사용하여 합성될 수 있는 도파민-소마토스타틴 키메라에는 WO 02/100888 및 WO 04/091490에 기술되어 있는 바와 같은 하기와 같은 분자들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다:
Figure 112014067595450-pct00058
Figure 112014067595450-pct00059
Figure 112014067595450-pct00060
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Figure 112014067595450-pct00089
기타 실시양태
당업자라면, 상기한 상세한 설명에서 본 발명의 필수적인 특징들을 용이하게 확인할 수 있을 것이며, 그 취지 및 범주에서 벗어나지 않고도 다양한 용도 및 조건에 맞도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형들을 구성할 수 있을 것이다. 따라서, 기타 실시양태들 역시 본 청구범위에 속하는 것으로 한다.

Claims (16)

  1. (a) 쌍극성 비양성자성 용매 중에서 Fmoc-시이버(Sieber) 수지 (시이버 아미드 수지 또는 Fmoc 시이버 아미드 수지로도 지칭됨)를 팽윤시키는 단계;
    (b) 쌍극성 비양성자성 용매 중에서 피페리딘 용액을 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
    (c) Fmoc 탈보호 후 쌍극성 비양성자성 용매를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
    (d) 쌍극성 비양성자성 용매 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시킨 다음 염기를 첨가하고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
    (e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
    (f) 쌍극성 비양성자성 용매 중에서 염기와 함께 커플링 시약으로서 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여, 활성화된 Fmoc-아미노산을 커플링시키는 단계;
    (g) 각 Fmoc-아미노산 커플링 후 수지를 세척하는 단계;
    (h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
    (i) 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계;
    (j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계; 및
    (k) 여과물을 증발시킨 후, 유기 용매를 사용하여 농축 용액으로부터 조 생성물을 침전시키고 부분적으로 정제함으로써, 부분적으로 정제된 펩티드를 산출하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 상기 절단 칵테일은 TFA, 1종 이상의 스캐빈저 및 디클로로메탄 (DCM)의 용액을 포함하며, 여기서 상기 스캐빈저는 트리이소프로필실란 (TIPS), 트리에틸실란 (TES), 페놀, 아니솔, 티오아니솔, 물, 에탄디티올 (EDT), 1-도데칸티올, 디티오트레이톨 (DTT) 및 인돌로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 상기 절단 칵테일 중 TFA의 백분율이 25%를 초과하지 않으며,
    여기서 상기 펩티드는 하기 화학식 I의 그렐린 유사체이며
    <화학식 I>
    Figure 112019006264484-pct00094

    상기 식에서,
    A1은 Aib, Apc 또는 Inp이고;
    A2는 D-Bal, D-Bip, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal, D-Ser(Bzl) 또는 D-Trp이고;
    A3은 D-Bal, D-Bip, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal, D-Ser(Bzl) 또는 D-Trp이고;
    A4는 2Fua, Orn, 2Pal, 3Pal, 4Pal, Pff, Phe, Pim, Taz, 2Thi, 3Thi, Thr(Bzl)이고;
    A5는 Apc, Dab, Dap, Lys, Orn이거나 또는 결실되고;
    R1은 수소이고;
    R2는 OH 또는 NH이고;
    단, A5가 Dab, Dap, Lys 또는 Orn인 경우라면,
    A2가 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
    A3이 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
    A4가 2Thi, 3Thi, Taz, 2Fua, 2Pal, 3Pal, 4Pal, Orn, Thr(Bzl) 또는 Pff이고;
    A5가 결실되는 경우라면,
    A3이 D-Bip, D-Bpa 또는 D-Dip이거나; 또는
    A4가 2Fua, Pff, Taz 또는 Thr(Bzl)이거나; 또는
    A1이 Apc이고,
    A2가 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
    A3이 D-Bip, D-Bpa, D-Dip 또는 D-Bal이거나; 또는
    A4가 2Thi, 3Thi, Orn, 2Pal, 3Pal 또는 4Pal인,
    단계적 고체-상 Fmoc-화학을 사용한 치료 펩티드의 합성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 쌍극성 비양성자성 용매가 디메틸포름아미드 (DMF)인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 염기가 3급 아민 염기인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염기가 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 스캐빈저가 TIPS, TES, 아니솔 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, Boc 및 tBu 측쇄 보호기가 제거되어야 하는 경우, 상기 절단 칵테일이 2.5 내지 12% v/v의 TIPS와 함께 15 내지 25% v/v의 TFA를 포함하며, 절단 칵테일의 나머지가 100%까지 DCM으로 구성되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 절단 칵테일이 10% v/v의 TIPS 및 70% v/v의 DCM과 함께 20% v/v의 TFA로 이루어지는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 먼저 Fmoc 기가 DMF 중에서 피페리딘을 사용하여 수지로부터 제거되며, 이때 DMF 중 상기 피페리딘의 농도는 20% (v/v) 미만인 치료 펩티드의 합성 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 f에서 아미노산 잔기가 커플링 시약 조합을 사용하여 커플링되며, 여기서 상기 커플링 시약 조합의 성분은 TBTU/HOBt/DIEA, HATU/DIEA, 및 HCTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 f에서 아미노산 잔기가 커플링 시약 조합을 사용하여 커플링되며, 여기서 상기 커플링 시약 조합의 성분은 HCTU/DIEA 및 TBTU/HOBt/DIEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 Fmoc-시이버 수지 (시이버 아미드 수지 또는 Fmoc 시이버 아미드 수지로도 지칭됨)를 팽윤시키는 단계;
    (b) DMF 중에서 피페리딘 용액을 사용하여 Fmoc 기를 탈보호시키는 단계;
    (c) Fmoc 탈보호 후 DMF를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
    (d) DMF 중에 Fmoc-아미노산 및 커플링 시약(들)을 용해시킨 다음 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 첨가하고 교반함으로써, 탈보호된 수지에 커플링시키기 위한 Fmoc-아미노산을 활성화시키는 단계;
    (e) 반응기 내 수지에 활성화된 Fmoc-아미노산 용액을 충전하는 단계;
    (f) DMF 중에서 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)과 함께 커플링 시약으로서 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트 (HCTU) 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)을 사용하여, 활성화된 Fmoc-아미노산을 커플링시키는 단계;
    (g) 각 Fmoc-아미노산 커플링 후 수지를 세척하는 단계;
    (h) 펩티드가 형성될 때까지 단계 (b)-(g)를 반복하는 단계;
    (i) 절단 칵테일을 사용하여 아미노산 측쇄를 탈보호시키는 동시에 수지로부터 원하는 펩티드를 절단하는 단계;
    (j) 수지로부터 절단 혼합물을 여과하는 단계; 및
    (k) 여과물을 증발시킨 후, 유기 용매를 사용하여 농축 용액으로부터 조 생성물을 침전시키고 부분적으로 정제함으로써, 부분적으로 정제된 펩티드를 산출하는 단계
    의 연속 단계들을 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 화학식 I의 화합물이며, 여기서
    A1은 Aib, Apc 또는 Inp이고;
    A2는 D-Bal, D-Bip, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal, D-Ser(Bzl) 또는 D-Trp이고;
    A3은 D-Bal, D-Bpa, D-Dip, D-1Nal, D-2Nal 또는 D-Trp이고;
    A4는 Orn, 3Pal, 4Pal, Pff, Phe, Pim, Taz, 2Thi 또는 Thr(Bzl)이고;
    A5는 Apc, Lys이거나 또는 결실되는 것인
    방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 화학식 I의 화합물이며, 여기서
    A1은 Apc 또는 Inp이고;
    A2는 D-Bal, D-Bip, D-1Nal 또는 D-2Nal이고;
    A3은 D-Bal, D-1Nal, D-2Nal 또는 D-Trp이고;
    A4는 3Pal, 4Pal, Pff, Phe, Pim, Taz, 2Thi 또는 Thr(Bzl)이고;
    A5는 Apc 또는 Lys인
    방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2, H-Inp-D-2Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2, H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH2 및 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH2로부터 선택되는 그렐린 유사체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩티드가 H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH2인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 펩티드가 H-Inp-D-2-Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH2인 방법.
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