KR20230110319A - Egf 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 아미노산 서열: C1(X)7C2(X)4 - 5C3(X)10 -13C4(X)C5(X)8C6 [서열번호 49]을 포함하는 상피 성장 인자-유사 펩타이드 (EGF-유사 펩타이드)의 제조 방법에 관한 것으로, 서열번호 49에서 C1-C6는 각각 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고, EGF-유사 펩타이드는 분자내 이황화 결합 3개를 가진다: (I) N-말단 아미노산이 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 보호기 PG1에 의해 보호된, 제1 펩타이드 단편을 제조하는 단계; (II) C-말단 아미노산이 트리틸, 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기 PG2에 의해 보호된, 제2 펩타이드 단편을 제조하는 단계로서, 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 아미노산 측쇄들은 선택적으로 보호된, 단계; (III) 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액 중에 커플링하여, 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드를 생성하는 단계; (IV)(a) (i) 단계 (III)에서 생성된 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여, 산화된 혼합물을 생성하는 단계; (ii) 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계; (iii) 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 DMSO/DTT를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 또는 (IV)(b) (i) 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계; (ii) 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 및 (V) 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계. 본 발명의 추가적인 측면들은 다양한 단편 축합을 이용한 EGF-유사 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비-제한적으로 EGF 및 형질전환 성장인자-α (TGF-α)를 비롯한 상피 성장 인자-유사 펩타이드 (EGF-유사 펩타이드) 및 이의 유사체 및 변이체의 화학적 합성 방법을 기술한다.
상피 성장 인자 (EGF)는 단백질의 EGF-계열에 속하는 초기 구성원이다. 이 단백질 계열에 속하는 구성원은 구조와 기능 특징들이 매우 유사하다. EGF 자체 이외의 다른 계열 구성원으로는 헤파린-결합성 EGF-유사 성장인자 (HB-EGF), 형질전환 성장인자-α (TGF-α), 암피레굴린 (Amphiregulin, AR), 에피레굴린 (Epiregulin, EPR), 에피겐 (Epigen), 베타셀룰린 (Betacellulin, BTC), 뉴레귤린-1 (neuregulin-1, NRG1), 뉴레귤린-2 (NRG2), 뉴레귤린-3 (NRG3) 및 뉴레귤린-4 (NRG4) 등이 있다.
모든 계열 구성원들은 하기 보존된 아미노산 서열을 하나 이상의 반복으로 포함한다:
C1(X)7C2(X)4 - 5C3(X)10 - 13C4(X)C5(X)8C6 [ 서열번호 49]
상기 서열에서, C1-C6는 각각 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 아미노산이다 (Harris R.C., Chung E., Coffey, R.J., Experimental Cell Research 284 (2003) 2-13). 이 서열은 분자내 이황화 결합 3개 (C1-C3, C2-C4 및 C5-C6)를 형성하는 시스테인 잔기 6개를 가지고 있다. 이황화 결합 형성은 EGF-계열의 구성원과 이의 세포-표면 수용체 간의 고-친화성 결합에 기본적인 구조 루프 3개를 형성한다.
EGF는 이의 수용체 EGFR에 결합함으로써 세포 증식과 분화를 자극하는 단백질이다. 인간 상피 성장 인자 (hEGF)는 하기 서열을 가진 아미노산 53개와 분자내 이황화 결합 3개를 포함하는 기능적으로 다재다능한 6 kDa 폴리펩타이드이다:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
분자내 이황화 결합 3개는 Cys6와 Cys20, Cys14와 Cys31, 그리고 Cys33와 Cys42 간에 이루어진다.
상피 성장 인자 수용체 (EGFR)는 항암제 및 항암제 개발에 주요한 표적 중 하나이다. 인간 상피 성장 인자 (hEGF)는 치료학적 활성 항암제, 항체 또는 hEGFR에 대한 항암제를 선택적으로 수송하기 위한 비히클로서 이러한 치료학적 접근 방식 다수에 이용된다. 아울러, 형광 표지된 EGF-유사 펩타이드와 같은 수종의 EGF-접합체들이 진단제로서 이용되었다. EGF 유사 펩타이드, 특히 hEGF, 및 인간 형질전환 성장인자 (hTGF)는 화장품, 피부 관리 및 약물에, 예를 들어 당뇨병성 족부 궤양 (DFU)의 치료에 여러가지 용도가 밝혀져 있다.
EGF-유사 도메인의 한 카피 이상이 지방세포 분화 저해제 (유전자 PREF-1), Agrin, Amphiregulin, Betacellulin, Blastula 단백질 BP10, BM86, 뼈 형태형성 단백질 1 (BMP-1), 드로소필라 (등-배 패터닝 단백질 톨로이드), 카노르하브디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans) 발생 단백질 lin-12 및 glp-1, 카노르하브디티스 엘레강스 축-1 단백질, 칼슘-의존적인 세린 프로테이나제 (CASP), 연골 기질 단백질 CMP, 연골 올리고메릭 기질 단백질 COMP, 세포 표면 항원 114/A10, 세포 표면 당단백질 복합체 막관통 서브유닛 ASGP-2 응집 관련 단백질 C, Z 및 S, 응고 인자 VII, IX, X 및 XII, 보체 C1r, 보체 C1s, Ra-반응성 인자의 보체-활성화 성분 (RARF), 보체 성분 C6, C7, C8 α 및 β 쇄, 및 C9, Crumbs, 상피 성장 인자 전구체, 엑소가스트룰라-유도 펩타이드 A, C, D 및 X, Fat 단백질, 태아 항원 1, 피브릴린 1 및 피브릴린 2, 파이브로펠린 IA, IB, IC, II 및 III, 피불린-1 및 -2, Giant-lens 단백질 (단백질 Argos), 다양한 폭스바이러스로부터 유래한 성장인자-관련 단백질, Gurken 단백질, 헤파린-결합성 EGF-유사 성장인자 (HB-EGF), 형질전환 성장인자 α (TGF-α), 성장인자 Lin-3 및 Spitz, 간세포 성장인자 (HGF) 활성제, LDL 및 VLDL 수용체, LDL 수용체-관련 단백질 (LRP), 백혈구 항원 CD97, 세포 표면 당단백질 EMR1 및 세포 표면 당단백질 F4/80, 리뮬러스 응고 인자 (Limulus clotting factor) C, Meprin A α 서브유닛, MFG-E8 (Milk fat globule-EGF factor 8), 뉴레굴린 GGF-I 및 GGF-II, 뉴렉신 (Neurexin), 신경성 단백질 Notch, Nidogen, Ookinete 표면 단백질 (24 Kd, 25 Kd, 28 Kd), 췌장 분비성 과립구 막 주요 당단백질 GP2, 퍼포린, 프로테오글리칸, 어그레칸, 베르시칸, 퍼레칸, 브레비칸 및 콘드로이틴 설페이트, 프로테오글리칸, 프로스타글란딘 G/H 신타제 1 및 2, Reelin, S1-5, 신경초종-유래 성장인자 (SDGF), 셀렉틴, 세린/트레오닌-단백질 키나제 상동체 (유전자 Pro25), 정자-난자 융합 단백질 PH-30 α 및 β, 정자 플라젤라 막 단백질, 기질 세포 유래 단백질-1 (SCP-1), TDGF-1, 인간 기형암종-유래 성장인자 1, 테나신 (또는 뉴로넥틴), 트롬보모듈린 (페토모듈린), 트롬보스폰딘 1, 2, 3 및 4, 갑상선 퍼옥시다제 1, 형질전환 성장인자 β-1 결합 단백질 (TGF-B1-BP), 티로신-단백질 키나제 수용체 Tek 및 Tie, 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성자 및 조직 플라스미노겐 (TPA) 우로모듈린, 비타민 K-의존적인 항-응집제 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z 등의 매우 다양한 기능성 단백질에 함유되어 있다.
EGF-유사 펩타이드는 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 생산한다. EGF-유사 펩타이드를 제조하는 화학적 방법은 전형적으로 물질을 저 수율 및/또는 순도로 생산하고, 노동력이 많이 들고, 및/또는 매우 유독하고 상당한 부식성 HF를 사용하여야 한다.
최초 우로가스트론 (h-EGF) 전합성은 아미노 보호기로서 Boc, 티올 보호기로서 Acm 그리고 카르복시 보호기로서 Pac를 이용하여 합성된 소형 분절 10개를 분절 축합에 의해 이루어진다 (Neya M., Hagiwara D., Miyazaki Y., Nakamura T., Hemmi K. and Hashimoto M., Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, 1989, Issue: 12, 2187-2198). 제조된 선형의 보호된 EGF 펩타이드는 이후 유독하며 상당한 부식성 액체 HF를 이용해 탈보호화된다. HF의 사용은 특히 Trp, Tyr, Met 및 Cys과 같은 민감한 친핵성 아미노산을 함유한 펩타이드 경우에 몇가지 부반응의 원인이다 (hEGF는 서열에 잔기 Met 하나, Trp 2개, Tyr 5개 및 Cys 6개를 함유함). 이 방법은 HF를 사용하는 것 외에도 매우 힘들고, 약학적 펩타이드를 대규모 생산하기에는 부적절하다.
비슷한 방법으로 EGF 합성은 또한 보호된 단편 9개의 단편 축합에 의해 수행된 바 있다 (Shin S.Y., Kaburaki Y., Watanabe M., and Munekata E., Biosci . Biotech. Biochem ., 56 (3), 404-408, 1992; Neya M., Hagiwara D., Hemmi K., and Hashimoto M., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1989, 2199-2205). 이들 단편은 Boc/벤질 아미노산을 이용해 용액 중에 제조한 다음 용액에서 순차적으로 축합한다. 제조된 선형의 보호된 EGF 펩타이드는 이후 액체 HF로 탈보호한다.
고상 펩타이드 합성에 의한 EGF의 분절 합성은 문헌에서 기술된 바 있다 (Gell A.L., Groysbeck N., Becker C.F.W., Conibear A.C., J Pept Sci . 2017 Dec;23(12):871-879. doi : 10.1002/ psc .3051. Epub 2017 Nov 6). C1r의 EGF-유사 모듈의 구조를 결정하고 칼슘 결합에 대한 이의 기여를 평가하기 위한 검토로서, C1r(123-175)을 Boc/벤질 전략을 이용해 자동화된 고상 방법으로 합성하였다 (Hernandez J.F., Bersch B., Petillot Y., Arlaud G.J., J Pept Res. 1997, 49(3), 221-31). 인간 cripto (인간 기형암종-유래 성장인자 1으로도 알려짐, TDGF-1)의 40 아미노산 상피 성장 인자-유사 도메인의 합성 역시 개시된 바 있다 (Lohmeyer M., Harrison P.M., Kannan S., DeSantis M., O'Reilly N.J., Sternberg M.J.E., Salomon D.S., and Gullick W.J., Biochemistry, 1997, 36 (13), pp 3837-3845).
형질전환 성장인자 α (TGF-α)는 EGF 계열에 속하는 또 다른 구성원이다. TGF-α는 인간에서 TGFA 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. TGF-α는 상피 성장 인자 수용체의 리간드로서, 세포 증식, 분화 및 발생의 신호전달 경로를 활성화한다. 이 단백질은 막관통-결합성 리간드 또는 용해성 리간드로서 작용할 수 있다. TGF-α는 일부 인간 암에서 상향 조절된다. 이는 대식세포, 뇌 세포 및 각질 형성 세포에서 생산되며, 상피 발생을 유도한다.
TGF-α는 아미노산 160개 (인간) 또는 159개 (랫)로 이루어진 막관통 전구체의 일부로서 체내에서 합성된다 (Ferrer I., Alcantara S., Ballabriga J., Olive M., Blanco R., Rivera R., Carmona M., Berruezo M., Pitarch S., Planas A.; Prog. Neurobiol . 1996, 49(2), 99-123). 이 전구체는 소수성 막관통 도메인을 함유한 세포외 도메인, TGF-α의 아미노산 50개 및 35개 잔기 길이의 세포질 도메인으로 구성된다. TGF-α는 이의 최소 형태에서 이황화 결합 3개를 통해 서로 결합되는 시스테인 6개를 가지고 있다. 총체적으로 EGF/TGF-α 계열의 모든 구성원들이 이 구조를 공유한다.
TGF-α의 선형 아미노산 잔기 50개의 단계별 고상 합성은 Boc/벤질 아미노산을 이용해 수행된 바 있다 (Tam J.P., Sheikh M.A., Solomon D.S., and Ossowski L., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 83(21), 8082-8086, 1986). 수지에서 펩타이드를 절단한 다음 액체 HF로 탈보호 처리한다. HF를 사용하므로, 재차 이 방법은 확장하기 부적절하다. 아울러, 긴 펩타이드의 단계별 합성은 전형적으로 제어하기 어렵고 원하는 산물로부터 분리하기 매우 어려운, 상당히 유사한 결손 및 부가 펩타이드들을 다수 함유한 혼합물이 만들어진다. 그래서, 이러한 방법은 약학적 펩타이드를 대규모 합성하기에는 부적절하다.
지금까지, EGF-유사 펩타이드를 대규모 생산하는 기존 방법은 충분히 만족스러운 것이 없다. 이에, 본 발명은 EGF-유사 펩타이드를 합성하기 위한 대안적인 방법, 이상적으로 더 효율적인 방법을 제공하고자 하며, 개선된 수율 및/또는 순도를 달성하고자 한다. 구체적으로, 산업적인 규모 확장에 적합하고, 독성이거나 또는 달리 부적절한 시약의 사용을 회피하는 방법을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 제1 측면에서 하기 아미노산 서열을 포함하는 상피 성장 인자-유사 펩타이드 (EGF-유사 펩타이드)의 제조 방법에 관한 것으로,
C1(X)7C2(X)4 - 5C3(X)10 - 13C4(X)C5(X)8C6 [ 서열번호 49]
상기 서열에서, C1-C6는 각각 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고, 상기한 EGF-유사 펩타이드는 분자내 이황화 결합 3개를 가지고 있으며;
상기한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(I) N-말단 아미노산이 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 보호기 PG1에 의해 보호된, 제1 펩타이드 단편을 제조하는 단계;
(II) C-말단 아미노산이 트리틸, 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기 PG2에 의해 보호된, 제2 펩타이드 단편을 제조하는 단계로서,
여기서 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 아미노산 측쇄들은 선택적으로 보호된 단계;
(III) 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액 중에 커플링하여, 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드를 생성하는 단계;
(IV)(a)
(i) 단계 (III)에서 생성된 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여, 산화된 혼합물을 생성하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(iii) 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 DMSO/DTT를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 또는
(IV)(b)
(i) 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 및
(V) 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계.
유익하게는, 본 발명의 방법은 단편 축합 (fragment condensation)에 의해 인간 및 뮤라인 EGF-유사 펩타이드를 우수한 수율 및 순도로 합성할 수 있다. 아울러, 본 발명의 방법은 극히 유독하고 부식성인 HF의 사용을 회피하여, 약학적 펩타이드를 대량 제조하는데 더 적합하다.
본 발명은 제2 측면에서 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) EGF-유사 펩타이드의 제조 방법에 관한 것으로:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기한 방법은, 서열번호 2의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을, 용액에서, 서열번호 3의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함한다:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-OH [서열번호 2]
상기 서열번호 2에서, PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고; 및
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 3],
상기 서열번호 3에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
본 발명은 제3 측면에서 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) EGF-유사 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기한 방법은, 서열번호 4의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을, 용액에서, 서열번호 5의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계, 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함한다:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10-Asp11-Gly12-OH [서열번호 4]
상기 서열번호 4에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 5]
상기 서열번호 5에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
본 발명은 제4 측면에서 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) EGF-유사 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로:
H-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 6]
상기한 방법은, 서열번호 7의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을, 용액에서, 서열번호 8의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계, 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함한다:
PG1-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-OH [서열번호 7]
서열번호 7에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고; 및
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 8]
서열번호 8에서,
PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
일반적인
EGF
-유사
펩타이드
제조 방법
제1 측면에서, 본 발명은, EGF-유사 펩타이드가 C1와 C3, C2와 C4 및 C5와 C6 간에 분자내 이황화 결합 3개를 가진, 하기 아미노산 서열을 포함하는 상피 성장 인자-유사 펩타이드 (EGF-유사 펩타이드)를 제조하기 위한 전술한 방법에 관한 것이다:
C1(X)7C2(X)4 - 5C3(X)10 - 13C4(X)C5(X)8C6 [ 서열번호 49]
상기 서열에서, C1-C6는 각각 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 [서열번호 49]의 N-말단에 부가적인 천연 또는 비-천연 아미노산을 1-20개, 또는 바람직하게는 2-15개, 또는 더 바람직하게는 5-10개를 포함한다. 바람직한 일 특정 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 아미노산 5개를 N-말단에 포함한다. 특히 바람직한 다른 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 아미노산 7개를 N-말단에 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 [서열번호 49]의 C-말단에 부가적인 천연 또는 비-천연 아미노산을 1-20개, 또는 바람직하게는 2-15개, 또는 더 바람직하게는 5-12개 또는 5-10개를 포함한다. 바람직한 일 특정 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 아미노산 11개를 C-말단에 포함한다. 특히 바람직한 다른 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 아미노산 7개를 C-말단에 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 또는 비-천연 아미노산 1-20개, 또는 바람직하게는 2-15개, 또는 더 바람직하게는 5-10개를 [서열번호 49]의 N-말단에, 그리고 부가적인 천연 또는 비-천연 아미노산 1-20개, 또는 바람직하게는 2-15개, 또는 더 바람직하게는 5-12개 또는 5-10개를 [서열번호 49]의 C-말단에 포함한다. 바람직한 일 특정 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 아미노산 5개를 N-말단에, 그리고 부가적인 천연 아미노산 11개를 C-말단에 포함한다. 특히 바람직한 다른 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 부가적인 천연 아미노산 7개를 N-말단에, 그리고 부가적인 천연 아미노산들을 C-말단에 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-천연 아미노산 (non-natural amino acid 또는 unnatural amino acid)"은 α 및 α-이중 치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 천연 아미노산의 할라이드 유도체, 예를 들어 트리플루오로티로신, p-Cl-페닐알라닌, p-F-페닐알라닌, p-Br-페닐알라닌, p-NO2-페닐알라닌, 페닐글리신, 사르코신, 페니실라민 (penicillamine), D-2-메틸트립토판, 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, p-I-페닐알라닌, L-알릴-글리신, β-알라닌, β-아스파르트산, β-사이클로헥실알라닌, 시트룰린, 호모세린, 호모시스테인, 피로글루탐산, L-α-아미노 부티르산, L-γ-아미노 부티르산, L-α-아미노 이소부티르산, α-사이클로헥실글리신, 다이아미노부티르산, 다이아미노피멜산, N-ε-다이니트로페닐-라이신, L-1-나프틸알라닌, L-2-나프틸알라닌, 3-(2-피리딜)-L-알라닌, 3-(3-피리딜)-L-알라닌, 3-(4-피리딜)-L-알라닌, N-ε-메틸-라이신, N,N-ε-다이메틸-라이신, N,N,N-ε-트리메틸-라이신, 3-머캅토프로피온산, L-ε-아미노 카프로산, 7-아미노 헵탄산, 6-아미노 헥산산 L-메티오닌 설폰, 오르니틴, L-노르루신, L-노르발린, p-니트로-L-페닐알라닌, L-하이드록시프롤린, γ-글루탐산, γ-아미노 부티르산, L-티오프롤린, 페닐알라닌 (Phe)의 메틸 유도체, 예를 들어 4-메틸-Phe, 펜타메틸-Phe, L-Phe (4-아미노), L-Tyr (메틸), L-Phe (4-이소프로필), L-Tic (1,2,3,4 테트라하이드로 이소-퀴놀린-3-카르복시산), L-다이아미노프로피온산 및 L-Phe (4-벤질)을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 각각의 X는 독립적으로 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로부터 선택되는 천연 아미노산이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 단백질은 EGF, 헤파린-결합성 EGF-유사 성장인자 (HB-EGF), 형질전환 성장인자-α (TGF-α), Amphiregulin (AR), Epiregulin (EPR), Epigen, Betacellulin (BTC), neuregulin-1 (NRG1), neuregulin-2 (NRG2), neuregulin-3 (NRG3) 및 neuregulin-4 (NRG4)로부터 선택된다. 더 바람직하게는, EGF-유사 단백질은 EGF 및 형질전환 성장인자-α (TGF-α)로부터 선택된다.
바람직한 일 특정 구현예에서, EGF-유사 단백질은 EGF이며, 더 바람직하게는 인간 또는 뮤라인 EGF이고, 보다 더 바람직하게는, 인간 EGF이다.
특히 바람직한 다른 구현예에서, EGF-유사 단백질은 형질전환 성장인자-α (TGF-α)이고, 더 바람직하게는 인간 TGF-α이다.
또한, 본 발명은, 본원에 언급된 구체적인 펩타이드 외에도, 이의 변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 단편을 망라한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 주어진 서열의 "변이체"는 대상 펩타이드가 하나 이상의 내인성 기능을 유지하는 방식으로 아미노산 잔기들로 된 특정 서열이 변형된 서열이다. 변이체 서열은 자연 생성 펩타이드에 존재하는 잔기 하나 이상의 부가, 결손, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 수득할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기술된 펩타이드와 관련하여 용어 "유도체"는 생성되는 펩타이드가 자체 내인성 기능 하나 이상을 유지하는 한, 서열로부터 유래하거나 또는 그 서열에 하나 (또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결손 및/또는 부가를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩타이드와 관련하여 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉 이것이 모방하는 펩타이드의 하나 이상의 내인성 기능을 가진 화학적 화합물을 망라한다.
전형적으로, 변형된 서열이 필요한 활성 또는 능력을 유지하는 한, 아미노산 치환이 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 1, 2 또는 3개에서 10 또는 20개의 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 비-천연 생성 유사체의 사용을 망라할 수 있다.
본원에 기술된 펩타이드는 침묵 변화 (silent change)를 야기하는 아미노산의 결손, 삽입 또는 치환을 가질 수 있으며, 기능적으로 동등한 펩타이드를 생성할 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산으로는 라이신 및 아르기닌을 포함하고; 비하전된 극성 헤드 기를 가진 비슷한 친수성 값의 아미노산으로는 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.
보존적인 치환은 예를 들어 아래 표에 따라 행해질 수 있다. 2번째 칸에서 동일 블럭의, 바람직하게는 3번째 칸에서 동일한 라인의 아미노산들 간에 서로 치환될 수 있다:
| 지방족 | 비-극성 | G A P |
| I L V | ||
| 극성 - 비하전 | C S T M | |
| N Q | ||
| 극성 - 하전 | D E | |
| K R H | ||
| 방향족 | F W Y |
본원에 사용된 바와 같이 용어 "상동체"는 야생형 아미노산 서열과 특정한 상동성을 가진 실체를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동등할 수 있다.
본 맥락에서, 상동성 서열은 대상 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일한, 바람직하게는 적어도 95%, 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 함유하는 것으로 이해된다. 전형적으로, 상동성 서열은 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성이 또한 유사성 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 가진 아미노산 잔기) 측면에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서, 바람직하게는 서열 동일성 측면에서의 상동성을 의미한다.
바람직하게는, 본원에 상세히 기술된 서열번호들 중 어느 하나에 대해 동일성 %를 가진 서열에 대한 언급은 언급된 서열번호의 전체 길이에 대해 언급된 동일성 %를 가진 서열을 의미한다.
상동성 비교는 육안으로 또는 보다 통상적으로는 쉽게 이용가능한 서열 비교 프로그램을 보조로 이용해 수행할 수 있다. 이러한 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 서열 2종 이상 간의 상동성 % 또는 동일성 %를 계산할 수 있다.
상동성 %는 인접한 서열들에 대해 계산할 수 있으며, 즉 하나의 서열을 다른 서열과 정렬하고, 하나의 서열에서 각 아미노산을 다른 서열에서 대응되는 아미노산과 한번에 잔기 하나씩 직접 비교한다. 이를 "비-갭형 (ungapped)" 정렬이라 칭한다. 전형적으로, 이러한 비-갭형 정렬은 비교적 짧은 아미노산 길이에 대해서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관성 있는 방법이지만, 예를 들어, 달리 동일한 서열 쌍에서, 아미노산 서열에서의 하나의 삽입 또는 결손이 다음 잔기 또는 코돈을 정렬에서 제거되게 하여, 잠재적으로 전체 정렬을 수행하였을 때 상동성 %에 상당한 감소가 발생할 수 있다는 것은 고려하지 못한다. 그래서, 대부분의 서열 비교 방법들은 전체 상동성 점수에 과도하게 불리하지 않으면서 가능한 삽입 및 결손을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화하도록 서열 정렬에 "갭"을 삽입하여 달성된다.
그러나, 이러한 더 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여, 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드 개수에 대해, 가능한 갭 수가 적은 서열 정렬은, 비교하는 서열 2종 간의 더 높은 관련성을 반영하여, 갭이 많이 주어진 것보다 더 높은 점수를 얻을 것이다. 전형적으로 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 코스트를 부과하고, 갭에서 각 후속 잔기에 대해 더 낮은 패널티를 부과하는 "아핀 갭 코스트 (Affine gap cost)"를 이용한다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 패널티는 물론 갭 개수가 더 적게 최적화된 정렬을 생성하게 될 것이다. 대부분 정렬 프로그램이 갭 패널티를 수정할 수 있다. 그러나, 이러한 서열 비교 소프트웨어를 이용할 경우 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용할 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 각 갭에 대해 -12이고, 각 확장에 대해 -4이다.
따라서, 최대 상동성 %의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려해, 최적 정렬을 생성하여야 한다. 이러한 정렬을 수행하는데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지이다 (University of Wisconsin, USA; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12: 387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어에 대한 예로는 BLAST 패키지 (Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 비교 툴 GENEWORKS 슈이트 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 둘다 오프라인 및 온라인 검색에 이용가능하다 (Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60). 그러나, 일부 어플리케이션에서는 GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. 다른 툴, BLAST 2 Sequences 역시 단백질 및 뉴클레오티드 서열 비교에 이용가능하다 (FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174(2):247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177(1):187-8).
최종 상동성 %는 동일성 측면에서 측정할 수 있지만, 정렬 프로세스 자체는 전형적으로 전부 또는 전무 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화 거리에 기반하여 각 쌍별 비교에 점수를 할당하는 스케일링된 유사성 점수 행렬을 일반적으로 이용한다. 이러한 일반적으로 이용되는 행렬의 일 예는 BLOSUM62 matrix (BLAST 프로그램 제품군에 대한 디폴트 행렬)이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값 또는 제공된 경우 커스텀 기호 비교 표 (추가적인 상세 내용은 사용자 설명서 참조)를 이용한다. 일부 어플리케이션의 경우에는 GCG 패키지에 대한 공개 디폴트 값을 이용하고, 또는 기타 소프트웨어의 경우에는 BLOSUM62와 같은 디폴트 행렬을 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면, 상동성 %, 바람직하게는 서열 동일성 %를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 서열 비교의 일환으로서 이를 수행하여, 수치 결과를 생성한다.
"단편"은 또한 변이체이며, 이 용어는 전형적으로 기능적으로 또는 예를 들어 분석에서 펩타이드의 선택한 관심 대상 영역을 의미한다. "단편"은 따라서 전장 펩타이드의 일부인 아미노산 서열을 의미한다.
더 바람직하게는, 용어 "변이체"는 (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연 생성 아미노산 잔기 또는 비-천연 생성 아미노산 잔기로 치환되었거나, (b) 아미노산 잔기 2개 이상 정도가 역위되었거나, (c) 아미노산 1, 2 또는 3개가 결손되었거나, (d) 스페이서 기가 임의의 아미노산 잔기 2개 사이에 존재하거나, (e) 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태이거나, (f) 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 (N-C-C) 백본이 변형되었거나, (g) 하나 이상의 추가의 아미노산이 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하거나, 또는 임의의 (a)-(g) 조합을 가진, 임의의 변이체를 망라한다. 바람직하게는, 변이체는 (a), (b) 또는 (c) 중 하나로 생성된다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 슈도프롤린 (Ψ로 표시됨)의 통합에 의해 변형된 아미노산 서열을 망라한다. 슈도프롤린은 펩타이드의 FMOC 고상 합성 중에 응집을 최소화하는 인공 생성된 다이펩타이드이다. 슈도프롤린은 프롤린-유사 고리 구조를 가진 세린- (Oxa) 또는 트레오닌-유래 옥사졸리딘 [Oxa(5-Me)] 및 시스테인-유래 티라졸리딘 (THz)으로 구성된다 (하기 참조).
C2-치환된 슈도프롤린의 앞 잔기와의 cis-아미드 결합 선호성으로 인해, 이의 통합으로 펩타이드 백본이 꼬인 입체형태가 형성되어, 펩타이드 응집, 자가-결합 또는 β-구조 형성이 방지된다. 그래서, 슈도프롤린은 동시에 2가지 기능을 충족한다: 첫째, Ser, Thr 및 Cys에 대해 일시적인 측쇄 보호 역할을 하고, 둘째 펩타이드 합성 및 후속 쇄 조립 과정 중에 용매화 및 결합 속도를 높이기 위한 가용화 빌딩 블록으로서 작용한다.
슈도프롤린은 유리 아미노산과 알데하이드 또는 케톤의 반응에 의해 수득된다. 슈도프롤린 다이펩타이드는 다른 아미노산 유도체와 동일한 방식으로 도입할 수 있다. 바람직하게는, 슈도프롤린은 Ser-X, Thr-X 또는 Cys-X 기로부터 유래하며, 여기서 X는 천연 또는 비-천연 아미노산이다. 세린- 및 트레오닌-함유 펩타이드의 FMOC 고상 펩타이드 합성 (SPPS)에 일상적인 슈도프롤린 (옥사졸리딘) 다이펩타이드를 사용하면 조산물의 품질 및 수율에 상당한 개선이 이루어진다. 펩타이드를 탈보호화하면, 슈도프롤린은 X-Ser, X-Thr 또는 X-Cys 형태의 통례적인 다이펩타이드가 되며, 이때 X는 천연 또는 비-천연 아미노산이다.
더 바람직하게는, 변이체는 아미노산 잔기 1-5개, 또는 1-4개, 또는 1-3개가 다른 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 보다 더 바람직하게는, 아미노산 잔기 2개가 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 더 바람직하게는, 아미노산 잔기 1개가 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 바람직하게는, 치환은 상동적이다.
상동적인 치환 (치환 및 대체는 둘다 본원에서 기존 아미노산 잔기가 대안적인 잔기로 교환되는 것을 의미함), 즉 염기성에서 염기성, 산성에서 산성, 극성에서 극성 등과 같이 동류 (like-for-like) 치환이 이루어질 수 있다. 비-상동적인 치환 역시, 즉 한 계열의 잔기에서 다른 계열의 잔기로, 또는 대안적으로 오르니틴, 다이아미노부티르산 오르니틴, 노르루신 오르니틴, 피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비-천연 아미노산의 함유가 발생할 수 있으며, 상세한 목록은 아래에서 열거한다. 아미노산 잔기 2 이상이 한번에 변형될 수 있다.
담체 모이어티의 임의의 아미노산 잔기 2개 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기로는 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서뿐 아니라 알킬 기, 예를 들어, 메틸, 에틸 또는 프로필 기를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩토이드 형태로 존재하는 추가의 변이 형태, 타입 (e)는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 이해될 것이다. 의심의 여지를 없애기 위해, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소가 아닌 잔기의 질소 원자에 존재하는 변이체 아미노산 잔기를 지칭한다. 펩타이드를 펩토이드 형태로 제조하는 공정은 당해 기술 분야에, 예를 들어, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134에 공지되어 있다. 타입 (f) 변형은 국제 출원 PCT/GB99/01855 (WO 99/64574)에 기술된 방법과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.
아미노산 변이, 바람직하게는 타입 (a) 또는 (b)의 경우, 독립적으로 임의 위치에서 발생하는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 상동적인 또는 비-상동적인 치환 2 이상이 동시에 발생할 수 있다. 서열에서 아미노산 잔기 수개로 구성된 서열을 역위시킴으로써 추가의 변이가 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 대체 아미노산 잔기는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 잔기로부터 선택되는 천연 아미노산이다.
대체 아미노산 잔기는 부가적으로 비-천연 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(I) N-말단 아미노산이 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 보호기 PG1에 의해 보호된, 제1 펩타이드 단편을 제조하는 단계;
(II) C-말단 아미노산이 트리틸, 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기 PG2에 의해 보호된, 제2 펩타이드 단편을 제조하는 단계;
여기서 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 아미노산 측쇄들은 선택적으로 보호됨;
(III) 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액 중에 커플링하여, 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드를 생성하는 단계;
(IV)(a)
(i) 단계 (III)에서 생성된 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여, 산화된 혼합물을 생성하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(iii) 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 DMSO/DTT를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 또는
(IV)(b)
(i) 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 및
(V) 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계.
방법의 단계 (I)은 N-말단 아미노산이 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 보호기 PG1에 의해 보호된, 제1 펩타이드 단편을 제조하는 것을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편은 펩타이드 세부-단편 (sub-fragment) 2 이상을 커플링함으로써 제조된다.
다른 바람직한 구현예에서, 제1 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
방법의 단계 (II)는 C-말단 아미노산이 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기 PG2에 의해 보호된 제2 펩타이드 단편을 제조하는 것을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편은 펩타이드 세부-단편 2 이상을 커플링함으로써 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
방법의 단계 (III)는 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액에서 커플링화하여 보호된 EGF-유사 펩타이드를 형성하는 것을 포함한다. 제1 펩타이드 단편과 제2 펩타이드 단편의 각 서열은, 단계 (III)에서의 커플링에 의해 보호된 선형 형태의 서열 C1(X)7C2(X)4 - 5C3(X)10 -13C4(X)C5(X)8C6 [서열번호 49]의 펩타이드를 생성한다. 이러한 선형의 보호된 펩타이드는 이후에 탈보호 처리된 다음 재정렬을 이행하여, 분자내 이황화 결합을 올바른 배열로 가진 최종적인 EGF-유사 펩타이드가 형성된다 (단계 (IV)(a) 또는 (IV)(b) 참조). 예를 들어, EGF-유사 펩타이드가 EGF일 경우 (하기 참조), Cys6와 Cys20, Cys14와 Cys31, 그리고 Cys33과 Cys42 사이에 분자내 이황화 결합 3개가 형성된다.
바람직하게는, 제1 펩타이드 단편은 예를 들어 HOBt.H2O 처리하여 활성화한 다음 제2 펩타이드 단편과 커플링제 및 용매의 존재 하에 커플링한다. 바람직하게는, (예를 들어, HOBt.H2O를 이용한) 산 활성화는 본원에 기술된 모든 단편 축합 반응에 적용되며, COOH 기로 끝나는 제1 펩타이드 단편이 제2 펩타이드 단편의 유리 NH2 기와 커플링된다.
HOBt를 이용해 활성화된 에스테르를 생성한다. 제조된 에스테르는 이후 제2 펩타이드 단편의 아민 기와 반응해 아미드 결합을 형성한다. 다른 벤조트리아졸 활성화제 역시 이용될 수 있으며, 당업자에게 익숙할 것이다. 적합한 대안제로는 클로로 벤조트리아졸 및 아자 벤조트리아졸이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 활성화 및 커플링은 HBTU, TBTU 등과 같은 우라늄 염을 이용해 수행될 수도 있다.
적합한 커플링 시약들이 당업자들에게 익숙할 것이며, 예를 들어, DIC (N,N'-다이이소프로필카르보디이미드), DCC (N,N '-다이사이클로헥실카르보디이미드) 및 EDAC (1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카르보디이미드)와 같은 카르보디이미드 커플링 시약 등이 있다. 바람직하게는, 커플링 시약은 EDAC이고, 더 바람직하게는 이의 HCl 염 형태이다.
커플링 단계에 적합한 용매는 당업자에게 익숙할 것이다. 바람직하게는, 용매는 N-메틸 피롤리돈 (NMP), 다이메틸 포름아미드 (DMF), 다이메틸 아세트아미드 (DMAC), 다이클로로메탄 (DCM) 및 이의 혼합물로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 용매는 NMP이다.
본 발명의 방법은 이후 후술한 바와 같이 단계 (IV)(a) 또는 단계 (IV)(b)를 통해 진행된다.
바람직한 일 구현예에서, 방법은 단계 (IV)(a)를 통해 진행된다. 단계 (IV)(a)는 단계 (i)-(iii)를 포함한다. 단계 (IV)(a)(i)은 단계 (III)에서 형성된 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여 산화된 혼합물을 생성한다. 요오드는 시스테인 측쇄 보호기들을 동시에 제거한 다음 시스테인을 산화하여 이황화 결합을 형성한다. 이로써 시스테인 잔기들이 서로 가교된 매우 다양한 여러가지 산물들이 만들어진다. 바람직하게는, 요오드 산화 단계 (IV)(a)(i)는 적합한 유기 용매에서 이루어진다. 적합한 용매는 당업자에게 익숙할 것이며, 예를 들어, 다이클로로메탄을 포함한다. 바람직하게는, 요오드 산화 단계는 TFA/다이클로로메탄 중의 요오드 용액, 더 바람직하게는 TFA/ 다이클로로메탄 중의 1% 요오드 용액을 이용해 이루어진다.
방법의 단계 (IV)(a)(ii)는 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 것을 포함한다. 이 단계는 펩타이드에 남아있는 보호기들을 모두 제거한다. 바람직하게는, 이 단계는 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 TFA/H2O/DTT, 더 바람직하게는 94:3:3 비율로 포함하는 혼합물을 처리하는 것을 포함한다. DTT는 스캐빈저로서 기능하며, 잠재적인 조기 산화 (premature oxidation)를 방지한다.
방법의 단계 (IV)(a)(iii)는 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 다이티오트레이톨 (DTT) 및 DMSO를 처리하여 EGF-유사 펩타이드 조산물을 형성하는 것을 포함한다. DTT는 이황화 결합에 대한 환원제이고, DMSO는 약한 산화제이다. DMSO 및 DTT로 처리하면 이황화 결합이 평형화 (또는 "재편성 (reshuffle)")되어, 열역학적으로 가장 유리한 생성물이 만들어진다. 이 프로세스는 산화적 폴딩 (oxidative folding)으로 알려져 있으며, 올바른 이황화 결합 배위를 가진 EGF-유사 펩타이드가 만들어져 EGFR에 의한 인지에 필연적인 루프 구조가 형성된다. 바람직하게는, 이 단계는 물/DMSO에서 이루어진다. 더 바람직하게는, 이 단계는 Tris 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 DMSO 및 물 용액에서 이루어지며, Tris와 구아니딘 하이드로클로라이드는 카오트로프 (chaotrope)로 기능한다. 다른 구현예에서, 방법의 단계 (IV)(a)(iii)는 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 Tris 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 DMSO 및 물 용액을 처리하여 EGF-유사 펩타이드 조산물을 형성하는 것을 포함한다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 본 방법은 단계 (IV)(b)를 통해 진행된다. 단계 (IV)(b)는 단계 (i)-(ii)를 포함한다. 단계 (IV)(b)(i)은 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호를 수행하는 것을 포함한다. 이 단계는 펩타이드에 남아있는 보호기들을 모두 제거한다. 바람직하게는, 이 단계는 단계 (III)에서 수득한 산화된 혼합물에 TFA/H2O/DTT를, 더 바람직하게는 94:3:3 비율로 포함하는 혼합물을 처리하는 것을 포함한다. DTT는 스캐빈저로서 기능하고, 잠재적인 조기 산화를 방지한다.
단계 (IV)(b)(ii)는 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 방법의 단계 (IV)(b)(ii)는 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 Tris 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 DMSO 및 물 용액을 처리하여 EGF-유사 펩타이드 조산물을 형성하는 것을 포함한다.
방법의 단계 (V)는, 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 것을 포함한다. 적합한 정제 방법들이 당해 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어, HPLC 등이 있다. 당업자라면 펩타이드를 HPLC 정제하는데 적합한 용매 및 컬럼 물질에 익숙할 것이다. 정제에 적합한 용매, 컬럼 물질 및 조건은 첨부된 실시예에서 예시된다.
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편은 펩타이드 세부-단편 2 이상을 커플링함으로써 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편은 펩타이드 세부-단편 2 이상을 커플링함으로써 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
상피 성장 인자 (EGF)의 제조 방법
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 EGF, 또는 이의 유사체 또는 변이체이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 뮤라인 EGF, 또는 이의 유사체 또는 변이체이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 인간 EGF, 또는 이의 유사체 또는 변이체이다.
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산은 글리신이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기한 방법은, 서열번호 2의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을, 용액에서 서열번호 3의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계를 포함한다:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-OH [서열번호 2]
서열번호 2에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이이고,
H-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 3]
서열번호 3에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
산 절단가능한 보호기로는 tBu, Boc, Acm, OtBu, Trt, Mmt, Mtt 및 Pbf 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 측쇄가 tBu, Ttr, Pbf 및 Boc로부터 선택되는 산-절단성 보호기로 선택적으로 보호된다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-OH [서열번호 9]
제1 펩타이드 단편은 서열번호 10의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-OH [서열번호 10];
제2 펩타이드 단편은 서열번호 11의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 11];
여기서 각각의 P는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 측쇄 보호기이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-OH [서열번호 12];
상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 13의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-OH [서열번호 13],
제2 펩타이드 단편은 서열번호 14의 서열 또는 이의 변이체를 포함한다 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된다):
H-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 14].
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-OH [서열번호 10] 또는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-OH [서열번호 13]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-OH [서열번호 15]는 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 16]와 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-O-PG2 [서열번호 17]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG2는 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-OH [서열번호 13]는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 18]와 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-O-PG2 [서열번호 19]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG2는 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 20] 또는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 21]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-O-PG2 [서열번호 17] 또는 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-O-PG2 [서열번호 19]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 11]는 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 22]와 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 14]는 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 24]와 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 11]는 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 26]와 H-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 27]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 14]는 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39--OH [서열번호 28]와 H-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 29]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23]는 PG1-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 30]와 H-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 27]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]는 PG1-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 31]와 H-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 29]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 22] 또는 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 24]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23] 또는 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]는 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 26] 또는 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39 --OH [서열번호 28]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 27] 또는 H-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 29]는 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기한 방법은 서열번호 4의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 5의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계를 포함하고:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10-Asp11-Gly12-OH [서열번호 4]
서열번호 4에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고;
H-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 5]
서열번호 5에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-OH [서열번호 9]
제1 펩타이드 단편은 서열번호 20의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 20]
제2 펩타이드 단편은 서열번호 32의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 32]
여기서 각각의 P는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 측쇄 보호기이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-OH [서열번호 12];
상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 18의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 18],
제2 펩타이드 단편은 서열번호 33의 서열 또는 이의 변이체를 포함한다 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된다):
H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 33].
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 34] 또는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 18]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 32] 또는 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 33]는 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 32]는 PG1-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 35]와 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 33]는 PG1-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 36]와 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 PG1-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 35] 또는 PG1-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 36]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23] 또는 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]는 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 EGF(1-53) 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 단편 Fmoc-EGF(19-36)-OH를 단편 H-EGF(37-53)-OClt와 커플링하여 Fmoc-EGF(19-53)-OClt를 형성하는 단계;
(b) 단편 Fmoc-EGF(19-53)-OClt로부터 Fmoc 기를 제거하여 H-EGF(19-53)-OClt를 형성하는 단계;
(c) 단편 H-EGF(19-53)-OClt를 단편 Boc-EGF(1-18)-OH와 커플링하여 보호된 선형의 펩타이드 Boc-EGF(1-53)-OClt를 형성하는 단계;
(d) 보호된 선형의 펩타이드 Boc-EGF(1-53)-OClt에 TFA/다이클로로메탄 중의 요오드 용액을 처리하는 단계;
(e) 단계 (d)의 생성물을 TFA/H2O/DTT 처리에 의해 전체적으로 탈보호화하여 선형의 펩타이드 EGF(1-53) 조산물을 형성하는 단계;
(f) 단계 (e)의 생성물에 Tris 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유한 DMSO 및 물 용액을 처리하는 단계;
(g) 선택적으로 단계 (f)의 생산물을 HPLC에 의해 정제하는 단계.
바람직하게는, 단계 (a)에서 단편 Fmoc-EGF(19-36)-OH는 예를 들어, HOBt.H2O를 처리함으로써 활성화된다.
형질전환 성장인자-α (TGF-α)의 제조 방법
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 형질전환 성장인자-α (TGF-α), 또는 이의 유사체 또는 변이체이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 인간 형질전환 성장인자-α (hTGF-α), 또는 이의 유사체 또는 변이체이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 6];
상기한 방법은 서열번호 7의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 8의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계를 포함하고:
PG1-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-OH [서열번호 7]
서열번호 7에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고;
H-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 8],
서열번호 8에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Val1-Val2-Ser3(P)-His4(P)-Phe5-Asn6(P)-Asp7(P)-Cys8(P)-Pro9-Asp10(P)-ΨSer11-His12(P)-Thr13(P)-Gln14(P)-Phe15-Cys16(P)-Phe17-His18(P)-Gly19-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 37],
상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 38의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Val1-Val2-Ser3(P)-His4(P)-Phe5-Asn6(P)-Asp7(P)-Cys8(P)-Pro9-Asp10(P)-ΨSer11-His12(P)-Thr13(P)-Gln14(P)-Phe15-Cys16(P)-Phe17-His18(P)-Gly19-OH [서열번호 38],
상기 제2 펩타이드 단편은 서열번호 39의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
H-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 39],
여기서 각각의 P는 동일하거나 또는 상이할 수 있는 측쇄 보호기이다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드는 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Val1-Val2-Ser3(tBu)-His4(Trt)-Phe5-Asn6(Trt)-Asp7(tBu)-Cys8(Trt)-Pro9-Asp10(tBu)-ΨSer11-His12(Trt)-Thr13(tBu)-Gln14(Trt)-Phe15-Cys16(Trt)-Phe17-His18(Trt)-Gly19-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 40],
상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 41의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고 (또는 더 바람직하게는 이로 구성되고):
PG1-Val1-Val2-Ser3(tBu)-His4(Trt)-Phe5-Asn6(Trt)-Asp7(tBu)-Cys8(Trt)-Pro9-Asp10(tBu)-ΨSer11-His12(Trt)-Thr13(tBu)-Gln14(Trt)-Phe15-Cys16(Trt)-Phe17-His18(Trt)-Gly19-OH [서열번호 41],
상기 제2 펩타이드 단편은 서열번호 42의 서열 또는 이의 변이체를 포함한다 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된다):
H-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 42].
바람직한 일 구현예에서, 제1 펩타이드 단편 PG1-Val1-Val2-Ser3(P)-His4(P)-Phe5-Asn6(P)-Asp7(P)-Cys8(P)-Pro9-Asp10(P)-ΨSer11-His12(P)-Thr13(P)-Gln14(P)-Phe15-Cys16(P)-Phe17-His18(P)-Gly19-OH [서열번호 38] 또는 PG1-Val1-Val2-Ser3(tBu)-His4(Trt)-Phe5-Asn6(Trt)-Asp7(tBu)-Cys8(Trt)-Pro9-Asp10(tBu)-ΨSer11-His12(Trt)-Thr13(tBu)-Gln14(Trt)-Phe15-Cys16(Trt)-Phe17-His18(Trt)-Gly19-OH [서열번호 41]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 서열 H-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 39]를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드 단편은 PG1-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-OH [서열번호 43]와 H-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 44]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 서열 H-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 45]를 포함하는 (또는 더 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드 단편은 PG1-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-OH [서열번호 46]와 H-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 47]의 단편 축합에 의해 제조된다. 바람직하게는, 보호기 PG1은 이후에 제거된다.
바람직한 일 구현예에서, 펩타이드 단편 H-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 48] 또는 H-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 47]는 Fmoc-Ala-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, 제2 펩타이드 단편 PG1-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-OH [서열번호 43] 또는 PG1-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-OH [서열번호 46]는 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
바람직한 일 구현예에서 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 TGF(1-50) 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 단편 Fmoc-TGF(20-37)-OH를 단편 H-TGF(38-50)-OClt와 커플링하여 Fmoc-EGF(20-50)-OClt를 형성하는 단계;
(b) 단편 Fmoc-TGF(20-50)-OClt로부터 Fmoc 기를 제거하여 H-TGF(20-50)-OClt를 형성하는 단계;
(c) 단편 H-TGF(20-50)-OClt를 단편 Boc-TGF(1-19)-OH와 커플링하여 보호된 선형의 펩타이드 Boc-TGF(1-50)-OClt를 형성하는 단계;
(d) 보호된 선형의 펩타이드 Boc-TGF(1-50)-OClt에 TFA/다이클로로메탄 중의 요오드 용액을 처리하는 단계;
(e) 단계 (d)의 생성물을 TFA/H2O/DTT 처리에 의해 전체적으로 탈보호화하여 선형의 펩타이드 TGF(1-50) 조산물을 형성하는 단계;
(f) 단계 (e)의 생성물에 Tris 및 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유한 DMSO 및 물 용액을 처리하는 단계;
(g) 선택적으로 단계 (f)의 생산물을 HPLC에 의해 정제하는 단계.
바람직하게는, 단계 (a)에서 단편 Fmoc-TGF(20-37)-OH는 예를 들어, HOBt.H2O를 처리함으로써 활성화된다.
본원에 기술된 모든 구현예들에서, 바람직하게는 PG2는 클로로트리틸 또는 트리틸이고, 더 바람직하게는, 클로로트리틸이다. 유익하게는, 합성시 클로로트리틸 보호기의 사용은 전체 수율의 상당한 증가를 달성하고, 예를 들어, 일부 경우에, 클로로트리틸 보호기의 사용은 원하는 펩타이드의 수율을 25% 정도로 전체적으로 증가시킬 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, PG1은 Boc (부틸옥시카르보닐)이다.
본원에 기술된 모든 구현예들에서, 바람직하게는, 제1 단편은 고상에서 또는 액체 중에서 제조된다. 제1 단편이 고상에서 제조되는 경우, 이는 제2 단편과 용액에서 커플링하기 전 수지로부터 절단된다.
본원에 기술된 모든 구현예들에서, 바람직하게는, 제2 단편은 고상에서 또는 액체 중에서 제조된다. 제2 단편이 고상에서 제조되는 경우, 이는 제1 단편과 용액에서 커플링하기 전 수지로부터 절단된다.
본원에 기술된 모든 구현예들에서, 바람직하게는 제2 단편은 2 이상의 세부-단편을 커플링함으로써 제조된다.
바람직한 일 구현예에서, EGF-유사 펩타이드 조산물은 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올 중의 다양한 완충제를 이용한 분취용 HPLC에 의해 정제한다.
다른 측면에서, 본 발명은 EGF-유사 펩타이드 또는 이의 유사체 또는 변이체, 더 바람직하게는, EGF 또는 TGF-α의 합성에서의, 본원에 기술된 하나 이상의 펩타이드 단편의 용도에 관한 것이다.
특이적인 단편 조합에 의한 EGF 합성
제2 측면에서, 본 발명은 하기 서열 또는 이의 변이체를 가진 EGF-유사 펩타이드의 제조 방법에 관한 것으로:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기 방법은, 서열번호 2의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 3의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함하고:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-OH [서열번호 2],
서열번호 2에서,
PG1은 N-말단 보호기, 바람직하게는 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고;
H-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 3],
서열번호 3에서, PG2는 C-말단 보호기이고, 바람직하게는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
제3 측면에서, 본 발명은 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 바람직하게는 이로 구성된) EGF-유사 펩타이드의 제조 방법에 관한 것으로:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기 방법은, 서열번호 4의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 바람직하게는 이로 구성된) 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 5의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 바람직하게는 이로 구성된) 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함하고:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10-Asp11-Gly12-OH [서열번호 4];
서열번호 4에서,
PG1은 N-말단 보호기, 바람직하게는 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체 형태이고;
H-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 5];
서열번호 5에서, PG2는 C-말단 보호기이고, 바람직하게는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
특이적인 단편
축합에
의한
TGF
-α 합성
제4 측면에서, 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 (또는 바람직하게는 이로 구성된) EGF-유사 펩타이드의 제조 방법에 관한 것으로:
H-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 6];
상기 방법은, 서열번호 7의 서열 또는 이의 변이체를 가진 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 5의 서열 또는 이의 변이체를 가진 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함하고:
PG1-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-OH [서열번호 7];
서열번호 7에서,
PG1은 N-말단 보호기, 바람직하게는 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고;
H-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 8],
서열번호 8에서, PG2는 C-말단 보호기이고, 바람직하게는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상은 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직하게는 각 경우에 방법은 단편 축합 단계에서 형성된 보호된 또는 비보호된 선형의 EGF-유사 펩타이드를 EGF-유사 펩타이드의 3차 구조를 형성하기 위한 특정 조건에 투입하는 것을 추가로 포함한다. 바람직한 조건은 제1 측면에서 전술한 바와 같이 단계 (IV)(a), (IV)(b) 및 (V)를 포함한다.
이에, 일 구현예에서, 본 발명의 전술한 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직하게는, 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(III) 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액 중에 커플링하여, 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드를 생성하는 단계;
(IV)(a)
(i) 단계 (III)에서 생성된 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여, 산화된 혼합물을 생성하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(iii) 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 DMSO/DTT를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 또는
(IV)(b)
(i) 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 및
(V) 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계.
바람직한 일 특정 구현예에서, 방법은 하기 단계들을 포함한다:
제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액에서 커플링하여 보호된 EGF-유사 펩타이드를 형성하는 단계;
단계 (a)에서 형성된 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리해, 산화된 혼합물을 형성하는 단계;
단계 (iv)에서 수득한 산화된 혼합물을 트리플루오로아세트산 (TFA) 처리에 의해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
단계 (v)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 다이티오트레이톨 (DTT) 및 DMSO를 처리해, EGF-유사 펩타이드 조산물을 형성하는 단계; 및
선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 각 방법 단계 각각에 대한 바람직한 구현예들은 본 발명의 제1 측면에서 전술된 바와 같다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 아미노산에 적합한 N-말단 및 C-말단 보호기는 당업자들에게 익숙할 것이다. 예들은 T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991; 및 P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994에서 찾아볼 수 있다.
아미노산에 바람직한 N-말단 보호기에 대한 예로는 Boc (tert-부틸옥시카르보닐) 및 Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시-카르보닐)가 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이들의 불안정성은 비가역적인 탈커플링 단계에서 쉽게 CO2를 방출하는 카바메이트 기에 의해 유발된다. 다른 적합한 카바메이트 기반의 기는 벤질옥시-카르보닐 (Z 또는 Cbz) 기이며; 이는 더 가혹한 조건에서 제거된다. Boc 및 Fmoc가 특히 바람직하다.
아미노산에 대한 C-말단 보호기의 예로는 클로로트리틸 및 t-부틸 등이 있다. 클로로트리틸이 특히 바람직하다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직하게는 일 구현예에서 제1 펩타이드 단편은 펩타이드 세부-단편 2 이상의 커플링에 의해 제조된다. 바람직하게는, 세부-단편은 본 발명의 제1 측면에서 기술된 바와 같다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직하게는 일 구현예에서 제1 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직하게는 일 구현예에서 제2 펩타이드 단편은 펩타이드 세부-단편 2 이상의 커플링에 의해 제조된다. 바람직하게는, 세부-단편은 본 발명의 제1 측면에서 기술된 바와 같다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직하게는 일 구현예에서 제2 펩타이드 단편은 고상 펩타이드 합성에 의해 제조된다.
전술한 커플링 반응들 각각에서, 바람직하게는 COOH 기는 예를 들어, HOBt.H2O 처리에 의해 활성화된다.
전술한 본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면에서, 바람직한 제1 및 제2 펩타이드 단편 및 이의 세부-단편 및 이의 제조 방법은 본 발명의 제1 측면에서 기술된 바와 같다.
본 발명은 아래 비-제한적인 실시예를 들어 추가로 기술된다.
약어
Acm
아세트아미도메틸
AIB (또는 Aib) 2-아미노이소부티르산 또는 α-아미노이소부티르산
Boc 또는 t-Boc
t-부틸옥시카르보닐
Bt
벤조트리아졸
Bz
벤질
Dde
1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸
EDC.HCl
1-에틸-3-(3'-다이메틸-아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드
DMAC
다이메틸 아세트아미드
DMF
다이메틸 포름아미드
DPM
다이페닐메틸
DCM
다이클로로메탄
DMSO
다이메틸 설폭사이드
DIC
N,N'-다이이소프로필카르보디이미드
DIPEA
N,N-다이이소프로필에틸아민
HBTU
(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로 포스페이트, (헥사플루오로포스페이트 벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄)
MeDPM
메틸-다이페닐메틸
MeODPM
메톡시-다이페닐메틸
MeOH
메탄올
ivDde
1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥실리덴)-3-메틸부틸
Fmoc
9-플루오레닐메톡시카르보닐
HPLC
고 성능 액체 크로마토그래피
HOBt
하이드록시벤조트리아졸
Mmt
모노메톡시트리틸 [(4-메톡시페닐)다이페닐메틸]
Mtt
4-메틸트리틸
NMP
N-메틸피롤리돈
Pfp
펜타플루오로페닐
Su
숙신이미드
tBu
tert-부틸
Pal
팔미토일
Pbf
2,2,4,6,7-펜타메틸-다이하이드로벤조푸란-5-설포닐
TBTU
N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트
TFA
트리플루오로아세트산
Tris
트리스(하이드록시메틸)아미노메탄
Trt
트리틸
Clt
클로로트리틸
실험 섹션:
Fmoc - EGF (37-53)-OH 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 96 g을 DCM 700 ㎖로 팽윤시켰다. DIPEA 56 ㎖ 및 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 25.2 g을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 세워 둔 후 메탄올 28 ㎖을 첨가하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA 288 ㎖로 중화하였다. 피페리딘 / NMP (15%) 혼합물 384 ㎖을 첨가하여 Fmoc-절단을 수행하였다. 모든 커플링은 NMP (0.5M) 중에 Fmoc-아미노산/HOBt/DIC (1:1.2:1.1)을 2.5 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. 보호된 펩타이드는 TFA/DCM (2%) 혼합물 1344 ㎖을 사용해 수지로부터 절단하였다. TFA를 물 (3300 ㎖)로 추출하고, 펩타이드는 헥산 (800 ㎖)을 첨가하여 축합 후 석출하였다. 최종 수율 (104 g, 72%).
Fmoc - EGF (37-53)-OH의 클로로트리틸 보호: 보호된 펩타이드 80 g을 DCM 296 ㎖로 용해하고, 2-클로로트리틸 클로라이드 32 g 및 DIPEA 36 ㎖를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 세워 둔 후 HPLC에 의해 모니터링하였다. 0.1N 하이드로클로라이드 산 592 ㎖을 이용해 다이클로로메탄 혼합물로부터 DIPEA를 추출하고, Fmoc-EGF(37-53)-OClt을 헥산 1600 ㎖을 이용하여 축합 후 석출시키고, 진공 건조하였다. NMP (168 ㎖) 중에 6 mmol 과량으로 피페리딘을 사용해 Fmoc 절단을 수행하였다. DCM 504 ㎖을 반응 혼합물에 첨가하고, 0.01N 하이드로클로라이드 산 504 ㎖로 다이클로로메탄 용액으로부터 피페리딘을 추출하였다. 헥산 1056 ㎖을 이용하여 축합 후 H-EGF(37-53)-OClt를 석출시키고, 다이에틸에테르 392 ㎖로 6번 헹군 후 진공 건조하였다. 최종 수율 78g (92%)
Fmoc - EGF (19-36)-OH 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 42 g을 DCM 232 ㎖로 팽윤시켰다. DIPEA 26 ㎖ 및 Fmoc-Gly-OH 5 g을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 세워 둔 후 메탄올 14 ㎖을 첨가하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA 126 ㎖로 중화하였다. 피페리딘 / NMP (15%) 혼합물 192 ㎖을 첨가하여 Fmoc-절단을 수행하였다. 모든 커플링은 NMP (0.5M) 중에 Fmoc-아미노산/HOBt/DIC (1:1.2:1.1)를 2.5 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. TFA/DCM (2%) 혼합물 588 ㎖을 이용해 수지에서 보호된 펩타이드를 절단하였다. TFA를 물 (1450 ㎖)로 추출하고, 펩타이드는 헥산 (400 ㎖)을 이용하여 축합 후 석출하였다. 최종 수율 42 g (82%).
Boc - EGF (1-18)-OH 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 42 g을 DCM 232 ㎖로 팽윤시켰다. DIPEA 26 ㎖ 및 Fmoc-Gly-OH 5 g을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 세워 둔 후 메탄올 14 ㎖을 첨가하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA 6.3 ㎖로 중화하였다. 피페리딘 / NMP (15%) 혼합물 192 ㎖을 첨가하여 Fmoc-절단을 수행하였다. 모든 커플링은 NMP (0.5M) 중에 Fmoc-아미노산/HOBt/DIC (1:1.2:1.1)를 2.5 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. TFA/DCM (2%) 혼합물 588 ml을 사용해 수지에서 보호된 펩타이드를 절단하였다. TFA를 물 (1450 ㎖)로 추출하고, 펩타이드는 헥산 (400 ㎖)을 이용하여 축합 후 석출하였다. 최종 수율 42 g (80%).
보호된 EGF (1-53) 합성: Fmoc-EGF(19-36)-OH 40 g을 NMP 140 ㎖ 중의 HOBt.H2O (2.1 g) 및 EDAC.HCl (2.4 g)로 활성화시키고, H-EGF(37-53)-OClt (52 g)를 활성화된 보호된 펩타이드에 첨가하였다. 반응의 완료를 HPLC에 의해 모니터링하였다. Fmoc-EGF(19-36)-OH가 대응되는 Fmoc-EGF(19-53)-OClt와 비교해 면적이 <0.5%이면, Fmoc-절단을 위해 피페리딘 7 ml을 첨가하였다. DCM 432 ㎖을 반응 혼합물에 첨가하고, 0.01N 하이드로클로라이드 산 432 ㎖을 사용해 다이클로로메탄 용액으로부터 피페리딘을 추출하였다. 헥산 1850 ㎖을 이용하여 축합 후 H-EGF(19-53)-OClt를 석출시키고, 다이에틸에테르 460 ㎖로 6번 헹군 다음 진공 건조하였다. 최종 수율 84.6 g (94%).
NMP 420 ㎖에 용해된 보호된 H-EGF(19-53)-OClt 84 g에, NMP 310 ㎖에 용해된 활성화된 Boc-EGF(1-18)-OH (40 g), HOBt.H2O (1.9 g), EDAC.HCl (2.3 g)을 첨가하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. H-EGF(19-53)-OClt가 조산물 EGF와 면적을 비교해 <1%이면, 물 7.3 Lt를 첨가하여 반응을 정지시키고, 여과하였다. 최종 보호된 펩타이드를 물 (400 ㎖)로 3번 헹구고, 수분 함량이 <3%가 될 때까지 진공 건조하였다. 최종 수율 115.2 g (96%).
단편 Fmoc-EGF(13-36)-OH를 제조하고 단편 H-EGF(37-53)-OClt와 커플링하여 Fmoc-EGF(13-53)-OClt를 제조한 다음 Fmoc 기를 제거해 H-EGF(13-53)-OClt를 제조함으로써, 비슷한 합성 전략을 이용할 수 있다. 그런 후, H-EGF(13-53)-OClt는 Boc-EGF(1-12)-OH와 커플링하여 보호된 선형의 EGF 펩타이드를 제조할 수 있다.
보호된 EGF (1- 53)의 요오드 산화: 보호된 펩타이드 (110 g)을 DCM 800 ㎖에 용해하고, 1% TFA/DCM 800 ㎖ 중의 요오드 용액 (3.7 g)을 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 세워 둔 후, 소듐 설페이트 5수화물 (7.3 g)의 수용액 (1.6Lt)을 첨가하였다. DCM / 펩타이드 용액을 물 1.6Lt를 사용해 2번 이상 추출하고, 진공 농축한 다음 헥산 (1.2Lt)을 첨가해 석출하고, 다이에틸에테르 (500 ㎖)로 3번 헹구었다. 최종 수율 95.7 g (99%)
전체 탈보호 : Boc-EGF(1-53)-OClt 95 g은, TFA/H2O/DTT (94:3:3) 혼합물 5.6Lt을 첨가하여 RT에서 2.5시간 동안 보호기를 탈보호화하였다. DTT는 스캐빈저로 기능하며, 잠재적인 조기 산화를 방지한다. 반응물은 진공 농축하고, 다이에틸에테르 940 ㎖을 첨가하여 선형의 EGF 조산물을 석출한 다음 다이에틸에테르 (240 ㎖)로 3번 헹구었다. 최종 수율 47.2 g (100%).
DMSO / DTT 산화: 선형의 EGF 조산물 (40 g)을 DMSO 5.28 Lt에 용해하고, Tris (200 g) 및 구아니딘 하이드로클로라이드 (260 g)가 함유된 물 용액 (21.4 Lt)을 RT에서 첨가한다. 구아니딘 하이드로클로라이드는 카오트로프로 기능한다. 반응물을 24시간 동안 세워 두었으며, 반응 완료를 HPLC에 의해 모니터링하였다. 최종 수율 15%.
HPLC 정제: 0.2% TFA를 첨가하여 산성화한 다음, 선형의 EGF 조산물 용액을 바로 Kromasil C-18, 100A, 13μm이 충진된 분취용 HPLC 컬럼에 주입하였다. 2-단계 정제 공정, 즉 0.1% TFA를 이용한 1차와 암모늄 바이카보네이트 (pH 7.8)를 이용한 2차에 의해 네이티브 h-EGF 조산물을 정제하였다. 아세토니트릴을 유기 개변제 (organic modifier)로 사용하였다. 네이티브 EGF를 순도 >98%로 함유한 분획들을 추가로 동결건조하였다. 최종 수율 1.04 g (70%).
Fmoc - TGF (38-50)-OH 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 70 g을 DCM 350 ㎖로 팽윤시켰다. DIPEA 48 ㎖ 및 Fmoc-Ala-OH 10 g을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 세워 둔 후 메탄올 21 ㎖를 첨가하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA 250 ㎖로 중화하였다. 피페리딘 / NMP (15%) 혼합물 230 ㎖을 첨가하여 Fmoc-절단을 수행하였다. 모든 커플링은 NMP (0.5M) 중에 Fmoc-아미노산/HOBt/DIC (1:1.2:1.1)를 2.5 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. TFA/DCM (2%) 혼합물 490 ㎖를 사용해 수지에서 보호된 펩타이드를 절단하였다. TFA를 물 (490 ㎖)로 추출하고, 헥산 (1400 ㎖)을 이용하여 축합 후 펩타이드를 석출하였다. 최종 수율 (59 g, 83%)
Fmoc - TGF (38-50)-OH의 클로로트리틸 보호: 보호된 펩타이드 65 g을 DCM 1300 ㎖에 용해하고, 2-클로로트리틸 클로라이드 16 g 및 DIPEA 17.5 ㎖를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 세워 둔 후 HPLC에 의해 모니터링하였다. 0.1N 하이드로클로라이드 산 1300 ㎖을 이용해 다이클로로메탄 혼합물로부터 DIPEA를 추출하고, 헥산 1400 ㎖로 축합하여 Fmoc-TGF(38-50)-OClt를 석출한 다음 진공 건조하였다. Fmoc 절단은 NMP (15 ㎖) 중에 피페리딘을 6 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. DCM 480 ㎖를 반응 혼합물에 첨가하고, 다이클로로메탄 용액으로부터 0.01N 하이드로클로라이드 산 480 ㎖를 이용해 피페리딘을 추출하였다. 헥산 1400 ㎖로 축합하여 H-TGF(38-50)-OClt를 석출하고, 다이에틸에테르 400 ㎖로 6번 헹군 후 진공 건조하였다. 최종 수율 56 g (95%).
Fmoc - TGF (20-37)-OH 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 70 g을 DCM 350 ㎖로 팽윤시켰다. DIPEA 48 ㎖ 및 Fmoc-Gly-OH 8.4 g을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 세워 둔 후 메탄올 21 ㎖을 첨가하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA 250 ㎖로 중화하였다. 피페리딘 / NMP (15%) 혼합물 230 ㎖를 첨가하여 Fmoc-절단을 수행하였다. 모든 커플링은 NMP (0.5M) 중에 Fmoc-아미노산/HOBt/DIC (1:1.2:1.1)를 2.5 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. TFA/DCM (2%) 혼합물 490 ㎖를 사용해 수지에서 보호된 펩타이드를 절단하였다. TFA를 물 (490 ㎖)로 추출하고, 헥산 (1400 ㎖)을 이용하여 축합 후 펩타이드를 석출하였다. 최종 수율 (69 g, 76%).
Boc - TGF (1-19)-OH 합성: 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 70 g을 DCM 350 ㎖로 팽윤시켰다. DIPEA 48 ㎖ 및 Fmoc-Gly-OH 8.4 g을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 세워 둔 후 메탄올 21 ㎖을 첨가하였다. 수지를 여과하고, DCM/MeOH/DIPEA 250 ㎖로 중화하였다. 피페리딘 / NMP (15%) 혼합물 230 ㎖를 첨가하여 Fmoc-절단을 수행하였다. 모든 커플링은 NMP (0.5M) 중에 Fmoc-아미노산/HOBt/DIC (1:1.2:1.1)를 2.5 mmol 과량으로 사용해 수행하였다. TFA/DCM (2%) 혼합물 490 ㎖를 사용해 수지에서 보호된 펩타이드를 절단하였다. TFA를 물 (490 ㎖)로 추출하고, 헥산 (2000 ㎖)을 이용하여 축합 후 펩타이드를 석출하였다. 최종 수율 (83 g, 80%).
보호된 TGF (1-50) 합성: Fmoc-TGF(20-37)-OH 65 g을 NMP 120 ㎖ 중의 HOBt.H2O (2.5 g)으로 활성화한 다음 EDAC.HCl (2.83 g) 및 H-TGF(38-50)-OClt (37 g)을 활성화된 보호된 펩타이드에 첨가하였다. 반응 완료를 HPLC에 의해 모니터링하였다. Fmoc-TGF(20-37)-OH가 대응되는 Fmoc-TGF(20-50)-OClt와 면적을 비교에 의해 <0.5%인 것으로 확인되면, Fmoc-절단을 위해 피페리딘 8 ㎖를 첨가하였다. DCM 360 ㎖를 반응 혼합물에 첨가하고, 다이클로로메탄 용액으로부터 0.01N 하이드로클로라이드 산 360 ㎖를 사용해 피페리딘을 추출하였다. 헥산 1700 ㎖로 축합한 후 H-TGF(20-50)-OClt를 석출시키고, 다이에틸에테르 420 ㎖로 6번 헹군 후 진공 건조하였다. 최종 수율 80.2 g (95%).
NMP 400 ㎖에 용해된 보호된 H-TGF(20-50)-OClt 78 g에, NMP 280 ㎖에 용해된 활성화된 Boc-TGF(1-19)-OH (55 g), HOBt.H2O (2.4 g), EDAC.HCl (2.73 g)을 첨가하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였다. H-TGF(20-50)-OClt가 EGF 조산물과의 면적 비교시 <1%이면, 물 3.2 Lt를 첨가해 반응을 중단시킨 후 여과하였다. 최종 보호된 펩타이드를 물 (800 ㎖)로 3번 헹구고, 수분 함량이 <3%가 될 때까지 진공 건조하였다. 최종 수율 121 g (98%)
보호된 TGF (1- 50)의 요오드 산화: 보호된 펩타이드 (110 g)을 DCM 1000 ㎖에 용해하고, 1% TFA/DCM 600 ㎖ 중의 요오드 용액 (5.4 g)을 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 세워 둔 후, 소듐 설페이트 오수화물 (9.6 g)의 수용액 (1.6 Lt)을 첨가하였다. 물 1.6 Lt로 DCM / 펩타이드 용액을 2번 추출하고, 진공 농축한 후 헥산 (1.2 Lt)으로 석출하여 다이에틸에테르 (440 ㎖)로 3번 헹구었다. 최종 수율 86 g (97%).
전체적인 탈보호 : Boc-타우GF(1-50)-OClt 80 g을, TFA/H2O/DTT (94:3:3) 혼합물 5.3 Lt를 첨가하여 보호기를 RT에서 2.5시간 동안 탈보호화하였다. DTT는 스캐빈저로 기능하며, 잠재적인 조기 산화를 방지한다. 반응물은 진공 농축하고, 다이에틸에테르 1000 ㎖를 첨가하여 선형의 EGF 조산물을 석출한 후 다이에틸에테르 (250 ㎖)로 3번 헹구었다. 최종 수율 48.6 g (97%).
DMSO / DTT 산화: 선형의 TGF 조산물 (45 g)을 DMSO 6 Lt에 용해하고, Tris (220 g) 및 구아니딘 하이드로클로라이드 (280 g)를 함유한 수용액 (24 Lt)를 RT에서 첨가하였다. 구아니딘 하이드로클로라이드는 카오트로프로 기능한다. 반응물을 24시간 동안 세워 두었으며, 반응 완료를 HPLC에 의해 모니터링하였다. 최종 수율 22%.
HPLC 정제: 0.2% TFA로 산성화한 후, 선형의 TGF 조산물 용액을 Kromasil C-18, 100A, 13μm로 충전된 분취용 HPLC 컬럼에 바로 주입하였다. 2-단계 정제 공정, 즉 0.1% TFA를 이용한 1차와 암모늄 바이카보네이트 (pH 6)를 이용한 2차에 의해 네이티브 h-EGF 조산물을 정제하였다. 아세토니트릴을 유기 개변제 (organic modifier)로 사용하였다. 네이티브 TGF를 순도 >97%로 함유한 분획들을 추가로 동결건조하였다. 최종 수율 최종 수율 2.1 g (78%).
당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 기술된 측면에 대한 다양한 수정 및 변화가 자명할 것이다. 본 발명이 구체적으로 바람직한 구현예를 들어 기술되었지만, 청구하는 본 발명이 이러한 구체적인 구현예들로 과도하게 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 실제, 관련 기술 분야에서 당업자에게 명확한 본 발명을 수행하는 기술된 방식에 대한 다양한 수정들이 첨부된 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Chemical & Biopharmaceutical Laboratories of Patras S.A.
<120> PROCESS
<130> P119807PCT
<140> PCT/IB2021/060271
<141> 2021-11-05
<150> GR20200100690
<151> 2020-11-20
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(1-53)-OH
<220>
<221> DISULFID
<222> (6)..(6)
<223> C6-C20
<220>
<221> DISULFID
<222> (14)..(14)
<223> C14-C31
<220>
<221> DISULFID
<222> (20)..(20)
<223> C6-C20
<220>
<221> DISULFID
<222> (31)..(31)
<223> C14-C31
<220>
<221> DISULFID
<222> (33)..(33)
<223> C33-C42
<220>
<221> DISULFID
<222> (42)..(42)
<223> C33-C42
<400> 1
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-18)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<400> 2
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(19-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 3
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp
20 25 30
Glu Leu Arg
35
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-12)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<400> 4
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(13-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 5
Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr
20 25 30
Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
35 40
<210> 6
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-TGF(1-50)-OH
<400> 6
Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys
1 5 10 15
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys
20 25 30
Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
35 40 45
Leu Ala
50
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-TGF(1-19)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<400> 7
Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys
1 5 10 15
Phe His Gly
<210> 8
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-TGF(20-50)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 8
Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys Val Cys His
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala
20 25 30
<210> 9
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(1-53)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(14)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(17)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(29)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(33)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(46)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(51)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> Side chain protecting group
<400> 9
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-18)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(14)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(17)
<223> side chain protecting group
<400> 10
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly
<210> 11
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(19-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(11)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(15)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(28)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(33)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 11
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp
20 25 30
Glu Leu Arg
35
<210> 12
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(1-53)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Boc side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(33)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> Pbf side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(43)
<223> Trt side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Pbf side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(50)
<223> Boc side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> tBu side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> Pbf side chain protecting group
<400> 12
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-18)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> tBu protecting group
<400> 13
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly
<210> 14
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(19-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Boc protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(15)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(25)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(32)
<223> Boc protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> Pbf protecting group
<400> 14
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp
20 25 30
Glu Leu Arg
35
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-18)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(14)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(17)
<223> side chain protecting group
<400> 15
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-12)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> side chain protecting group
<400> 16
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(13-18)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 17
Tyr Cys Leu His Asp Gly
1 5
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-12)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> tBu protecting group
<400> 18
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(13-18)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 19
Tyr Cys Leu His Asp Gly
1 5
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-12)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> Side chain protecting group
<400> 20
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-12)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> tBu protecting group
<400> 21
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(19-36)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<400> 22
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(37-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(10)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(15)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> side chain protecting group
<400> 23
Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu
1 5 10 15
Arg
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(19-36)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(15)
<223> Trt protecting group
<400> 24
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(37-53)-OPG2
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Pbf protecting group
<400> 25
Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu
1 5 10 15
Arg
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(19-36)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<400> 26
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly Tyr Ile Gly
20
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(40-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(12)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 27
Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
1 5 10
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(19-36)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Boc protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(15)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> side chain protecting group
<400> 28
Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val
1 5 10 15
Val Gly Tyr Ile Gly
20
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(40-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(4)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(11)
<223> Boc protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 29
Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(37-39)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> side chain protecting group
<400> 30
Tyr Ile Gly
1
<210> 31
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(37-39)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu protecting group
<400> 31
Tyr Ile Gly
1
<210> 32
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(13-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(17)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(21)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(34)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(39)
<223> protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> protecting side group
<400> 32
Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr
20 25 30
Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
35 40
<210> 33
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-EGF(13-53)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Trt protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Trt protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Trt protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Boc protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(21)
<223> Trt protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Pbf protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(31)
<223> Trt protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Pbf protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(38)
<223> Boc protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> tBu protecting side group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> Pbf protecting side group
<400> 33
Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr
20 25 30
Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
35 40
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(1-12)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
<223> Side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> Side chain protecting group
<400> 34
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(13-36)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc or Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> protecting side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> protecting side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> protecting side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> protecting side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> protecting side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(17)
<223> protecting side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(21)
<223> protecting side chain
<400> 35
Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly
20
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-EGF(13-36)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc or Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Trt side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Trt side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> tBu side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Trt side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> tBu side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> tBu side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> tBu side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Boc side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> tBu side chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(21)
<223> Trt side chain
<400> 36
Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly
20
<210> 37
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PG1-TGF(1-50)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc or Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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t-butyl
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1 5 10 15
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys
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Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
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Leu Ala
50
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<400> 38
Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys
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Phe His Gly
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<212> PRT
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<220>
<223> H-TGF(20-50)-OPG2
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<220>
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t-butyl
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
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Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys
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Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
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Leu Ala
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<210> 41
<211> 19
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<213> Artificial Sequence
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<223> PG1-TGF(1-19)-OH
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<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc or Fmoc
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<223> Trt protecting group
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> PG1-TGF(20-37)-OH
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys Val Cys His
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<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
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<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Trt protecting group
<220>
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<223> tBu protecting group
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<223> tBu protecting group
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<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Trt protecting group
<220>
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
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<213> Artificial Sequence
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N-terminal protecting group selected from Boc and Fmoc
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
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<220>
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<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> tBu protecting group
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-TGF(38-50)-OPG2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 47
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<223> H-TGF(38-50)-OPG2
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> C-terminal protecting group selected from chlorotrityl and
t-butyl
<400> 48
Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Generic
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(1)
<223> C1-C3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> (X)7, where each X is independently a natural or unnatural amino
acid
<220>
<221> DISULFID
<222> (3)..(3)
<223> C2-C4
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> (X)4-5, where each X is independently a natural or unnatural
amino acid
<220>
<221> DISULFID
<222> (5)..(5)
<223> C1-C3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> (X)10-13, where each X is independently a natural or unnatural
amino acid
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> C2-C4
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> (X), where each X is independently a natural or unnatural amino
acid
<220>
<221> DISULFID
<222> (9)..(9)
<223> C5-C6
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> (X)8, where each X is independently a natural or unnatural amino
acid
<220>
<221> DISULFID
<222> (11)..(11)
<223> C5-C6
<400> 49
Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys
1 5 10
<210> 50
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-TGF(1-50)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> side chain protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> side chain protecting group
<400> 50
Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys
1 5 10 15
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys
20 25 30
Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
35 40 45
Leu Ala
50
<210> 51
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-TGF(1-50)-OH
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Psi-Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Boc protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(34)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (38)..(38)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> Pbf protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> tBu protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> Trt protecting group
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> tBu protecting group
<400> 51
Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys
1 5 10 15
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys
20 25 30
Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
35 40 45
Leu Ala
50
Claims (51)
- 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 상피 성장 인자-유사 펩타이드 (EGF-유사 펩타이드)의 제조 방법으로서,
C1(X)7C2(X)4 - 5C3(X)10 - 13C4(X)C5(X)8C6 [ 서열번호 49]
상기 서열번호 49에서,
C1-C6는 각각 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비-천연 아미노산이고,
상기 EGF-유사 펩타이드는 분자내 이황화 결합을 3개 포함하고,
상기 방법은 하기 단계를 포함하는, 방법:
(I) N-말단 아미노산이 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 보호기 PG1에 의해 보호된, 제1 펩타이드 단편을 제조하는 단계;
(II) C-말단 아미노산이 트리틸, 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기 PG2에 의해 보호된, 제2 펩타이드 단편을 제조하는 단계로서,
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 아미노산 측쇄들은 선택적으로 보호된, 단계;
(III) 제1 펩타이드 단편의 C-말단 아미노산을 제2 펩타이드 단편의 N-말단 아미노산과 용액 중에 커플링하여, 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드를 생성하는 단계;
(IV)(a)
(i) 단계 (III)에서 생성된 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 요오드를 처리하여, 산화된 혼합물을 생성하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(a)(i)에서 수득한 산화된 혼합물에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리해 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(iii) 단계 (IV)(a)(ii)에서 수득한 탈보호된 산화된 혼합물에 DMSO/DTT를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 또는
(IV)(b)
(i) 단계 (III)에서 수득한 선형의 보호된 EGF-유사 펩타이드에 트리플루오로아세트산 (TFA)을 처리하여 전체적으로 탈보호화를 수행하는 단계;
(ii) 단계 (IV)(b)(i)에서 수득한 탈보호된 혼합물에 DMSO를 처리하여, EGF-유사 펩타이드 조산물을 생성하는 단계; 및
(V) 선택적으로, EGF-유사 펩타이드 조산물을 정제하는 단계. - 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 단편이 펩타이드 세부-단편 2 이상을 커플링함으로써 제조되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 단편이 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 단편이 펩타이드 세부-단편 2 이상을 커플링함으로써 제조되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 단편이 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 EGF 또는 이의 유사체 또는 변이체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 뮤라인 EGF, 또는 이의 유사체 또는 변이체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 인간 EGF, 또는 이의 유사체 또는 변이체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드의 C-말단 아미노산이 글리신인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 1의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
상기 방법이
서열번호 2의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 3의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 펩타이드와 커플링하는 단계를 포함하고:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-OH [서열번호 2]
상기 서열번호 2에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 3]
상기 서열번호 3에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기임,
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상이 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된, 방법. - 제10항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 9의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-OH [서열번호 9],
상기 제1 펩타이드 단편이 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-OH [서열번호 10],
상기 제2 펩타이드 단편이 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 11],
서열에서, 각각의 P가 동일하거나 상이할 수 있는 측쇄 보호기인, 방법. - 제10항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-OH [서열번호 12];
상기 제1 펩타이드 단편이 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-OH [서열번호 13];
상기 제2 펩타이드 단편이 하기 서열 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법:
H-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 14]. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 서열 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-OH [서열번호 10] 또는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-OH [서열번호 13]을 포함하는 제1 펩타이드 단편이 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-OH [서열번호 15]를 포함하는 제1 펩타이드 단편이 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 20]와 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-O-PG2 [서열번호 17]의 단편 축합 후 보호기 PG2를 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 서열 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-OH [서열번호 13]를 포함하는 제1 펩타이드 단편이 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 18]와 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-O-PG2 [서열번호 19]를 단편 축합한 다음 보호기 PG2를 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 서열 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 20] 또는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt) -Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 21]를 포함하는 제1 펩타이드 단편이 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 서열 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-O-PG2 [서열번호 17] 또는 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-O-PG2 [서열번호 19]를 포함하는 펩타이드 단편이 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 H-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 11]를 포함하는 제2 펩타이드 단편이 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 22]와 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 서열 H-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 14]를 포함하는 제2 펩타이드 단편이 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 24]와 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 서열 H-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 11]를 포함하는 제2 펩타이드 단편이 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 26]와 H-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 27]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 서열 H-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 14]를 포함하는 제2 펩타이드 단편이 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39--OH [서열번호 28]와 H-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 29]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제18항에 있어서, 서열 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23]를 포함하는 펩타이드 단편이 PG1-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 30]와 H-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 27]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제19항에 있어서, 서열 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]를 포함하는 펩타이드 단편이 PG1-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 31]와 H-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 29]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 펩타이드 단편 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 22] 또는 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 24]가 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 펩타이드 단편 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23] 또는 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]가 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 펩타이드 단편 PG1-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-OH [서열번호 26] 또는 PG1-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39 --OH [서열번호 28]가 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 펩타이드 단편 H-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 27] 또는 H-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 29]가 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)를 이용한 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 11의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1],
상기 방법이
서열번호 4의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 5의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 펩타이드와 커플링하는 단계를 포함하고:
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-OH [서열번호 4]
상기 서열번호 4에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 5]
상기 서열번호 5에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상이 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된, 방법. - 제28항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 9의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-OH [서열번호 9],
상기 제1 펩타이드 단편이 서열번호 34의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [서열번호 34];
상기 제2 펩타이드 단편이 서열번호 32의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 32];
각각의 P가 동일하거나 상이할 수 있는 측쇄 보호기인, 방법. - 제28항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 12의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-OH [서열번호 12];
상기 제1 펩타이드 단편이 서열번호 18의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 18],
상기 제2 펩타이드 단편이 서열번호 33의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법:
H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 33]. - 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 단편 PG1-Asn1(P)-Ser2(P)-Asp3(P)-ΨSer4-Glu5(P)-Cys6(P)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(P)-Asp11(P)-Gly12-OH [ 서열번 호 34] 또는 PG1-Asn1(Trt)-Ser2(tBu)-Asp3(tBu)-ΨSer4-Glu5(tBu)-Cys6(Trt)-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10(Trt)-Asp11(tBu)-Gly12-OH [서열번호 18]가 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 단편 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 32] 또는 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 33]가 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 단편 H-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 32]가 PG1-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 35]와 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 제2 펩타이드 단편 또는 H-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 33]가 PG1-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 36]와 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 펩타이드 단편 PG1-Tyr13(P)-Cys14(P)-Leu15-His16(P)-Asp17(P)-Gly18-Val19-Cys20(P)-Met21-Tyr22(P)-Ile23-Glu24(P)-Ala25-Leu26-Asp27(P)-Lys28(P)-Tyr29(P)-Ala30-Cys31(P)-Asn32(P)-Cys33(P)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 35] 또는 PG1-Tyr13(tBu)-Cys14(Trt)-Leu15-His16(Trt)-Asp17(tBu)-Gly18-Val19-Cys20(Trt)-Met21-Tyr22(tBu)-Ile23-Glu24(tBu)-Ala25-Leu26-Asp27(tBu)-Lys28(Boc)-Tyr29(tBu)-Ala30-Cys31(Trt)-Asn32(Trt)-Cys33(Trt)-Val34-Val35-Gly36-OH [서열번호 36]가 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 펩타이드 단편 H-Tyr37(P)-Ile38-Gly39-Glu40(P)-Arg41(P)-Cys42(P)-Gln43(P)-Tyr44(P)-Arg45(P)-Asp46(P)-Leu47-Lys48(P)-Trp49(P)-Trp50(P)-Glu51(P)-Leu52-Arg53(P)-O-PG2 [서열번호 23] 또는 H-Tyr37(tBu)-Ile38-Gly39-Glu(tBu)40-Arg41(Pbf)-Cys42(Trt)-Gln43(Trt)-Tyr44(tBu)-Arg45(Pbf)-Asp46(tBu)-Leu47-Lys48(Boc)-Trp49(Boc)-Trp50(Boc)-Glu51(tBu)-Leu52-Arg53(Pbf)-O-PG2 [서열번호 25]가 Fmoc-Arg(P) 또는 Fmoc-Arg(Pbf)로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 형질전환 성장인자-α (TGF-α), 또는 이의 유사체 또는 변이체인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 인간 형질전환 성장인자-α (hTGF-α), 또는 이의 유사체 또는 변이체인, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 6의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 6];
상기 방법이 서열번호 7의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 8의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 펩타이드와 커플링하는 단계를 포함하고:
PG1-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-OH [서열번호 7]
상기 서열번호 7에서,
PG1은 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 8]
상기 서열번호 8에서, PG2는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상이 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된, 방법. - 제37항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 50의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Val1-Val2-Ser3(P)-His4(P)-Phe5-Asn6(P)-Asp7(P)-Cys8(P)-Pro9-Asp10(P)-ΨSer11-His12(P)-Thr13(P)-Gln14(P)-Phe15-Cys16(P)-Phe17-His18(P)-Gly19-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 50]
상기 제1 펩타이드 단편이 서열번호 38의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
PG1-Val1-Val2-Ser3(P)-His4(P)-Phe5-Asn6(P)-Asp7(P)-Cys8(P)-Pro9-Asp10(P)-ΨSer11-His12(P)-Thr13(P)-Gln14(P)-Phe15-Cys16(P)-Phe17-His18(P)-Gly19-OH [서열번호 38],
상기 제2 펩타이드 단편이 서열번호 39의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 39],
각각의 P가 동일하거나 또는 상이할 수 있는 측쇄 보호기인, 방법, - 제37항에 있어서, 상기 EGF-유사 펩타이드가 서열번호 51의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
H-Val1-Val2-Ser3(tBu)-His4(Trt)-Phe5-Asn6(Trt)-Asp7(tBu)-Cys8(Trt)-Pro9-Asp10(tBu)-ΨSer11-His12(Trt)-Thr13(tBu)-Gln14(Trt)-Phe15-Cys16(Trt)-Phe17-His18(Trt)-Gly19-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 51],
상기 제1 펩타이드 단편이 서열번호 41의 서열 또는 이의 변이체를 포함하고:
PG1-Val1-Val2-Ser3(tBu)-His4(Trt)-Phe5-Asn6(Trt)-Asp7(tBu)-Cys8(Trt)-Pro9-Asp10(tBu)-ΨSer11-His12(Trt)-Thr13(tBu)-Gln14(Trt)-Phe15-Cys16(Trt)-Phe17-His18(Trt)-Gly19-OH [서열번호 41],
상기 제2 펩타이드 단편이 서열번호 42의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는, 방법:
H-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 42]. - 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 단편 PG1-Val1-Val2-Ser3(P)-His4(P)-Phe5-Asn6(P)-Asp7(P)-Cys8(P)-Pro9-Asp10(P)-ΨSer11-His12(P)-Thr13(P)-Gln14(P)-Phe15-Cys16(P)-Phe17-His18(P)-Gly19-OH [서열번호 38] 또는 PG1-Val1-Val2-Ser3(tBu)-His4(Trt)-Phe5-Asn6(Trt)-Asp7(tBu)-Cys8(Trt)-Pro9-Asp10(tBu)-ΨSer11-His12(Trt)-Thr13(tBu)-Gln14(Trt)-Phe15-Cys16(Trt)-Phe17-His18(Trt)-Gly19-OH [서열번호 41]가 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제40항에 있어서, 서열 H-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 39]를 포함하는 제2 펩타이드 단편이 PG1-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-OH [서열번호 43]와 H-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 44]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제41항에 있어서, 서열 H-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 45]를 포함하는 제2 펩타이드 단편이 PG1-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-OH [서열번호 46]와 H-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 47]의 단편 축합 후 보호기 PG1을 제거함으로써 제조되는, 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 펩타이드 단편 H-Tyr38(P)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(P)-Cys43(P)-Glu44(P)-His45(P)-Ala46-Asp47(P)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 48] 또는 H-Tyr38(tBu)-Val39-Gly40-Ala41-Arg42(Pbf)-Cys43(Trt)-Glu44(tBu)-His45(Trt)-Ala46-Asp47(tBu)-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 47]이 Fmoc-Ala-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 펩타이드 단편 PG1-Thr20(P)-Cys21(P)-Arg22(P)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(P)-Asp28(P)-Lys29(P)-Pro30-Ala31-Cys32(P)-Val33-Cys34(P)-His35-Ser36(P)-Gly37-OH [서열번호 43] 또는 PG1-Thr20(tBu)-Cys21(Trt)-Arg22(Pbf)-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27(tBu)-Asp28(tBu)-Lys29(Boc)-Pro30-Ala31-Cys32(Trt)-Val33-Cys34(Trt)-His35-Ser36(tBu)-Gly37-OH [서열번호 46]가 Fmoc-Gly-OH로부터 시작해 고상 펩타이드 합성에 의해 제조되는, 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, PG2가 클로로트리틸인, 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, PG1이 Boc인, 방법.
- 서열번호 1의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 EGF-유사 펩타이드의 제조 방법으로서,
상기 방법이 서열번호 2의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 3의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함하고:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-OH [서열번호 2]
상기 서열번호 2에서,
PG1은 N-말단 보호기이고, 바람직하게는 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 3]
상기 서열번호 3에서, PG2는 보호기이고, 바람직하게는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상이 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된, 방법. - 서열번호 1의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 EGF-유사 펩타이드의 제조 방법으로서,
상기 방법이 서열번호 4의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 5의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함하고:
H-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-Ser9-His10-Asp11-Gly12-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-OH [서열번호 1]
PG1-Asn1-Ser2-Asp3-Ser4-Glu5-Cys6-Pro7-Leu8-ΨSer9-His10-Asp11-Gly12-OH [서열번호 4]
상기 서열번호 4에서,
PG1은 N-말단 보호기, 바람직하게는 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Tyr13-Cys14-Leu15-His16-Asp17-Gly18-Val19-Cys20-Met21-Tyr22-Ile23-Glu24-Ala25-Leu26-Asp27-Lys28-Tyr29-Ala30-Cys31-Asn32-Cys33-Val34-Val35-Gly36-Tyr37-Ile38-Gly39-Glu40-Arg41-Cys42-Gln43-Tyr44-Arg45-Asp46-Leu47-Lys48-Trp49-Trp50-Glu51-Leu52-Arg53-O-PG2 [서열번호 5]
상기 서열번호 5에서, PG2는 보호기이고, 바람직하게는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상이 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된, 방법. - 서열번호 6의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 EGF-유사 펩타이드의 제조 방법으로서,
상기 방법이 서열번호 7의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 펩타이드 단편을 용액에서 서열번호 8의 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 펩타이드와 커플링하는 단계; 및 선택적으로, 보호기 PG1 및 PG2를 제거하는 단계를 포함하고:
H-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-OH [서열번호 6]
PG1-Val1-Val2-Ser3-His4-Phe5-Asn6-Asp7-Cys8-Pro9-Asp10-Ser11-His12-Thr13-Gln14-Phe15-Cys16-Phe17-His18-Gly19-OH [서열번호 7]
상기 서열번호 7에서,
PG1은 N-말단 보호기, 바람직하게는 Boc 및 Fmoc로부터 선택되는 N-말단 보호기이고;
C-말단 아미노산은 선택적으로 활성화된 카르복시산 유도체의 형태이고,
H-Thr20-Cys21-Arg22-Phe23-Leu24-Val25-Gln26-Glu27-Asp28-Lys29-Pro30-Ala31-Cys32-Val33-Cys34-His35-Ser36-Gly37-Tyr38-Val39-Gly40-Ala41-Arg42-Cys43-Glu44-His45-Ala46-Asp47-Leu48-Leu49-Ala50-O-PG2 [서열번호 8]
상기 서열번호 8에서, PG2는 보호기이고, 바람직하게는 클로로트리틸 및 t-부틸로부터 선택되는 보호기이고;
상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편에서 아미노산 잔기 하나 이상이 선택적으로 보호되고, 바람직하게는 산-절단성 보호기로 보호된, 방법.
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