CN109700741A

CN109700741A - 一种柿子单宁复合材料及其在抗电离辐射中的应用

Info

Publication number: CN109700741A
Application number: CN201910167469.7A
Authority: CN
Inventors: 王仲民; 宁金良; 李桂银; 高明敏; 周治德; 杨成贤
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-03-06
Also published as: CN109700741B

Abstract

一种柿子单宁复合材料的制备方法，柿子单宁：0‑乙酰基：壳聚糖：透明质酸的质量比（0.5‑2）：（0.5‑2）：1：1。将该材料作为抗电离辐射应用时，在细胞培养基中添加柿子单宁复合材料粉末制成混合培养基，在X射线辐射L02细胞后，经CCK‑8检测法检测细胞活性，接受复合材料预处理的细胞活性增长量最大可达到35.354%。抗电离辐射性能效果好，仅需200μg/ml即可获得显著的防护效果；制成的柿子单宁复合材料稳定利于储存，材料有效成分对人体无害，副作用低，可以作为保健品、药品、化妆品的功效原料。

Description

一种柿子单宁复合材料及其在抗电离辐射中的应用

技术领域

本发明涉及生物功能材料领域，具体是一种柿子单宁复合材料的制备方法及该材料在防辐射领域中的应用。

背景技术

电离辐射存在于人类生活中，最常见的天然辐射来源于太阳，宇宙射线和在地壳中存在的放射性核素。除了天然辐射还有人造辐射，人造辐射广泛用于医疗、工业、通讯、电力等领域，例如医学及影响设备、核电站、手机、电脑等均存在电离辐射。电离辐射对人体危害巨大，已经严重威胁了人类的健康，目前市场上大多数的抗电离辐射产品普遍存在副作用大、稳定性差、效果不明显、成本高等问题，因此，研发新的效果更好、成本更低、副作用小的抗电离辐射产品对人类健康发展有着重大意义。

柿子是一种营养价值很高的的水果，含有丰富的单宁、蔗糖、蛋白质，以及胡萝卜素、维生素C、钙、铁等人体必需的维生素、微量元素。中国柿子产量世界第一，柿子成长过程中为了保证柿子成熟，需摘除部分青涩柿子，如果将这部分青柿子用来提取柿子单宁并应用于抗辐射行业，将大大提升柿子产业的经济效益，也为抗辐射行业提供了一种高效廉价的材料。

芦荟营养价值很高，含有丰富的蒽醌类化合物、氨基酸、维生素、多糖类化合物，各种酶和矿物质，具有杀菌消炎、增强免疫功能、清除内毒素和自由基的作用，能解除便秘、预防结肠炎，改善血液循环，祛痘养颜,增进全身健康，常用于化妆品、医药保健品等。芦荟多糖是芦荟的主要成分，特别是乙酰化甘露聚糖可提高人体的免疫力，显著减轻癌症、艾滋病症状和减少感染。

壳聚糖是一种源于虾蟹壳中的丰富的天然生物材料，无毒、可降解、生物相容性好，具有抑菌、抗氧化、促进凝血和伤口愈合等作用；此外，壳聚糖具有一定的亲水性，可在偏酸性水溶液条件下形成凝胶，利用这一特性，将药物与壳聚糖制备成合成物，可以阻止药物的过速扩散和溶出，提高了药物的稳定性和活性，还可通过上皮层增强对亲水物质的吸收能力。透明质酸是一种酸性粘多糖，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿型最好的物质，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂，与其他营养成分配合使用，可以起到促进营养吸收的更理想效果。此外通明质酸还有加速伤口愈合、恢复皮肤生理功能的作用。

公开号为CN104491241A的发明专利申请，采用柿子单宁、芦荟粉末、金银花提取物、枸杞提取物、茶多酚、甘油、医用凡士林混合组成抗电离辐射复方膏剂，但是该技术还存在以下技术问题：1、该复方膏剂合成方法仅为简单搅拌混合，有效成分稳定性差，不能保证各活性成分长时间保存，容易随着使用过程逐步失效，比如柿单宁、茶多酚在空气中容易氧化；2、该复方膏剂使用凡士林对于人体皮肤而言会堵塞毛孔，且有拒水性；凡士林等石油脂制品厚重的质地难以清洗，容易引起粉刺等皮肤问题。为了避免以上的技术问题，本专利选择了壳聚糖、透明质酸与柿子单宁、芦荟交联合成柿子单宁复合材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗电离辐射效果明显的、质量稳定的柿子单宁复合材料，该复合材料可以作为保健品、药品、化妆品的功效原料。为了解决该技术问题，本发明采取的技术方案是：将柿子粉与原色全叶芦荟冷冻干燥粉、壳聚糖粉末、透明质酸粉末通过交联复合制成复合材料，并对该材料进行抗电离辐射性能测试。具体步骤如下：

一种柿子单宁复合材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1）柿子粉内柿单宁含量测定，用福林酚法测定；

利用福林酚法，在碱性条件下，酚类物质与铜结合生成复合物，福林酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被酚还原，形成钼蓝和钨蓝的混合物，产生深蓝色。在一定条件下，蓝色深度与酚类物质的含量成正比。

用福林酚法，结合紫外分光光度计所测得的没食子酸标准曲线，将所用的柿子粉中的柿子单宁含量进行测定，检测结果为柿子单宁含量占柿子粉的20-25.0%；

步骤2）原色全叶芦荟冷冻干燥粉内的0-乙酰基含量测定，用分光光度法；

用分光光度法，结合紫外分光光度计所测得的氯化乙酰胆碱标准曲线，将所用的原色全叶芦荟冷冻干燥粉中的0-乙酰基含量进行测定，检测结果为0-乙酰基含量占芦荟粉的0.5%-0.7%。

壳聚糖和透明质酸粉末均为购买成品，优选壳聚糖有效成分为90%，透明质酸为95%。

步骤3）柿子单宁复合材料粉末的制备：

按柿子粉、原色全叶芦荟冷冻干燥粉、壳聚糖和透明质酸内的有效成分比例，柿子单宁：0-乙酰基：壳聚糖：透明质酸的质量比为（0.5-2）：（0.5-2）：1：1，将相应量的柿子粉、芦荟冷冻干粉、壳聚糖粉、透明质酸粉和交联剂戊二醛进行混合，将四种原料和交联剂加入去离子水中，加热至25-30℃并搅拌2-3h，待四种材料交联反应混合充分后，静置2-4h；在抽滤后，在50-60 ℃条件下真空干燥4-6h；烘干后将样品研磨粉碎，即可制得柿子单宁复合材料粉末。

柿子单宁复合材料粉末作为抗电离辐射的应用；

柿子单宁复合材料粉末抗电离辐射实验，采用CCK-8检测法检测细胞活性，

原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐），它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。使用多功能酶标仪在490nm波长处测定OD值，可间接反映活细胞数量。

L02细胞为人体正常人肝细胞，对X射线电离辐射敏感，因此选用L02人肝细胞作为研究对象，将柿子单宁复合材料作为受试材料，通过CCK-8检测法检测细胞活力来验证柿子单宁复合材料对电离辐射损伤的保护作用，实验表明，随着辐射剂量的增大，细胞的活性逐渐降低，通过CCK-8检测法检测细胞活性可知，经过柿子单宁复合材料预处理过的细胞，辐射后的活性显著升高，而且在辐射剂量为8Gy、细胞辐射后培养12 h、柿子单宁复合材料的浓度为200ug/ ml时，相比于未用复合材料预处理的细胞，细胞活性增量最大，复合材料具有最明显的抗辐射作用。

优选方案按柿子单宁、芦荟0-乙酰基、壳聚糖及透明质酸质量比为2：1：1：1合成材料，在辐射剂量为8Gy时，仅需200μg/ml的材料浓度就可达到最佳的抗电离辐射效果，正常人肝细胞L02的凋亡率下降到最低，存活率可以达到78.715%，而且与现有专利技术CN104491241A中复方膏剂相比，辐射剂量为20Gy时，经过本发明专利中柿子单宁复合材料预处理的细胞活性大部分维持在前者的两倍左右，抗电离辐射性能比前者多了一倍，抗电离辐射性能显著。壳聚糖具有缓释效果的特性可大大保持其它三种有效成分的活性，使材料的有效成分更容易被有效利用，透明质酸可促进人体对其他有效成分的吸收，四种有效成分配合协作，大大增强了柿子单宁抗电离辐射的效果，且四种有效成分对人体无害，副作用小，可以作为保健品、药品、化妆品的功效原料。

本发明具有下列优点和特性：

（1）抗电离辐射效果好且稳定。按柿子单宁、芦荟0-乙酰基、壳聚糖及透明质酸质量比为2：1：1：1合成材料，在辐射剂量为8Gy时，仅需200μg/ml的材料浓度就可达到最佳的抗电离辐射效果，正常人肝细胞L02的凋亡率下降到最低，存活率可以达到71.715%，而且与现有专利技术CN104491241A中复方膏剂相比，辐射剂量为20Gy时，经过本发明专利中柿子单宁复合材料预处理的细胞活性大部分维持在前者的两倍左右，抗电离辐射性能比前者多了一倍，抗电离辐射性能显著。与辐射后培养12h的细胞活性值相比，培养24h后的细胞活性值下降最大值不超过20%，效果稳定。

（2）现有专利技术CN104491241A中复方膏剂柿单宁浓度需要2mg/ml才能达到最佳抗电离辐射效果，本发明专利中的柿子单宁复合材料仅需200μg/ml就可达到最佳抗电离辐射效果，浓度仅为前者的十分之一，抗电离辐射效果更加显著。

（3）操作简单，原材料资源丰富，合成复合材料所用的柿子单宁提取自柿子生长过程中废弃的青柿子，芦荟冷冻干燥粉、壳聚糖、透明质酸都是市场常见且价格低廉的原材料；因此，本发明专利作为保健品等产品的功效原料可大大降低产品的成本。

具体实施方式

本发明通过实施例，对本发明内容作进一步说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

步骤1）柿子粉内柿单宁含量测定：将柿子粉烘干后，筛选去除大颗粒杂质，然后用福林酚法测定柿子粉内柿单宁含量；

实验步骤：准确量取1000μg/mL的没食子酸标准溶液0 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0ml、5.0 ml于100 mL容量瓶中，定容到刻度制成没食子酸工作液，取0.1g柿子粉加入100ml容量瓶中，定容到刻度，吸取2.5ml母液定容至50ml容量瓶中制成测试液待用，取没食子酸工作液和柿子粉测试液各1ml于刻度试管内，每个试管加入5ml福林酚试剂，摇匀，静止5min，再加浓度为100mg/mL Na₂CO₃溶液2.5mL，避光显色4小时，取出.用紫外分光光度计(TU-1901)在765nm处测吸光度，吸光度测三次去平均值，取得标准曲线：y=0.0119x+0.0033(R²=0.9996)，表明没食子酸在0-50ug/ml范围内吸光度与浓度之间存在良好的线性关系，经检测，所用柿子粉中柿子单宁含量为25.0%；

步骤2）原色全叶芦荟冷冻干燥粉内的0-乙酰基含量测定：将芦荟冷冻干燥粉烘干后，筛选去除大颗粒杂质，利用分光光度法对芦荟冻干燥分中的0-乙酰基含量进行测定；

具体步骤：制备3.5mol/L 氢氧化钠溶液；2mol/L 盐酸羟胺溶液（冷藏）；4mol/L 盐酸溶液；0.1mol/L 盐酸溶液；0.001 mol/L 醋酸钠溶液；取六水三氯化铁10.0g，加制备好的0.1 mol/L 盐酸溶液定容至100 ml，制备成0.37 mol/L FeCl₃-HCl 溶液；取2 mol/L 盐酸羟胺溶液25 mL与等体积的3.5 mol/L的氢氧化钠溶液混匀制备成碱性羟胺溶液（3h内使用），精确量取氯化乙酰胆碱标准溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml，分别置于试管中，均补蒸馏水至1ml，摇匀，分别加入2ml 碱性羟胺溶液，摇匀并静置6min，然后分别加1ml 4 mol/L 盐酸溶液，摇匀，再分别加入1ml 0.37 mol/L FeCl₃-HCl溶液，摇匀；同时做标准空白对照，即作与上列相同的标准管，先加1mL 4 mol/L盐酸溶液，然后加2ml碱性羟胺溶液，其余步骤与上相同；在550nm 波长处分别测定吸光度，取得标准曲线：y=2.3127x+0.0087（R²=0.9983），在0.010 mg/mL～0.750 mg/ ml 内线性关系好，经检测，芦荟冷冻干燥粉中的0-乙酰基含量为0.5%-0.7%；结合所测得的氯化乙酰胆碱标准曲线，将所用的原色全叶芦荟冷冻干燥粉中的0-乙酰基含量进行测定，检测结果为0-乙酰基含量占芦荟粉的0.60%；

步骤3）柿子单宁复合粉末的制备，按柿子粉中的柿子单宁、原色全叶芦荟冷冻干燥粉中的0-乙酰基、壳聚糖和透明质酸的质量比为1：1：1：1计，将相应量已前处理过的柿子粉40mg、芦荟冷冻干粉1.667g、壳聚糖粉11mg和透明质酸粉10.5mg混合于烧杯中，加入20ml戊二醛作为交联剂，加300ml去离子水加热至30℃并搅拌2h，使四种材料交联反应混合充分后静置2h，抽滤后在60 ℃真空干燥箱中干燥6h，烘干后研磨粉碎，即得到具有抗电离辐射作用的柿子单宁复合粉末。

柿子单宁芦荟粉末抗电离辐射实验，采用CCK-8检测法检测细胞活性，具体方法如下：

（1）选取对数生长期的L02细胞，制成1×10⁴个/ml的单细胞悬液，然后将细胞接种到96孔板中，每个孔加入100μl含10%胎牛血清的DMEM新鲜培养液，96孔板的边缘用无菌的PBS填充，然后置于恒温密闭的细胞培养箱中培养至细胞单层铺满孔底，培养箱控制温度：37℃，CO2含量：5%；

（2）细胞培养24h至贴壁后，倒去旧的培养液，然后加入100μl含10%新生牛血清的DMEM新鲜培养液，培养12h，使L02细胞同步化；

（3）待细胞同步化后，弃旧培养液，每孔加入90μl含l0%新生牛血清的DMEM培养液和10μl柿子单宁复合材料溶液，材料溶液组按每孔单宁的终浓度分设6个浓度亚组(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)，同时设置空白组，空白组为无细胞的培养基，每亚组设4个平行，培养24小时后，L02细胞接受不同剂量的X射线（4GY、8GY、12GY、16GY、20GY）照射，同时设置对照组，对照组不接收X射线的照射；

（4）辐射后，分别于12、24h后，将96孔培养板中的旧液弃除，用无菌的PBS溶液洗涤3次，然后每孔分别加入90μl新鲜的DMEM培养基及10μl CCK-8液继续培养3h；

（5）3h后将96孔细胞培养板置于多功能酶标仪(Victor X5)下（490nm，1S）测定各孔的吸光度(OD)值；

（6）按下列公式计算细胞活力

细胞活力结果见表1和表2。

表1. 辐射后12h不同辐射剂量与不同柿子单宁复合材料溶液浓度的细胞活性值（%）

表2. 辐射后24h不同辐射剂量与不同柿子单宁复合材料溶液浓度的细胞活性值（%）

由表1、表2可知，通过CCK-8检测法检测细胞活性，在辐射前添加不同浓度的柿子单宁复合材料都对细胞具有防护作用，当辐射剂量为8Gy、辐照后培养时间为12h、浓度为200ug/ml时效果最好，细胞活性达到65.613%，相比于未用复合材料预处理的细胞，细胞活性增长量最高。

实施例2

为了研究不同柿子单宁、0-乙酰基、壳聚糖、透明质酸的质量比对抗电离辐射性能的影响，制备了柿子单宁、0-乙酰基、壳聚糖和透明质酸的质量比为2：1：1：1柿子单宁复合材料粉末并进行抗电离辐射实验。

未特别说明的步骤与本实施例1方法相同，不同之处在于：所述步骤3）中，柿子粉中的柿子单宁、原色全叶芦荟冷冻干燥粉中的0-乙酰基、壳聚糖和透明质酸的质量比为2：1：1：1，柿子粉、芦荟冷冻干粉、壳聚糖粉和透明质酸粉的量分别为40mg，1.667g，11mg，10.5g。

柿子单宁复合粉末抗电离辐射实验，采用CCK-8检测法检测细胞活性，细胞活性结果见表3、表4。

表3. 辐射后12h不同辐射剂量与不同柿子单宁复合材料溶液浓度的细胞活性值（%）

表4. 辐射后24h不同辐射剂量与不同柿子单宁复合材料溶液浓度的细胞活性值（%）

由表3、表4可知，通过CCK-8检测法检测细胞活性，在辐射前添加不同浓度的柿子单宁复合材料都对细胞具有防护作用，当辐射剂量为8Gy、辐照后培养时间为12h、浓度为200ug/ml时效果最好，细胞活性达到了78.715%，相比于未用复合材料预处理的细胞，细胞活性增长量最高。

从实施例可以得出，用本发明的柿子单宁抗电离辐射复合材料的制备方法制备出来的柿子单宁复合材料具有优良的抗电离辐射效果。与实施例1相比，按柿子单宁、0-乙酰基、壳聚糖和透明质酸的质量比为2：1：1：1合成的柿子单宁复合材料粉末对细胞活性的保护作用比按质量比为1：1：1：1合成的柿子单宁复合材料高出13.102%，抗电离辐射效果更好。此外，柿子单宁复合材料抗辐射效果比较稳定，与辐射后培养12h的细胞活性值相比，培养24h后的细胞活性值下降最大值不超过20%。

Claims

1.一种柿子单宁复合材料，其特征在于：

按柿子粉、原色全叶芦荟冷冻干燥粉、壳聚糖和透明质酸内的有效成分比例范围：柿子单宁：0-乙酰基：壳聚糖：透明质酸的质量比（0.5-2）：（0.5-2）：1：1，称取相应原料，和交联剂戊二醛进行混合，反应制得柿子单宁复合材料。

2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：所述反应的条件为，将四种原料和交联剂加入去离子水中，加热至25-30℃并搅拌2-3h，静置；抽滤，以40-60 ℃条件下真空干燥4-6h；干燥后将样品研磨粉碎。

3.将权利要求1或2所述柿子单宁复合材料作为抗电离辐射的应用，其特征在于：在细胞培养基中添加柿子单宁复合材料粉末，制成复合材料浓度为50-800 μg/ml的混合培养基，将L02细胞分组置于50-800 μg/ml的柿单宁复合材料混合培养基中预处理培养，再以一定剂量的X射线辐射L02细胞后，每组L02细胞加入不含复合材料的新鲜培养基培养一定时间，L02细胞的活性值范围为43.361-78.715%。

4.将权利要求1或2所述柿子单宁复合材料作为抗电离辐射的应用，其特征在于：柿子单宁复合材料浓度为200μg/ml时达到最佳抗电离辐射效果，对比未用复合材料预处理的细胞活性值，经预处理的细胞活性值增长量最大可达到35.354%；柿子单宁复合材料抗辐射效果比较稳定，与辐射后培养12h的细胞活性值相比，培养24h后的细胞活性值下降最大值不超过20%。