CN105997988A - 葡萄籽中原花青素的新用途 - Google Patents

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孙萌
焦兴志
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Abstract

本发明公开了一种葡萄籽中原花青素的新用途，原花青素作为制备辐射增敏剂的用途。本发明为葡萄籽中原花青素的应用提供了可能性，为新型辐射增敏剂的开发提供了新的途径。

Description

葡萄籽中原花青素的新用途
技术领域
本发明涉及一种天然产物提取物的用途，特别涉及一种葡萄籽中原花青素的新用途。
背景技术
原花青素广泛存在于多种植物中，而葡萄籽是原花青素丰富的来源。葡萄籽原花青素(GSPs)具有广泛的用途，比如抗氧化、清除自由基、紫外辐射保护等，而关于其具备的抗肿瘤作用少有报道。少量报道称GSPs可引起细胞凋亡，影响癌细胞的浸润和转移，抑制一些酶的表达、对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族具有抑制作用(参见文献：(1)PLoS One 2011,e21539.(2)Frontiers in Bioscience-landmark 2008,13,887–897.(3)Mol.Cancer Ther.2010,9,569–580.(4)Carcinogenesis2006,27,1682–1691.(5)Neoplasia 2005,7,24–36.(6)Clinical Cancer Research 2009,15,821–831.(7)Molecular Carcinogenesis 2009,48,232–42.)，而对其具有的针对肺癌细胞的辐射增敏效应没有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡萄籽中原花青素的新用途，以拓宽GSPs的应用范围，为GSPs的应用提供更多的可能性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种葡萄籽中原花青素的新用途，原花青素作为制备辐射增敏剂的用途。作为优选，原花青素作为制备针对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏剂的用途。
作为优选，所述针对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏剂中原花青素浓度<30μg/mL。
作为优选，所述针对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏剂中原花青素浓度为12μg/mL。发明人意外发现GSPs对人类非小细胞肺癌细胞A549具有辐射增敏作用，尤其是在特定的浓度12μg/mL以及特定辐射剂量1Gy下，这为新型辐射增敏剂的开发提供了新的途径。
现有技术报道了GSPs对小鼠正常组织或者人类皮肤细胞具有紫外辐射或者γ-辐射保护作用，对癌细胞具有抑制增殖作用，本发明则提供了GSPs对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏作用，将GSPs运用于临床既具有潜在的保护正常组织的作用又能增强X射线对肺癌细胞的杀伤作用，既能降低病人的痛苦又能提高治疗效率。本发明为新型辐射增敏剂的开发提供了新的途径。该辐射增敏剂是一种新型植物源辐射增敏剂，它由GSPs为活性成分制备而成。
本发明的有益效果是：提供了葡萄籽原花青素的新用途，拓宽了葡萄籽原花青素的应用范围，为葡萄籽原花青素的应用提供更多的可能性。
附图说明
图1是原花青素标准曲线(平均值±标准差，n＝3)。
图2是GSPs清除自由基能力(平均值±标准差，n＝2)。
图3是GSPs对A549、BEAS-2B细胞增殖的影响(平均值±标准差，n＝3)。
图4辐射剂量为2Gy条件下GSPs对A549细胞存活数的影响(平均值±标准差，n＝3)。
图5辐射剂量为2Gy条件下GSPs对A549细胞存活率的影响(平均值±标准差，n＝3)。
图6是不同的剂量条件下GSPs对A549增殖的影响(平均值±标准差，n＝3)。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
本发明所用的GSPs从葡萄籽中提取的，纯度为73.3％，其提取及纯度测定过程如下：
提取过程:称取500g葡萄籽并研碎，以料液比1:10加入5L乙醇40℃超声提取2h，将过滤后的溶液减压浓缩得到葡萄籽粗提物58.4g。随后进行大孔树脂柱层析，以EtOH-H2O为洗脱剂，收集50％部分并减压浓缩即得原花青素粗样5.3g。
纯度检测：
配制不同浓度的原花青素标准溶液，测定各个浓度在546nm下的紫外吸光度，并绘制标准曲线，见图1。测定葡萄籽提取物的吸光度，根据标准曲线计算葡萄籽原花青素的含量为73.3％，见表1。表1是从葡萄籽中提取的原花青素的吸光度以及计算浓度(平均值±标准差，n＝3)。
表1 原花青素样品中原花青素的含量cx(mg/mL)
。
GSPs对X射线的辐射增敏活性测定
1.供试细胞：
人类非小细胞肺癌细胞(A549)、SV40永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为中国科学院近代物理研究所空间辐射生物实验室提供，X射线照射采用Faxitron RX-650型X-ray生物辐照系统。
2.试验方法：
2.1GSPs清除自由基实验
2.1.1DPPH自由基清除实验
取1mgDPPH溶于20mL无水乙醇中，充分溶解后测定吸光度，取1mL该溶液测定519nm下的吸光度，使其值在1.2-1.3之间，避光保存。
A0的测量：吸取500μLDPPH工作液加入1.5mL EP管中，然后加入500μL无水乙醇，充分混匀后静置30min测定519nm下的吸光度。
A1的测量：吸取500μLDPPH工作液加入1.5mL EP管中，然后加入不同浓度的无水乙醇配制的GSPs溶液，充分混匀后静置30min测定519nm下的吸光度。
2.1.2ABTS自由基清除实验
7.4mM的ABTS0.2mL与2.6mM的K2S2O80.2mL充分混合后在暗处室温反应12h，然后用无水乙醇稀释40-50倍，使混合液在734nm处的吸光度在0.68-0.72之间即为ABTS+工作液。
A0的测量：吸取500μL ABTS+工作液加入1.5mL EP管中，然后加入500μL无水乙醇，充分混匀后静置30min测定734nm下的吸光度。
A1的测量：吸取500μLABTS+工作液加入1.5mL EP管中，然后加入不同浓度的无水乙醇配制的GSPs溶液，充分混匀后静置30min测定734nm下的吸光度。
2.2MTT法检测GSPs对细胞增殖的影响
取对数生长期的细胞，调整细胞密度后接种于96孔无菌培养板中，每孔5×103个细胞，培养24h后，分别加入含有不同浓度(18.8，37.5，75，150，300μg/mL)的GSPs的RPMI1640培养基至100μL，不加药物组作为对照。每个浓度设5个平行孔(重复2次)，培养24h后每孔加入终浓度为5mg/ml的MTT溶液10μL，37℃避光作用4h，弃上清液，加入150μL DMSO，振荡10min至结晶紫完全溶解后上机检测。酶标检测仪570nm波长检测吸光度(OD)。计算细胞生长抑制率[细胞抑制率(％)＝(1-实验组OD值/空白组OD值)×100％]。最后以抑制率为纵坐标，以药物浓度(μg/mL)为横坐标，绘制生长曲线。
2.3细胞计数法检测GSPs作用后细胞对X射线的辐射敏感性
取对数生长期的细胞，调整细胞密度后接种于35mm的无菌培养皿中，培养24h后，分别加入给予不同的处理：1、加入含有不同浓度(0，10，30，120μg/mL)的GSPs的RPMI1640培养基后给予0Gy或者2Gy的辐照。2、加入12μg/mL的GSPs后给予0Gy，1Gy，2Gy，4Gy，6Gy的X射线辐照。GSPs作用24h后，更换新鲜培养基，然后给予辐照处理。每组实验设置三个平行。继续培养五天后，胰酶消化计数。
3.实验结果
3.1原花青素对DPPH和ABTS两种自由基的清除能力见图2。
由图2可知原花青素对DPPH和ABTS两种自由基具有很强的清除能力，IC50值在2μg/mL以下。
3.2MTT法检测原花青素对A549、BEAS-2B细胞的增殖作用见图3。
由图3可知，无论是高浓度还是低浓度的GSPs对肺癌细胞的抑制作用均高于正常肺细胞。其中在高浓度时(300μg/mL)GSPs对A549细胞的抑制率达到50％左右，而对正常肺细胞的增殖基本没有抑制(抑制率为20％左右)，而在低浓度18.8μg/mL时对两种细胞的抑制作用仍然是肿瘤细胞偏高(抑制率为20％左右)，对正常细胞BEAS-2B细胞基本没有抑制作用(抑制率为5％左右)，由此可见GSPs对细胞增殖的抑制作用具有比较好的选择性，即对肿瘤细胞的杀伤能力明显高于正常细胞。
3.3GSPs加入后A549细胞对X射线的辐射敏感性
由图4知，12μg/mL的GSPs对A549细胞基本没有杀伤力，30μg/mL的GSPs对细胞具有比较微弱的杀伤作用。由图6知，当辐射剂量为1Gy，GSPs的浓度为12μg/mL时，具有比较强的辐射增敏效应，增敏效率达到20％；而在浓度为12μg/mL，2Gy的剂量下具有特别微弱的增敏效果这与图5的结果基本一致。在高浓度120μg/mL下GSPs对细胞的杀伤作用大于辐射的杀伤作用，而不具备辐射增敏效果，而在6Gy的高剂量条件下细胞的死亡率明显升高，辐射致死大于药物的作用而不具备辐射增敏作用。
按照实验结果，其实能看到的实际在12μg/mL辐射剂量为1Gy时对A549细胞具有比较显著的辐射增敏作用，在30μg/mL时原花青素对A549细胞的杀伤力大于辐射对细胞的杀伤作用看不到增敏效果，2Gy时12μg/mL下具备非常微弱的增敏作用。GSPs在1-2Gy最佳剂量条件下在0-30μg/mL之间应该有最佳增敏浓度。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种葡萄籽中原花青素的新用途，其特征在于：原花青素作为制备辐射增敏剂的用途。
2.根据权利要求1所述的葡萄籽中原花青素的新用途，其特征在于：原花青素作为制备针对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏剂的用途。
3.根据权利要求2所述的葡萄籽中原花青素的新用途，其特征在于：所述针对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏剂中原花青素浓度<30μg/mL。
4.根据权利要求2所述的葡萄籽中原花青素的新用途，其特征在于：所述针对人类非小细胞肺癌细胞A549的辐射增敏剂中原花青素浓度为12μg/mL。
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