CN109668975A - 伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明名称为伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法，属于药物分析技术领域。本发明采用高效液相色谱仪‑电雾式检测器(CAD检测器)，嵌入强阴离子交换基团的十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以乙腈‑水‑三氟醋酸为流动相梯度洗脱，并对注射液进行Ag/H型前处理小柱处理，能够有效分离、测定伊班膦酸钠注射液中的有关物质。

Description

伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法，可作为伊班膦酸钠注射液质量控制的重要组成部分。

背景技术

伊班膦酸钠注射液是第三代双磷酸类药物，由瑞士罗氏公司开发，于1996年在德国首次上市，商品名为Bondronat，主要用于治疗恶性肿瘤所致高钙血症及多发性骨髓瘤和实体瘤的骨转移，并可预防和治疗骨质疏松症。与其他双磷酸盐类药物相比，伊班膦酸钠具有高效、低毒，使用方便，适应症广等优点，尤其是其肾毒性在磷酸盐类药物里最小，对肾脏安全性最高，在临床应用上具有更强的优势。

杂质水平是药品安全性和有效性的重要因素之一，因此如何准确测定伊班膦酸钠注射液相关杂质的含量则成为一个丞待解决的问题。

目前伊班膦酸钠注射液未收入药典，现有进口注册标准及国家标准，主要控制的杂质为磷酸盐与亚磷酸盐，未对其他有机杂质进行深入研究。现有技术中也仅有薄层色谱法及离子色谱法检测磷酸盐与亚磷酸盐的文献报道。采用薄层色谱法存在灵敏度不高、无法准确定量测定的缺点；离子色谱法虽然灵敏度较高，但主要用于检测离子型化合物，对有机化合物杂质的分离能力略有欠缺。

目前仅有一篇专利文献CN103134886A，采用高效液相色谱紫外检测法检测伊班磷酸钠原料药中的有关物质，但该申请中的检测方法针对的是中间体杂质I(3-N-甲基-N正戊基胺丙酸)和成品的降解产物杂质II(1-羟基-3-(N-戊胺基)-亚丙基二膦酸)，其无法对伊班膦酸钠原料药的国家药品标准中主要控制的亚磷酸和磷酸杂质进行检测。

为了有效分析药品质量，保证用药安全，需要开发出一种便捷、有效的伊班膦酸钠注射液的杂质检测方法，能同时检测磷酸、亚磷酸及其他有机杂质，并能排除辅料中氯离子的干扰。

发明内容

本发明根据原料药的结构特点、注射液的处方工艺、结合降解试验结果，对伊班膦酸钠注射液中的杂质进行了全面的分析。采用通用型电雾式检测器(CAD检测器)，嵌入强阴离子交换基团的十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以乙腈-水-三氟醋酸为流动相梯度洗脱，优化了注射液的前处理方法，建立了适用于伊班膦酸钠注射液的有关物质方法。不仅能有效实现分离杂质磷酸、亚磷酸，还能对杂质A及其他工艺杂质进行控制，该方法能排除辅料氯离子的干扰，专属性强，方便快速、准确度高，实现了伊班膦酸钠注射液中有关物质的质量控制，保证伊班膦酸钠注射液的安全性和可靠性，具有现实意义。

本发明的目的在于提供一种伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法。

本发明提供一种伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法，包括以下步骤：

1)称取杂质A、苯丙氨酸、磷酸二氢钠和亚磷酸各适量，制备对照品溶液；

2)取待检的伊班膦酸钠注射液样品，作为供试品溶液M；

3)取待检的伊班膦酸钠注射液样品，经Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合前处理小柱过滤，取续滤液，作为供试品溶液N；或者

取待检的伊班膦酸钠注射液样品，先经Ag型强酸性阳离子交换树脂前处理小柱过滤，再经H型强酸性阳离子交换树脂前处理小柱过滤，取续滤液，作为供试品溶液N；

4)采用高效液相色谱法分别对所述对照品溶液、供试品溶液M、N进行检测，其中所述高效液相色谱法的检测条件为：

仪器：高效液相色谱仪-电雾式检测器

色谱柱的固定相为嵌入强阴离子交换基团的十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相A为乙腈、水与三氟醋酸的混合溶液，其中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为0:100:0～10:90:0.3；

流动相B为乙腈：水：三氟醋酸的混合溶液；其中乙腈：水：三氟醋酸混合溶液中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为5:95:0.03～30:70:0.5；

5)采用梯度洗脱方式洗脱；

其中所述杂质A的结构式为：

本发明的上述检测方法，优选地，步骤3)中：所述Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合小柱的规格为1cc～10cc，优选1cc～2.5cc；所述Ag型强酸性阳离子交换树脂复合小柱的规格为1cc～10cc，优选1cc～2.5cc；所述H型强酸性阳离子交换树脂复合小柱的规格为1cc～10cc，优选1cc～2.5cc。

本发明的上述检测方法，一个优选的实施例中，步骤4)中所述色谱柱的固定相的长度为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm。

本发明的上述检测方法，其中，电雾式检测器的蒸发温度为25℃～50℃，优选蒸发温度为35℃；电雾式检测器的采集频率为2HZ～10HZ，优选采集频率为25HZ。

本发明的上述检测方法，一个优选的实施例中，步骤4)中：所述流动相A中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为3:97:0.02；所述流动相B中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为15:85:0.2。

优选地，所述流动相A中三氟醋酸的浓度选自体积分数为0.002％～0.1％，优选体积分数为0.02％；所述流动相B中三氟醋酸的浓度选自体积分数为0.02％～0.3％，优选0.2％。

本发明的上述检测方法，其中，步骤4)中所述色谱柱的柱温为15℃～45℃，优选25℃。

本发明的上述检测方法，其中，在梯度洗脱过程中，流动相的流速为0.4ml/min～1.5ml/min；优选流速为0.6ml/min。

本发明的上述检测方法，其中，在梯度洗脱过程中，进样体积为10μl～200μl；优选地，进样体积为100μl。

在本发明的一个优选实施例中，梯度洗脱程序为：

时间(min)	流速(ml/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0	0.6	100	0
3	0.6	100	0
				10	0.6	0	100
15	0.6	0	100
				15.5	1.0	100	0
22	1.0	100	0

结果计算：

1、供试品溶液M色谱图中仅计算磷酸峰之前的杂质，供试品溶液N色谱图中仅计算磷酸及磷酸峰之后的杂质；

2、供试品溶液M色谱图中如有杂质峰，杂质A按外标法以峰面积计算，其他单个杂质按外标法以对照品溶液中的苯丙氨酸峰面积计算；

3、供试品溶液N色谱图中如有杂质峰，磷酸按外标法以峰面积计算，亚磷酸按外标法以峰面积计算，其他单个杂质按外标法以对照品溶液中的亚磷酸峰面积计算。

本发明提供的一种伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法，有益效果如下：

(1)本发明首次采用高效液相色谱结合电雾式检测器，克服了伊班膦酸钠注射液杂质没有紫外吸收的缺点，利用嵌入强阴离子交换基团的十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，实现不同种类杂质的同时分离。

(2)本发明首次将Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合小柱用于伊班膦酸钠注射液的前处理，除去注射液中高浓度的氯离子干扰。前处理方法操作简便，容易控制，所需样品量较少，成本较低。

(3)本发明分析方法具有简便、快速、准确度高等优点，完善了伊班膦酸钠注射液有关物质检测的质量标准。

附图说明

图1为本发明Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合前处理小柱外形图；

图2为本发明专属性试验定位溶液色谱图；

图3为本发明专属性试验混合溶液色谱图；

图4为本发明准确度试验中对照品溶液色谱图；

图5为本发明准确度试验中加标供试品溶液(未处理)色谱图；

图6为本发明准确度试验中加标供试品溶液(Ag/H型小柱处理)色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，在本发明技术方案的前提下对本发明的简单改进均属于本发明的保护范围。

本发明具体实施方式中使用的注射液、设备、对照品、前处理小柱均为已知产品，注射液为本公司制备品，设备、对照品、前处理小柱通过购买市售产品获得。

主要设备来源如下：

Waters e2695型高效液相色谱仪，购自沃特世公司；

Corona Veo RS型电雾式检测器，购自ThermoFisher公司；

Coresep SB色谱柱(4.6mm×150mm，2.7μm)，购自SIELC公司。

供试品及杂质对照品的主要来源如下：

伊班膦酸钠注射液的批号为16J0021C42，来源于齐鲁制药有限公司；处方组成为：伊班膦酸钠、醋酸、醋酸钠、氯化钠、注射用水。

杂质A批号为F0K080，含量：100％，来源于USP；

苯丙氨酸批号为140676-200405，含量100％，来源于中国药品生物制品检定所；

磷酸二氢钠一水合物批号为BCBQ3265V，含量99.8％，来源于sigma公司；

亚磷酸批号为MKBS4781V，含量100.5％，来源于sigma公司；

杂质TWY批号为TWY160906s，含量99.98％，杂质TJY批号为TJY160907s，含量98.99％，杂质EJY批号为EJY161025-1s，含量100.0％，均来源于齐鲁制药有限公司。

本发明中所用对照品的化学名称及结构式分别如下：

伊班膦酸钠名称为1-羟基-3-(N-甲基-戊胺基)-亚丙基二膦酸一钠盐；

杂质A名称为3-(N-甲基正戊胺基)丙酸；

杂质TWY名称为1-羟基-3-(N-甲基-氨基)-亚丙基二膦酸；

杂质TJY名称为1-羟基-3-(N-戊胺基)-亚丙基二膦酸；

杂质EJY名称为1-羟基-3-(N,N-二甲基-氨基)-亚丙基二膦酸。

实施例1本发明的检测分析方法的方法学研究

本实施例中各种试验均采用如下条件：

仪器：Waters e2695液相色谱仪-电雾式检测器(CAD Veo RS)

色谱柱：SIELC Coresep SB色谱柱，规格为4.6mm×150mm，2.7μm

流动相A：乙腈：水：三氟醋酸(3:97:0.02)

流动相B：乙腈：水：三氟醋酸(15:85:0.2)

稀释剂：水

进样体积：100μl

柱温：25℃

检测器蒸发温度：35℃

检测器采集频率：5Hz

按下表进行线性梯度洗脱：

检测步骤：

取杂质A、苯丙氨酸、磷酸二氢钠和亚磷酸各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含杂质A、苯丙氨酸、磷酸、亚磷酸各约15μg的溶液对照品贮备液。

取杂质A、苯丙氨酸、磷酸二氢钠和亚磷酸各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含杂质A、苯丙氨酸、磷酸、亚磷酸各约3μg的对照品溶液。

取待检的伊班膦酸钠注射液样品，作为供试品溶液M。

取待检的伊班膦酸钠注射液样品，经Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合前处理小柱 (如图1所示，规格1cc)过滤，取续滤液，作为供试品溶液N。

1、系统适用性及系统精密度试验

对照品溶液：精密称取杂质A、苯丙氨酸、磷酸二氢钠和亚磷酸各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含杂质A、苯丙氨酸、磷酸、亚磷酸各约3μg的溶液，即得。

检测：精密量取对照品溶液100μl，注入液相色谱仪，结果见表1，表2。

表1系统适应性试验结果表

系统适用性指标	结果
		钠离子峰与杂质A峰的分离度	6.5
杂质A峰与苯丙氨酸峰分离度	2.0
		亚磷酸峰理论板数	55336

表2系统精密度试验结果表

结果表明：钠离子峰与杂质A峰的分离度为6.5，杂质A峰与苯丙氨酸峰的分离度为2.0，理论板数铵亚磷酸峰计为55336，系统适用性符合规定。杂质A、苯丙氨酸、磷酸和亚磷酸的峰面积RSD均小于10.0％，保留时间RSD均小于1.0％，系统精密度符合要求。

2、专属性试验

称取氯化钠18.02g、醋酸钠0.81g、醋酸2.15g，加水2000ml混匀，作为空白辅料溶液。取伊班膦酸钠的各杂质对照品杂质A、杂质EJY、杂质TJY、杂质TWY、苯丙氨酸、磷酸、亚磷酸品各适量，置不同的容量瓶中，分别用水溶解并稀释制成每1ml中约含0.01mg 的定位溶液，作为各杂质定位溶液。取本品，作为供试品溶液。称取伊班膦酸钠对照品适量，置100ml量瓶中，分别加入上述杂质定位溶液，加水溶解并稀释至刻度，作为专属性混合溶液。分别取上述溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，专属性试验定位溶液色谱图如图2所示，专属性试验混合溶液色谱图如图3所示。保留时间及分离度结果见表3、表4。

表3专属性试验单针定位结果

溶液	杂质名称	保留时间(min)
			空白辅料	辅料峰(钠离子)	2.325
杂质A定位溶液	杂质A	3.559
			苯丙氨酸定位溶液	苯丙氨酸	4.059
磷酸定位溶液	磷酸	10.110
			*杂质TWY定位溶液	杂质TWY	10.312
*杂质EJY定位溶液	杂质EJY	11.166
			亚磷酸定位溶液	亚磷酸	12.149
*杂质TJY定位溶液	杂质TJY	12.807
			伊班膦酸钠溶液	伊班膦酸	13.491

*注：杂质TWY、杂质EJY、杂质TJY为原料药工艺杂质。

表4专属性试验混合溶液结果

结果表明：辅料对样品测试无干扰，各杂质与主峰分离度均大于1.5。

3、定量限

以水为空白溶剂，精密量取第1项下对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为定量限溶液。分别精密量取水、定量限溶液，注入液相色谱仪，结果见表5。

表5定量限结果

名称	浓度(μg/ml)	定量限S/N	定量限(％)
				杂质A	0.7527	18	0.08
苯丙氨酸	0.9065	59	0.09
				磷酸	0.9252	31	0.09
亚磷酸	0.9627	92	0.10

结果表明：杂质A、苯丙氨酸、磷酸、亚磷酸的定量限S/N均大于10，均符合定量限要求。

4、线性和范围

精密称取杂质A、苯丙氨酸、磷酸二氢钠和亚磷酸各适量，加水溶解并稀释制成每1ml 中约含杂质A、苯丙氨酸、磷酸、亚磷酸各约15μg的溶液，作为对照品贮备液。

分别精密量取线性贮备液1ml、15ml、2ml、3ml、10ml，置于10ml、100ml、10ml、10ml、25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为50％、75％、100％、150％、200％线性溶液。分别精密量取线性溶液及定量限溶液各100μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表6。

表6线性试验结果

结果表明：杂质A测定浓度在0.7527μg/ml～5.0179μg/ml的范围内呈线性，线性方程为y＝17830743x+589705，相关系数为0.9994(n＝6)；苯丙氨酸测定浓度在0.9065μg/ml～6.0432μg/ml的范围内呈线性，线性方程为y＝12298348x+4640538，相关系数为0.9960(n＝6)；磷酸测定浓度在0.9252μg/ml～6.1680μg/ml的范围内呈线性，线性方程为 y＝18774525x-10971452，相关系数为0.9984(n＝6)；亚磷酸测定浓度在0.9269μg/ml ～6.1792μg/ml的范围内呈线性，线性方程为y＝20034041x-6710378，相关系数为0.9979 (n＝6)。

5、方法精密度

对照品溶液同第1项下；取本品各6份，作为供试品溶液M；

取本品6份，各约4ml，经Ag-H型前处理小柱串联0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液2ml，取续滤液，作为供试品溶液N。按照本发明的检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算有关物质，结果见表7。

表7方法精密度结果

由上述结果可知，本发明检测方法的精密度良好。

6、准确度

分别精密量取试验例第5项下的对照品贮备液1ml、2ml、3ml各三份，分别置10ml量瓶中，加注射用定容至刻度，摇匀，分别作为杂质A与苯丙氨酸回收率供试品溶液。分别精密量取9份回收率供试品溶液剂试验例第1项下的对照品溶液各100μl进样测定，记录色谱图，其中，准确度试验中对照品溶液色谱图如图4所示，准确度试验中加标供试品溶液(未处理)色谱图如图5所示，准确度试验中加标供试品溶液(Ag/H型小柱处理)色谱图如图6所示。计算杂质A与苯丙氨酸的回收率，结果见表8～表9。

表8准确度结果(杂质A)

表9准确度结果(苯丙氨酸)

分别精密量取试验例第6项下的对照品贮备液1ml、2ml、3ml各三份，分别置10ml量瓶中，加注射用定容至刻度，摇匀。取4ml，经Ag-H型前处理小柱串联0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液2ml，取续滤液，分别作为磷酸与亚磷酸的回收率供试品溶液。分别精密量取9份回收率供试品溶液剂试验例第1项下的对照品溶液各100μl进样测定，记录色谱图，计算磷酸与亚磷酸的回收率，结果见表10～表11。

表10准确度结果(磷酸)

表11准确度结果(亚磷酸)

图4为本发明检测条件下对照品溶液色谱图

图5为本发明检测条件下加标供试品溶液(未处理)色谱图

图6为本发明检测条件下加标供试品溶液(Ag/H型小柱处理)色谱图

结果表明：杂质A、苯丙氨酸、磷酸与亚磷酸的回收率范围均为80％～130％之间，符合准确度要求。

7、溶液稳定性

取本品作为供试品溶液。分别于0、2、4、8、12、18、24、30小时，精密量取100μl 进样检测，记录色谱图，试验结果见表12。

表12供试品溶液(未处理)稳定性结果表

注：N.D.表示未检测到。

取样品溶液4ml，经Ag-H型前处理小柱串联0.22μm滤膜过滤，弃去初滤液2ml，取续滤液，作为供试品溶液。分别于0、2、5、12、22、26、30小时，精密量取100μl进样检测，记录色谱图，试验结果见表13。

表13供试品溶液(处理后)稳定性结果表

注：N.D.表示未检测到。

结果表明：供试品溶液(处理后)在室温条件下，各已知杂质及未知杂质含量均在0.05％以下，无新杂质产生，放置在30小时内稳定。供试品溶液(未处理)在室温下放置在30小时，各杂质均未检测到，无新杂质产生，放置在30小时内稳定。

综上所述，本发明提供了一种伊班膦酸钠注射液有关物质的检测方法，将氯离子处理技术首次应用于该有关物质方法中，该方法专属性好，辅料、各已知杂质峰均能与伊班膦酸峰完全分离，各杂质峰之间分离度良好；系统精密度和系统适用性良好；各杂质的线性关系良好；该方法的灵敏度高、方法耐用性、精密度良好，为监控伊班膦酸钠注射液中有关物质，提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了伊班膦酸钠注射液的产品质量和患者用药安全。

Claims (10)

1.一种伊班膦酸钠注射液中有关物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)称取杂质A、苯丙氨酸、磷酸二氢钠和亚磷酸各适量，制备对照品溶液；

2)取待检的伊班膦酸钠注射液，作为供试品溶液M；

3)取待检的伊班膦酸钠注射液，经Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合前处理小柱过滤，取续滤液，作为供试品溶液N；或者

取待检的伊班膦酸钠注射液，经Ag型强酸性阳离子交换树脂前处理小柱过滤，再经H型强酸性阳离子交换树脂前处理小柱过滤，取续滤液，作为供试品溶液N；

4)采用高效液相色谱法分别对所述对照品溶液、供试品溶液M、N进行检测，其中所述高效液相色谱法的检测条件为：

检测器：高效液相色谱仪-电雾式检测器；

色谱柱的固定相为嵌入强阴离子交换基团的十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相A为乙腈、水与三氟醋酸的混合溶液，其中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为0:100:0～10:90:0.3；

流动相B为乙腈：水：三氟醋酸的混合溶液；其中乙腈：水：三氟醋酸混合溶液中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为5:95:0.03～30:70:0.5；

5)采用梯度洗脱方式洗脱；

其中所述杂质A的结构式为：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中：所述Ag、H型强酸性阳离子交换树脂复合小柱的规格为1cc～10cc，优选1cc～2.5cc；所述Ag型强酸性阳离子交换树脂复合小柱的规格为1cc～10cc，优选1cc～2.5cc；所述H型强酸性阳离子交换树脂复合小柱的规格为1cc～10cc，优选1cc～2.5cc。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中所述色谱柱的固定相的长度为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.7μm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述电雾式检测器的蒸发温度为25℃～50℃，优选蒸发温度为35℃；所述电雾式检测器的采集频率为2HZ～10HZ，优选采集频率为25HZ。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中：所述流动相A中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为3:97:0.02；所述流动相B中乙腈、水与三氟醋酸的体积比为15:85:0.2。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A中三氟醋酸的浓度选自体积分数为0.002％～0.1％，优选体积分数为0.02％；所述流动相B中三氟醋酸的浓度选自体积分数为0.02％～0.3％，优选体积分数为0.2％。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤4)中所述色谱柱的柱温为15℃～45℃，优选25℃。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在梯度洗脱过程中，流动相的流速为0.4ml/min～1.5ml/min；优选流速为0.6ml/min。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在梯度洗脱过程中，进样体积为10μl～200μl；优选地，进样体积为100μl。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用如下梯度洗脱：

时间(min) 流速(ml/min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 0.6 100 0 3 0.6 100 0 10 0.6 0 100 15 0.6 0 100 15.5 1.0 100 0 22 1.0 100 0