TWI759845B - ]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物的雜質檢測方法 - Google Patents

]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物的雜質檢測方法 Download PDF

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Abstract

本發明涉及2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物的含量、有關物質及掌性異構物檢測方法。採用HPLC-CAD方法檢測含量和有關物質I，採用LC-MS檢測有關物質Ⅱ和掌性異構物。本發明所述方法能實現2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物與有關物質I、Ⅱ及其掌性異構物的有效分離及定量檢測，分離度大於1.5；專屬性、重複性和穩定性好，保證了藥物品質及患者用藥安全；檢測成本大大降低，有利於工業化生產。

Description

2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基) 乙酸苯磺酸鹽或其組合物的雜質檢測方法
本發明涉及藥物領域，具體涉及藥物的分析檢測，尤其涉及2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或包含其的組合物的含量、有關物質及掌性異構物的檢測方法。
PCT/CN2017/101364公開了一種稠合三環γ-胺基酸衍生物，是全新的口服治療糖尿病周圍神經痛、皰疹後遺神經痛、纖維肌痛的藥物。臨床前試驗表明其中的2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽具有強效、長效的鎮痛作用，並且中樞副作用小，提示該化合物在臨床應用中將具有藥效顯著、安全性好、用藥方便、患者順從性好等明顯臨床優勢。若其成功上市，可有效打破普瑞巴林、加巴噴丁的壟斷地位，為中國眾多的神經病理性疼痛患者提供更優的用藥選擇，具有重要的臨床意義和社會意義。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的結構主體為含有5個掌性碳原子的四並五並六員稠合環，稠環的剛性結構使得實際存在4個掌性異構物，掌性立體結構複雜，對映異構物與非對映異構物的立體結構差異性複雜，同時兼有胺基與羧酸基官能團，整體結構無共軛，紫外吸收極微弱。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯 磺酸鹽涉及數個有關物質，有關物質同樣為弱紫外或無紫外吸收化合物，部分有關物質與2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽結構高度相似。
傳統的通用型檢測器有示差折光檢測器(RID)、蒸發光散射檢測器(ELSD)，其中RID的檢測靈敏度低，不適合採用梯度沖提，且受環境溫度、流動相組成等波動的影響較大；ELSD的檢測靈敏度和重現性較差，所用流動相必須是揮發性的溶液，並且響應峰面積與待測物濃度不直接成線性關係。
綜上，2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽無共軛的結構特徵決定了其不能採用一般的紫外檢測器進行檢測，檢測器大大受限；多掌性中心使得異構物檢測分析難度增大。因此，2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽分析檢測方法的建立面臨巨大挑戰，需做全面研究與開發。
低靈敏度的RID、ELSD不適用於2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物的品質研究，遠達不到雜質報告極限的檢測要求。
為了有效、精準的監控2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物的品質情況，本發明的一個目的是尋找適宜的檢測器，開發合理的層析條件，建立2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物有關物質和含量的分析檢測方法，顯著提高檢測靈敏度。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯 磺酸鹽有5個掌性碳原子，稠環的剛性結構使得實際存在4個掌性異構物，同時兼有胺基與羧酸官能團，普通掌性管柱和絕大部分特種掌性管柱對2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽及其異構物均無法達到有效分離，需做衍生處理後再分離檢測。本發明的另一個目的是尋找適宜的掌性管柱，開發合理的層析條件，建立2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽異構物的檢測方法，對2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽及其異構物無需衍生處理即能實現直接有效的分離。
本發明的另一個目的是為無紫外吸收化合物的檢測分析提供參考借鑒。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽結構式如下：
Figure 109130159-A0305-02-0004-2
根據本發明的一個實施方案，採用HPLC-CAD方法進行2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽含量以及有關物質I檢測。
電噴霧檢測器(CAD)是一種新型的通用型檢測技術，廣泛應用於醫藥、化工、食品等行業。其檢測原理為：CAD首先將沖提液霧化成液滴，然後乾燥成顆粒，顆粒的大小隨著被分析物的含量而增加；接著溶質顆粒與帶正電荷的氮氣相撞，電荷隨之轉移到顆粒上，溶質顆粒越大，帶電越多；最後溶質顆粒把它們的電荷轉移給收集器，通過高靈敏度的靜電計測出溶質顆粒的帶電量，由此產生的電流信號與溶質的含量成正比。
本發明使用HPLC-CAD方法，有關物質I與2-((1S,2S,3R,6S,8S)- 2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽之間均能有效分離，靈敏度更高，檢測極限更低。
方法參數如下：高效液相層析儀：賽默飛世爾(Thermo)Ultimate 3000 UHPLC，二元泵，CAD；層析管柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠柱 (4.6×250mm，5μm)，例如資生堂CAPCELL PAK ADME；流動相：A：10mM甲酸銨溶液 B：乙腈；梯度沖提程序：0~5min，A 90%；5~25min，A 90%→40%；25~29min，A 40%→20%；29~35min，A 20%；35~36min，A20%→90%；36~40min，A 90%；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；CAD參數：霧化溫度50℃，採集頻率5.0Hz 濾光片5。
上述層析條件下，有關物質I與2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽之間均能有效分離，分離度大於1.5；在上述檢測器CAD參數下，有關物質I有良好響應，檢測靈敏度可達0.02%或更低。
根據本發明的一個實施方案，所述有關物質I結構式為
Figure 109130159-A0305-02-0005-3
和
Figure 109130159-A0305-02-0005-5
，所述方法包括以下步驟：1)有關物質I供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽加入稀釋劑製備有關物質I供試品溶液； 2)有關物質I對照溶液製備：取步驟1)得到的有關物質I供試品溶液加入稀釋劑稀釋100倍，即得；3)將步驟1)得到的有關物質I供試品溶液和步驟2)得到的有關物質I對照溶液注入液相層析儀，層析條件為：高效液相層析儀：賽默飛世爾(Thermo)Ultimate 3000 UHPLC，二元泵，CAD；層析管柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠柱 (4.6×250mm，5μm)；例如資生堂CAPCELL PAK ADME；流動相：A：10mM甲酸銨溶液、B：乙腈；梯度沖提程序：0~5min，A 90%；5~25min，A 90%→40%；25~29min，A 40%→20%；29~35min，A 20%；35~36min，A20%→90%；36~40min，A 90%；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；CAD參數：霧化溫度50℃，採集頻率5.0Hz，濾光片5。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)或步驟2)中的稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑，較佳為10mM甲酸銨與乙腈的混合溶劑，進一步較佳為10mM甲酸銨：乙腈體積比=80：20的混合溶劑。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)有關物質I供試品溶液製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物50mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，即得；所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑，較佳為10mM甲酸銨與乙腈的混合溶劑，進一步較佳為10mM甲酸銨：乙腈體積比=80：20的混合溶劑。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)得到的有關物質I供 試品溶液濃度為5mg/mL。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟2)有關物質I對照溶液製備包括：精密量取步驟1)得到的有關物質I供試品溶液1.0mL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得；所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑，較佳為10mM甲酸銨與乙腈的混合溶劑，進一步較佳為10mM甲酸銨：乙腈體積比=80：20的混合溶劑。
根據本發明的另一個實施方案，可採用LC-MS進行有關物質Ⅱ的檢測，方法參數如下：層析管柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠柱 (4.6×250mm，3.5μm)；例如Waters Xselect HSS T3；流動相：A：10mM甲酸銨溶液 B：乙腈；梯度沖提程序：0~15min，A 70%→30%；15~16min，A 30%→10%；16~18min，A 10%；18~20min，10%→70%；20~25min，A70%；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)。
上述層析條件下，有關物質Ⅱ與2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽之間均能有效分離，分離度大於1.5；在上述檢測器MS參數下，有關物質Ⅱ有非常良好的響應，檢測靈敏度可達0.001%或更低。
根據本發明的一個實施方案，有關物質Ⅱ包括雜質A、B、C、D、E：
Figure 109130159-A0305-02-0007-35
Figure 109130159-A0305-02-0008-7
所述方法包括以下步驟：1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備：分別取有關物質Ⅱ對照品適量加稀釋劑溶解得到有關物質Ⅱ對照品溶液；2)有關物質Ⅱ供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品製備有關物質Ⅱ供試品溶液；3)將步驟1)得到的有關物質Ⅱ對照品溶液和步驟2)得到的有關物質Ⅱ供試品溶液注入液相層析儀，層析條件為：液相層析串連質譜儀：安捷倫(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；層析管柱：Waters Xselect HSS T3 (4.6×250mm，3.5μm)；流動相：A：10mM甲酸銨溶液、B：乙腈；梯度沖提程序：0~15min，A 70%→30%；15~16min，A 30%→10%；16~18min，A 10%；18~20min，10%→70%；20~25min，A70%；流速：1.0mL/min； 柱溫：30℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備包括：取有關物質Ⅱ對照品加入稀釋劑溶解並稀釋得到有關物質Ⅱ對照品溶液；所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳的，所述稀釋劑為乙腈：水=5：1，v/v。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備包括：精密稱取有關物質Ⅱ對照品25mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為有關物質Ⅱ對照品儲備液；精密量取有關物質Ⅱ對照品儲備液100μL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備包括：分別稱取雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E對照品10mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，用稀釋劑(乙腈：水=5：1)溶解稀釋配製成每1mL含1mg的溶液，作為對照品儲備液；精密量取雜質A、雜質D、雜質E對照品儲備液各25μL，雜質C對照品儲備液50μL、雜質B對照品儲備液200μL至100mL量瓶，加稀釋劑稀釋製成每1mL含雜質A、雜質D、雜質E約0.25μg，雜質B約2μg、雜質C約0.5μg的混合溶液作為對照品溶液。
所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳的，所述稀釋劑為乙腈：水=5：1，v/v。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟1)得到的有關物質Ⅱ對照品溶液濃度為2.5μg/mL。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟2)中有關物質Ⅱ供試品溶液製備包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸 苯磺酸鹽或其組合物加入稀釋劑溶解並稀釋得到有關物質Ⅱ供試品溶液；所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳的，所述稀釋劑為乙腈：水=5：1，v/v。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟2)有關物質Ⅱ供試品溶液製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物25mg至25mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度搖勻，即得；所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳的，所述稀釋劑為乙腈：水=5：1，v/v。
根據本發明的一個實施方案，上述步驟2)得到的有關物質Ⅱ供試品溶液濃度為1mg/mL。
根據本發明的另一個實施方案，2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的掌性異構物採用篩選合適的特種掌性管柱進行分析檢測，方法參數如下：層析管柱：CROWNPAK CR-I(+) (3×150mm，5μm)；流動相：A：高氯酸溶液(pH1.3) B：乙腈；沖提程序：流動相A：流動相B=80：20等度沖提35分鐘；流速：0.2mL/min；柱溫：20℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)。
上述層析條件下，對映異構物、非對映異構物與2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽可達有效分離，分離度大於1.5；在上述檢測器MS參數下，異構物有良好的響應，檢測靈敏度可達0.05%以下。
根據本發明的一個實施方案，掌性異構物包括雜質F、G、H，所述雜質F、G、H如下：
Figure 109130159-A0305-02-0011-38
包括下述步驟：1)掌性異構物對照品溶液製備：取掌性異構物對照品適量，用稀釋劑溶解並製備異構物對照品溶液；2)掌性異構物供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物製備掌性異構物供試品溶液；3)將步驟1)得到的掌性異構物對照品溶液和步驟2)得到的掌性異構物供試品溶液注入液相層析儀，層析條件為：液相層析串連質譜儀：安捷倫(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；層析管柱：CROWNPAK CR-I(+) (3×150mm，5μm)；流動相：A：高氯酸溶液(pH1.3)、B：乙腈；沖提程序：流動相A：流動相B=80：20等度沖提35分鐘；流速：0.2mL/min；柱溫：20℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min， 乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟1)掌性異構物對照品溶液製備包括：取掌性異構物對照品加入稀釋劑溶解並稀釋得到掌性異構物對照品溶液；所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳的，乙腈：水=20：80，v/v。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟1)掌性異構物對照品溶液製備包括：精密稱取掌性異構物對照品10mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為對照品儲備液；精密量取對照品儲備液100μL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟1)掌性異構物對照品溶液製備包括：分別稱取雜質F、雜質G(或雜質H)對照品10mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，用稀釋劑(乙腈：水=1：4)溶解稀釋配製成每1mL含1mg的溶液，作為對照品儲備液；精密量取雜質F、雜質G(或雜質H)對照品儲備液100μL至100mL量瓶中，用稀釋劑稀釋製成每1mL中含雜質F 1μg、雜質G(或雜質H)1μg的混合溶液，作為對照品溶液。
所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳的，乙腈：水=20：80，v/v。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟1)得到的掌性異構物對照品溶液濃度為1μg/mL。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟2)掌性異構物供試品溶液製備包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物加入稀釋劑得到掌性異構物供試品溶液；所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳地，乙腈：水=20：80，v/v。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟2)掌性異構物供試品溶 液製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物10mg，至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為供試品儲備液；精密量取供試品儲備液1mL至10mL容量瓶，加稀釋劑定容至刻度，搖勻，即得；所述稀釋劑較佳為乙腈和水的混合溶劑；進一步較佳地，乙腈：水=20：80，v/v。
根據本發明的一個實施方案，所述步驟2)得到的掌性異構物供試品溶液濃度為0.1mg/mL。
本發明另一個目的是提供2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物雜質檢測方法，所述方法能實現2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽與有關物質I、Ⅱ及其異構物的有效分離和準確定量檢測，分離度均大於1.5；重複性和穩定性好，保證了藥物品質及患者用藥安全；檢測成本大大降低，有利於工業化生產。
本發明採用CAD檢測2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的含量和有關物質I，與傳統的通用型檢測器RID、ELSD相比具有以下優勢：1.使用CAD檢測2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽及有關物質檢測極限可達0.02%，靈敏度遠高於RID、ELSD(檢測極限約為0.5-1%)；2.響應與化學結構無關，具有響應一致性；3.相較於ELSD無需取對數，可實現較寬的線性範圍，方便定量計算；4.廣泛的適用性(所有半揮發性、非揮發性化合物都可以通過該檢測器進行測定──包括不含發色團的物質)； 5.重現性、穩定性更好，受流動相和環境影響小。
本發明採用MS進行2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽有關物質Ⅱ和異構物的檢測，不僅顯著提高了雜質檢測靈敏度，同時定離子模式檢測也更好地保障了檢測專一性，快速有效地實現有關物質Ⅱ的分離檢測。
本發明採用CROWNPAK CR-I(+)柱進行異構物分離，對2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽及其異構物無需做衍生處理，即實現直接有效的分離，檢測直覺簡便。
圖1為有關物質I的檢測層析圖。
圖2為有關物質Ⅱ的檢測層析圖。
圖3為掌性異構物的檢測層析圖。
圖4為含量檢測層析圖。
以下結合附圖及實施例詳細說明本發明的技術方案，但本發明的保護範圍包括但是不限於此。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸參照PCT/CN2017/101364公開的方法製備。
含量對照品、有關物質I、有關物質Ⅱ及掌性異構物對照品採用自製。其餘原料、試劑均為市購。
實施例1：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.0 3,8 ]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽有關物質I和含量的測定。
有關物質I供試品溶液製備：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品50mg至10mL塑料容量瓶，加稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)溶解並稀釋至刻度，作為供試品溶液。
有關物質I對照溶液製備：精密量取有關物質I供試品溶液1.0mL至100mL塑料容量瓶，加稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)稀釋至刻度，搖勻，即得。
含量供試品溶液製備：精密稱取自製2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品10mg至10mL塑料容量瓶，加稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)溶解並稀釋至刻度，作為供試品儲備液。精密量取供試品儲備液0.5mL至10mL塑料容量瓶，加前述稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)稀釋至刻度，搖勻，即得。
含量對照品溶液製備：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽對照品10mg至10mL塑料容量瓶，加稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)溶解並稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.5mL至10mL塑料容量瓶，加前述稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。
液相層析條件：高效液相層析儀：賽默飛世爾(Thermo)Ultimate 3000 UHPLC，二元泵，CAD；層析管柱：資生堂CAPCELL PAK ADME (4.6×250mm，5μm)；流動相：A：10mM甲酸銨溶液 B：乙腈； 梯度沖提程序：0~5min，A 90%；5~25min，A 90%→40%；25~29min，A 40%→20%；29~35min，A 20%；35~36min，A20%→90%；36~40min，A 90%；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；CAD參數：霧化溫度50℃，採集頻率5.0Hz 濾光片5；進樣量：20μL。
測試：分別精密量取有關物質I供試品溶液、有關物質I對照溶液、含量供試品溶液及含量對照品溶液各20μL，注入液相層析儀，記錄層析圖進行分析計算，含量以外標法計算，檢測層析圖見圖4；有關物質I以自身對照法計算，檢測層析圖見圖1。
實施例2：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.0 3,8 ]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽有關物質Ⅱ的測定。
對照品溶液製備：精密稱取有關物質Ⅱ對照品(雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E)各25mg至10mL容量瓶，加稀釋劑(乙腈：水=5：1，v/v)溶解並稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液100μL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。
對照品溶液製備方法二：分別稱取雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E對照品10mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，用稀釋劑(乙腈：水=5：1)溶解稀釋配製成每1mL含1mg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取雜質A、雜質D、雜質E對照品儲備液各25μL，雜質C對照品儲備液50μL、雜質B對照品儲備液200μL至100mL量瓶，加稀釋劑稀釋製成每1mL含雜質A、雜質D、雜質E約0.25μg，雜質B約2μg、雜質C約0.5μg的混合溶液作為對照品 溶液。
供試品溶液製備：精密稱取自製的2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品25mg至25mL容量瓶，加前述稀釋劑(乙腈：水=5：1，v/v)溶解並稀釋至刻度搖勻，即得。
液相層析條件：液相層析串連質譜儀：安捷倫(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；層析管柱：Waters Xselect HSS T3 (4.6×250mm，3.5μm)；流動相：A：10mM甲酸銨溶液 B：乙腈；梯度沖提程序：0~15min，A 70%→30%；15~16min，A 30%→10%；16~18min，A 10%；18~20min，10%→70%；20~25min，A70%；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)；進樣量：10μL。
測定：精密量取供試品溶液及對照品溶液各10μL，注入液相層析儀，記錄層析圖進行分析計算，以外標法計算有關物質Ⅱ的含量。檢測層析圖見圖2。
實施例3：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.0 3,8 ]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽異構物的測定。
對照品溶液製備：精密稱取掌性異構物對照品(雜質F、雜質G(或雜質H))各10mg至10mL容量瓶，加稀釋劑(乙腈：水=20：80，v/v) 溶解並稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液100μL至100mL容量瓶，加稀釋劑(乙腈：水=20：80，v/v)稀釋至刻度，搖勻，即得。
對照品溶液製備方法二：分別稱取雜質F、雜質G(或雜質H)對照品10mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，用稀釋劑(乙腈：水=1：4)溶解稀釋配製成每1mL含1mg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取雜質F、雜質G(或雜質H)對照品儲備液100μL至100mL量瓶中，用稀釋劑稀釋製成每1mL中含雜質F 1μg、雜質G(或雜質H)1μg的混合溶液，作為對照品溶液。
供試品溶液製備：精密稱取自製2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品10mg，至10mL容量瓶，加稀釋劑(乙腈：水=20：80，v/v)超聲溶解並稀釋至刻度，作為供試品儲備液。精密量取供試品儲備液1mL至10mL容量瓶，加前述稀釋劑(乙腈：水=20：80，v/v)定容至刻度，搖勻，即得。
液相層析條件：液相層析串連質譜儀：安捷倫(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；層析管柱：CROWNPAK CR-I(+) (3×150mm，5μm)；流動相：A：高氯酸溶液(pH1.3) B：乙腈；沖提程序：流動相A：流動相B=80：20等度沖提35分鐘；流速：0.2mL/min；柱溫：20℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)；進樣量：5μL。
測定：分別精密量取對照品溶液和供試品溶液各5μL，注入液相 層析儀，記錄層析圖進行分析計算，以外標法計算掌性異構物的含量。檢測層析圖見圖3。
實施例4 有關物質I強制降解實驗
稱取6份2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品各125mg於10ml量瓶中，分別進行未破壞、酸、鹼、高溫、氧化、光照等處理後加入稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)溶解配製成每1mL中含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽約5mg的樣品溶液；將未破壞和破壞處理後的樣品溶液進行HPLC-CAD和HPLC-MS檢測，破壞條件和試驗結果見下表1。
Figure 109130159-A0305-02-0019-9
Figure 109130159-A0305-02-0020-10
結果分析：
Figure 109130159-A0305-02-0020-28
各強制降解條件下該方法均未檢出新的雜質，質譜顯示各條件下主峰的m/z為210(2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽)；
Figure 109130159-A0305-02-0020-29
各條件下質譜均能檢出m/z為192的峰(RT=24min為雜質C的準分子離子峰，RT=22min為雜質D的碎片峰)，CAD對雜質D、C的檢測靈敏度弱於MS；
Figure 109130159-A0305-02-0020-30
鹼破壞條件下質譜檢測到較強的m/z=192(RT=24min)的峰，說明鹼破壞可能是雜質C的降解途徑之一。因主峰過載且CAD屬通用型、高靈敏度檢測器，雜質漏檢的可能性低，故未作物料平衡統計。
綜合雜質定位及破壞試驗結果，本發明方法檢測有關物質I的專屬性良好。方法學驗證結果表明該方法靈敏度、重複性、線性範圍、準確度及穩定性均良好。
實施例5 有關物質Ⅱ強制降解試驗
取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽供試品適量，精密稱定，分別進行未破壞、酸、鹼、高溫、氧化、光照、高濕等處理後加入稀釋劑(10mM甲酸銨：乙腈=80：20，v/v)配製成每1mL中約含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽1mg的樣品溶液，並同法配製空白溶液；將未破壞和破壞處理後的樣品溶液進樣檢測並對結果進行比較，具體破壞條件和測試結果見下表2。
Figure 109130159-A0305-02-0020-11
Figure 109130159-A0305-02-0021-12
結果分析：
Figure 109130159-A0305-02-0021-31
鹼性條件下雜質E增加明顯，鹼性條件下2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽可能降解產生雜質C；
Figure 109130159-A0305-02-0021-33
酸、鹼、高溫條件下雜質B降低明顯，酸、鹼、高溫條件下雜質B可能降解生成2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽；
Figure 109130159-A0305-02-0021-34
各破壞條件下均未產生新雜質。
綜合雜質定位及破壞試驗結果，本發明方法檢測有關物質Ⅱ的專屬性良好；方法學驗證結果表明該方法具有超高的靈敏度，且重複性、線性範圍、準確度及穩定性均良好。
製備工藝：DMF：N,N-二甲基甲醯胺
DBU：1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯
DCM：二氯甲烷
PE：石油醚
EA：乙酸乙酯
DEA：二乙胺
INT1製備方法：第一步：3-(環己基-3-烯-1-基)丙酸(1B)
3-(cyclohex-3-en-1-yl)propanoic acid
Figure 109130159-A0305-02-0022-39
將無水甲酸(18.82Kg,409.09moL)抽入100升的反應釜中，抽畢。開啟攪拌和製冷設備，降溫至10℃。當內溫為10℃時，將三乙胺(16.53Kg,163.64moL)滴加到反應液中，加畢，攪拌20分鐘。當內溫為10℃時，先將丙二酸環(亞)異丙酯(7.86Kg,54.55moL)加入反應釜，再將3-環己烯-1-甲醛(6.00Kg,54.55moL)於40℃下慢慢滴加到反應液中，加畢。升溫到140-150℃反應至無氣體。用6N HCl(24.0L)調節水相pH=1-2之間。水相用二氯甲烷(12L×2)萃取，合併有機相，並用飽和食鹽水(10L×2)洗滌。有機相用無水硫酸鈉(2.0Kg)乾燥1小時，過濾，濾液濃縮蒸乾得黃色油狀物3-(環己基-3-烯-1-基)丙酸(1B)(8.80Kg，產率100%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.23(s,1H),5.73-5.55(m,2H),2.46-2.30(m,2H),2.09-1.96(m,2H),1.81-1.53(m,6H),1.35-1.17(m,1H)。
LCMS m/z=153.1[M-1]。
第二步：3-(環己基-3-烯-1-基)-1-(吡咯烷基-1-基)丙基-1-酮(1C)
3-(cyclohex-3-en-1-yl)-1-(pyrrolidin-1-yl)propan-1-one
Figure 109130159-A0305-02-0022-41
將3-(環己基-3-烯-1-基)丙酸(1B)(11.20Kg,72.727moL)用二氯甲烷(60.0L)溶解後，抽入100L反應釜中。開啟攪拌，加入DMF(3.0mL)並將草醯氯(9.046Kg,71.272moL)滴加到反應液中。加畢，室溫攪拌2.0小時。 TLC檢測反應完全，將四氫吡咯(5.689Kg,79.999moL)和三乙胺(8.814Kg,87.272moL)先後滴加入反應釜中。控制內溫小於10℃加畢，停止降溫。於室溫下攪拌過夜。TLC檢測反應完成後，將反應液冷卻至10℃。滴加3N鹽酸(20.0L)調節反應液pH=1-2之間。靜置，分液，水相用二氯甲烷(10.0L×1)萃取。合併有機相依次用5%氫氧化鈉溶液(10.0L×1)，飽和氯化銨溶液(20.0L×1)洗滌。有機相用無水硫酸鈉(2.0Kg)乾燥30分鐘後，過濾，濾液濃縮得到棕色液體3-(環己基-3-烯-1-基)-1-(吡咯烷基-1-基)丙基-1-酮(1C)(15.00Kg，收率99.6%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 5.73-5.56(m,2H),3.43(dd,4H),2.37-2.22(m,2H),2.16-2.01(m,4H),1.90(dt,4H),1.81-1.51(m,6H),1.30-1.15(m,2H)。
LCMS m/z=208.1[M+1]。
第三步：三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-酮(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(INT1)
tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-one(1R,3S,6R,8R and 1S,3R,6S,8S racemate)
Figure 109130159-A0305-02-0023-42
將中間體3-(環己-3-烯-1-基)-1-(吡咯烷-1-基)丙基-1-酮(1C)(5.64Kg，27.22moL)用二氯甲烷(40.0L)溶解後，抽入100L的反應釜中。攪拌，降溫至-10℃，加入2，4，6-三甲基吡啶(4.94Kg，40.83mol)。將三氟甲烷磺酸酐(11.50Kg，40.83mol)的二氯甲烷(16.0L)溶液滴加到反應液中，加畢，加熱回流12小時。檢測反應完全後，將氫氧化鈉(3.10Kg，77.5mol)的水溶液(23.0L)滴加到反應液中，調節反應液pH=10-11之間。反應放熱，加畢繼續回流5-6小 時。靜置分液，水相用二氯甲烷(5.0L×1)萃取，合併有機相。將有機相抽入反應釜中，攪拌並降溫到10℃。滴加2.0M鹽酸溶液(20.0L)調節反應液pH=1-2之間。靜置分液，有機相用飽和食鹽水(20L×1)洗滌。有機相直接濃縮，殘留物用丙酮(20.0L)溶解後，抽入100L反應釜中。開啟攪拌，滴加濃硫酸(4.0L)和水(20.0L)配製溶液，反應放熱，加畢回流2小時。降溫到15℃，向反應液中加入飽和食鹽水(20.0L)，並用正己烷(15.0L×2)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(20.0L×1)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥過夜。過濾，濾液減壓濃縮後得黃色固體粗品三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-酮(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(INT1)(3.00Kg，收率81%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.39(m,1H),3.19(m,1H),2.77(m,1H),2.38(m,1H),2.05(m,1H),1.93(d,1H),1.77(m,1H),1.45(m,4H),1.20(m,1H)。
LCMS m/z=137.1[M+1]。
精製：將無水亞硫酸氫鈉(5.735Kg，55.147moL)溶於66L純化水中加入100L的反應釜中，室溫攪拌下滴加入(INT1)粗品(3.00Kg,22.059moL)的乙醇(3.0L)溶液，加畢於室溫下攪拌過夜，用乙酸乙酯(20L×2)萃取，水相加入反應釜中攪拌並降溫到10℃下，滴加入氫氧化鈉(2.250Kg,56.250moL)的水(10L)溶液，調pH為10-12，加畢於室溫下攪拌2小時，用正己烷(20L×2)萃取，合併有機相並用純化水(20L×1)洗滌，有機相用無水硫酸鈉2Kg乾燥1小時，過濾，將濾液蒸乾得無色晶狀固體三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-酮(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(INT1)(2.7Kg，收率90%)。
LCMS m/z=137.1[M+1]。
INT2製備方法：第一步：第三丁基2-(三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-葉立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(INT2)
tert-butyl 2-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-ylidene)acetate(1R,3S,6R,8R and 1S,3R,6S,8S racemate)
Figure 109130159-A0305-02-0025-46
將第三丁醇鉀(4.94g,44.0mmol)和四氫呋喃(30mL)加入100mL反應瓶中。降溫到5℃，滴加二甲氧基膦醯基乙酸第三丁酯(9.86g,44.0mmol,1.1eq)到反應液中，控制反應溫度10℃-15℃，約20分鐘滴加完畢。繼續控溫10℃-15℃下攪拌20分鐘。再將(1R,6R,8R)-三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-酮(INT1)(5.40g,40.0mmol,1.0eq)的四氫呋喃(30mL)溶液滴加到反應液，0.3小時左右滴加完，加畢自然升到室溫反應3小時。向反應釜依次加入飽和氯化銨(200mL)，純化水(200mL)淬滅反應。攪拌20分鐘後靜置分層，水相用二氯甲烷(30mL×1)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(30mL×1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濃縮，取5.0粗品通過製備純化得到黃色液體第三丁基2-(三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-葉立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(INT2)(4.0g，產率：80%)。
LCMS m/z=235.3[M+1]。
Figure 109130159-A0305-02-0025-47
INT3製備方法：第三丁基2-(2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋體)(INT3)
tert-butyl 2-(2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(1R,2R,3S,6R,8R and 1S,2S,3R,6S,8S racemate)
Figure 109130159-A0305-02-0026-48
向反應瓶依次加入第三丁基2-(三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-葉立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(INT2)(2.34g,10.0mmol)，硝基甲烷(1.68g,25.0mmol)，1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(1.83g,12.0mmol)和二甲基亞碸(5.0mL)。攪拌，加熱到80℃-85℃，繼續保溫反應6小時。冷卻到室溫，向反應釜加入純化水(100.0mL，水相用二氯甲烷(40mL×3)萃取。合併有機相，用飽和食鹽水(30mL×1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濃縮，得到無色液體第三丁基2-(2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋體)(INT3)。
LCMS m/z=318.1[M+Na]。
Figure 109130159-A0305-02-0026-49
INT4製備方法：第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(INT4)
tert-butyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(S)-2-acetoxy-2-phenylacetate
Figure 109130159-A0305-02-0027-50
向50L反應釜加入第三丁基2-(2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋體)(INT3)(730.0g,2.47mol)和甲醇(7.3L)。開啟攪拌，將氯化鎳六水合物(118g,0.49mol,0.2eq)加到反應釜中，將反應液降溫到5℃，分批加入硼氫化鈉(374g,9.88mol,4.0eq)，保持反應液體系溫度20℃-30℃，約3小時加完。加畢繼續攪拌反應2小時。向反應釜加入冰水(16.4L)淬滅反應，用矽藻土2-3cm過濾。濾液用二氯甲烷(3.0L×2)萃取，合併有機相，用飽和食鹽水(4L×1)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液加入O-乙醯基-L-扁桃酸(384g,1.97mol,0.8eq)，加畢攪拌20分鐘。將有機相蒸餾濃縮直到無溶劑蒸出，得到粗產品第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(1H)粗品。粗產品用異丙醇(5.9L)攪拌打漿2小時，降溫到5℃攪拌1小時。過濾，濾餅用異丙醇洗滌(0.4L×1)，烘乾得到白色固體產品第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(INT4)(422g，產率：34.96%)。取樣衍生測定ee值為48.35%。
第一次結晶：將第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(INT4)(420.0g,0.92mol),異丙醇(4.20L)和水(0.21L)依次加入反應釜中。升溫至82℃，使固體完全 溶解，保溫0.5小時。降溫至20℃析晶，約6小時。內溫至20℃時，過濾，濾餅用異丙醇(0.40L×1)洗滌。合併固體，60-65℃鼓風乾燥4小時烘乾至恒重。取樣衍生後測定ee值為81.25%。得白色固體產品第三丁基2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(1H)粗品-1(260g，產率：62%)。取樣衍生測定ee值為81.00%。
第二次結晶：將第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(INT4)(177g,0.39mol)，異丙醇(2.53L)和水(0.126L)依次加入反應釜中。程序升溫至82℃，使固體完全溶解，保溫0.5小時。降溫至20℃析晶，約4.5小時。內溫至30℃時，過濾，濾餅用異丙醇(0.10L×1)洗滌。合併固體，60-65℃鼓風乾燥4小時烘乾至恒重。取樣衍生後測定ee值為99.73%。得白色固體產品第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(INT4)(128g，產率：72%)。
LCMS m/z=266.3[M+1]。
Figure 109130159-A0305-02-0028-51
INT5製備方法： 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸苯磺酸化合物(1：1)(INT5)
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid compound with benzenesulfonic acid(1：1)
Figure 109130159-A0305-02-0029-54
將第三丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙醯氧基-2苯乙酸(INT4)(150.0g，0.326mol)和純化水(1.5L)依次加入反應釜中，攪拌，降溫到0-10℃。保溫0-10℃，滴加1mol/L NaOH(360mL)水溶液到反應釜中，調節水相pH=9-10。靜置分層，水相用二氯甲烷(0.80L×2)萃取。合併有機相，依次用1mol/L NaOH(0.30L×1)溶液和飽和食鹽水(0.15L×1)洗滌。有機相中加入活性炭(5.0g)脫色，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液濃縮，濃縮剩餘物用乙腈(328mL)溶解得到乙腈溶液。另在合適的容器內將苯磺酸一水合物(114g，0.359mol)加入到純化水(328mL)中，攪拌至溶解澄清配製成苯磺酸水溶液備用。向乙腈溶液中滴加配製好的苯磺酸水溶液，加畢。升溫至80-85℃。保溫反應4-6小時，檢測原料反應完全後，停止加熱。降溫至10-20℃析晶，約4-6小時。內溫至10-20℃時，過濾，濾餅依次用水(30mL×1)，乙腈(30mL×1)洗滌。乾燥後得到白色固體2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸苯磺酸化合物(1：1)(INT5)(104g，產率：86.9%)。
Figure 109130159-A0305-02-0029-56
Figure 109130159-A0305-02-0030-14
INT6製備方法：2-((1S,2S,3R,8S))-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure 109130159-A0305-02-0030-117
將INT5(8.15g,37.89mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入碳酸鉀(15.38g,109.8mmol)、水(100mL)、乙醇(10mL)，緩慢滴加二第三丁基二碳酸酯(10.9g,49.36mmol)到反應液中，加畢，室溫反應3h，反應液用石油醚萃取(100mL×2)，分液，水相在冰水浴下向其中滴加5mol/L的鹽酸溶液調節pH約3左右，析出白色固體，二氯甲烷萃取(100mL×3)，合併有機相並用飽和食鹽水洗滌(150mL×1)無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得白色固體產物2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸INT6(8.5g,73%)。
INT9製備方法：第一步：(1S,6S,8S))-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-醇
(1S,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-ol
Figure 109130159-A0305-02-0031-58
向反應瓶中加入INT1(72.3g，0.53mol)，硝基甲烷(1.0L)，DBU(80.8g，0.53mol)，室溫反應18h。加入飽和氯化銨水溶液(5L)，用二氯甲烷(2L×3)萃取，合併有機層，乾燥，過濾，濃縮。矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1-10：1)得到黃色油狀物INT7(10.5g，收率10.1%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 4.73-4.40(m,2H),2.65-2.58(m,1H),2.51-2.44(m,1H),2.34(qd,2H),1.99-1.86(m,1H),1.80-1.44(m,6H),1.30-1.17(m,1H)。
第二步：(1S,6S,8S,E)-2-(硝基亞甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷
(1S,6S,8S,E)-2-(nitromethylene)tricyclo[4.2.1.03,8]nonane
Figure 109130159-A0305-02-0031-60
向反應瓶中加入INT7(0.50g，2.54mmol)，醋酐(10mL)，對甲苯磺酸(0.44g，2.54mmol)，室溫反應2h。冷卻至0℃，加入50ml飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌1h，用二氯甲烷(35ml×3)萃取，合併有機層，乾燥，過濾，濃縮。得到無色液體0.15g，將得到的無色液體溶於甲醇(8mL)，冷卻至0℃，加入甲醇鈉(0.03g，0.61mmol)，室溫反應2h。加入20mL飽和氯化銨水溶液，用二氯甲烷(40ml×3)萃取，合併有機層，乾燥，過濾，濃縮。矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)得到黃色油狀物INT8(0.08g，收率74.1%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 6.87(dd,1H),3.94-3.61(m,1H), 3.25(ddd,1H),3.01-2.80(m,1H),2.39(td,1H),2.12-1.76(m,4H),1.73-1.51(m,1H),1.48-1.23(m,3H)。
第三步：第三丁基2-((1S,2R,6S,8S)-2-(硝基亞甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1S,2R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0032-62
向反應瓶中加入1M雙(三甲矽基)胺基鋰(290mL，0.29mol)，氮氣保護，冷卻至-60℃，滴加乙酸第三丁酯(33.62g，0.29mmol)的四氫呋喃(150mL)溶液，攪拌20mins，滴加INT8(28.82g,0.16mol)的四氫呋喃(250mL)溶液，-60℃反應2h。加入飽和氯化銨水溶液(400mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合併有機層，乾燥，過濾，濃縮。矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)得到無色液體INT9(39.4g，收率84.8%)。
Figure 109130159-A0305-02-0032-63
雜質A製備方法：第一步：乙基-2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三 環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
ethyl 2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0033-121
將2-((1S,2S,3R,8S))-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸INT6(2.07g,6.46mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入DMF(20mL),碳酸鉀(1.36g,9.7mmol)，冰水浴下，緩慢滴加碘乙烷(1.57g,9.7mmol)，加畢，室溫反應2h，向反應液中加水30mL，用甲基第三丁基醚萃取(30mL×2)，合併有機相並用飽和食鹽水洗滌(50mL×3)，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得乙基-2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯INT6-A。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 4.98(br,1H),4.13(q,2H,J=7.2Hz),3.39(d,2H,J=6.4Hz),2.84(dd,2H,J=12.8Hz,5.2Hz),2.39(m,1H),2.37(s,2H),2.27(dd,1H,J=12.4Hz,5.6Hz),2.07(m,1H),1.98(m,1H),1.75-1.67(m,1H),1.59-1.47(m,5H),1.44(s,9H),1.26(t,3H)。
第二步：乙基2-((1S,2S,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸鹽
ethyl 2-((1S,2S,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate benzenesulfonate
Figure 109130159-A0305-02-0033-65
將乙基-2-((1S,2S,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環 [4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯INT6-A(2.2g,6.502mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入苯磺酸(2.05g,13.0mmol)及乙腈22mL，加畢，升溫至80度反應0.5h，冷卻至室溫，減壓濃縮得白色固體，向其中加入10mL甲基第三丁基醚打漿，攪拌10min後，過濾，得白色固體產物雜質A。
Ms m/z(ESI)：238.2[M+H+]。
Figure 109130159-A0305-02-0034-68
雜質B製備方法：將INT4(2.02g，4.35mmol)加入到圓底燒瓶中，冰水浴下，依次加入水(10mL)、二氯甲烷(10mL)、氫氧化鈉(0.18g,4.35mmol)，在該溫度下保持30min攪拌，分液漏斗分液，無水硫酸鈉乾燥有機層，向有機層加入苯磺酸(0.77g，4.35mmol)，加畢，在20℃下減壓濃縮得白色固體雜質B。
Ms m/z(ESI)：266.2[M+H+]
Figure 109130159-A0305-02-0034-118
Figure 109130159-A0305-02-0035-15
雜質C製備方法：第一步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)雙環[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(1B-2)
(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one
Figure 109130159-A0305-02-0035-72
反應瓶中加入環戊二烯(1A-2)(26.4g，0.4mol)和環己烷(1200mL)，充氮氣保護後加入三乙胺(24.2g，0.24mol)，將反應體系加熱至回流，滴加4-溴丁醯氯(44.4g，0.24mol)的環己烷(50mL，25mL/h)溶液，滴畢回流反應4小時。冷卻至室溫後將反應液抽濾，環己烷(100mL×3)洗滌，合併濾液，依次用飽和氯化銨(500mL×3)、水(500mL×3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=80：1)得到淡黃色油狀(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)雙環[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(1B)(12g，產率：24%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 5.97-5.85(m,1H),5.80-5.70(m,1H),3.91-3.79(m,1H),3.67(dd,J=9.7,5.5Hz,2H),3.47(t,J=6.8Hz,2H),2.68 (ddd,J=18.3,15.2,3.9Hz,1H),2.47-2.31(m,1H),2.13(dq,J=21.0,6.5Hz,1H),1.93(ddd,J=21.5,12.2,7.1Hz,1H)。
第二步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚[2]烯-6,2'-[1,3]二惡茂烷](1C-2)
(±)-1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)spiro[bicyclo[3.2.0]hept[2]ene-6,2'-[1,3]dioxolane]
Figure 109130159-A0305-02-0036-74
反應瓶中依次加入(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)雙環[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(1B-2)(37g，0.173mol)，對甲苯磺酸一水合物(1.6g，8.6mmol)，乙二醇(42.9g，0.692mol)和甲苯(320mL)，加熱至回流，分水5小時。冷卻後將反應液倒入冰水中，加入飽和碳酸氫鈉溶液至pH值約為7，用乙酸乙酯(400mL×3)萃取，合併有機相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)，得到黃色油狀物(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚[2]烯-6,2'-[1,3]二惡茂烷](1C-2)(27.4g，產率：61%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 5.94-5.83(m,1H),5.67-5.56(m,1H),3.95-3.75(m,4H),3.36-3.25(m,2H),3.23-3.12(m,1H),3.02(ddd,J=22.9,15.7,8.0Hz,2H),2.48-2.25(m,2H),1.99-1.78(m,2H)。
第三步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二惡茂烷]-2-醇(1D-2)
(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)spiro[bicyclo[3.2.0]heptane-6,2'-[1,3]dioxolan]-2-ol
(1'S,6'R)-spiro[[1,3]dioxolane-2,2'-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan]-7'-one
Figure 109130159-A0305-02-0037-75
向反應瓶中加入(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚[2]烯-6,2'-[1,3]二惡茂烷](1C-2)(27.4g，0.11mol)和四氫呋喃(330mL)，冰水浴下滴加硼烷二甲硫醚溶液(55mL，0.55mol)，冰水浴下反應2小時後依次滴加純化水(1.1mol)，氫氧化鈉水溶液(3mol/L，360mL)和雙氧水(含H2O2 1.1mol)溶液，加完升至室溫反應3小時。用乙酸乙酯(500mL×3)萃取，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(500mL×2)和水(500mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到淡黃色油狀液體(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二惡茂烷]-2-醇(1D-2)(30g)，直接用於下一步反應。
第四步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二惡茂烷]-2-酮(1E-2)
(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)spiro[bicyclo[3.2.0]heptane-6,2'-[1,3]dioxolan]-2-one
Figure 109130159-A0305-02-0037-76
向反應瓶中加入(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二惡茂烷]-2-醇(1D-2)(30g，0.11mol)和二氯甲烷(500mL)，冰浴下分批加入戴斯馬丁氧化劑(70g，0.17mol)，室溫反應2小時。向反應液中加入二氯甲烷(300mL)和硫代硫酸鈉水溶液(2M，500mL)，攪拌30分鐘，分液，水相用二氯甲烷(300mL×2)萃取，合併有機相，用氫氧化鈉溶液(2mol/L，500mL×2)和水(500mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物 用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=10：1)得到淡黃色油狀液體(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二惡茂烷]-2-酮(1E-2)(15g，產率：50%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.02-3.81(m,4H),3.40(dd,J=10.3,3.8Hz,2H),3.15(td,J=10.3,4.9Hz,2H),2.61(ddd,J=20.6,14.0,8.1Hz,2H),2.27(ddt,J=18.9,9.6,1.8Hz,1H),2.12-2.00(m,1H),1.99-1.70(m,3H)。
第五步：(±)-(1'S,3'R,6'R,8'S)-螺[[1,3]二惡茂烷-2,2'-三環[4.2.1.03,8]壬烷]-7'-酮(1F-2)
(±)-(1'S,3'R,6'R,8'S)-spiro[[1,3]dioxolane-2,2'-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan]-7'-one
Figure 109130159-A0305-02-0038-78
向反應瓶中加入第三丁醇鉀(0.58g，5.2mmol)和甲苯(40mL)，充氮氣保護，降溫至-15℃，滴加(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[雙環[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二惡茂烷]-2-酮(1E-2)的甲苯溶液(1.1g，1mmol，5mL)，-15℃反應1小時後升至0℃攪拌1小時。冰浴下滴加飽和氯化銨溶液至pH為7左右，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，有機相用水(80mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=8：1)得到淡黃色油狀物(±)-(1'S,3'R,6'R,8'S)-螺[[1,3]二惡茂烷-2,2'-三環[4.2.1.03,8]壬烷]-7'-酮(1F-2)(0.4g，產率：51%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.04-3.86(m,4H),3.20-3.07(m,1H),2.99-2.86(m,1H),2.53(ddd,J=8.6,5.6,1.7Hz,1H),2.41-2.24(m,2H),2.24 -2.01(m,2H),1.95(d,J=13.2Hz,1H),1.61(dddd,J=14.4,7.6,2.6,0.7Hz,1H),1.51-1.38(m,1H)。
第六步：(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S)-螺[[1,3]二惡茂烷-2,2'-三環[4.2.1.03,8]壬烷](1G-2)
(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S)--spiro[[1,3]dioxolane-2,2'-tricyclo[4.2.1.03,8]nonane]
Figure 109130159-A0305-02-0039-80
向反應瓶中加入(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S)-螺[[1,3]二惡茂烷-2,2'-三環[4.2.1.03,8]壬烷]-7'-酮(1F-2)(9.5g，49mmol)，一縮二乙二醇(170mL)，水合聯胺(18.4g，294mmol)和氫氧化鉀(16.5g，294mmol)，180℃反應3小時，70℃減壓旋蒸除水，升溫至220℃攪拌2小時，冷卻至室溫，向反應液中加入水(200mL)，用甲基第三丁基醚(300mL×3)萃取，合併有機相並順序用鹽酸(1M，500mL×2)和水(500mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=60：1)得到無色油狀物(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S-螺[[1,3]二惡茂烷-2,2'-三環[4.2.1.03,8]壬烷](1G-2)(5.6g)，不純化直接用於下一步。
第七步：(±)-(1S,6S,8S)-三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-酮(1H-2)
(±)-(1S,6S,8S)-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-one
Figure 109130159-A0305-02-0039-81
向反應瓶中加入(±)-(1'R,3'S,6'R,8'R)-螺[[1,3]二惡茂烷-2,2'-三環 [4.2.1.03,8]壬烷](1G-2)(5.6g，31mmol)，溶劑四氫呋喃(60mL)和水(20mL)，冰浴下滴加三氟醋酸(7g，62mmol)，45℃反應3小時，冰水浴下滴加飽和碳酸氫鈉溶液至pH為7左右，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有機相用水(200mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)得到白色固體(±)-(1S,6S,8S)-三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-酮(1H-2)(3.5g，產率：83%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.47-3.33(m,1H),3.19(dd,J=3.3,1.8Hz,1H),2.84-2.69(m,1H),2.47-2.32(m,1H),2.12-1.97(m,1H),1.93(d,J=12.3Hz,1H),1.82-1.69(m,1H),1.56-1.35(m,4H),1.27-1.10(m,1H)。
第八步：第三丁基2-(三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-葉立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(1I-2)
(±)-tert-butyl 2-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-ylidene)acetate(1R,3S,6R,8R and 1S,3R,6S,8S racemate)
Figure 109130159-A0305-02-0040-82
反應瓶中加入氫化鈉(60%，0.8g，33.4mmol)和四氫呋喃(80mL)，降溫至0℃，滴加二乙基磷醯乙酸第三丁酯(7.5g，33.4mmol)溶於四氫呋喃(10mL)的溶液，0℃下反應20分鐘後滴加(±)-(1R,3S,6R,8R)-三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-酮(1H-2)(3.5g，25.7mmol)的四氫呋喃(10mL)溶液，室溫反應2小時。向反應液中加入水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)，攪拌分液，水相用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合併乙酸乙酯並用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到淡黃色油狀粗品第三丁基2-(三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-葉立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋體)(1I-2)(5.1g)，直接用於下一步。
第九步：第三丁基2-(2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋體)(INT10)
(±)-tert-butyl 2-(2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(1R,2R,3S,6R,8R and 1S,2S,3R,6S,8S racemate)
Figure 109130159-A0305-02-0041-83
將上步所得粗品(±)-2-((1R,3S,6R,8R)-三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-亞基)乙酸第三丁酯(1I-2)(5g，24.3mmol)，硝基甲烷(90mL)和1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(6.6g，43.7mmol)依次加入反應瓶中，升溫至70℃反應6小時。向反應液中加入乙酸乙酯(100mL)和1M的鹽酸溶液(100mL)，攪拌分液，水相用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)，得到無色油狀液體(±)-2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸第三丁酯(INT10)(5g，產率：70%)。
第十步：(1'S,2'S,6'S,8'S)-螺[吡咯烷-3,2'-三環[4.2.1.03,8]壬]-5-酮
(1'S,2'S,6'S,8'S)-spiro[pyrrolidine-3,2'-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan]-5-one
Figure 109130159-A0305-02-0041-85
將INT10(75g，280.6mmol)加入到三頸燒瓶中，依次加入乙醇(400mL)、水(200mL)，攪拌下加入鐵粉(78.34g,1403mmol)，氯化銨(75.04g,1403mmol)，升溫至100℃攪拌5小時，抽濾，收集濾液，濃縮掉乙醇，剩餘部分以乙酸乙酯(800ml)萃取，乙酸乙酯用2M HCl洗滌，無水硫酸鈉乾燥有 機層，在30℃下減壓濃縮得白色固體INT11-A(52.0g,271.87mmol)。
第十一步：(1'S,2'S,6'S,8'S)-螺[吡咯烷-3,2'-三環[4.2.1.03,8]壬]-5-酮
(1'S,2'S,6'S,8'S)-spiro[pyrrolidine-3,2'-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan]-5-one
將化合物INT11-A(3g,16mmol)置於三頸燒瓶中，加入無水乙醇12mL，加熱至70℃，待固體全部溶解，邊攪拌邊降至室溫，析出固體，抽濾，濾餅用乙酸乙酯5mL洗滌一次，抽乾溶劑，得固體雜質C。
Ms m/z(ESI)：192.2[M+H+]。
Figure 109130159-A0305-02-0042-87
雜質D製備方法：第一步：甲基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
Methyl-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0043-16
將2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸INT6(2.10g,6.79mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入DMF(20mL)，碳酸鉀(1.35g,9.7mmol)，冰水浴下，緩慢滴加碘甲烷(1.35g,9.7mmol)，加畢，室溫反應2h，向反應液中加水30mL，用甲基第三丁基醚萃取(30mL×2)，合併有機相並用飽和食鹽水洗滌(50mL×3)，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得甲基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯INT12-A(1.9g,95%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 4.96(br,1H),3.65(s,3H),3.39(d,2H,J=10.4Hz),2.84(dd,1H,J=12.8Hz,5.2Hz),2.41-2.37(m,3H),2.28(dd,1H,J=12.0Hz,6.0Hz),2.07(m,1H),1.98(m,1H),1.72(m,1H),1.58-1.51(m,4H),1.44(s,9H),1.25-1.18(m,2H)。
第二步：甲基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸鹽
methyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate benzenesulfonate
Figure 109130159-A0305-02-0043-88
將甲基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯INT12-A(1.9g,5.8mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入苯磺酸(1.83g,11.6mmol)及乙腈20mL，加畢，升溫至80℃反應0.5h，冷卻至室溫，減壓濃縮得粘稠狀白色固體產物，向其中加入10mL甲基第三丁基醚打 漿，攪拌10min後，過濾，得白色固體甲基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸鹽雜質D。
Ms m/z(ESI)：224.2[M+H+]。
Figure 109130159-A0305-02-0044-89
雜質E製備方法：第一步：異丙基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
isopropyl-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0044-123
將2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸INT6(2.02g，6.47mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入DMF(20mL)，碳酸鉀(1.35g,14.5mmol)，冰水浴下，緩慢滴加碘代異丙烷(1.62g， 9.7mmol)，加畢，室溫反應2h，向反應液中加水30mL，用甲基第三丁基醚萃取(30mL×2)，合併有機相並用飽和食鹽水洗滌(50mL×3)，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得乙基-2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯INT13-A(2.2g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 4.99(m,2H),3.39(d,2H,J=5.6Hz),2.85(m,1H),2.39(m,1H),2.32(d,2H,J=3.2Hz),2.27(m,1H),2.07(m,1H),1.94(m,1H),1.72(m,1H),1.59-1.47(m,5H),1.44(s,9H),1.24(d,6H,J=6.0Hz),1.22(m,1H)。
第二步：異丙基2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸鹽
isopropyl 2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate benzenesulfonate
Figure 109130159-A0305-02-0045-93
將異丙基-2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯INT13-A(2.2g,6.26mmol)加入到圓底燒瓶中，依次加入苯磺酸(1.99g,12.52mmol)及乙腈22mL，加畢，升溫至80℃反應0.5h，冷卻至室溫，減壓濃縮得白色固體，向其中加入10mL甲基第三丁基醚打漿，攪拌5min後，過濾，得白色固體產物乙基2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸鹽雜質E。
Ms m/z(ESI)：252.2[M+H+]。
Figure 109130159-A0305-02-0045-119
Figure 109130159-A0305-02-0046-17
雜質F製備方法：第一步：乙基2-((1S,3R,6S,8S)-三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-亞甲基)乙酯(+/-)
ethyl 2-((1R,3S,6R,8R)-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-ylidene)acetate(+/-)
Figure 109130159-A0305-02-0046-95
將氫化鈉(266.55g,6.109mol)加入到三頸燒瓶中，氮氣保護，加入9L乾燥的四氫呋喃，攪拌，將反應體系降溫至0℃，滴加二甲氧基膦醯乙酸乙酯(1369.6g,6.109mmol)，加完保溫15min，滴加原料INT1(640g,4.699mol)的四氫呋喃溶液，加完自然升至室溫，反應1h。TLC監測反應完全，冰水浴下滴加飽和氯化銨至反應溶液pH到7-8，加水8L，然後分液。水相以乙酸乙酯萃取(4000mL)，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，管柱層析分離 (PE：EA=100：1)，得產物INT14(590g,2.860mol)。
第二步：乙基2-((1R,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酯(+/-)
ethyl 2-((1R,3S,6R,8R)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(+/-)
Figure 109130159-A0305-02-0047-18
將原料INT14(590g,2.860mol)加入反應瓶中，加入硝基甲烷6L，室溫下滴加DBU(826.5g,5.429mol)，加完80℃反應9小時左右，將反應液倒入到冰水中(4L)，DCM萃取(4L×2)，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，濃縮，然後管柱層析分離(PE：EA=200：1-30：1)，得產物INT15(507.9g,1.9mol)。
第三步拆分由INT15(507.9g,1.9mol)經SFC拆分，製備條件：儀器：Waters UPC2 analytical SFC(SFC-H)；層析管柱：ChiralPak AD,150×4.6mm I.D.,3μm；流動相：A for CO2 and B for MeOH(0.05%DEA)；梯度：B 5~40%；流速：2.5mL/min；管柱溫度為35℃。分離後得到兩個光學異構物：峰1(滯留時間：3.247分鐘)，其中，峰1為INT16(250g，187.1mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.74(q,2H),2.86(dt,1H),2.75-2.63(m,2H),2.53(ddd,1H),2.31(tt,2H),2.05(dt,1H),1.84-1.73(m,1H),1.68-1.55(m,4H),1.52(dd,1H),1.48-1.40(m,9H),1.31-1.23(m,1H)。
第四步：(1'R,2'R,3'S,6'R,8'R)-螺[吡咯烷-3,2'-三環[4.2.1.03,8]壬]-5-酮
(1'R,2'R,3'S,6'R,8'R)-spiro[pyrrolidine-3,2'- tricyclo[4.2.1.03,8]nonan]-5-one
Figure 109130159-A0305-02-0048-96
將INT16(50g，187.1mmol)加入到三頸燒瓶中，依次加入乙醇(200mL)、水(100mL)，攪拌下加入鐵粉(41.78g,748.2mmol)，氯化銨(40.02g,748.2mmol)，升溫至100℃攪拌5小時，抽濾，收集濾液，濃縮掉乙醇，剩餘部分以乙酸乙酯(600ml)萃取，有機相用2M HCl洗滌，無水硫酸鈉乾燥有機層，在30℃下減壓濃縮得白色固體INT17(40.16g)。將白色固體溶於乙酸乙酯200mL重結晶，升溫至80℃溶解，降溫攪拌析晶，抽濾，得濾餅濕重30.65g，油泵抽溶劑2小時，得白色固體INT17(28.30g)。
Ms m/z(ESI)：192.2[M+H+]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 6.06(br,1H),3.36-3.61(m,2H)2.81(dt,1H),2.45(ddd,1H),2.06-2.33(m,4H),1.89-2.01(m,1H),1.29-1.73(m,6H),1.12-1.23(m,1H)。
第五步：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸鹽
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid Benzenesulfonate
將化合物INT17(9.4g,49.2mmol)加入到120mL水中，攪拌加入苯磺酸(52.33g,282.87mmol)，升溫至120℃攪拌4小時，有白色固體析出，用LC-MS監測反應至反應完全，冷卻至室溫，抽濾，濾餅用冰水150mL洗滌3次，抽乾濾餅，濾餅用二氯甲烷150mL打漿三次，抽濾，得雜質F(13.07g)。
Ms m/z(ESI)：210.2[M+H+]。
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.83(ddd,2H),7.34-7.50(m,3H),3.24-3.39(m,2H),2.86(dt,1H),2.42-2.59(m,3H),2.32(dd,1H),1.94-2.19(m,2H),1.38-1.82(m,6H),1.22-1.31(m,1H)。
第六步：2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸鹽
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid Benzenesulfonate
將雜質F(13g,35.42mmol)加入到三頸燒瓶中，加入甲醇15mL,水34mL，升溫至85℃攪拌25分鐘，冷卻至室溫攪拌過夜，抽濾，濾餅用冰的混合溶劑(MeOH：H2O=3：1)洗滌，抽乾。得固體雜質F。
Ms m/z(ESI)：210.2[M+H+]。
雜質G製備方法：第一步：(1S,3R,6S,8S)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-醇
(1S,3R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-ol
Figure 109130159-A0305-02-0049-99
向反應瓶中加入INT1(72.3g，0.53mol)，硝基甲烷(1.0L)，DBU(80.8g，0.53mol)，室溫反應18h。加入飽和氯化銨水溶液(5L)，用二氯甲烷(2L×3)萃取，合併有機層，有機層乾燥，過濾，濃縮。矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1-10：1)得到黃色油狀物INT7(10.5g，收率10.1%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 4.73-4.40(m,2H),2.65-2.58(m,1H),2.51-2.44(m,1H),2.34(qd,2H),1.99-1.86(m,1H),1.80-1.44(m,6H),1.30-1.17(m,1H)。
第二步：(1S,3R,6S,8S)-2-(硝基亞甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷
(1S,3R,6S,8S)-2-(nitromethylene)tricyclo[4.2.1.03,8]nonane
Figure 109130159-A0305-02-0050-101
向反應瓶中加入INT7(0.50g，2.54mmol)，醋酐(10mL)，對甲苯磺酸(0.44g，2.54mmol)，室溫反應2h。冷卻至0℃，加入50ml飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌1h，用二氯甲烷(35ml×3)萃取，合併有機層，乾燥，過濾，濃縮。得到無色液體0.15g，直接用於下一步反應，溶於甲醇(8mL)，冷卻至0℃，加入甲醇鈉(0.03g，0.61mmol)，室溫反應2h。加入20mL飽和氯化銨水溶液，用二氯甲烷(40ml×3)萃取，合併有機層，有機層乾燥，過濾，濃縮。矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)得到黃色油狀物INT8(0.08g，收率74.1%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 6.87(dd,1H),3.94-3.61(m,1H),3.25(ddd,1H),3.01-2.80(m,1H),2.39(td,1H),2.12-1.76(m,4H),1.73-1.51(m,1H),1.48-1.23(m,3H)。
第三步：第三丁基2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(硝基亞甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0051-21
向反應瓶中加入1M雙(三甲矽基)胺基鋰(290mL，0.29mol)，氮氣保護，冷卻至-60℃，滴加乙酸第三丁酯(33.62g，0.29mmol)的四氫呋喃(150mL)溶液，攪拌20mins，滴加INT8(28.82g,0.16mol)的四氫呋喃(250mL)溶液，-60℃反應2h。加入飽和氯化銨水溶液(400mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合併有機層，有機層乾燥，過濾，濃縮。矽膠管柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)=100：1)得到無色液體INT9(39.4g，收率84.8%)。掌性拆分，(製備條件：儀器：Waters UPC2 analytical SFC(SFC-H)；層析管柱：ChiralPak AD,150×4.6mm I.D.,3μm；流動相：A for CO2 and B for EtOH(0.05%DEA)；梯度：B 5~40%；流速：2.5mL/min；管柱溫度為35℃。)分離後得到兩個光學異構物：峰1(滯留時間：2.452分鐘，9.33g)，其中，峰1為(+)-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸第三丁酯(INT18)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.74(q,2H),2.86(dt,1H),2.75-2.63(m,2H),2.53(ddd,1H),2.31(tt,2H),2.05(dt,1H),1.84-1.73(m,1H),1.68-1.55(m,4H),1.52(dd,1H),1.48-1.40(m,9H),1.31-1.23(m,1H)。
第四步：第三丁基2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0051-102
向反應瓶中加入(+)-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸第三丁酯(INT18，8.33g,28.1mmol)，乙醇(50mL)，水(25mL)，鐵粉(7.87g，0.14mol)，氯化銨(7.56g，0.14mol)，回流反應7h。冷至室溫後，過濾，用乙醇(150ml)沖洗濾餅，加入100ml水，用二氯甲烷(100ml×3)萃取，合併有機層，有機層乾燥，過濾，濃縮，矽膠管柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)=50：1,10：1)得到淡黃色油狀物INT19(7.49g，產率99.4%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.14(d,2H),2.89-2.72(m,3H),2.52-2.42(m,1H),2.35-2.18(m,2H),2.05-1.93(m,1H),1.78-1.68(m,1H),1.64-1.40(m,13H),1.33-1.17(m,2H)。
第五步：2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環lo[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure 109130159-A0305-02-0052-103
向反應瓶中加入INT19(7.4g，2.79mmol)，二氯甲烷(50mL)，冰浴下滴加三氟醋酸(50mL)，加畢於室溫反應2小時，減壓濃縮，將殘留物溶於二氯甲烷(100mL)中，加入三乙胺至溶液pH為7-8，過濾，得到白色固體INT20(3.9g，產率：67.0%)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 3.00(dt,3H),2.72(s,2H),2.49(s,1H),2.32(d,1H),2.16(s,1H),2.03(t,1H),1.76(s,1H),1.67(d,2H),1.58-1.46(m,2H),1.47-1.37(m,1H),1.30-1.20(m,1H)。
第六步：2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure 109130159-A0305-02-0053-104
向反應瓶中加入INT20(4.58g，21.9mmol)，四氫呋喃(60ml)，氫氧化鈉(2.02g，50.4mmol)的50ml水溶液，冷卻至0℃，滴加二碳酸二第三丁酯(5.25g，24.1mmol)的45ml四氫呋喃溶液，室溫反應2h。補加氫氧化鈉(1.01g，25.2mmol)，二碳酸二第三丁酯(2.62g，12.0mmol)，室溫反應1h。用石油醚：乙酸乙酯(5：1)(100ml×3)的混合溶液洗滌，合併有機層，用100ml純水萃取1次，合併水層，加入磷酸二氫鈉調至pH為4左右，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合併有機層，濃縮，加入80ml環己烷，攪拌，加熱至回流，溶解，冷卻至室溫析出固體，過濾，得到白色固體INT21(6.4g，99%)，不純化直接下一步。
第七步：2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸鹽
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid benzenesulfonate
Figure 109130159-A0305-02-0053-106
向反應瓶中加入INT21(5.9g，19.1mmol)，水(47ml)，苯磺酸(7.1g，38.2mmol)，加熱至100℃反應2h。冷卻至室溫，過濾得到白色固 體雜質G。
Figure 109130159-A0305-02-0054-108
Ms m/z(ESI)：210.2[M+H+]。
雜質H製備方法：第一步：第三丁基-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0054-109
INT9掌性拆分，製備條件：儀器：Waters UPC2 analytical SFC (SFC-H)；層析管柱：ChiralPak AD,150×4.6mm I.D.,3μm；流動相：A for CO2 and B for EtOH(0.05%DEA)；梯度：B 5~40%；流速：2.5mL/min；管柱溫度為35℃。分離後得到兩個光學異構物：峰2(滯留時間：3.247分鐘，8.68g)，其中，峰2為(-)-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸第三丁酯(INT22)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 4.74(q,2H),2.86(dt,1H),2.75-2.63(m,2H),2.53(ddd,1H),2.31(tt,2H),2.05(dt,1H),1.84-1.73(m,1H),1.68-1.55(m,4H),1.52(dd,1H),1.48-1.40(m,9H),1.31-1.23(m,1H)。
第二步：第三丁基-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate
Figure 109130159-A0305-02-0055-111
向反應瓶中加入INT22(7.3g,24.7mmol)，乙醇(50mL)，水(25mL)，鐵粉(6.9g，123.6mmol)，氯化銨(6.6g，123.6mmol)，回流反應6h。冷至室溫後，過濾，用乙醇(60ml×2)洗滌濾餅，合併濾液濃縮除去乙醇，加入150ml水，用二氯甲烷(300ml×2)萃取，合併有機層，有機層乾燥，過濾，濃縮得到白色固體INT23(6.56g，產率100%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 3.14(d,2H),2.89-2.72(m,3H),2.52-2.42(m,1H),2.35-2.18(m,2H),2.05-1.93(m,1H),1.78-1.68(m,1H),1.64-1.40(m,13H),1.33-1.17(m,2H)。
第三步：2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基) 乙酸
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure 109130159-A0305-02-0056-112
向反應瓶中加入INT23(6.56g，24.7mmol)，和二氯甲烷(60mL)，滴加三氟醋酸(60mL)，加畢於室溫反應3小時，減壓濃縮，將殘留物溶於二氯甲烷(150mL)中，加入三乙胺至溶液pH為7-8，抽濾，用二氯甲烷(20mL×3)洗滌濾餅，得到白色固體INT24(4.0g，產率：77.3%)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 3.00(dt,3H),2.72(s,2H),2.49(s,1H),2.32(d,1H),2.16(s,1H),2.03(t,1H),1.76(s,1H),1.67(d,2H),1.58-1.46(m,2H),1.47-1.37(m,1H),1.30-1.20(m,1H)。
第四步：2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(((第三丁氧羰基)胺基)甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸
2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure 109130159-A0305-02-0056-113
向反應瓶中加入INT24(4.47g，22.7mmol)，四氫呋喃(60ml)，氫氧化鈉(2.27g，56.7mmol)的50ml水溶液，冷卻至0℃，滴加二碳酸二第三丁酯(9.91g，45.4mmol)的45ml四氫呋喃溶液，室溫反應2h。補加氫氧化鈉(1.1g，27.5mmol)，二碳酸二第三丁酯(2.62g，12.0mmol)，室溫反應1h。用 石油醚：乙酸乙酯(5：1)的混合溶液(100ml×3)洗滌反應溶液，合併有機層，用100ml純水萃取1次，合併水層，加入磷酸二氫鈉調至pH為4左右，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合併有機層，濃縮，加入80ml環己烷，攪拌，加熱至回流，溶解，冷卻至室溫析出固體，過濾，得到白色固體INT25(5.5g，83.3%)，不純化直接下一步。
第五步：2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(胺基甲基)三環[4.2.1.03,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸鹽
2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetic acid
向反應瓶中加入INT25(5.0g，16.2mmol)，水(40ml)，苯磺酸(6.0g，32.4mmol)，加熱至100℃反應2h。冷卻至室溫，過濾得到白色固體雜質H。
Figure 109130159-A0305-02-0057-116
Figure 109130159-A0305-02-0001-1

Claims (43)

  1. 一種2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的組合物中有關物質I的檢測方法，其中，所述有關物質I結構式為
    Figure 109130159-A0305-02-0058-24
    和
    Figure 109130159-A0305-02-0058-23
    ，所述檢測方法採用HPLC-CAD方法檢測，所述方法包括以下步驟：1)有關物質I供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物加入稀釋劑製備有關物質I供試品溶液；2)有關物質I對照溶液製備：取步驟1)得到的有關物質I供試品溶液加入稀釋劑稀釋100倍，即得；3)將步驟1)得到的有關物質I供試品溶液和步驟2)得到的有關物質I對照溶液注入液相層析儀，層析條件為：層析管柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠柱 (4.6×250mm，5μm)；流動相：A：10mM甲酸銨溶液、B：乙腈；梯度沖提程序：0~5min，A 90%；5~25min，A 90%→40%；25~29min，A 40%→20%；29~35min，A 20%；35~36min，A20%→90%；36~40min，A 90%；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；CAD參數：霧化溫度50℃，採集頻率5.0Hz，濾光片5。
  2. 如請求項1所述的檢測方法，其中，步驟1)或步驟2)中的稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  3. 如請求項1所述的檢測方法，其中，步驟1)有關物質I供試品溶液製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物50mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，即得；所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  4. 如請求項1所述的檢測方法，其中，步驟1)得到的有關物質I供試品溶液濃度為5mg/mL。
  5. 如請求項1所述的檢測方法，其中，步驟2)有關物質I對照溶液製備包括：精密量取步驟1)得到的有關物質I供試品溶液1.0mL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的檢測方法，其中，所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  7. 如請求項1-5中任一項所述的檢測方法，其中，所述稀釋劑為10mM甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  8. 如請求項1-5中任一項所述的檢測方法，其中，所述稀釋劑為10mM甲酸銨：乙腈體積比=80：20的混合溶劑。
  9. 一種2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的組合物中有關物質Ⅱ的檢測方法，其中，有關物質Ⅱ包括雜質A、B、C、D、E：雜質名稱 結構式
    Figure 109130159-A0305-02-0060-25
     所述檢測方法採用LC-MS進行檢測，包括以下步驟：1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備：取有關物質Ⅱ對照品加稀釋劑溶解得到有關物質Ⅱ對照品溶液；2)有關物質Ⅱ供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物製備有關物質Ⅱ供試品溶液；3)將步驟1)得到的有關物質Ⅱ對照品溶液和步驟2)得到的有關物質Ⅱ供試品溶液注入液相層析儀，層析條件為：層析管柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠柱 (4.6×250mm，3.5μm)；流動相：A：10mM甲酸銨溶液、B：乙腈；梯度沖提程序：0~15min，A 70%→30%；15~16min，A 30%→10%；16~18min，A 10%；18~20min，10%→70%；20~25min，A70%；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)。
  10. 如請求項9所述的檢測方法，其中，步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備包括：取有關物質Ⅱ對照品加入稀釋劑溶解並稀釋得到有關物質Ⅱ對照品溶液。
  11. 如請求項9所述的檢測方法，其中，步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備包括：精密稱取有關物質Ⅱ對照品25mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為有關物質Ⅱ對照品儲備液；精密量取有關物質Ⅱ對照品儲備液100μL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得；或分別稱取雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E對照品10mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋配製成每1mL含1mg的溶液，作為對照品儲備液；精密量取雜質A、雜質D、雜質E對照品儲備液各25μL，雜質C對照品儲備液50μL、雜質B對照品儲備液200μL至100mL量瓶，加稀釋劑稀釋製成每1mL含雜質A、雜質D、雜質E約0.25μg，雜質B約2μg、雜質C約0.5μg的混合溶液作為對照品溶液。
  12. 如請求項10或11所述的檢測方法，其中，步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備中所述稀釋劑為乙腈和水的混合溶劑。
  13. 如請求項10或11所述的檢測方法，其中，步驟1)有關物質Ⅱ對照品溶液製備中所述稀釋劑為乙腈：水體積比=5：1。
  14. 如請求項9-11中任一項所述的檢測方法，其中，步驟1)得到的有關物質Ⅱ對照品溶液濃度為2.5μg/mL或1μg/mL。
  15. 如請求項9所述的檢測方法，其中，步驟2)中有關物質Ⅱ供試品溶液製備包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物加入稀釋劑溶解並稀釋得到有關物質Ⅱ供試品溶液。
  16. 如請求項15所述的檢測方法，其中，步驟2)有關物質Ⅱ供試品溶液製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物25mg至25mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度搖勻，即得。
  17. 如請求項15或16所述的檢測方法，其中，步驟2)有關物質Ⅱ供試品溶液製備中所述稀釋劑為乙腈和水的混合溶劑。
  18. 如請求項15或16所述的檢測方法，其中，步驟2)有關物質Ⅱ供試品溶液製備中所述稀釋劑為乙腈：水體積比=5：1。
  19. 如請求項9-11中任一項所述的檢測方法，其中，步驟2)得到的有關物質Ⅱ供試品溶液濃度為1mg/mL。
  20. 一種2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的組合物中掌性異構物的檢測方法，其中，掌性異構物包括雜質F、G、H，所述雜質F、G、H如下：
    Figure 109130159-A0305-02-0062-26
     所述檢測方法採用LC-MS進行檢測，包括下述步驟： 1)掌性異構物對照品溶液製備：取掌性異構物對照品適量，用稀釋劑溶解並製備異構物對照品溶液；2)掌性異構物供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物製備掌性異構物供試品溶液；3)將步驟1)得到的掌性異構物對照品溶液和步驟2)得到的掌性異構物供試品溶液注入液相層析儀，層析條件為：層析管柱：CROWNPAK CR-I(+) (3×150mm，5μm)；流動相：A：高氯酸溶液(pH1.3)、B：乙腈；沖提程序：流動相A：流動相B=80：20等度沖提35分鐘；流速：0.2mL/min；柱溫：20℃；MS參數：ESI離子源，霧化室壓力35psig，乾燥氣流速12L/min，乾燥氣溫度350℃，檢測模式SIM(+)。
  21. 如請求項20所述的檢測方法，其中，步驟1)掌性異構物對照品溶液製備包括：取掌性異構物對照品加入稀釋劑溶解並稀釋得到掌性異構物對照品溶液。
  22. 如請求項21所述的檢測方法，其中，步驟1)掌性異構物對照品溶液製備包括：精密稱取掌性異構物對照品10mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為對照品儲備液；精密量取對照品儲備液100μL至100mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得；或分別稱取雜質F、雜質G(或雜質H)對照品10mg，精密稱定，置於10mL量瓶中，用稀釋劑(乙腈：水=1：4)溶解稀釋配製成每1mL含1mg的溶液，作為對照品儲備液；精密量取雜質F、雜質G(或雜質H)對照品儲備液100μL至 100mL量瓶中，用稀釋劑稀釋製成每1mL中含雜質F 1μg、雜質G(或雜質H)1μg的混合溶液，作為對照品溶液。
  23. 如請求項20或21所述的檢測方法，其中，步驟1)掌性異構物對照品溶液製備中所述稀釋劑為乙腈和水的混合溶劑。
  24. 如請求項23所述的檢測方法，其中，步驟1)掌性異構物對照品溶液製備中乙腈：水體積比=20：80。
  25. 如請求項20-22中任一項所述的檢測方法，其中，步驟1)得到的掌性異構物對照品溶液濃度為1μg/mL。
  26. 如請求項20所述的檢測方法，其中，步驟2)掌性異構物供試品溶液製備包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物加入稀釋劑得到掌性異構物供試品溶液。
  27. 如請求項26所述的檢測方法，其中，步驟2)掌性異構物供試品溶液製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物10mg，至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為供試品儲備液；精密量取供試品儲備液1mL至10mL容量瓶，加稀釋劑定容至刻度，搖勻，即得。
  28. 如請求項26或27所述的檢測方法，其中，步驟2)掌性異構物供試品溶液製備中所述稀釋劑為乙腈和水的混合溶劑。
  29. 如請求項28所述的檢測方法，其中，步驟2)掌性異構物供試品溶液製備中乙腈：水體積比=20：80。
  30. 如請求項20-22中任一項所述的檢測方法，其中，步驟2)得到的掌性異構物供試品溶液濃度為0.1mg/mL。
  31. 一種2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽的組合物含量檢測方法，所述檢測方法採用HPLC-CAD方法檢測，包括以下步驟：1)含量供試品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物製備含量供試品溶液；2)含量對照品溶液製備：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽對照品製備含量對照品溶液；3)將步驟1)得到的含量供試品溶液和步驟2)得到的含量對照品溶液注入層析儀，層析條件為：層析管柱：十八烷基矽烷鍵合矽膠柱 (4.6×250mm，5μm)；流動相：A：10mM甲酸銨溶液、B：乙腈；梯度沖提程序：0~5min，A 90%；5~25min，A 90%→40%；25~29min，A 40%→20%；29~35min，A 20%；35~36min，A20%→90%；36~40min，A 90%；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；CAD參數：霧化溫度50℃，採集頻率5.0Hz，濾光片5。
  32. 如請求項31所述的檢測方法，其中，步驟1)含量供試品溶液製備包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物加入稀釋劑溶解並稀釋得到含量供試品溶液。
  33. 如請求項32所述的檢測方法，其中，步驟1)含量供試品溶液 製備包括：精密稱取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(胺甲基)三環[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸鹽或其組合物10mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為供試品儲備液；精密量取供試品儲備液0.5mL至10mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。
  34. 如請求項32或33所述的檢測方法，其中，步驟1)含量供試品溶液製備中所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  35. 如請求項34所述的檢測方法，其中，所述甲酸銨濃度為10mM。
  36. 如請求項35所述的檢測方法，其中，所述10mM甲酸銨：乙腈體積比=80：20。
  37. 如請求項31-33中任一項所述的檢測方法，其中，步驟1)得到的含量供試品溶液濃度為0.05mg/mL。
  38. 如請求項31所述的檢測方法，其中，步驟2)含量對照品溶液製備包括：取含量對照品加入稀釋劑溶解並稀釋得到含量對照品溶液。
  39. 如請求項38所述的檢測方法，其中，步驟2)含量對照品溶液製備中所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  40. 如請求項38所述的檢測方法，其中，步驟2)含量對照品溶液製備包括：精密稱取含量對照品10mg至10mL容量瓶，加稀釋劑溶解並稀釋至刻度，作為含量對照品儲備液；精密量取含量對照品儲備液0.5mL至10mL容量瓶，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得；所述稀釋劑為甲酸銨與乙腈的混合溶劑。
  41. 如請求項39或40所述的檢測方法，其中，所述甲酸銨濃度為10mM。
  42. 如請求項41所述的檢測方法，其中，所述10mM甲酸銨：乙腈體積比=80：20。
  43. 如請求項31-33中任一項所述的檢測方法，其中，步驟2)得到的含量對照品溶液濃度為0.05mg/mL。
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