CN111337619B - 离子色谱法分析伊班膦酸钠药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种新的检测伊班膦酸钠药物质量的方法，以简化现有技术中的分析步骤。该方法包括以下步骤：1)制备对照品溶液：取亚磷酸、磷酸对照品，制成亚磷酸进样浓度0.0500μg/ml～12.0000μg/ml，磷酸进样浓度0.1000μg/ml～18.0000μg/ml的对照品溶液；2)制备供试品溶液：取伊班膦酸钠注射液样品，作为制剂供试品溶液，或者，取伊班膦酸钠原料，加水定量稀释制成每1ml中含0.6‑6.0mg的溶液，作为原料供试品溶液，2)分别将各供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，分别获得色谱图，本发明采用离子色谱柱Thermo Dionex Ionpac AS11为分析柱，并采用特定的洗脱程序。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种离子色谱检测伊班膦酸钠的方法。
背景技术
伊班膦酸钠，化学名称为：1-羟基-3-(N-甲基-戊胺基)-亚丙基二膦酸一钠盐一水合物，临床上用于治疗绝经后骨质疏松症、恶性肿瘤溶骨性骨转移以及伴有或不伴有骨转移的恶性肿瘤引起的高钙血症，目前的剂型为注射液。在该药物的最后一步合成中，通常会产生诸如亚磷酸根、磷酸根、1-羟基-3-戊胺基-亚丙基二膦酸、1-羟基-3-甲胺基-亚丙基二膦酸等杂质。伊班膦酸钠和这些杂质的结构皆没有发色基团，也不具备电化学活性，故不能用常规的紫外、荧光或电化学分析方法检测。
目前报道伊班膦酸钠及伊班膦酸钠注射液有关物质检测方法的文献较少，且没有文献能在一个方法中同时检测亚磷酸根、磷酸根、杂质B(1-羟基-3-戊胺基-亚丙基二膦酸)、杂质C(1-羟基-3-甲胺基-亚丙基二膦酸)及其他未知杂质，并能排除氯离子、碳酸根、硫酸根的干扰。
CN103134886A采用高效液相色谱紫外检测法检测伊班膦酸钠原料药中的有关物质，但该检测方法针对的是中间体杂质I(3-N-甲基-N正戊基胺丙酸)和成品的降解产物杂质II(1-羟基-3-戊胺基-亚丙基二膦酸)，其无法对伊班膦酸钠原料药的国家药品标准中主要控制的亚磷酸和磷酸杂质进行检测。
CN109668975A采用高效液相色谱电雾式检测器(CAD检测器)，检测伊班膦酸钠注射液中的有关物质，样品需经Ag、H型强酸性阳离子交换树脂前处理小柱处理，其样品处理过程稍繁琐，而且对部分物质的灵敏度有待提高。
发明内容
本发明提出一种新的检测伊班膦酸钠药物质量的方法，同时采用外标法以磷酸峰面积计算有机杂质(杂质B、杂质C及未知杂质)的含量，以简化现有技术中的分析步骤，降低分析的费用成本。该方法包括以下步骤：
1)制备对照品溶液：取亚磷酸、磷酸对照品，制成亚磷酸进样浓度0.0500μg/ml～12.0000μg/ml，磷酸进样浓度0.1000μg/ml～18.0000μg/ml的对照品溶液；
2)制备供试品溶液：取伊班膦酸钠注射液样品，作为制剂供试品溶液，或者，取伊班膦酸钠原料，加水定量稀释制成每1ml中含0.6-6.0mg的溶液，作为原料供试品溶液；
2)分别将各供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，分别获得色谱图，色谱条件为：
色谱柱：分析柱Thermo Dionex Ionpac AS11
检测器：电导检测器
淋洗液：氢氧化钾溶液
梯度程序：
柱温：40-45℃
根据本发明的供试品溶液制作方法操作，具有较高的精密度、稳定性和重现性，系统适用性强，可适用于该类化合物的制作。所建立的高效液相色谱分析方法灵敏度高，而且较现有技术简化了操作步骤。
附图说明
图1显示采用本发明的色谱条件在3种柱温下的分离效果。
图2是系统适用性溶液色谱图。
图3是制剂供试品溶液色谱图。
图4是原料供试品溶液色谱图。
具体实施方式
供试品与对照品溶液的制备
在典型的实施例中，为制备对照品溶液，取亚磷酸、磷酸对照品各适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含亚磷酸2μg、磷酸3μg的溶液，作为对照品溶液。
在典型的实施例中，为制备供试品溶液，取伊班膦酸钠注射液样品，作为制剂供试品溶液，或者，取伊班膦酸钠原料适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为原料供试品溶液。
色谱条件
色谱柱：分析柱：Thermo Dionex Ionpac AS11
检测器：ECD(电导检测器)
淋洗液：KOH溶液
梯度程序：
柱温：40-45℃，
流速：1.0ml/min。
更优选的实施方式是，分析柱的规格为4mm×250mm，并且采用4mm×50mm的ThermoDionex Ionpac AG11色谱柱作为保护柱。
本发明采用上述条件，比现有技术提高了杂质的检测灵敏度，而且相对简化了操作步骤。
本发明方法学验证和典型实施例中使用的试剂列于表1中。
表1实验样品和试剂信息
| 试剂/样品名称 | 生产厂家 | 批号 | 含量/规格 |
| 伊班膦酸钠原料药 | 湖南方盛制药股份有限公司 | 171002 | / |
| 伊班膦酸钠注射液 | 湖南方盛制药股份有限公司 | 170901 | 2ml:2mg |
| 空白辅料溶液 | 湖南方盛制药股份有限公司 | 171201 | / |
| 磷酸对照品 | 中国药品生物制品检定研究院 | 101195-201601 | 1.00mg/ml |
| 亚磷酸对照品 | 中国药品生物制品检定研究院 | 101194-201601 | 1.00mg/ml |
| 杂质B | TLC | 2310-053A3 | 93.0％ |
| 杂质C | TLC | 2641-091A3 | 90.2％ |
| 无水碳酸钠 | 国药集团 | 20150824 | / |
| 无水硫酸钠 | 国药集团 | 20140916 | / |
| 氯化钠 | 国药集团 | 20140818 | / |
| 醋酸钠 | 国药集团 | 20120808 | / |
| 水 | 湖南方盛制药股份有限公司 | / | 超纯水 |
表1中，杂质B为1-羟基-3-戊胺基-亚丙基二膦酸；杂质C为1-羟基-3-甲胺基-亚丙基二膦酸；空白辅料溶液为按伊班膦酸钠注射液处方比例配制的不含主成分(伊班膦酸钠)的溶液。
图1显示采用本发明的色谱条件在3种柱温下的分离效果。从图中1可以看出，在柱温为35℃时，磷酸根峰与杂质B峰未分离，可能是杂质B峰的保留时间对柱温较敏感，增加柱温，杂质B峰保留时间延后，为保证方法的耐用性，将本方法柱温调整为42℃，使磷酸根峰与杂质B峰分离度符合要求。
系统适用性和专属性试验
溶液的配制包括：
空白溶剂：取超纯水即得。
系统适用性溶液：取伊班膦酸钠及氯化钠、亚磷酸、碳酸钠、硫酸钠、磷酸、杂质B各适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含伊班膦酸钠1mg及氯离子、亚磷酸根、碳酸根、硫酸根、杂质B各3μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
对照品溶液：称取杂质B 5.49mg、杂质C 5.56mg、精密量取磷酸对照品1ml、亚磷酸对照品1ml，加水溶解并定量稀释制成每1ml分别含杂质B1.0211μg、杂质C1.0030μg、磷酸3.0000μg、亚磷酸2.0000μg的混合溶液，作为对照品溶液1。同法配制对照品溶液2，上述各杂质对照品的取样量分别为5.48mg、5.38mg、1ml和1ml。
干扰离子定位溶液：称取碳酸钠、硫酸钠、醋酸钠和氯化钠，分别置不同的量瓶中，加水定量稀释制成一定浓度的溶液，作为各干扰离子定位溶液。
制剂供试品溶液：取伊班膦酸钠注射液样品，作为供试品溶液。
原料供试品溶液：取伊班膦酸钠原料适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。
测定结果表明，空白溶剂及供试品溶液中无干扰已知杂质峰(磷酸、亚磷酸、杂质B和杂质C)测定的色谱峰；亚磷酸根峰与碳酸根峰之间的分离度、磷酸根峰与杂质B峰之间的分离度、伊班膦酸峰与磷酸根峰之间的分离度均≥1.5，均符合要求，色谱图见图2～4；对照品溶液1连续进样6针，亚磷酸根、磷酸根、杂质B和杂质C峰面积的RSD分别为0.5％、0.4％、6.2％和1.8％，对照品溶液2各杂质的回收率在96.2％～103.3％之间，系统适用性良好，测定结果见表2。
表2系统适用性试验结果
线性试验
取磷酸、亚磷酸、杂质B、杂质C、伊班膦酸钠对照品各适量，加水溶解并定量稀释制成一系列浓度的线性溶液，精密量取10μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，以浓度C(μg/ml)(x轴)与其对应峰面积A(y轴)绘制回归曲线，计算回归方程和相关系数。
在线性范围内，各杂质线性方程相关系数r均≥0.990，线性关系良好，测定结果见表3。
表3线性试验结果
结果表明，亚磷酸进样浓度在0.0500μg/ml～12.0000μg/ml(相当于供试品溶液中伊班膦酸钠浓度的0.005％～1.2％)峰面积与浓度的线性关系良好，线性方程：y＝0.0131x-0.0001，r＝0.9999；磷酸进样浓度在0.1000μg/ml～18.0000μg/ml(相当于供试品溶液中伊班膦酸钠浓度的0.01％～1.8％)，峰面积与浓度的线性关系良好，线性方程：y＝0.0109x-0.0008，r＝0.9999；杂质B进样浓度在0.6382μg/ml～6.1268μg/ml(相当于供试品溶液中伊班膦酸钠浓度的0.06％～0.6％)，峰面积与浓度的线性关系良好，线性方程：y＝0.0031x-0.0006，r＝0.9995，相对于磷酸校正因子F＝3.5；杂质C进样浓度在0.2508μg/ml～6.0181μg/ml(相当于供试品溶液中伊班膦酸钠浓度的0.025％～0.6％)，峰面积与浓度的线性关系良好，线性方程：y＝0.0049x-0.0002，r＝0.9998，相对磷酸校正因子F＝2.2。
检测限、定量限试验
取各杂质对照品，加水溶解并逐步稀释制成各杂质的检测限和定量限溶液。精密量取10μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，按信噪比S/N约为10确立定量限，信噪比S/N约为3确立检测限，定量限连续进样6次，考察各杂质峰面积的RSD。
各杂质的检测限及定量限均满足方法灵敏度要求，定量限均不大于供试品浓度的0.05％；定量限溶液连续进样6针，各杂质峰面积的RSD值均小于10.0％，测定结果见表4～5。
表4定量限及检测限试验结果
| 名称 | 磷酸 | 亚磷酸 | 杂质B | 杂质C |
| 定量限溶液S/N | 14.0 | 13.6 | 13.1 | 16.1 |
| 定量限浓度(μg/ml) | 0.08 | 0.04 | 0.5 | 0.2 |
| 相当于供试品浓度％ | 0.008 | 0.004 | 0.05 | 0.02 |
| 检测限溶液S/N | 5.3 | 4.9 | 4.7 | 6.4 |
| 检测限浓度(μg/ml) | 0.04 | 0.02 | 0.25 | 0.10 |
| 相当于供试品浓度％ | 0.004 | 0.002 | 0.025 | 0.010 |
表5杂质定量限精密度试验结果
精密度试验
制剂测试试验取伊班膦酸钠注射液20支，分装为6份供试品溶液，精密量取10μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，测定结果见表6。
表6制剂重复性试验结果
结果显示，6份供试品溶液中均未检出未知杂质，各已知杂质含量及总杂质含量的最大差值均不大于限度的20％，本方法重复性良好。
原料(药)测试试验取伊班膦酸钠原料，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，平行配制6份，称样量分别为10.18mg、10.11mg、10.06mg、10.33mg、10.20mg和10.12mg，精密量取10μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，测定结果见表7。
表7原料重复性试验结果
结果显示，6份供试品溶液中均未检出未知杂质，各已知杂质含量及总杂质含量测定结果RSD均小于10.0％，本方法重复性良好。
准确度试验
制剂测试(注射液)
称取伊班膦酸钠原料及各杂质对照品适量，加空白辅料溶解配制成各杂质加入浓度约为各杂质限度浓度的50％、100％及150％的杂质加标供试品溶液，各浓度平行配制三份；另取杂质对照品各适量，按照限度浓度配制杂质对照品溶液。
精密量取供试品溶液与杂质对照品溶液各10μl，分别注入离子色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算各已知杂质的回收率，测定结果显示，浓度约为各杂质限度浓度的50～150％时，各已知杂质的平均回收率均在80.0％～120.0％之间，本方法准确度良好，测定结果具体见表8～11。
表8磷酸准确度试验结果
表9亚磷酸准确度试验结果
表10杂质B准确度试验结果
表11杂质C准确度试验结果
原料(药)测试
称取伊班膦酸钠原料及各杂质对照品适量，加水溶解配制成各杂质加入浓度约为各杂质限度浓度的50％、100％及150％的杂质加标供试品溶液，各浓度平行配制三份；另取杂质对照品各适量，按照限度浓度配制杂质对照品溶液。
精密量取供试品溶液与杂质对照品溶液各10μl，分别注入离子色谱仪，记录色谱图，以峰面积计算各已知杂质的回收率，测定结果显示，浓度约为各杂质限度浓度的50～150％时，各已知杂质的平均回收率均在80.0％～120.0％之间，本方法准确度良好，测定结果具体见表12～15。
表12磷酸准确度试验结果
表13亚磷酸准确度试验结果
表14杂质B准确度试验结果
表15杂质C准确度试验结果
方法耐用性试验
取伊班膦酸钠注射液样品，直接作为制剂供试品溶液；取伊班膦酸钠原料适量，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含本品1mg的溶液，作为原料供试品溶液；取磷酸、亚磷酸、杂质B和杂质C各适量，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含磷酸3μg，亚磷酸2μg，杂质B1μg和杂质C1μg的混合溶液，作为对照品溶液；取氯化钠、亚磷酸、碳酸钠、硫酸钠、磷酸、杂质B、伊班膦酸钠各适量，加水使溶解并稀释制成每1ml中约含氯离子、亚磷酸、碳酸根、硫酸根、磷酸、杂质B各3μg和伊班膦酸钠1mg的溶液，作为系统适用性溶液。分别在柱流量变化±0.1ml/min、柱温变化±2℃等条件下，精密量取10μl，注入离子色谱仪，记录色谱图。考察各条件下供试品溶液中已知杂质含量的变化量，测定结果见表16～18。
表16方法耐用性试验制剂样品中杂质含量测定结果
表17方法耐用性试验原料供试品中杂质含量测定结果
表18方法耐用性试验系统适用性结果
结论：上述色谱条件下，系统适用性均符合要求，制剂及原料供试品溶液中检出杂质个数一致，各已知杂质含量测定结果变化量均小于限度的20％，本方法耐用性较好。
计算方法
本发明中，考虑准确性和易操作性，亚磷酸和磷酸对照品易于购买，故本品亚磷酸盐和磷酸盐的含量采用外标法进行计算；杂质B、C对照品很难获得，需定制，货期长，且价格昂贵，故杂质B、C及未知杂质的含量测定采用加校正因子的方法进行，杂质B、C按外标法以磷酸峰面积进行计算，并乘以校正因子。由于未知杂质一般与主成分的结构相似，故单个未知杂质相对于磷酸的校正因子与伊班膦酸钠相对于磷酸的校正因子基本一致。本发明通过方法验证获得各自的校正因子。
在分析注射液制剂时，制剂中亚磷酸盐与磷酸盐含量的计算公式为：
其中：AX为供试品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；AS为对照品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；CS为对照品溶液中亚磷酸或磷酸的浓度(μg/ml)；1为供试品溶液中主药的标示浓度(mg/ml)。
在分析注射液制剂时，制剂中杂质B、C和其他杂质的计算公式为：
其中：AX为供试品溶液中杂质的峰面积；AS为对照品溶液中磷酸根的峰面积；CS为对照品溶液中磷酸的浓度(μg/ml)；1为供试品溶液中主药的标示浓度(mg/ml)；F为各杂质的校正因子(杂质B：3.5；杂质C：2.2；未知单杂：3.1)。
在分析伊班膦酸钠原料时，原料中亚磷酸盐与磷酸盐含量的计算公式为：
其中：AX为供试品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；AS为对照品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；CS为对照品溶液中亚磷酸或磷酸的浓度(μg/ml)；V为供试品溶液的稀释体积(ml)；W为供试品的称样量(mg)。
在分析伊班膦酸钠原料时，原料中杂质B、C和其他杂质的计算公式为：
其中：AX为供试品溶液中杂质的峰面积；AS为对照品溶液中磷酸根的峰面积；CS为对照品溶液中磷酸的浓度(μg/ml)；V为供试品溶液的稀释体积(ml)；W为供试品的称样量(mg)；F为各杂质的校正因子(杂质B：3.5；杂质C：2.2；未知单杂：3.1)。
Claims (8)
1.离子色谱法分析伊班膦酸钠药物的方法，包括以下步骤：
1)制备对照品溶液：取亚磷酸、磷酸对照品，制成亚磷酸进样浓度0.0500μg/ml～12.0000μg/ml，磷酸进样浓度0.1000μg/ml～18.0000μg/ml的对照品溶液；
2)制备供试品溶液：取伊班膦酸钠注射液样品，作为制剂供试品溶液，或者，取伊班膦酸钠原料药，加水定量稀释制成每1ml中含1mg的溶液，作为原料药供试品溶液；
3)分别将各供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，分别获得色谱图，色谱条件为：
色谱柱：分析柱Thermo Dionex Ionpac AS11，尺寸规格为4mm×250mm，
检测器：电导检测器，
淋洗液：氢氧化钾溶液，
梯度程序：
柱温：40-45℃，
所测的杂质为：亚磷酸、磷酸、杂质B：1-羟基-3-戊胺基-亚丙基二膦酸、杂质C：1-羟基-3-甲胺基-亚丙基二膦酸；
4)含量计算：亚磷酸盐和磷酸盐的含量用外标法测定，杂质B、C和未知杂质的含量按外标法以磷酸峰面积进行计算，并乘以校正因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，取亚磷酸、磷酸对照品，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含亚磷酸2μg、磷酸3μg的溶液，作为所述对照品溶液。
3.权利要求1所述的方法，其中，柱温为42℃。
4.权利要求1所述的方法，其中，所述供试品溶液为所述制剂供试品溶液，亚磷酸盐与磷酸盐含量的计算公式为：
其中：AX为供试品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；
AS为对照品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；
CS为对照品溶液中亚磷酸或磷酸的浓度，单位是μg/ml；
1为供试品溶液中主药的标示浓度，单位是mg/ml。
5.权利要求1所述的方法，其中，所述供试品溶液为所述制剂供试品溶液，杂质B、C和未知杂质含量的计算公式为：
其中：AX为供试品溶液中杂质的峰面积；
AS为对照品溶液中磷酸根的峰面积；
CS为对照品溶液中磷酸的浓度，单位是μg/ml；
1为供试品溶液中主药的标示浓度，单位是mg/ml；
F为各杂质的校正因子，其中杂质B为3.5；杂质C为2.2；单种未知杂质为3.1。
6.权利要求1所述的方法，其中，所述供试品溶液为所述原料药供试品溶液，亚磷酸盐与磷酸盐含量的计算公式为：
其中：
AX为供试品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；
AS为对照品溶液中亚磷酸根或磷酸根的峰面积；
CS为对照品溶液中亚磷酸或磷酸的浓度，单位是μg/ml；
V为供试品溶液的稀释体积，单位是ml；
W为供试品的称样量，单位是mg。
7.权利要求1所述的方法，其中，所述供试品溶液为所述原料药供试品溶液，杂质B、C和未知杂质含量的计算公式为：
其中，
AX为供试品溶液中杂质的峰面积；
AS为对照品溶液中磷酸根的峰面积；
CS为对照品溶液中磷酸的浓度，单位是μg/ml；
V为供试品溶液的稀释体积，单位是ml；
W为供试品的称样量，单位是mg；
F为各杂质的校正因子，其中杂质B为3.5；杂质C为2.2；单种未知杂质为3.1。
8.权利要求1所述的方法，其中，色谱条件中，流速为1.0ml/min。
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