WO2021043117A1 - 2-((1s,2s,3r,6s,8s)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物杂质检测方法 - Google Patents

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WO2021043117A1 PCT/CN2020/112764 CN2020112764W WO2021043117A1 WO 2021043117 A1 WO2021043117 A1 WO 2021043117A1 CN 2020112764 W CN2020112764 W CN 2020112764W WO 2021043117 A1 WO2021043117 A1 WO 2021043117A1
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diluent
acetonitrile
tricyclo
impurity
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PCT/CN2020/112764
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邓娟娟
汪莉莉
赵彩桂
彭田东
严庞科
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四川海思科制药有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/28—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and containing rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicines, in particular to the analysis and detection of medicines, in particular to 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane- 2-yl)acetic acid benzene sulfonate or the composition containing the content, related substances and chiral isomer detection method.
  • PCT/CN2017/101364 discloses a fused tricyclic ⁇ -amino acid derivative, which is a brand-new oral treatment for diabetic peripheral neuralgia, postherpetic neuralgia, and fibromyalgia.
  • Pre-clinical trials have shown that 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate It has a strong and long-acting analgesic effect and small central side effects, suggesting that the compound will have obvious clinical advantages in clinical applications, such as significant efficacy, good safety, convenient medication, and good patient compliance. If it is successfully marketed, it can effectively break the monopoly of pregabalin and gabapentin, and provide a better choice of medication for many neuropathic pain patients in my country, which has important clinical and social significance.
  • the main structure of 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzene sulfonate contains 5 Four-and-five-six-membered fused ring with six chiral carbon atoms.
  • the rigid structure of the fused ring makes four chiral isomers actually exist.
  • the chiral three-dimensional structure is complex, enantiomers and diastereomers
  • the three-dimensional structure difference is complicated, and it has both amino and carboxylic functional groups.
  • the overall structure is not conjugated, and the ultraviolet absorption is very weak.
  • 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate involves several related substances, Related substances are also weak ultraviolet or non-UV absorbing compounds. Some related substances are related to 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane
  • the structure of -2-yl)acetic acid benzene sulfonate is highly similar.
  • RID refractive index detector
  • ELSD evaporative light scattering detector
  • 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate has no conjugate
  • the structural characteristics of the product determine that it cannot be detected by a conventional UV detector, which is greatly limited; multiple chiral centers make the detection and analysis of isomers more difficult. Therefore, 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate analysis and detection method
  • the establishment is facing huge challenges and requires comprehensive research and development.
  • one purpose of the present invention is to find a suitable detector, develop reasonable chromatographic conditions, and establish 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl) tricyclic ring [4.2.1.0 3,8 ] Nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate or its composition related substances and content analysis and detection method, significantly improve the detection sensitivity.
  • Another purpose of the present invention is to find a suitable chiral column, develop reasonable chromatographic conditions, and establish 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl) tricyclic [4.2.1.0 3 ,8 ]Nonane-2-yl)Acetate benzenesulfonate isomers detection method for 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclic [4.2. 1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate and its isomers can achieve direct and effective separation without derivatization.
  • Another purpose of the present invention is to provide a reference for the detection and analysis of non-UV-absorbing compounds.
  • the HPLC-CAD method is used to carry out 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2 -Yl)acetate benzenesulfonate content and related substances I detection.
  • Electrospray detector is a new type of general-purpose detection technology, which is widely used in medicine, chemical, food and other industries.
  • the detection principle is: CAD first atomizes the eluent into droplets, and then dries them into particles. The size of the particles increases with the content of the analyte; then the solute particles collide with the positively charged nitrogen gas, and the charge is transferred accordingly. On the particles, the larger the solute particles, the more charged; finally the solute particles transfer their charge to the collector, and the charge amount of the solute particles is measured by a highly sensitive electrometer. The resulting signal current is proportional to the solute content. Proportional.
  • the present invention uses the HPLC-CAD method, the related substance I and 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl )
  • the benzene sulfonate acetate can be effectively separated, the sensitivity is higher, and the detection limit is lower.
  • the method parameters are as follows:
  • Chromatographic column octadecylsilane bonded silica gel column (4.6 ⁇ 250mm, 5 ⁇ m), such as Shiseido CAPCELL PAK ADME;
  • CAD parameters Atomization temperature of 50°C, acquisition frequency of 5.0Hz, filter 5.
  • the related substance I and 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzene Both sulfonates can be effectively separated, and the resolution is greater than 1.5; under the above-mentioned detector CAD parameters, the related substance I has a good response, and the detection sensitivity can reach 0.02% or lower.
  • the structural formula of the related substance I is with It includes the following steps:
  • test solution of related substance I Take 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl ) Benzene sulfonate acetate is added with a diluent to prepare a test solution of related substance I;
  • Chromatographic column octadecylsilane bonded silica gel column (4.6 ⁇ 250mm, 5 ⁇ m); for example, Shiseido CAPCELL PAK ADME;
  • Mobile phase A: 10mM ammonium formate solution, B: acetonitrile;
  • CAD parameters atomization temperature 50°C, acquisition frequency 5.0Hz, filter 5.
  • the above step 1) related substance I test solution preparation includes: accurately weighing 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclic [ 4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate or its composition 50mg to 10mL volumetric flask, add diluent to dissolve and dilute to the mark, it is obtained; the diluent is ammonium formate and acetonitrile
  • the concentration of the test solution of the related substance I obtained in the above step 1) is 5 mg/mL.
  • the above step 2) preparation of the related substance I control solution includes: accurately measuring the related substance I test solution obtained in step 1) from 1.0 mL to a 100 mL volumetric flask, diluting with diluent to the mark, and shaking
  • LC-MS can be used to detect related substances II, and the method parameters are as follows:
  • Chromatographic column octadecylsilane bonded silica gel column (4.6 ⁇ 250mm, 3.5 ⁇ m); such as Waters Xselect HSS T3;
  • MS parameters ESI ion source, spray chamber pressure 35psig, drying gas flow rate 12L/min, drying gas temperature 350°C, detection mode SIM(+).
  • the related substance II and 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzene Both sulfonates can be effectively separated, and the resolution is greater than 1.5; under the above-mentioned detector MS parameters, the related substance II has a very good response, and the detection sensitivity can reach 0.001% or lower.
  • related substance II includes impurities A, B, C, D, and E:
  • test solution for related substance II Take 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl ) Preparation of test product solution of related substance II test product of acetic acid benzene sulfonate;
  • Mobile phase A: 10mM ammonium formate solution, B: acetonitrile;
  • MS parameters ESI ion source, spray chamber pressure 35psig, drying gas flow rate 12L/min, drying gas temperature 350°C, detection mode SIM(+).
  • the above step 1) The preparation of the related substance II reference substance solution includes: accurately weighing 25 mg of the related substance II reference substance into a 10 mL volumetric flask, dissolving it with a diluent and diluting to the mark, as the related substance II reference substance Stock solution: Precisely measure 100 ⁇ L of the stock solution of related substance II reference substance to a 100mL volumetric flask, add diluent to dilute to the mark, shake well, and get it.
  • the concentration of the related substance II reference substance solution obtained in step 1) above is 2.5 ⁇ g/mL.
  • the preparation of the test solution of the related substance II in the above step 2) includes: taking 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclic [4.2 .1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate or its composition is dissolved and diluted with a diluent to obtain a test solution of related substance II;
  • the concentration of the test solution of the related substance II obtained in the above step 2) is 1 mg/mL.
  • MS parameters ESI ion source, spray chamber pressure 35psig, drying gas flow rate 12L/min, drying gas temperature 350°C, detection mode SIM(+).
  • Nonane-2-yl)acetic acid benzene sulfonate can be effectively separated, with a resolution greater than 1.5; under the above-mentioned detector MS parameters, the isomer has a good response, and the detection sensitivity can reach below 0.05%.
  • the chiral isomer includes impurities F, G, and H, and the impurities F, G, and H are as follows:
  • MS parameters ESI ion source, spray chamber pressure 35psig, drying gas flow rate 12L/min, drying gas temperature 350°C, detection mode SIM(+).
  • the step 1) preparing the chiral isomer reference substance solution includes: taking the chiral isomer reference substance and adding a diluent to dissolve and dilute to obtain the chiral isomer reference substance solution; the dilution
  • the step 1) preparing the chiral isomer reference substance solution includes: accurately weighing 10 mg of the chiral isomer reference substance into a 10 mL volumetric flask, dissolving it with a diluent and diluting it to the mark as a control
  • Product stock solution Precisely measure 100 ⁇ L of reference product stock solution to a 100mL volumetric flask, add diluent to dilute to the mark, shake well, and get it.
  • the step 1) preparation of chiral isomer reference substance solution includes: weighing 10 mg of impurity F and impurity G (or impurity H) reference substance respectively, accurately weighing it, and placing it in a 10 mL volumetric flask
  • accurately measure 100 ⁇ L of impurity F and impurity G (or impurity H) reference substance stock solution to In a 100mL volumetric flask, dilute with a diluent to prepare a mixed solution containing 1 ⁇ g of impurity F and 1 ⁇ g of impurity G (or impurity H) per 1mL, as a reference solution.
  • the concentration of the chiral isomer reference solution obtained in step 1) is 1 ⁇ g/mL.
  • the step 2) preparation of the chiral isomer test solution includes: taking 2-((1S, 2S, 3R, 6S, 8S)-2-(aminomethyl) tricyclic [4.2.1.0 3,8 ] nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate or its composition is added with a diluent to obtain a chiral isomer test solution;
  • the concentration of the chiral isomer test solution obtained in step 2) is 0.1 mg/mL.
  • Another object of the present invention is to provide 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate Or its composition impurity detection method, the method can realize 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonane-2-yl ) Effective separation and accurate quantitative detection of acetic acid benzene sulfonate and related substances I, II and its isomers, with a resolution greater than 1.5; good repeatability and stability, ensuring drug quality and patient medication safety; testing costs are high Reduction is conducive to industrial production.
  • the present invention uses CAD to detect 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate Content and related substances I, compared with the traditional general-purpose detectors RID, ELSD, has the following advantages:
  • the response has nothing to do with the chemical structure and has response consistency
  • the present invention uses MS to carry out 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate related
  • the detection of substance II and isomers not only significantly improves the sensitivity of impurity detection, but the fixed ion mode detection also better guarantees the detection specificity, and realizes the separation and detection of related substances II quickly and effectively.
  • the present invention uses CROWNPAK CR-I(+) column to separate the isomers, to 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl) tricyclic [4.2.1.0 3,8 ]
  • the nonane-2-yl)acetic acid benzene sulfonate and its isomers do not need to be derivatized, that is, realize direct and effective separation, and the detection is intuitive and simple.
  • Figure 1 shows the detection chromatogram of related substance I.
  • Figure 2 shows the detection chromatogram of related substance II.
  • Figure 3 shows the detection chromatogram of chiral isomers.
  • Figure 4 shows the content detection chromatogram.
  • Example 1 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate related substances I and determination of content.
  • test solution accurately weigh out 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl )
  • Acetate benzene sulfonate test product 50mg to 10mL plastic volumetric flask, add diluent (10mM ammonium formate: acetonitrile 80:20, v/v) to dissolve and dilute to the mark, as the test product solution.
  • CAD parameters atomization temperature 50°C, collection frequency 5.0Hz filter 5;
  • Injection volume 20 ⁇ L.
  • Test Precisely measure 20 ⁇ L each of related substance I test solution, related substance I control solution, content test solution and content reference solution, and inject into the liquid chromatograph, record the chromatogram for analysis and calculation, and the content is external standard method
  • the detection chromatogram is shown in Figure 4; the related substance I is calculated by self-control method, and the detection chromatogram is shown in Figure 1.
  • Example 2 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate related substances Determination of II.
  • impurity A Precisely measure each 25 ⁇ L of impurity A, impurity D, and impurity E reference substance stock solution, impurity C reference substance stock solution 50 ⁇ L, impurity B reference substance stock solution 200 ⁇ L to 100mL volumetric flask, dilute with diluent to make every 1mL containing impurity A,
  • the mixed solution of impurity D and impurity E is about 0.25 ⁇ g
  • impurity B is about 2 ⁇ g
  • impurity C is about 0.5 ⁇ g as the reference solution.
  • MS parameters ESI ion source, spray chamber pressure 35psig, drying gas flow rate 12L/min, drying gas temperature 350°C, detection mode SIM(+);
  • Determination Precisely measure 10 ⁇ L each of the test solution and the reference solution, and inject it into the liquid chromatograph, record the chromatogram for analysis and calculation, and calculate the content of related substance II by the external standard method.
  • the detection chromatogram is shown in Figure 2.
  • Example 3 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetate benzenesulfonate isomerization Body determination.
  • MS parameters ESI ion source, spray chamber pressure 35psig, drying gas flow rate 12L/min, drying gas temperature 350°C, detection mode SIM(+);
  • Determination accurately measure 5 ⁇ L each of the reference solution and the test solution, and inject into the liquid chromatograph, record the chromatogram for analysis and calculation, and calculate the content of chiral isomers by the external standard method.
  • the detection chromatogram is shown in Figure 3.
  • the method of the present invention has good specificity for detecting related substance I.
  • the method verification results show that the method has good sensitivity, repeatability, linear range, accuracy and stability.
  • impurity E increased significantly under alkaline conditions. Under alkaline conditions, 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane Alk-2-yl)acetic acid benzene sulfonate may degrade to produce impurity C; 2 The impurity B decreases significantly under acid, alkali, and high temperature conditions, and impurity B may degrade to form 2-((1S,2S, 3R,6S,8S)-2-(Aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid benzenesulfonate; 3No new impurities were produced under each damage condition.
  • the method of the present invention has good specificity for detecting related substances II; the method verification results show that the method has ultra-high sensitivity, and the repeatability, linear range, accuracy and stability are all good.
  • PE Petroleum ether
  • the anhydrous formic acid (18.82Kg, 409.09mol) was pumped into a 100-liter reactor and the pumping was completed. Turn on the mixing and refrigeration equipment and reduce the temperature to 10°C.
  • triethylamine (16.53Kg, 163.64 mol) was added dropwise to the reaction solution, and after the addition, the mixture was stirred for 20 minutes.
  • the internal temperature is 10°C, first add cyclo(propylene) malonate (7.86Kg, 54.55moL) into the reactor, and then add 3-cyclohexene-1-carbaldehyde (6.00Kg, 54.55moL) to the reaction kettle.
  • the third step tricyclic [4.2.1.0 3,8 ] nonanyl-2-one (1R, 3S, 6R, 8R and 1S, 3R, 6S, 8S racemate) (INT1)
  • an aqueous solution (23.0L) of sodium hydroxide (3.10Kg, 77.5mol) was added dropwise to the reaction solution, and the pH of the reaction solution was adjusted to be between 10-11.
  • the reaction exotherms, and the reflux is continued for 5-6 hours after the addition.
  • the aqueous phase was extracted with dichloromethane (5.0L ⁇ 1), and the organic phases were combined.
  • the organic phase was pumped into the reactor, stirred and cooled to 10°C.
  • a 2.0M hydrochloric acid solution (20.0L) was added dropwise to adjust the pH of the reaction solution to between 1-2. After standing for liquid separation, the organic phase was washed with saturated brine (20L ⁇ 1).
  • the organic phase was directly concentrated, and the residue was dissolved in acetone (20.0L) and pumped into a 100L reactor. Turn on the stirring, add dropwise concentrated sulfuric acid (4.0L) and water (20.0L) to prepare a solution, the reaction is exothermic, and the addition is refluxed for 2 hours. The temperature was lowered to 15°C, saturated brine (20.0L) was added to the reaction solution, and the mixture was extracted with n-hexane (15.0L ⁇ 2). The organic phases were combined, washed with saturated brine (20.0 L ⁇ 1), and the organic phase was dried with anhydrous sodium sulfate overnight.
  • the first step tert-butyl 2-(tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonyl-2-ylidene) acetate (1R,3S,6R,8R and 1S,3R,6S,8S racemization Body) (INT2)
  • the first crystallization the tert-butyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonanyl-2-yl)ethyl Ester (S)-2-acetoxy-2-phenylacetic acid (INT4) (420.0g, 0.92mol), isopropanol (4.20L) and water (0.21L) were added to the reaction kettle in sequence. Raise the temperature to 82°C to dissolve the solid completely, and keep it for 0.5 hour. Decrease the temperature to 20°C and crystallize, about 6 hours. When the internal temperature reaches 20°C, filter and wash the filter cake with isopropanol (0.40L ⁇ 1).
  • the second crystallization the tert-butyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonanyl-2-yl)ethyl Ester (S)-2-acetoxy-2-phenylacetic acid (INT4) (177g, 0.39mol), isopropanol (2.53L) and water (0.126L) were added to the reaction kettle in sequence. The temperature was programmed to 82°C to completely dissolve the solids, and the temperature was kept for 0.5 hours. Decrease the temperature to 20°C and crystallize, about 4.5 hours.
  • the tert-butyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonanyl-2-yl)acetate (S) -2-Acetoxy-2 phenylacetic acid (INT4) (150.0g, 0.326mol) and purified water (1.5L) were sequentially added to the reaction kettle, stirred, and the temperature was lowered to 0-10°C. Keep the temperature at 0-10°C, add 1mol/L NaOH (360mL) aqueous solution dropwise to the reaction kettle, and adjust the pH of the water phase to 9-10. After standing to separate layers, the aqueous phase was extracted with dichloromethane (0.80L ⁇ 2).
  • the third step tert-butyl 2-((1S,2R,6S,8S)-2-(nitromethylene)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetate
  • the first step ethyl-2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl )Acetate
  • Step 2 Ethyl 2-((1S,2S,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetate benzenesulfonate
  • Purified water (1.1 mol), sodium hydroxide aqueous solution (3 mol/L, 360 mL) and hydrogen peroxide (containing H 2 O 2 1.1 mol) solution were added dropwise, and after the addition, the solution was raised to room temperature and reacted for 3 hours.
  • the aqueous phase was extracted with dichloromethane (300mL ⁇ 2), and the organic phases were combined and used with hydroxide Wash with sodium solution (2mol/L, 500mL ⁇ 2) and water (500mL ⁇ 2), dry with anhydrous sodium sulfate, filter, and concentrate the filtrate under reduced pressure.
  • the eighth step tert-butyl 2-(tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonyl-2-ylidene) acetate (1R,3S,6R,8R and 1S,3R,6S,8S racemization Body) (1I-2)
  • the ninth step tert-butyl 2-(2-(nitromethyl) tricyclo[4.2.1.0 3,8 ] nonanyl-2-yl) acetate (1R, 2R, 3S, 6R, 8R and 1S, 2S, 3R, 6S, 8S racemate) (INT10)
  • Step 2 Methyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetate benzenesulfonic acid salt
  • Step 2 Ethyl 2-((1R,3S,6R,8R)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)ethyl ester (+/- )
  • the third step of resolution was split by INT15 (507.9g, 1.9mol) by SFC, preparation conditions: instrument: Waters UPC2 analytical SFC (SFC-H); chromatographic column: ChiralPak AD, 150 ⁇ 4.6mm ID, 3 ⁇ m; mobile phase : A for CO 2 and B for MeOH (0.05% DEA); gradient: B 5-40%; flow rate: 2.5 mL/min; column temperature is 35°C.
  • Two optical isomers were obtained after separation: peak 1 (retention time: 3.247 minutes), of which, peak 1 was INT16 (250 g, 187.1 mmol).
  • the white solid was dissolved in 200 mL of ethyl acetate and recrystallized, heated to 80°C to dissolve, cooled and stirred to crystallize, and filtered by suction to obtain a wet cake weight of 30.65 g. Pump the solvent for 2 hours to obtain a white solid INT17 (28.30 g).
  • the fifth step 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetic acid benzenesulfonate
  • the third step tert-butyl 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(nitromethylene)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetate
  • (+)-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]nonane-2-yl)acetic acid to the reaction flask Tert-butyl ester (INT18, 8.33g, 28.1mmol), ethanol (50mL), water (25mL), iron powder (7.87g, 0.14mol), ammonium chloride (7.56g, 0.14mol), reflux for 7h.
  • Step 5 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclic lo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetic acid
  • the seventh step 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetic acid benzenesulfonate
  • the first step tert-butyl-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetate
  • INT22 (7.3g, 24.7mmol), ethanol (50mL), water (25mL), iron powder (6.9g, 123.6mmol), ammonium chloride (6.6g, 123.6mmol) were added to the reaction flask, and the reaction was refluxed for 6h. After cooling to room temperature, filter, wash the filter cake with ethanol (60ml ⁇ 2), combine the filtrate and concentrate to remove ethanol, add 150ml of water, extract with dichloromethane (300ml ⁇ 2), combine the organic layers, dry the organic layers, filter, and concentrate A white solid INT23 (6.56 g, yield 100%) was obtained.
  • the third step 2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetic acid
  • the fifth step 2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8 ]non-2-yl)acetic acid benzenesulfonate

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Abstract

提供2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物的含量、有关物质及手性异构体检测方法。采用HPLC-CAD方法检测含量和有关物质Ⅰ，采用LC-MS检测有关物质Ⅱ和手性异构体。所述方法能实现2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物与有关物质Ⅰ、Ⅱ及其手性异构体的有效分离及定量检测，分离度大于1.5；专属性、重复性和稳定性好，保证了药物质量及患者用药安全；检测成本大大降低，有利于工业化生产。

Description

2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物杂质检测方法 技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及药物的分析检测，尤其涉及2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或包含其的组合物的含量、有关物质及手性异构体的检测方法。
背景技术
PCT/CN2017/101364公开了一种稠合三环γ-氨基酸衍生物，是全新的口服治疗糖尿病周围神经痛、疱疹后遗神经痛、纤维肌痛的药物。临床前试验表明其中的2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐具有强效、长效的镇痛作用，并且中枢副作用小，提示该化合物在临床应用中将具有药效显著、安全性好、用药方便、患者依从性好等明显临床优势。若其成功上市，可有效打破普瑞巴林、加巴喷丁的垄断地位，为我国众多的神经病理性疼痛患者提供更优的用药选择，具有重要的临床意义和社会意义。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的结构主体为含有5个手性碳原子的四并五并六元稠合环，稠环的刚性结构使得实际存在4个手性异构体，手性立体结构复杂，对映异构体与非对映异构体的立体结构差异性复杂，同时兼有氨基与羧酸基官能团，整体结构无共轭，紫外吸收极微弱。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐涉及数个有关物质，有关物质同样为弱紫外或无紫外吸收化合物，部分有关物质与2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐结构高度相似。
传统的通用型检测器有示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器(ELSD)，其中RID的检测灵敏度低，不适合采用梯度洗脱，且受环境温度、流动相组成等波动的影响较大；ELSD的检测灵敏度和重现性较差，所用流动相必须是挥发性的溶液，并且响应峰面积与待测物浓度不直接成线性关系。
综上，2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐无共轭的结构特征决定了其不能采用常规的紫外检测器进行检测，检测器大大受限；多手性中心使得异构体检测分析难度增大。因此，2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐分析检测方法的建立面临巨大挑战，需做全面研究与开发。
发明内容
低灵敏度的RID、ELSD不适用于2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物的质量研究，远达不到杂质报告限的检测要求。
为了有效、精准的监控2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物的质量情况，本发明的一个目的是寻找适宜的检测器，开发合理的色谱条件，建立2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物有关物质和含量的分析检测方法，显著提高检测灵敏度。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐有5个手性碳原子，稠环的刚性结构使得实际存在4个手性异构体，同时兼有氨基与羧酸官能团，普通手性柱和绝大部分特种手性柱对2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐及其异构体均无法达到有效分离，需做衍生处理后再分离检测。本发明的另一个目的是寻找适宜的手性柱，开发合理的色谱条件，建立2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐异构体的检测方法，对2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐及其异构体无需衍生处理即能实现直接有效的分离。
本发明的另一个目的是为无紫外吸收化合物的检测分析提供参考借鉴。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐结构式如下：
Figure PCTCN2020112764-appb-000001
根据本发明的一个实施方案，采用HPLC-CAD方法进行2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐含量以及有关物质Ⅰ检测。
电喷雾检测器(CAD)是一种新型的通用型检测技术，广泛应用于医药、化工、食品等行业。其检测原理为：CAD首先将洗脱液雾化成液滴，然后干燥成颗粒，颗粒的大小随着被分析物的含量而增加；接着溶质颗粒与带正电荷的氮气相撞，电荷随之转移到颗粒上，溶质颗粒越大，带电越多；最后溶质颗粒把它们的电荷转移给收集器，通过高灵敏度的静电计测出溶质颗粒的带电量，由此产生的信号电流与溶质的含量成正比。
本发明使用HPLC-CAD方法，有关物质Ⅰ与2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐之间均能有效分离，灵敏度更高，检测限更低。
方法参数如下：
高效液相色谱仪：赛默飞世尔(Thermo)Ultimate 3000 UHPLC，二元泵，CAD；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，5μm)，例如资生堂CAPCELL PAK ADME；
流动相：A：10mM甲酸铵溶液     B：乙腈；
梯度洗脱程序：0～5min，A 90％；5～25min，A 90％→40％；25～29min，A 40％→20％；29～35min，A 20％；35～36min，A20％→90％；36～40min，A 90％；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
CAD参数：雾化温度50℃，采集频率5.0Hz  滤光片5。
上述色谱条件下，有关物质Ⅰ与2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐之间均能有效分离，分离度大于1.5；在上述检测器CAD参数下，有关物质Ⅰ有良好响应，检测灵敏度可达0.02％或更低。
根据本发明的一个实施方案，所述有关物质Ⅰ结构式为
Figure PCTCN2020112764-appb-000002
和
Figure PCTCN2020112764-appb-000003
包括以下步骤：
1)有关物质Ⅰ供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐加入稀释剂制备有关物质Ⅰ供试品溶液；
2)有关物质Ⅰ对照溶液制备：取步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液加入稀释剂稀释100倍，即得；
3)将步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液和步骤2)得到的有关物质Ⅰ对照溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：
高效液相色谱仪：赛默飞世尔(Thermo)Ultimate 3000 UHPLC，二元泵，CAD；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，5μm)；例如资生堂CAPCELL PAK ADME；
流动相：A：10mM甲酸铵溶液、B：乙腈；
梯度洗脱程序：0～5min，A 90％；5～25min，A 90％→40％；25～29min，A 40％→20％；29～35min，A 20％；35～36min，A20％→90％；36～40min，A 90％；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
CAD参数：雾化温度50℃，采集频率5.0Hz，滤光片5。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)或步骤2)中的稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂，优选为10mM甲酸铵与乙腈的混合溶剂，进一步优选为10mM甲酸铵：乙腈体积 比＝80：20的混合溶剂。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)有关物质Ⅰ供试品溶液制备包括：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物50mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得；所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂，优选为10mM甲酸铵与乙腈的混合溶剂，进一步优选为10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20的混合溶剂。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液浓度为5mg/mL。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤2)有关物质Ⅰ对照溶液制备包括：精密量取步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液1.0mL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂，优选为10mM甲酸铵与乙腈的混合溶剂，进一步优选为10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20的混合溶剂。
根据本发明的另一个实施方案，可采用LC-MS进行有关物质Ⅱ的检测，方法参数如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，3.5μm)；例如Waters Xselect HSS T3；
流动相：A：10mM甲酸铵溶液      B：乙腈；
梯度洗脱程序：0～15min，A 70％→30％；15～16min，A 30％→10％；16～18min，A 10％；18～20min，10％→70％；20～25min，A70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)。
上述色谱条件下，有关物质Ⅱ与2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐之间均能有效分离，分离度大于1.5；在上述检测器MS参数下，有关物质Ⅱ有非常良好的响应，检测灵敏度可达0.001％或更低。
根据本发明的一个实施方案，有关物质Ⅱ包括杂质A、B、C、D、E：
Figure PCTCN2020112764-appb-000004
Figure PCTCN2020112764-appb-000005
包括以下步骤：
1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备：分别取有关物质Ⅱ对照品适量加稀释剂溶解得到有关物质Ⅱ对照品溶液；
2)有关物质Ⅱ供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品制备有关物质Ⅱ供试品溶液；
3)将步骤1)得到的有关物质Ⅱ对照品溶液和步骤2)得到的有关物质Ⅱ供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：
液质联用仪：安捷伦(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；
色谱柱：Waters Xselect HSS T3(4.6×250mm，3.5μm)；
流动相：A：10mM甲酸铵溶液、B：乙腈；
梯度洗脱程序：0～15min，A 70％→30％；15～16min，A 30％→10％；16～18min，A 10％；18～20min，10％→70％；20～25min，A70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备包括：取有关物质Ⅱ对照品加入稀释剂溶解并稀释得到有关物质Ⅱ对照品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水＝5：1，v/v。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备包括：精密称取有关物质Ⅱ对照品25mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为有关物质Ⅱ对照品储备液；精密量取有关物质Ⅱ对照品储备液100μL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备包括：分别称取 杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用稀释剂(乙腈:水＝5:1)溶解稀释配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液；精密量取杂质A、杂质D、杂质E对照品储备液各25μL，杂质C对照品储备液50μL、杂质B对照品储备液200μL至100mL量瓶，加稀释剂稀释制成每1mL含杂质A、杂质D、杂质E约0.25μg，杂质B约2μg、杂质C约0.5μg的混合溶液作为对照品溶液。
所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水＝5：1，v/v。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤1)得到的有关物质Ⅱ对照品溶液浓度为2.5μg/mL。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤2)中有关物质Ⅱ供试品溶液制备包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物加入稀释剂溶解并稀释得到有关物质Ⅱ供试品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水＝5：1，v/v。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤2)有关物质Ⅱ供试品溶液制备包括：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物25mg至25mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度摇匀，即得；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水＝5：1，v/v。
根据本发明的一个实施方案，上述步骤2)得到的有关物质Ⅱ供试品溶液浓度为1mg/mL。
根据本发明的另一个实施方案，2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的手性异构体采用筛选合适的特种手性柱进行分析检测，方法参数如下：
色谱柱：CROWNPAK CR-Ⅰ(+)    (3×150mm，5μm)；
流动相：A：高氯酸溶液(pH1.3)      B：乙腈；
洗脱程序：流动相A：流动相B＝80：20等度洗脱35分钟；
流速：0.2mL/min；
柱温：20℃；
MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)。
上述色谱条件下，对映异构体、非对映异构体与2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐可达有效分离，分离度大于1.5；在上述检测器MS参数下，异构体有良好的响应，检测灵敏度可达0.05％以下。
根据本发明的一个实施方案，手性异构体包括杂质F、G、H，所述杂质F、G、H如下：
Figure PCTCN2020112764-appb-000006
包括下述步骤：
1)手性异构体对照品溶液制备：取手性异构体对照品适量，用稀释剂溶解并制备异构体对照品溶液；
2)手性异构体供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物制备手性异构体供试品溶液；
3)将步骤1)得到的手性异构体对照品溶液和步骤2)得到的手性异构体供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：
液质联用仪：安捷伦(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；
色谱柱：CROWNPAK CR-Ⅰ(+)(3×150mm，5μm)；
流动相：A：高氯酸溶液(pH1.3)、B：乙腈；
洗脱程序：流动相A：流动相B＝80：20等度洗脱35分钟；
流速：0.2mL/min；
柱温：20℃；
MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤1)手性异构体对照品溶液制备包括：取手性异构体对照品加入稀释剂溶解并稀释得到手性异构体对照品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，乙腈：水＝20：80，v/v。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤1)手性异构体对照品溶液制备包括：精密称取手性异构体对照品10mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液100μL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤1)手性异构体对照品溶液制备包括：分别称取杂质F、杂质G(或杂质H)对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用稀释剂(乙腈:水＝1:4)溶解稀释配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液；精密量取杂质F、 杂质G(或杂质H)对照品储备液100μL至100mL量瓶中，用稀释剂稀释制成每1mL中含杂质F 1μg、杂质G(或杂质H)1μg的混合溶液，作为对照品溶液。
所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，乙腈：水＝20：80，v/v。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤1)得到的手性异构体对照品溶液浓度为1μg/mL。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤2)手性异构体供试品溶液制备包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物加入稀释剂得到手性异构体供试品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选地，乙腈：水＝20：80，v/v。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤2)手性异构体供试品溶液制备包括：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物10mg，至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液；精密量取供试品储备液1mL至10mL容量瓶，加稀释剂定容至刻度，摇匀，即得；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选地，乙腈：水＝20：80，v/v。
根据本发明的一个实施方案，所述步骤2)得到的手性异构体供试品溶液浓度为0.1mg/mL。
本发明另一个目的是提供2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物杂质检测方法，所述方法能实现2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐与有关物质Ⅰ、Ⅱ及其异构体的有效分离和准确定量检测，分离度均大于1.5；重复性和稳定性好，保证了药物质量及患者用药安全；检测成本大大降低，有利于工业化生产。
本发明采用CAD检测2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的含量和有关物质Ⅰ，与传统的通用型检测器RID、ELSD相比具有以下优势：
1.使用CAD检测2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐及有关物质检测限可达0.02％，灵敏度远高于RID、ELSD(检测限约为0.5-1％)；
2.响应与化学结构无关，具有响应一致性；
3.相较于ELSD无需取对数，可实现较宽的线性范围，方便定量计算；
4.广泛的适用性(所有半挥发性、非挥发性化合物都可以通过该检测器进行测定——包括不含发色团的物质)；
5.重现性、稳定性更好，受流动相和环境影响小。
本发明采用MS进行2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐有关物质Ⅱ和异构体的检测，不仅显著提高了杂质检测灵敏度，同时定离子模式检测也更好地保障了检测专属性，快速有效地实现有关物质Ⅱ的分离检测。
本发明采用CROWNPAK CR-Ⅰ(+)柱进行异构体分离，对2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐及其异构体无需做衍生处理，即实现直接有效的分离，检测直观简便。
附图说明
图1为有关物质Ⅰ的检测色谱图。
图2为有关物质Ⅱ的检测色谱图。
图3为手性异构体的检测色谱图。
图4为含量检测色谱图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围包括但是不限于此。
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 378]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸参照PCT/CN2017/101364公开的方法制备。
含量对照品、有关物质Ⅰ、有关物质Ⅱ及手性异构体对照品采用自制。其余原料、试剂均为市购。
实施例1：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐有关物质Ⅰ和含量的测定。
有关物质Ⅰ供试品溶液制备：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品50mg至10mL塑料容量瓶，加稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
有关物质Ⅰ对照溶液制备：精密量取有关物质Ⅰ供试品溶液1.0mL至100mL塑料容量瓶，加稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)稀释至刻度，摇匀，即得。
含量供试品溶液制备：精密称取自制2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品10mg至10mL塑料容量瓶，加稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液。精密量取供试品储备液0.5mL至10mL塑料容量瓶，加前述稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)稀释至刻度，摇匀，即得。
含量对照品溶液制备：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐对照品10mg至10mL塑料容量瓶，加稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5mL至10mL 塑料容量瓶，加前述稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
液相色谱条件：
高效液相色谱仪：赛默飞世尔(Thermo)Ultimate 3000 UHPLC，二元泵，CAD；
色谱柱：资生堂CAPCELL PAK ADME  (4.6×250mm，5μm)；
流动相：A：10mM甲酸铵溶液     B：乙腈；
梯度洗脱程序：0～5min，A 90％；5～25min，A 90％→40％；25～29min，A 40％→20％；29～35min，A 20％；35～36min，A20％→90％；36～40min，A 90％；
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
CAD参数：雾化温度50℃，采集频率5.0Hz  滤光片5；
进样量：20μL。
测试：分别精密量取有关物质Ⅰ供试品溶液、有关物质Ⅰ对照溶液、含量供试品溶液及含量对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图进行分析计算，含量以外标法计算，检测色谱图见图4；有关物质Ⅰ以自身对照法计算，检测色谱图见图1。
实施例2：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐有关物质Ⅱ的测定。
对照品溶液制备：精密称取有关物质Ⅱ对照品(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E)各25mg至10mL容量瓶，加稀释剂(乙腈：水＝5：1，v/v)溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液100μL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液制备方法二：分别称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用稀释剂(乙腈:水＝5:1)溶解稀释配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液。精密量取杂质A、杂质D、杂质E对照品储备液各25μL，杂质C对照品储备液50μL、杂质B对照品储备液200μL至100mL量瓶，加稀释剂稀释制成每1mL含杂质A、杂质D、杂质E约0.25μg，杂质B约2μg、杂质C约0.5μg的混合溶液作为对照品溶液。
供试品溶液制备：精密称取自制的2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品25mg至25mL容量瓶，加前述稀释剂(乙腈：水＝5：1，v/v)溶解并稀释至刻度摇匀，即得。
液相色谱条件：
液质联用仪：安捷伦(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；
色谱柱：Waters Xselect HSS T3  (4.6×250mm，3.5μm)；
流动相：A：10mM甲酸铵溶液   B：乙腈；
梯度洗脱程序：0～15min，A 70％→30％；15～16min，A 30％→10％；16～18min，A 10％；18～20min，10％→70％；20～25min，A70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)；
进样量：10μL。
测定：精密量取供试品溶液及对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图进行分析计算，以外标法计算有关物质Ⅱ的含量。检测色谱图见图2。
实施例3：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐异构体的测定。
对照品溶液制备：精密称取手性异构体对照品(杂质F、杂质G(或杂质H))各10mg至10mL容量瓶，加稀释剂(乙腈：水＝20：80，v/v)溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液100μL至100mL容量瓶，加稀释剂(乙腈：水＝20：80，v/v)稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液制备方法二：分别称取杂质F、杂质G(或杂质H)对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用稀释剂(乙腈:水＝1:4)溶解稀释配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液。精密量取杂质F、杂质G(或杂质H)对照品储备液100μL至100mL量瓶中，用稀释剂稀释制成每1mL中含杂质F 1μg、杂质G(或杂质H)1μg的混合溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液制备：精密称取自制2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品10mg，至10mL容量瓶，加稀释剂(乙腈：水＝20：80，v/v)超声溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液。精密量取供试品储备液1mL至10mL容量瓶，加前述稀释剂(乙腈：水＝20：80，v/v)定容至刻度，摇匀，即得。
液相色谱条件：
液质联用仪：安捷伦(Agilent)LCMS 6120，二元泵，MS；
色谱柱：CROWNPAK CR-Ⅰ(+)    (3×150mm，5μm)；
流动相：A：高氯酸溶液(pH1.3)    B：乙腈；
洗脱程序：流动相A：流动相B＝80：20等度洗脱35分钟；
流速：0.2mL/min；
柱温：20℃；
MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)；
进样量：5μL。
测定：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图进行分析计算，以外标法计算手性异构体的含量。检测色谱图见图3。
实施例4 有关物质Ⅰ强制降解实验
称取6份2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品各125mg于10ml量瓶中，分别进行未破坏、酸、碱、高温、氧化、光照等处理后加入稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)溶解配制成每1mL中含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐约5mg的样品溶液；将未破坏和破坏处理后的样品溶液进行HPLC-CAD和HPLC-MS检测，破坏条件和试验结果见下表1。
表1、有关物质Ⅰ破坏性实验结果
Figure PCTCN2020112764-appb-000007
Figure PCTCN2020112764-appb-000008
结果分析：①各强制降解条件下该方法均未检出新的杂质，质谱显示各条件下主峰的m/z为210(2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐)；②各条件下质谱均能检出m/z为192的峰(RT＝24min为杂质C的准分子离子峰，RT＝22min为杂质D的碎片峰)，CAD对杂质D、C的检测灵敏度弱于MS；③碱破坏条件下质谱检测到较强的m/z＝192(RT＝24min)的峰，说明碱破坏可能是杂质C的降解途径之一。因主峰过载且CAD属通用型、高灵敏度检测器，杂质漏检的可能性低，故未作物料平衡统计。
综合杂质定位及破坏试验结果，本发明方法检测有关物质Ⅰ的专属性良好。方法学验证结果表明该方法灵敏度、重复性、线性范围、准确度及稳定性均良好。
实施例5 有关物质Ⅱ强制降解试验
取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐供试品适量，精密称定，分别进行未破坏、酸、碱、高温、氧化、光照、高湿等处理后加入稀释剂(10mM甲酸铵：乙腈＝80：20，v/v)配制成每1mL中约含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐1mg的样品溶液，并同法配制空白溶液；将未破坏和破坏处理后的样品溶液进样检测并对结果进行比较，具体破坏条件和测试结果见下表2。
表2、有关物质Ⅱ破坏性实验结果
Figure PCTCN2020112764-appb-000009
结果分析：①碱性条件下杂质E增加明显，碱性条件下2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐可能降解产生杂质C；②酸、碱、高温条件下杂质B降低明显，酸、碱、高温条件下杂质B可能降解生成2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环 [4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐；③各破坏条件下均未产生新杂质。
综合杂质定位及破坏试验结果，本发明方法检测有关物质Ⅱ的专属性良好；方法学验证结果表明该方法具有超高的灵敏度，且重复性、线性范围、准确度及稳定性均良好。
制备工艺：
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DBU：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯
DCM：二氯甲烷
PE：石油醚
EA：乙酸乙酯
DEA：二乙胺
INT1制备方法：
第一步：3-(环己基-3-烯-1-基)丙酸(1B)
3-(cyclohex-3-en-1-yl)propanoic acid
Figure PCTCN2020112764-appb-000010
将无水甲酸(18.82Kg,409.09moL)抽入100升的反应釜中，抽毕。开启搅拌和制冷设备，降温至10℃。当内温为10℃时，将三乙胺(16.53Kg,163.64moL)滴加到反应液中，加毕,搅拌20分钟。当内温为10℃时，先将丙二酸环(亚)异丙酯(7.86Kg,54.55moL)加入反应釜，再将3-环己烯-1-甲醛(6.00Kg,54.55moL)于40℃下慢慢滴加到反应液中，加毕。升温到140-150℃反应至无气体。用6N HCl(24.0L)调节水相pH＝1-2之间。水相用二氯甲烷(12L×2)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(10L×2)洗涤。有机相用无水硫酸钠(2.0Kg)干燥1小时，过滤，滤液浓缩蒸干得黄色油状物3-(环己基-3-烯-1-基)丙酸(1B)(8.80Kg，产率100％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ10.23(s,1H),5.73–5.55(m,2H),2.46–2.30(m,2H),2.09–1.96(m,2H),1.81–1.53(m,6H),1.35–1.17(m,1H)。
LCMS m/z＝153.1[M-1]。
第二步：3-(环己基-3-烯-1-基)-1-(吡咯烷基-1-基)丙基-1-酮(1C)
3-(cyclohex-3-en-1-yl)-1-(pyrrolidin-1-yl)propan-1-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000011
将3-(环己基-3-烯-1-基)丙酸(1B)(11.20Kg,72.727moL)用二氯甲烷(60.0L)溶解 后，抽入100L反应釜中。开启搅拌，加入DMF(3.0mL)并将草酰氯(9.046Kg,71.272moL)滴加到反应液中。加毕，室温搅拌2.0小时。TLC检测反应完全，将四氢吡咯(5.689Kg,79.999moL)和三乙胺(8.814Kg,87.272moL)先后滴加入反应釜中。控制内温小于10℃加毕，停止降温。于室温下搅拌过夜。TLC检测反应完成后，将反应液冷却至10℃。滴加3N盐酸(20.0L)调节反应液pH＝1-2之间。静置，分液，水相用二氯甲烷(10.0L×1)萃取。合并有机相依次用5％氢氧化钠溶液(10.0L×1)，饱和氯化铵溶液(20.0L×1)洗涤。有机相用无水硫酸钠(2.0Kg)干燥30分钟后，过滤，滤液浓缩得到棕色液体3-(环己基-3-烯-1-基)-1-(吡咯烷基-1-基)丙基-1-酮(1C)(15.00Kg,收率99.6％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ5.73–5.56(m,2H),3.43(dd,4H),2.37–2.22(m,2H),2.16–2.01(m,4H),1.90(dt,4H),1.81–1.51(m,6H),1.30–1.15(m,2H)。
LCMS m/z＝208.1[M+1]。
第三步：三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-酮(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(INT1)
tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-one(1R,3S,6R,8R and 1S,3R,6S,8S racemate)
Figure PCTCN2020112764-appb-000012
将中间体3-(环己-3-烯-1-基)-1-(吡咯烷-1-基)丙基-1-酮(1C)(5.64Kg，27.22moL)用二氯甲烷(40.0L)溶解后，抽入100L的反应釜中。搅拌，降温至-10℃，加入2，4，6-三甲基吡啶(4.94Kg，40.83mol)。将三氟甲烷磺酸酐(11.50Kg，40.83mol)的二氯甲烷(16.0L)溶液滴加到反应液中，加毕，加热回流12小时。检测反应完全后，将氢氧化钠(3.10Kg，77.5mol)的水溶液(23.0L)滴加到反应液中，调节反应液pH＝10-11之间。反应放热，加毕继续回流5-6小时。静置分液，水相用二氯甲烷(5.0L×1)萃取，合并有机相。将有机相抽入反应釜中，搅拌并降温到10℃。滴加2.0M盐酸溶液(20.0L)调节反应液pH＝1-2之间。静置分液，有机相用饱和食盐水(20L×1)洗涤。有机相直接浓缩，残留物用丙酮(20.0L)溶解后，抽入100L反应釜中。开启搅拌，滴加浓硫酸(4.0L)和水(20.0L)配制溶液，反应放热，加毕回流2小时。降温到15℃，向反应液中加入饱和食盐水(20.0L)，并用正己烷(15.0L×2)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(20.0L×1)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。过滤，滤液减压浓缩后得黄色固体粗品三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-酮(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(INT1)(3.00Kg,收率81％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ3.39(m,1H),3.19(m,1H),2.77(m,1H),2.38(m,1H),2.05(m,1H),1.93(d,1H),1.77(m,1H),1.45(m,4H),1.20(m,1H)。
LCMS m/z＝137.1[M+1]。
精制：
将无水亚硫酸氢钠(5.735Kg，55.147moL)溶于66L纯化水中加入100L的反应釜中，室温搅拌下滴加入(INT1)粗品(3.00Kg,22.059moL)的乙醇(3.0L)溶液，加毕于室温下搅拌过夜，用乙酸乙酯(20L×2)萃取，水相加入反应釜中搅拌并降温到10℃下，滴加入氢氧化钠(2.250Kg,56.250moL)的水(10L)溶液，调pH为10-12，加毕于室温下搅拌2小时，用正己烷(20L×2)萃取，合并有机相并用纯化水(20L×1)洗涤，有机相用无水硫酸钠2Kg干燥1小时，过滤，将滤液蒸干得无色晶状固体三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-酮(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(INT1)(2.7Kg,收率90％)。
LCMS m/z＝137.1[M+1]。
INT2制备方法：
第一步：叔丁基2-(三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-叶立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(INT2)
tert-butyl 2-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-ylidene)acetate(1R,3S,6R,8Rand 1S,3R,6S,8S racemate)
Figure PCTCN2020112764-appb-000013
将叔丁醇钾(4.94g,44.0mmol)和四氢呋喃(30mL)加入100mL反应瓶中。降温到5℃，滴加二甲氧基膦酰基乙酸叔丁酯(9.86g,44.0mmol,1.1eq)到反应液中，控制反应温度10℃-15℃，约20分钟滴加完毕。继续控温10℃-15℃下搅拌20分钟。再将(1R,6R,8R)-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-酮(INT1)(5.40g,40.0mmol,1.0eq)的四氢呋喃(30mL)溶液滴加到反应液，0.3小时左右滴加完，加毕自然升到室温反应3小时。向反应釜依次加入饱和氯化铵(200mL)，纯化水(200mL)淬灭反应。搅拌20分钟后静置分层，水相用二氯甲烷(30mL×1)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(30mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，取5.0粗品通过制备纯化得到黄色液体叔丁基2-(三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-叶立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(INT2)(4.0g，产率：80％)。
LCMS m/z＝235.3[M+1]。
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 多重性
1.86,1.28/1.26 2,m
1.47,1.45 9,s
1.71,1.53/1.58,1.32 2,m
1.87,1.51/1.85,1.38 2,m
1.99,1.33 2,m
2.30 1,m
2.81,2.76 1,m
3.41,2.99 1,m
3.66,3.20 1,m
5.45,5.36 1,dd
INT3制备方法：
叔丁基2-(2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋体)(INT3)
tert-butyl 2-(2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(1R,2R,3S,6R,8R and 1S,2S,3R,6S,8S racemate)
Figure PCTCN2020112764-appb-000014
向反应瓶依次加入叔丁基2-(三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-叶立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(INT2)(2.34g,10.0mmol)，硝基甲烷(1.68g,25.0mmol)，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(1.83g,12.0mmol)和二甲基亚砜(5.0mL)。搅拌，加热到80℃-85℃，继续保温反应6小时。冷却到室温，向反应釜加入纯化水(100.0mL，水相用二氯甲烷(40mL×3)萃取。合并有机相，用饱和食盐水(30mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，得到无色液体叔丁基2-(2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋体)(INT3)。
LCMS m/z＝318.1[M+Na]。
Figure PCTCN2020112764-appb-000015
INT4制备方法：
叔丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(INT4)
tert-butyl2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(S)-2-acetoxy-2-phenylacetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000016
向50L反应釜加入叔丁基2-(2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋体)(INT3)(730.0g,2.47mol)和甲醇(7.3L)。开启搅拌，将氯化镍六水合物(118g,0.49mol,0.2eq)加到反应釜中，将反应液降温到5℃，分批加入硼氢化钠(374g,9.88mol,4.0eq)，保持反应液体系温度20℃-30℃，约3小时加完。加毕继续搅拌反应2小时。向反应釜加入冰水(16.4L)淬灭反应，用硅藻土2-3cm过滤。滤液用二氯甲烷(3.0L×2)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(4L×1)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液加入O-乙酰基-L-扁桃酸(384g,1.97mol,0.8eq)，加毕搅拌20分钟。将有机相蒸馏浓缩直到无溶剂蒸出，得到粗产品叔丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(1H)粗品。粗产品用异丙醇(5.9L)搅拌打浆2小时，降温到5℃搅拌1小时。过滤，滤饼用异丙醇洗涤(0.4L×1)，烘干得到白色固体产品叔丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(INT4)(422g，产率：34.96％)。取样衍生测定ee值为48.35％。
第一次结晶：将叔丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(INT4)(420.0g,0.92mol)，异丙醇(4.20L)和水(0.21L)依次加入反应釜中。升温至82℃，使固体完全溶解，保温0.5小时。降温至20℃析晶，约6小时。内温至20℃时，过滤，滤饼用异丙醇(0.40L×1)洗涤。合并固体，60-65℃鼓风干燥4小时烘干至恒重。取样衍生后测定ee值为81.25％。得白色固体产品叔丁基2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(1H)粗品-1(260g，产率：62％)。取样衍生测定ee值为81.00％。
第二次结晶：将叔丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(INT4)(177g,0.39mol)，异丙醇(2.53L)和水(0.126L)依次加入反应釜中。程序升温至82℃，使固体完全溶解，保温0.5小时。降温至20℃析晶，约4.5小时。内温至30℃时，过滤，滤饼用异丙醇(0.10L×1)洗涤。合并固体，60-65℃鼓风干燥4小时烘干至恒重。取样衍生后测定ee值为99.73％。得白色固体产品叔丁基 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(INT4)(128g，产率：72％)。
LCMS m/z＝266.3[M+1]。
Figure PCTCN2020112764-appb-000017
INT5制备方法：
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸苯磺酸化合物(1:1)(INT5)
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid compound with benzenesulfonic acid(1:1)
Figure PCTCN2020112764-appb-000018
将叔丁基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(S)-2-乙酰氧基-2苯乙酸(INT4)(150.0g，0.326mol)和纯化水(1.5L)依次加入反应釜中，搅拌，降温到0-10℃。保温0-10℃，滴加1mol/L NaOH(360mL)水溶液到反应釜中，调节水相pH＝9-10。静置分层，水相用二氯甲烷(0.80L×2)萃取。合并有机相，依次用1mol/L NaOH(0.30L×1)溶液和饱和食盐水(0.15L×1)洗涤。有机相中加入活性炭(5.0g)脱色，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩，浓缩剩余物用乙腈(328mL)溶解得到乙腈溶液。另在合适的容器内将苯磺酸一水合物(114g，0.359mol)加入到纯化水(328mL)中，搅拌至溶解澄清配制成苯磺酸水溶液备用。向乙腈溶液中滴加配制好的苯磺酸水溶液，加毕。升温至80-85℃。保温反应4-6小时，检测原料反应完全后，停止加热。降温至10-20℃析晶，约4-6小时。内温至10-20℃时，过滤，滤饼依次用水(30mL×1)，乙腈(30mL×1)洗涤。 干燥后得到白色固体2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸苯磺酸化合物(1:1)(INT5)(104g，产率：86.9％)。
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 多重性
7.87～7.78 2H,m
7.47～7.36 3H,m
3.34 2H,A-B system,J*＝13.62Hz
2.55 2H,A-Bsystem,J*＝16.4Hz
2.51～2.44 1H,m
2.36～2.27 1H,m
2.19～2.10 1H,m
2.09～1.96 1H,m
1,83～1.71 1H,m
1.71～1.64 1H,m
1.66～1.59 1H,m
1.59～1.51 2H,m
1.49～1.40 1H,m
1.32～1.22 1H,m
INT6制备方法：
2-((1S,2S,3R,8S))-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure PCTCN2020112764-appb-000019
将INT5(8.15g,37.89mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入碳酸钾(15.38g,109.8mmol)、水(100mL)、乙醇(10mL)，缓慢滴加二叔丁基二碳酸酯(10.9g,49.36mmol)到反应液中，加毕，室温反应3h，反应液用石油醚萃取(100mL×2)，分液，水相在冰水浴下向其中滴加5mol/L的盐酸溶液调节pH约3左右，析出白色固体，二氯甲烷萃取(100mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(150mL×1)无水硫酸钠干燥，减压浓缩得白色固体产物2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸INT6(8.5g,73％)。
INT9制备方法：
第一步：(1S,6S,8S))-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-醇
(1S,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-ol
Figure PCTCN2020112764-appb-000020
向反应瓶中加入INT1(72.3g，0.53mol)，硝基甲烷(1.0L)，DBU(80.8g，0.53mol)，室温反应18h。加入饱和氯化铵水溶液(5L)，用二氯甲烷(2L×3)萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1-10:1)得到黄色油状物INT7(10.5g,收率10.1％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ4.73–4.40(m,2H),2.65–2.58(m,1H),2.51–2.44(m,1H),2.34(qd,2H),1.99–1.86(m,1H),1.80–1.44(m,6H),1.30–1.17(m,1H)。
第二步：(1S,6S,8S,E)-2-(硝基亚甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷
(1S,6S,8S,E)-2-(nitromethylene)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonane
Figure PCTCN2020112764-appb-000021
向反应瓶中加入INT7(0.50g，2.54mmol)，醋酐(10mL)，对甲苯磺酸(0.44g，2.54mmol)，室温反应2h。冷却至0℃，加入50ml饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌1h，用二氯甲烷(35ml×3)萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩。得到无色液体0.15g，将得到的无色液体溶于甲醇(8mL)，冷却至0℃，加入甲醇钠(0.03g，0.61mmol)，室温反应2h。加入20mL饱和氯化铵水溶液，用二氯甲烷(40ml×3)萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)得到黄色油状物INT8(0.08g，收率74.1％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ6.87(dd,1H),3.94–3.61(m,1H),3.25(ddd,1H),3.01–2.80(m,1H),2.39(td,1H),2.12–1.76(m,4H),1.73–1.51(m,1H),1.48–1.23(m,3H)。
第三步：叔丁基2-((1S,2R,6S,8S)-2-(硝基亚甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1S,2R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000022
向反应瓶中加入1M双(三甲硅基)氨基锂(290mL，0.29mol)，氮气保护，冷却至-60℃，滴加乙酸叔丁酯(33.62g，0.29mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液,搅拌20mins，滴加INT8(28.82g,0.16mol)的四氢呋喃(250mL)溶液，-60℃反应2h。加入饱和氯化铵水溶液(400mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)得到无色液体INT9(39.4g,收率84.8％)。
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 氢数目及裂分情况
4.87 2H,A-B system,J*＝7.10Hz
2.89 1H,m
2.58 1H,m
2.47 2H,s
2.33 1H,m
2.30 1H,m
2.02,1.56 2H,m
1.77,1.55 2H,m
1.67,1.28 2H,m
1.62,1.42 2H,m
1.45 3H,s
杂质A制备方法：
第一步：乙基-2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
ethyl 2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000023
将2-((1S,2S,3R,8S))-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸INT6(2.07g,6.46mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入DMF(20mL),碳酸钾(1.36g,9.7mmol)，冰水浴下，缓慢滴加碘乙烷(1.57g,9.7mmol)，加毕，室温反应2h，向反应液中加水30mL，用甲基叔丁基醚萃取(30mL×2)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得乙基-2-((1S,2S,3R,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯INT6-A。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ4.98(br,1H),4.13(q,2H,J＝7.2Hz),3.39(d,2H,J＝6.4Hz),2.84(dd,2H,J＝12.8Hz,5.2Hz),2.39(m,1H),2.37(s,2H),2.27(dd,1H,J＝12.4Hz,5.6Hz),2.07(m,1H),1.98(m,1H),1.75-1.67(m,1H),1.59-1.47(m,5H),1.44(s,9H),1.26(t,3H)。
第二步：乙基2-((1S,2S,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸盐
ethyl 2-((1S,2S,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate benzenesulfonate
Figure PCTCN2020112764-appb-000024
将乙基-2-((1S,2S,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯INT6-A(2.2g,6.502mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入苯磺酸(2.05g,13.0mmol)及乙腈22mL，加毕，升温至80度反应0.5h，冷却至室温，减压浓缩得白色固体,向其中加入10mL甲基叔丁基醚打浆，搅拌10min后，过滤，得白色固体产物杂质A。
Ms m/z(ESI):238.2[M+H +]。
δH(ppm)(400MHz,CDCl 3) 氢数目及裂分情况
1.10 1，m
1.15 3，t
1.25 1，m
1.51-1.39 4，m
1.61 1，m
1.92 1，m
2.10 1，m
2.23 1，dd
2.41 1，m
2.53 2，s
2.70 1，dd
3.33 2，dd
4.00 2，m
7.39 4，m
7.77-7.86 3，m
9.63 1，br
杂质B制备方法：
将INT4(2.02g，4.35mmol)加入到圆底烧瓶中，冰水浴下，依次加入水(10mL)、二氯甲烷(10mL)、氢氧化钠(0.18g,4.35mmol)，在该温度下保持30min搅拌，分液漏斗分液，无水硫酸钠干燥有机层，向有机层加入苯磺酸(0.77g，4.35mmol)，加毕，在20℃下减压浓缩得白色固体杂质B。
Ms m/z(ESI):266.2[M+H +]
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 氢数目及裂分情况
1.13 1，m
1.32 1，m
1.38 9，s
1.49-1.39 4，m
1.63 1，m
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 氢数目及裂分情况
1.92 1，m
2.13 1，m
2.22 1，dd
2.47 2，s
2.73 1，m
3.31 2，m
7.35 3，m
7.89 2，m
7.94 3，br
杂质C制备方法：
第一步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)双环[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(1B-2)
(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)bicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000025
反应瓶中加入环戊二烯(1A-2)(26.4g，0.4mol)和环己烷(1200mL)，充氮气保护后加入三乙胺(24.2g，0.24mol)，将反应体系加热至回流，滴加4-溴丁酰氯(44.4g，0.24mol)的环己烷(50mL，25mL/h)溶液，滴毕回流反应4小时。冷却至室温后将反应液抽滤，环己烷(100mL×3)洗涤，合并滤液，依次用饱和氯化铵(500mL×3)、水(500mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝80:1)得到淡黄色油状(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)双环[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(1B)(12g，产率：24％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ5.97-5.85(m,1H),5.80-5.70(m,1H),3.91-3.79(m,1H),3.67(dd,J＝9.7,5.5Hz,2H),3.47(t,J＝6.8Hz,2H),2.68(ddd,J＝18.3,15.2,3.9Hz,1H),2.47-2.31(m,1H),2.13(dq,J＝21.0,6.5Hz,1H),1.93(ddd,J＝21.5,12.2,7.1Hz,1H)。
第二步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚[2]烯-6,2'-[1,3]二恶茂烷](1C-2)
(±)-1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)spiro[bicyclo[3.2.0]hept[2]ene-6,2'-[1,3]dioxolane]
Figure PCTCN2020112764-appb-000026
反应瓶中依次加入(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)双环[3.2.0]庚-2-烯-6-酮(1B-2)(37g，0.173mol)，对甲苯磺酸一水合物(1.6g，8.6mmol)，乙二醇(42.9g，0.692mol)和甲苯(320 mL)，加热至回流，分水5小时。冷却后将反应液倒入冰水中，加入饱和碳酸氢钠溶液至pH值约为7，用乙酸乙酯(400mL×3)萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)，得到黄色油状物(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚[2]烯-6,2'-[1,3]二恶茂烷](1C-2)(27.4g，产率：61％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ5.94-5.83(m,1H),5.67-5.56(m,1H),3.95-3.75(m,4H),3.36-3.25(m,2H),3.23-3.12(m,1H),3.02(ddd,J＝22.9,15.7,8.0Hz,2H),2.48-2.25(m,2H),1.99-1.78(m,2H)。
第三步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二恶茂烷]-2-醇(1D-2)
(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)spiro[bicyclo[3.2.0]heptane-6,2'-[1,3]dioxolan]-2-ol
(1'S,6'R)-spiro[[1,3]dioxolane-2,2'-tricyclo[4.2.1.03,8]nonan]-7'-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000027
向反应瓶中加入(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚[2]烯-6,2'-[1,3]二恶茂烷](1C-2)(27.4g，0.11mol)和四氢呋喃(330mL)，冰水浴下滴加硼烷二甲硫醚溶液(55mL，0.55mol)，冰水浴下反应2小时后依次滴加纯化水(1.1mol)，氢氧化钠水溶液(3mol/L，360mL)和双氧水(含H 2O 2 1.1mol)溶液，加完升至室温反应3小时。用乙酸乙酯(500mL×3)萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液(500mL×2)和水(500mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状液体(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二恶茂烷]-2-醇(1D-2)(30g)，直接用于下一步反应。
第四步：(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二恶茂烷]-2-酮(1E-2)
(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-bromoethyl)spiro[bicyclo[3.2.0]heptane-6,2'-[1,3]dioxolan]-2-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000028
向反应瓶中加入(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二恶茂烷]-2-醇(1D-2)(30g，0.11mol)和二氯甲烷(500mL)，冰浴下分批加入戴斯马丁氧化剂(70g，0.17mol)，室温反应2小时。向反应液中加入二氯甲烷(300mL)和硫代硫酸钠水溶液(2M，500mL)，搅拌30分钟，分液，水相用二氯甲烷(300mL×2)萃取，合并有机相，用氢氧化钠溶液(2mol/L，500mL×2)和水(500mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩， 残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝10:1)得到淡黄色油状液体(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二恶茂烷]-2-酮(1E-2)(15g，产率：50％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ4.02-3.81(m,4H),3.40(dd,J＝10.3,3.8Hz,2H),3.15(td,J＝10.3,4.9Hz,2H),2.61(ddd,J＝20.6,14.0,8.1Hz,2H),2.27(ddt,J＝18.9,9.6,1.8Hz,1H),2.12-2.00(m,1H),1.99-1.70(m,3H)。
第五步：(±)-(1'S,3'R,6'R,8'S)-螺[[1,3]二恶茂烷-2,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷]-7'-酮(1F-2)
(±)-(1'S,3'R,6'R,8'S)-spiro[[1,3]dioxolane-2,2'-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan]-7'-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000029
向反应瓶中加入叔丁醇钾(0.58g，5.2mmol)和甲苯(40mL)，充氮气保护，降温至-15℃，滴加(±)-(1R,5S,7R)-7-(2-溴乙基)螺[双环[3.2.0]庚烷-6,2'-[1,3]二恶茂烷]-2-酮(1E-2)的甲苯溶液(1.1g，1mmol，5mL)，-15℃反应1小时后升至0℃搅拌1小时。冰浴下滴加饱和氯化铵溶液至pH为7左右，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，有机相用水(80mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝8:1)得到淡黄色油状物(±)-(1'S,3'R,6'R,8'S)-螺[[1,3]二恶茂烷-2,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷]-7'-酮(1F-2)(0.4g，产率：51％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ4.04-3.86(m,4H),3.20-3.07(m,1H),2.99-2.86(m,1H),2.53(ddd,J＝8.6,5.6,1.7Hz,1H),2.41-2.24(m,2H),2.24-2.01(m,2H),1.95(d,J＝13.2Hz,1H),1.61(dddd,J＝14.4,7.6,2.6,0.7Hz,1H),1.51-1.38(m,1H)。
第六步：(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S)-螺[[1,3]二恶茂烷-2,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷](1G-2)
(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S)--spiro[[1,3]dioxolane-2,2'-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonane]
Figure PCTCN2020112764-appb-000030
向反应瓶中加入(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S)-螺[[1,3]二恶茂烷-2,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷]-7'-酮(1F-2)(9.5g，49mmol)，一缩二乙二醇(170mL)，水合联氨(18.4g，294mmol)和氢氧化钾(16.5g，294mmol)，180℃反应3小时，70℃减压旋蒸除水，升温至220℃搅拌2小时，冷却至室温，向反应液中加入水(200mL)，用甲基叔丁基醚(300mL×3)萃取，合并有机 相并顺序用盐酸(1M，500mL×2)和水(500mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝60:1)得到无色油状物(±)-(1'S,3'R,6'S,8'S-螺[[1,3]二恶茂烷-2,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷](1G-2)(5.6g)，不纯化直接用于下一步。
第七步：(±)-(1S,6S,8S)-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-酮(1H-2)
(±)-(1S,6S,8S)-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000031
向反应瓶中加入(±)-(1'R,3'S,6'R,8'R)-螺[[1,3]二恶茂烷-2,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷](1G-2)(5.6g，31mmol)，溶剂四氢呋喃(60mL)和水(20mL)，冰浴下滴加三氟醋酸(7g，62mmol)，45℃反应3小时，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液至pH为7左右，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有机相用水(200mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)得到白色固体(±)-(1S,6S,8S)-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-酮(1H-2)(3.5g，产率：83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ3.47-3.33(m,1H),3.19(dd,J＝3.3,1.8Hz,1H),2.84-2.69(m,1H),2.47-2.32(m,1H),2.12-1.97(m,1H),1.93(d,J＝12.3Hz,1H),1.82-1.69(m,1H),1.56-1.35(m,4H),1.27-1.10(m,1H)。
第八步：叔丁基2-(三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-叶立德烯)乙酸酯(1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(1I-2)
(±)-tert-butyl 2-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-ylidene)acetate(1R,3S,6R,8Rand 1S,3R,6S,8S racemate)
Figure PCTCN2020112764-appb-000032
反应瓶中加入氢化钠(60％，0.8g，33.4mmol)和四氢呋喃(80mL)，降温至0℃，滴加二乙基磷酰乙酸叔丁酯(7.5g，33.4mmol)溶于四氢呋喃(10mL)的溶液，0℃下反应20分钟后滴加(±)-(1R,3S,6R,8R)-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-酮(1H-2)(3.5g，25.7mmol)的四氢呋喃(10mL)溶液，室温反应2小时。向反应液中加入水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)，搅拌分液，水相用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并乙酸乙酯并用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状粗品叔丁基2-(三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-叶立德烯)乙酸酯 (1R,3S,6R,8R和1S,3R,6S,8S消旋体)(1I-2)(5.1g)，直接用于下一步。
第九步：叔丁基2-(2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷基-2-基)乙酸酯(1R,2R,3S,6R,8R和1S,2S,3R,6S,8S消旋体)(INT10)
(±)-tert-butyl 2-(2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.03,8]nonan-2-yl)acetate(1R,2R,3S,6R,8R and 1S,2S,3R,6S,8S racemate)
Figure PCTCN2020112764-appb-000033
将上步所得粗品(±)-2-((1R,3S,6R,8R)-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-亚基)乙酸叔丁酯(1I-2)(5g，24.3mmol)，硝基甲烷(90mL)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(6.6g，43.7mmol)依次加入反应瓶中，升温至70℃反应6小时。向反应液中加入乙酸乙酯(100mL)和1M的盐酸溶液(100mL)，搅拌分液，水相用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱色谱分离纯化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)，得到无色油状液体(±)-2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸叔丁酯(INT10)(5g，产率：70％)。
第十步：(1'S,2'S,6'S,8'S)-螺[吡咯烷-3,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬]-5-酮
(1'S,2'S,6'S,8'S)-spiro[pyrrolidine-3,2'-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan]-5-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000034
将INT10(75g，280.6mmol)加入到三颈烧瓶中，依次加入乙醇(400mL)、水(200mL)，搅拌下加入铁粉(78.34g,1403mmol)，氯化铵(75.04g,1403mmol),升温至100℃搅拌5小时，抽滤，收集滤液，浓缩掉乙醇，剩余部分以乙酸乙酯(800ml)萃取，乙酸乙酯用2M HCl洗涤，无水硫酸钠干燥有机层，在30℃下减压浓缩得白色固体INT11-A(52.0g,271.87mmol)。
第十一步：(1'S,2'S,6'S,8'S)-螺[吡咯烷-3,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬]-5-酮
(1'S,2'S,6'S,8'S)-spiro[pyrrolidine-3,2'-tricyclo[4.2.1.0 3-8]nonan]-5-one
将化合物INT11-A(3g,16mmol)置于三颈烧瓶中，加入无水乙醇12mL,加热至70℃，待固体全部溶解，边搅拌边降至室温，析出固体，抽滤，滤饼用乙酸乙酯5mL洗涤一次，抽干溶剂，得固体杂质C。
Ms m/z(ESI):192.2[M+H+]。
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 氢数目及裂分情况
1.24-1.17 1，m
1.47-1.36 2，m
1.53-1.50 1，d
1.64-1.57 1，m
1.75-1.66 2，m
2.01-1.92 1，m
2.21-2.20 3，d
2.36-2.26 1，q
2.48-2.45 1，m
2.97-2.82 1，m
3.31-3.30 1，m
3.48-3.45 1，d
3.56-3.53 1，d
杂质D制备方法：
第一步：甲基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
Methyl-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000035
将2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸INT6(2.10g,6.79mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入DMF(20mL),碳酸钾(1.35g,9.7mmol)，冰水浴下，缓慢滴加碘甲烷(1.35g,9.7mmol)，加毕，室温反应2h，向反应液中加水30mL，用甲基叔丁基醚萃取(30mL×2)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得甲基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯INT12-A(1.9g,95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ4.96(br,1H),3.65(s,3H),3.39(d,2H,J＝10.4Hz),2.84(dd,1H,J＝12.8Hz,5.2Hz),2.41-2.37(m,3H),2.28(dd,1H,J＝12.0Hz,6.0Hz),2.07(m,1H),1.98(m,1H),1.72(m,1H),1.58-1.51(m,4H),1.44(s,9H),1.25-1.18(m,2H)。
第二步：甲基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸盐
methyl 2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate benzenesulfonate
Figure PCTCN2020112764-appb-000036
将甲基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯INT12-A(1.9g,5.8mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入苯磺酸(1.83g,11.6mmol)及乙腈20mL，加毕，升温至80℃反应0.5h，冷却至室温，减压浓缩得粘稠状白色固体产物，向其中加入10mL甲基叔丁基醚打浆，搅拌10min后，过滤，得白色固体甲基2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸盐杂质D。
Ms m/z(ESI):224.2[M+H +]。
δH(ppm)(400MHz,CDCl 3) 氢数目及裂分情况
1.14-1.10 1，m
1.31-1.26 1，m
1.49-1.38 4，m
1.65 1，m
1.93 1，m
2.12 1，m
2.23 1，dd
2.42 1，dd
2.56 2，s
2.71 1，dd
3.33 2，s
3.52 3，s
7.39 4，m
7.79-7.87 4,m
杂质E制备方法：
第一步：
异丙基-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
isopropyl-2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000037
将2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸INT6(2.02g，6.47mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入DMF(20mL),碳酸钾(1.35g,14.5mmol)，冰水浴下，缓慢滴加碘代异丙烷(1.62g，9.7mmol)，加毕，室温反应2h，向反应液中加水 30mL，用甲基叔丁基醚萃取(30mL×2)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤(50mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得乙基-2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯INT13-A(2.2g)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ4.99(m,2H),3.39(d,2H,J＝5.6Hz),2.85(m,1H),2.39(m,1H),2.32(d,2H,J＝3.2Hz),2.27(m,1H),2.07(m,1H),1.94(m,1H),1.72(m,1H),1.59-1.47(m,5H),1.44(s,9H),1.24(d,6H,J＝6.0Hz),1.22(m,1H)。
第二步：
异丙基2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸盐
isopropyl 2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate benzenesulfonate
Figure PCTCN2020112764-appb-000038
将异丙基-2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯INT13-A(2.2g,6.26mmol)加入到圆底烧瓶中，依次加入苯磺酸(1.99g,12.52mmol)及乙腈22mL，加毕，升温至80℃反应0.5h，冷却至室温，减压浓缩得白色固体,向其中加入10mL甲基叔丁基醚打浆，搅拌5min后，过滤，得白色固体产物乙基2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯苯磺酸盐杂质E。
Ms m/z(ESI):252.2[M+H +]。
δH(ppm)(400MHz,CDCl 3) 氢数目及裂分情况
1.12 1，m
1.15 6，d
1.29 1，m
1.49-1.36 4，m
1.62 1，m
1.92 1，m
2.10 1，m
2.23 1，dd
2.42 1，dd
2.51 2，s
2.71 1，dd
3.33 2，m
4.90 1，m
7.39 4，m
7.86 3，m
9.60 1，br
杂质F制备方法：
第一步：乙基2-((1S,3R,6S,8S)-三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-亚甲基)乙酯(+/-)
ethyl 2-((1R,3S,6R,8R)-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-ylidene)acetate(+/-)
Figure PCTCN2020112764-appb-000039
将氢化钠(266.55g,6.109mol)加入到三颈烧瓶中，氮气保护，加入9L干燥的四氢呋喃，搅拌，将反应体系降温至0℃，滴加二甲氧基膦酰乙酸乙酯(1369.6g,6.109mmol)，加完保温15min，滴加原料INT1(640g,4.699mol)的四氢呋喃溶液，加完自然升至室温，反应1h。TLC监测反应完全，冰水浴下滴加饱和氯化铵至反应溶液pH到7-8，加水8L，然后分液。水相以乙酸乙酯萃取(4000mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(PE:EA＝100:1)，得产物INT14(590g,2.860mol)。
第二步：乙基2-((1R,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酯(+/-)
ethyl 2-((1R,3S,6R,8R)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate(+/-)
Figure PCTCN2020112764-appb-000040
将原料INT14(590g,2.860mol)加入反应瓶中，加入硝基甲烷6L，室温下滴加DBU(826.5g,5.429mol)，加完80℃反应9小时左右，将反应液倒入到冰水中(4L)，DCM萃取(4L×2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，然后柱层析分离(PE:EA＝200:1-30:1)，得产物INT15(507.9g,1.9mol)。
第三步拆分由INT15(507.9g,1.9mol)经SFC拆分，制备条件：仪器：Waters UPC2 analytical SFC(SFC-H)；色谱柱：ChiralPak AD,150×4.6mm I.D.,3μm；流动相：A for CO 2 and B for MeOH(0.05％DEA)；梯度：B 5～40％；流速：2.5mL/min；柱温度为35℃。分离后得到两个光学异构体：峰1(保留时间：3.247分钟)，其中，峰1为INT16(250g，187.1mmol)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ4.74(q,2H),2.86(dt,1H),2.75–2.63(m,2H),2.53(ddd,1H),2.31(tt,2H),2.05(dt,1H),1.84–1.73(m,1H),1.68–1.55(m,4H),1.52(dd,1H),1.48–1.40(m,9H),1.31–1.23(m,1H)。
第四步：(1'R,2'R,3'S,6'R,8'R)-螺[吡咯烷-3,2'-三环[4.2.1.0 3,8]壬]-5-酮
(1'R,2'R,3'S,6'R,8'R)-spiro[pyrrolidine-3,2'-tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan]-5-one
Figure PCTCN2020112764-appb-000041
将INT16(50g，187.1mmol)加入到三颈烧瓶中，依次加入乙醇(200mL)、水(100mL)，搅拌下加入铁粉(41.78g,748.2mmol)，氯化铵(40.02g,748.2mmol),升温至100℃搅拌5小时，抽滤，收集滤液，浓缩掉乙醇，剩余部分以乙酸乙酯(600ml)萃取，有机相用2M HCl洗涤，无水硫酸钠干燥有机层，在30℃下减压浓缩得白色固体INT17(40.16g)。将白色固体溶于乙酸乙酯200mL重结晶，升温至80℃溶解，降温搅拌析晶，抽滤，得滤饼湿重30.65g，油泵抽溶剂2小时，得白色固体INT17(28.30g)。
Ms m/z(ESI):192.2[M+H +]。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ6.06(br,1H),3.36-3.61(m,2H)2.81(dt,1H),2.45(ddd,1H),2.06-2.33(m,4H),1.89-2.01(m,1H),1.29-1.73(m,6H),1.12-1.23(m,1H)。
第五步：2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸盐
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid Benzenesulfonate
将化合物INT17(9.4g,49.2mmol)加入到120mL水中，搅拌加入苯磺酸(52.33g,282.87mmol)，升温至120℃搅拌4小时，有白色固体析出，用LC-MS监测反应至反应完全，冷却至室温，抽滤，滤饼用冰水150mL洗涤3次，抽干滤饼，滤饼用二氯甲烷150mL打浆三次，抽滤，得杂质F(13.07g)。
Ms m/z(ESI):210.2[M+H+]。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.83(ddd,2H),7.34-7.50(m,3H),3.24-3.39(m,2H),2.86(dt,1H),2.42-2.59(m,3H),2.32(dd,1H),1.94-2.19(m,2H),1.38-1.82(m,6H),1.22-1.31(m,1H)。
第六步：2-((1R,2R,3S,6R,8R)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸盐
2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid Benzenesulfonate
将杂质F(13g,35.42mmol)加入到三颈烧瓶中，加入甲醇15mL,水34mL，升温至85℃搅拌25分钟，冷却至室温搅拌过夜，抽滤，滤饼用冰的混合溶剂(MeOH:H 2O＝3:1)洗涤，抽干。得固体杂质F。
Ms m/z(ESI):210.2[M+H +]。
杂质G制备方法：
第一步：(1S,3R,6S,8S)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-醇
(1S,3R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-ol
Figure PCTCN2020112764-appb-000042
向反应瓶中加入INT1(72.3g，0.53mol)，硝基甲烷(1.0L)，DBU(80.8g，0.53mol)，室温反应18h。加入饱和氯化铵水溶液(5L)，用二氯甲烷(2L×3)萃取，合并有机层，有机层干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1-10:1)得到黄色油状物INT7(10.5g,收率10.1％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ4.73–4.40(m,2H),2.65–2.58(m,1H),2.51–2.44(m,1H),2.34(qd,2H),1.99–1.86(m,1H),1.80–1.44(m,6H),1.30–1.17(m,1H)。
第二步：(1S,3R,6S,8S)-2-(硝基亚甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷
(1S,3R,6S,8S)-2-(nitromethylene)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonane
Figure PCTCN2020112764-appb-000043
向反应瓶中加入INT7(0.50g，2.54mmol)，醋酐(10mL)，对甲苯磺酸(0.44g，2.54mmol)，室温反应2h。冷却至0℃，加入50ml饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌1h，用二氯甲烷(35ml×3)萃取，合并有机层，干燥，过滤，浓缩。得到无色液体0.15g，直接用于下一步反应，溶于甲醇(8mL)，冷却至0℃，加入甲醇钠(0.03g，0.61mmol)，室温反应2h。加入20mL饱和氯化铵水溶液，用二氯甲烷(40ml×3)萃取，合并有机层，有机层干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)得到黄色油状物INT8(0.08g，收率74.1％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3):δ6.87(dd,1H),3.94–3.61(m,1H),3.25(ddd,1H),3.01–2.80(m,1H),2.39(td,1H),2.12–1.76(m,4H),1.73–1.51(m,1H),1.48–1.23(m,3H)。
第三步：叔丁基2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(硝基亚甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000044
向反应瓶中加入1M双(三甲硅基)氨基锂(290mL，0.29mol)，氮气保护，冷却至-60℃，滴加乙酸叔丁酯(33.62g，0.29mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液,搅拌20mins，滴加INT8(28.82g,0.16mol)的四氢呋喃(250mL)溶液，-60℃反应2h。加入饱和氯化铵水溶液(400mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合并有机层，有机层干燥，过滤，浓缩。硅胶柱色谱分离提纯(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝100:1)得到无色液体INT9(39.4g,收率84.8％)。手性拆分，(制备条件：仪器：Waters UPC2 analytical SFC(SFC-H)；色谱柱：ChiralPak AD,150×4.6mm I.D.,3μm；流动相：A for CO 2 and B for EtOH(0.05％DEA)；梯度：B 5～40％；流速：2.5mL/min；柱温度为35℃。)分离后得到两个光学异构体：峰1(保留时间：2.452分钟，9.33g)，其中，峰1为(+)-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸叔丁酯(INT18)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ4.74(q,2H),2.86(dt,1H),2.75–2.63(m,2H),2.53(ddd,1H),2.31(tt,2H),2.05(dt,1H),1.84–1.73(m,1H),1.68–1.55(m,4H),1.52(dd,1H),1.48–1.40(m,9H),1.31–1.23(m,1H)。
第四步：叔丁基2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000045
向反应瓶中加入(+)-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸叔丁酯(INT18，8.33g,28.1mmol)，乙醇(50mL)，水(25mL)，铁粉(7.87g，0.14mol)，氯化铵(7.56g，0.14mol)，回流反应7h。冷至室温后，过滤，用乙醇(150ml)冲洗滤饼，加入100ml水，用二氯甲烷(100ml×3)萃取，合并有机层，有机层干燥，过滤，浓缩，硅胶柱色谱分离提纯(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝50:1,10:1)得到淡黄色油状物INT19(7.49g，产率99.4％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ3.14(d,2H),2.89–2.72(m,3H),2.52–2.42(m,1H),2.35–2.18(m,2H),2.05–1.93(m,1H),1.78–1.68(m,1H),1.64–1.40(m,13H),1.33–1.17(m,2H)。
第五步:2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环lo[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure PCTCN2020112764-appb-000046
向反应瓶中加入INT19(7.4g，2.79mmol)，二氯甲烷(50mL)，冰浴下滴加三氟醋酸(50mL)，加毕于室温反应2小时，减压浓缩，将残留物溶于二氯甲烷(100mL)中，加入三乙胺至溶液pH为7-8，过滤，得到白色固体INT20(3.9g，产率：67.0％)。
1H NMR(400MHz,CD 3OD):δ3.00(dt,3H),2.72(s,2H),2.49(s,1H),2.32(d,1H),2.16(s,1H),2.03(t,1H),1.76(s,1H),1.67(d,2H),1.58–1.46(m,2H),1.47–1.37(m,1H),1.30–1.20(m,1H)。
第六步：2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure PCTCN2020112764-appb-000047
向反应瓶中加入INT20(4.58g，21.9mmol)，四氢呋喃(60ml)，氢氧化钠(2.02g，50.4mmol)的50ml水溶液，冷却至0℃，滴加二碳酸二叔丁酯(5.25g，24.1mmol)的45ml四氢呋喃溶液，室温反应2h。补加氢氧化钠(1.01g，25.2mmol)，二碳酸二叔丁酯(2.62g，12.0mmol)，室温反应1h。用石油醚：乙酸乙酯(5:1)(100ml×3)的混合溶液洗涤，合并有机层，用100ml纯水萃取1次，合并水层，加入磷酸二氢钠调至pH为4左右，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有机层，浓缩，加入80ml环己烷，搅拌，加热至回流，溶解，冷却至室温析出固体，过滤，得到白色固体INT21(6.4g，99％)，不纯化直接下一步。
第七步：2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸盐
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid benzenesulfonate
Figure PCTCN2020112764-appb-000048
向反应瓶中加入INT21(5.9g，19.1mmol)，水(47ml)，苯磺酸(7.1g，38.2mmol)，加热至100℃反应2h。冷却至室温，过滤得到白色固体杂质G。
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 氢数目及裂分情况
7.84～7.82 2H，m
7.44～7.41 3H，m
3.34 2，s
2.89～2.84 1H,m
2.55～2.54 2H,d
2.50～2.46 1H,m
2.36～2.27 1H,m
2.35～2.30 1H,m
2.17～2.13 1H,m
2.07～2.00 1H,m
1.81～1.74 1H,m
1.70～1.62 2H,m
1.61～1.53 2H,m
1.48～1.42 1H,m
1.31～1.25 1H,m
Ms m/z(ESI):210.2[M+H +]。
杂质H制备方法：
第一步：叔丁基-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl 2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(nitromethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000049
INT9手性拆分，制备条件：仪器：Waters UPC2 analytical SFC(SFC-H)；色谱柱：ChiralPak AD,150×4.6mm I.D.,3μm；流动相：A for CO 2 and B for EtOH(0.05％DEA)；梯度：B 5～40％；流速：2.5mL/min；柱温度为35℃。分离后得到两个光学异构体：峰2(保留时间：3.247分钟，8.68g)，其中，峰2为(-)-2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(硝基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸叔丁酯(INT22)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ4.74(q,2H),2.86(dt,1H),2.75–2.63(m,2H),2.53(ddd,1H),2.31(tt,2H),2.05(dt,1H),1.84–1.73(m,1H),1.68–1.55(m,4H),1.52(dd,1H),1.48–1.40(m,9H),1.31–1.23(m,1H)。
第二步：叔丁基-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸酯
tert-butyl-2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetate
Figure PCTCN2020112764-appb-000050
向反应瓶中加入INT22(7.3g,24.7mmol)，乙醇(50mL)，水(25mL)，铁粉(6.9g，123.6mmol)，氯化铵(6.6g，123.6mmol)，回流反应6h。冷至室温后，过滤，用乙醇(60ml×2)洗涤滤饼，合并滤液浓缩除去乙醇，加入150ml水，用二氯甲烷(300ml×2)萃取，合并有机层，有机层干燥，过滤，浓缩得到白色固体INT23(6.56g，产率100％)。
1H NMR(400MHz,CDCl 3)δ3.14(d,2H),2.89–2.72(m,3H),2.52–2.42(m,1H),2.35–2.18(m,2H),2.05–1.93(m,1H),1.78–1.68(m,1H),1.64–1.40(m,13H),1.33–1.17(m,2H)。
第三步：2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸
2-((1S,2R,3R,6S,8S)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure PCTCN2020112764-appb-000051
向反应瓶中加入INT23(6.56g，24.7mmol)，和二氯甲烷(60mL)，滴加三氟醋酸(60mL)，加毕于室温反应3小时，减压浓缩，将残留物溶于二氯甲烷(150mL)中，加入三乙胺至溶液pH为7-8，抽滤，用二氯甲烷(20mL×3)洗涤滤饼，得到白色固体INT24(4.0g，产率：77.3％)。
1H NMR(400MHz,CD 3OD):δ3.00(dt,3H),2.72(s,2H),2.49(s,1H),2.32(d,1H),2.16(s,1H),2.03(t,1H),1.76(s,1H),1.67(d,2H),1.58–1.46(m,2H),1.47–1.37(m,1H),1.30–1.20(m,1H)。
第四步：2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸
2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(((tert-butoxycarbonyl)amino)methyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid
Figure PCTCN2020112764-appb-000052
向反应瓶中加入INT24(4.47g，22.7mmol)，四氢呋喃(60ml)，氢氧化钠(2.27g，56.7mmol)的50ml水溶液，冷却至0℃，滴加二碳酸二叔丁酯(9.91g，45.4mmol)的45ml四氢呋喃溶液，室温反应2h。补加氢氧化钠(1.1g，27.5mmol)，二碳酸二叔丁酯(2.62g， 12.0mmol)，室温反应1h。用石油醚：乙酸乙酯(5:1)的混合溶液(100ml×3)洗涤反应溶液，合并有机层，用100ml纯水萃取1次，合并水层，加入磷酸二氢钠调至pH为4左右，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有机层，浓缩，加入80ml环己烷，搅拌，加热至回流，溶解，冷却至室温析出固体，过滤，得到白色固体INT25(5.5g，83.3％),不纯化直接下一步。
第五步：2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(氨基甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬-2-基)乙酸苯磺酸盐
2-((1R,2S,3S,6R,8R)-2-(aminomethyl)tricyclo[4.2.1.0 3,8]nonan-2-yl)acetic acid
向反应瓶中加入INT25(5.0g，16.2mmol)，水(40ml)，苯磺酸(6.0g，32.4mmol)，加热至100℃反应2h。冷却至室温，过滤得到白色固体杂质H。
δH(ppm)(400MHz,CD3OD) 氢数目及裂分情况
7.87～7.78 2H,m
7.49～7.36 3H,m
3.19 2H
2.94～2.86 1H,m
2.77 2H
2.47～2.39 1H,m
2.35～2.29 1H,m
2.25～2.18 1H,m
2.08～1.97 1H,m
1,82～1.71 1H,m
1.70～1.63 1H,m
1.65～1.57 1H,m
1.59～1.51 2H,m
1.45～1.35 1H,m
1.32～1.22 1H,m

Claims (27)

  1. 一种2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的组合物中有关物质Ⅰ的检测方法，其中，所述有关物质Ⅰ结构式为
    Figure PCTCN2020112764-appb-100001
    采用HPLC-CAD方法检测，包括以下步骤：
    1)有关物质Ⅰ供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物加入稀释剂制备有关物质Ⅰ供试品溶液；
    2)有关物质Ⅰ对照溶液制备：取步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液加入稀释剂稀释100倍，即得；
    3)将步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液和步骤2)得到的有关物质Ⅰ对照溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：
    色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，5μm)；
    流动相：A：10mM甲酸铵溶液、B：乙腈；
    梯度洗脱程序：0～5min，A 90％；5～25min，A 90％→40％；25～29min，A 40％→20％；29～35min，A 20％；35～36min，A20％→90％；36～40min，A 90％；
    流速：1.0mL/min；
    柱温：35℃；
    CAD参数：雾化温度50℃，采集频率5.0Hz，滤光片5。
  2. 根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1)或步骤2)中的稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂，优选为10mM甲酸铵与乙腈的混合溶剂，进一步优选为10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20的混合溶剂。
  3. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其中，步骤1)有关物质Ⅰ供试品溶液制备包括：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物50mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得；
    所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂，优选为10mM甲酸铵与乙腈的混合溶剂，进一步优选为10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20的混合溶剂。
  4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其中，步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液浓度为5mg/mL。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其中，步骤2)有关物质Ⅰ对照溶液制备包括：精密量取步骤1)得到的有关物质Ⅰ供试品溶液1.0mL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
    所述稀释剂优选为甲酸铵与乙腈的混合溶剂，进一步优选为10mM甲酸铵与乙腈的混合溶剂，更进一步优选为10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20的混合溶剂。
  6. 一种2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的组合物中有关物质Ⅱ的检测方法，其中，有关物质Ⅱ包括杂质A、B、C、D、E：
    Figure PCTCN2020112764-appb-100002
    采用LC-MS进行检测，包括以下步骤：
    1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备：取有关物质Ⅱ对照品加稀释剂溶解得到有关物质Ⅱ对照品溶液；
    2)有关物质Ⅱ供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物制备有关物质Ⅱ供试品溶液；
    3)将步骤1)得到的有关物质Ⅱ对照品溶液和步骤2)得到的有关物质Ⅱ供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：
    色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，3.5μm)；
    流动相：A：10mM甲酸铵溶液、B：乙腈；
    梯度洗脱程序：0～15min，A 70％→30％；15～16min，A 30％→10％；16～18min，A 10％；18～20min，10％→70％；20～25min，A70％；
    流速：1.0mL/min；
    柱温：30℃；
    MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)。
  7. 如权利要求6所述的检测方法，其中，步骤1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备包括：取有关物质Ⅱ对照品加入稀释剂溶解并稀释得到有关物质Ⅱ对照品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水体积比＝5：1。
  8. 如权利要求6或7所述的检测方法，其中，步骤1)有关物质Ⅱ对照品溶液制备包括：精密称取有关物质Ⅱ对照品25mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为有关物质Ⅱ对照品储备液；精密量取有关物质Ⅱ对照品储备液100μL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；或
    分别称取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用稀释剂溶解稀释配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液；精密量取杂质A、杂质D、杂质E对照品储备液各25μL，杂质C对照品储备液50μL、杂质B对照品储备液200μL至100mL量瓶，加稀释剂稀释制成每1mL含杂质A、杂质D、杂质E约0.25μg，杂质B约2μg、杂质C约0.5μg的混合溶液作为对照品溶液；
    所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水体积比＝5：1。
  9. 如权利要求6-8任一项所述的检测方法，其中，步骤1)得到的有关物质Ⅱ对照品溶液浓度为2.5μg/mL或1μg/mL。
  10. 如权利要求6所述的检测方法，其中，步骤2)中有关物质Ⅱ供试品溶液制备包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物加入稀释剂溶解并稀释得到有关物质Ⅱ供试品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水体积比＝5：1。
  11. 如权利要求10所述的检测方法，其中，步骤2)有关物质Ⅱ供试品溶液制备包括：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物25mg至25mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度摇匀，即得；
    所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，所述稀释剂为乙腈：水体积比＝5：1。
  12. 如权利要求6-11任意一项所述的检测方法，其中，步骤2)得到的有关物质Ⅱ供试 品溶液浓度为1mg/mL。
  13. 一种2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的组合物中手性异构体的检测方法，其中，手性异构体包括杂质F、G、H，所述杂质F、G、H如下：
    Figure PCTCN2020112764-appb-100003
    采用LC-MS进行检测，包括下述步骤：
    1)手性异构体对照品溶液制备：取手性异构体对照品适量，用稀释剂溶解并制备异构体对照品溶液；
    2)手性异构体供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物制备手性异构体供试品溶液；
    3)将步骤1)得到的手性异构体对照品溶液和步骤2)得到的手性异构体供试品溶液注入液相色谱仪，色谱条件为：
    色谱柱：CROWNPAK CR-Ⅰ(+)(3×150mm，5μm)；
    流动相：A：高氯酸溶液(pH1.3)、B：乙腈；
    洗脱程序：流动相A：流动相B＝80：20等度洗脱35分钟；
    流速：0.2mL/min；
    柱温：20℃；
    MS参数：ESI离子源，雾化室压力35psig，干燥气流速12L/min，干燥气温度350℃，检测模式SIM(+)。
  14. 如权利要求13所述的检测方法，其中，步骤1)手性异构体对照品溶液制备包括：取手性异构体对照品加入稀释剂溶解并稀释得到手性异构体对照品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，乙腈：水体积比＝20：80。
  15. 权利要求14所述的检测方法，其中，步骤1)手性异构体对照品溶液制备包括：精密称取手性异构体对照品10mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照 品储备液；精密量取对照品储备液100μL至100mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；或
    分别称取杂质F、杂质G(或杂质H)对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用稀释剂(乙腈:水＝1:4)溶解稀释配制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品储备液；精密量取杂质F、杂质G(或杂质H)对照品储备液100μL至100mL量瓶中，用稀释剂稀释制成每1mL中含杂质F 1μg、杂质G(或杂质H)1μg的混合溶液，作为对照品溶液；
    所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选的，乙腈：水体积比＝20：80。
  16. 如权利要求13-15任一项所述的检测方法，其中，步骤1)得到的手性异构体对照品溶液浓度为1μg/mL。
  17. 如权利要求13-16任意一项所述的检测方法，其中，步骤2)手性异构体供试品溶液制备包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物加入稀释剂得到手性异构体供试品溶液；所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选地，乙腈：水体积比＝20：80。
  18. 如权利要求17所述的检测方法，其中，步骤2)手性异构体供试品溶液制备包括：精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物10mg，至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液；精密量取供试品储备液1mL至10mL容量瓶，加稀释剂定容至刻度，摇匀，即得；
    所述稀释剂优选为乙腈和水的混合溶剂；进一步优选地，乙腈：水体积比＝20：80。
  19. 如权利要求13-18任意一项所述的检测方法，其中，步骤2)得到的手性异构体供试品溶液浓度为0.1mg/mL。
  20. 一种2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或包含2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐的组合物含量检测方法，采用HPLC-CAD方法检测，包括以下步骤：
    1)含量供试品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物制备含量供试品溶液；
    2)含量对照品溶液制备：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐对照品制备含量对照品溶液；
    3)将步骤1)得到的含量供试品溶液和步骤2)得到的含量对照品溶液注入色谱仪，色谱条件为：
    色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6×250mm，5μm)；
    流动相：A：10mM甲酸铵溶液、B：乙腈；
    梯度洗脱程序：0～5min，A 90％；5～25min，A 90％→40％；25～29min，A 40％→20％；29～35min，A 20％；35～36min，A20％→90％；36～40min，A 90％；
    流速：1.0mL/min；
    柱温：35℃；
    CAD参数：雾化温度50℃，采集频率5.0Hz，滤光片5。
  21. 如权利要求20所述的检测方法，其中，步骤1)含量供试品溶液制备包括：取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物加入稀释剂溶解并稀释得到含量供试品溶液；优选的，所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂；进一步优选的，所述甲酸铵浓度为10mM；更进一步优选的，所述10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20。
  22. 如权利要求21所述的检测方法，其中，步骤1)含量供试品溶液制备包括：
    精密称取2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.0 3,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物10mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液；精密量取供试品储备液0.5mL至10mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
    优选的，所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂；进一步优选的，所述甲酸铵浓度为10mM；更进一步优选的，所述10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20。
  23. 如权利要求20-22任一项所述的检测方法，其中，步骤1)得到的含量供试品溶液浓度为0.05mg/mL。
  24. 如权利要求20所述的检测方法，其中，步骤2)含量对照品溶液制备包括：取含量对照品加入稀释剂溶解并稀释得到含量对照品溶液；优选的，所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂；进一步优选的，所述甲酸铵浓度为10mM；更进一步优选的，所述10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20。
  25. 如权利要求24所述的检测方法，其中，步骤2)含量对照品溶液制备包括：精密称取含量对照品10mg至10mL容量瓶，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为含量对照品储备液；精密量取含量对照品储备液0.5mL至10mL容量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
    所述稀释剂为甲酸铵与乙腈的混合溶剂；进一步优选的，所述甲酸铵浓度为10mM；更进一步优选的，所述10mM甲酸铵：乙腈体积比＝80：20。
  26. 如权利要求20-25任意一项所述的检测方法，其中，步骤2)得到的含量对照品溶 液浓度为0.05mg/mL。
  27. 一种检测2-((1S,2S,3R,6S,8S)-2-(氨甲基)三环[4.2.1.03,8]壬烷-2-基)乙酸苯磺酸盐或其组合物杂质的方法，所述方法是将权利要求1-5任一项的方法、权利要求6-12任一项的方法与权利要求13-19任一项的方法组合使用。
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